KR101815693B1 - 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항미생물 필터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명은 키토산 은 나노복합체 (CAgNC)를 형성 하는 단계 및 키토산 은 나노복합체를 건조하는 단계를 포함하는 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 제조 방법으로 제조한 키토산 은 나노 필름을 이용하여 항미생물 필터의 제작에 활용이 가능하다.

Description

키토산 은 나노 필름을 포함하는 항미생물 필터 {Chitosan silver nanofilms containing antimicrobial filter}

본 발명은 키토산 은 나노복합체 (CAgNC)를 형성 하는 단계 및 키토산 은 나노복합체를 건조하는 단계를 포함하는 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조하는 방법 및 상기 필름을 포함하는 항미생물 또는 항진균 필터에 관한 것이다.

나노 필름은 양식산업에 있어서 수질 정화, 질병 통제 (항 미생물성 소재 이용 시), 중금속 독성 감소, 및 해양 식품을 포장하기 위한 생분해 포장지 등 다양한 분야에 적용이 가능한 것으로 알려져 있고, 나노 필름 개발을 위해서 저비용, 및 환경 친화적인 비독성 특성을 가진 생중합체의 사용은 점점 증가하고 있는 현실이다.

한편, 키토산 (Chitosan)은 자연적으로 존재하는, 베타-(1,4)-연결 D-글루코사민 (탈아세틸 유닛) 및 N-아세틸-D-글루코사민 (아세틸 유닛)이 임의적으로 분포하는 양이온 선형 다당류이다. 일반적으로 키토산은 키틴의 탈아세틸화를 통해서 제작됨이 알려져 있고, 상기 키토산은 게, 바닷가재, 및 새우 등의 외골격의 구조적 요소로 알려져 있다. 또한, 키토산은 게와 같은 갑각류에 존재하는 키틴을 화학처리하여 얻을 수 있음이 종래에 알려져 있다.

한국특허공보 제10-0478093호에 의하면 키토산의 자연친화적인 성질을 이용하여 식품 포장용 필름을 제조하는 방법에 대하여 종래에 알려져 있으나, 키토산을 이용하여 나노 구조를 형성하는 필름을 제작하여 이를 활용하는 방법에 대해서는 현재까지 알려져 있지 않다.

따라서, 키토산을 이용하여 환경 친화적이고, 비독성의 나노 구조를 형성하는 필름을 제작하는 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명의 하나의 목적은 키토산 용액과 질산 은을 섞어주어 키토산 은 나노복합체 (CAgNC)를 형성 하는 단계; 및

상기 키토산 은 나노복합체를 건조하는 단계를 포함하는 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키토산 은 나노복합체 (CAgNC)를 형성하는 단계 및 키토산 은 나노복합체를 건조하는 단계를 포함하는 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조하는 방법에 의해서 제조된, 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항미생물 필터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키토산 은 나노복합체 (CAgNC)를 형성하는 단계 및 키토산 은 나노복합체를 건조하는 단계를 포함하는 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조하는 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항진균 필터를 제공하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 키토산 용액과 질산 은을 섞어주어 키토산 은 나노복합체 (CAgNC)를 형성하고, 상기 키토산 은 나노복합체를 건조하여 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제작하였고, 상기 제작한 키토산 은 나노 필름의 항균 및 항진균 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일예는 키토산 용액과 질산 은을 섞어주어 키토산 은 나노복합체(CAgNC)를 형성하는 단계; 및

상기 키토산 은 나노복합체를 건조하는 단계를 포함하는 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 상기 제조 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항미생물 필터에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 상기 제조 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항미생물 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 상기 제조 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항진균 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 키토산 용액과 질산 은을 섞어주어 키토산 은 나노복합체 (CAgNC)를 형성하는 단계; 및

상기 키토산 은 나노복합체를 건조하는 단계를 포함하는 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 키토산 용액과 질산 은을 섞어주는 과정에서 질산 은을 12 mM을 투입하여 얻은 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)은 CAgNf-12라 하고, 질산 은을 52 mM을 투입하여 얻은 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)은 CAgNf-52라 하며, 키토산 은 나노 필름의 제조 방법에서 질산 은을 섞어주는 과정을 제외하고 동일한 방법으로 사용하여 제조하는 키토산 나노 필름은 CNf라 하고, 상기 CNf는 대조구로 사용하였다.

본 발명에서 키토산은 갑각류에 함유되어 있는 키틴을 인체에 흡수되기 쉽도록 가공한 새로운 물질을 의미하는 것으로서, 게나 가재, 새우껍데기에 들어있는 키틴을 탈아세탈화하여 얻어내는 것을 의미한다.

상기 키토산은 노폐해진 세포를 활성화하여 노화를 억제하고 면역을 강화해주며 질병을 예방해주는 기능을 함이 알려져 있다. 또한, 키토산은 생체의 자연적인 치유능력을 활성화하는 기능과 함께 생체리듬을 조절해주고 항암작용, 과잉된 콜레스테롤을 흡착 배설하는 역할을 함이 알려져 있다.

상기 키토산 은 나노 필름을 제조하는 방법에서 키토산 용액과 질산 은을 섞어주면 콜로이드 키토산 은 나노 복합체 (CAgNC)를 형성할 수 있다.

상기 키토산 용액과 질산 은을 섞어주는 과정에서 사용한 키토산 용액의 농도는 0.1 내지 5 % (w/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 키토산 용액과 질산 은을 섞어주는 과정에서 사용한 질산 은의 농도는 5 내지 100 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 키토산 은 나노 복합체를 형성하는 단계는 50 내지 120℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 형성된 키토산 은 나노 복합체 (CAgNC)를 건조하여 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조할 수 있으며, 상기 건조 과정 이후에 중화과정을 추가로 수행할 수 있다.

상기 건조 과정을 통해서 산성 물질을 증발시킬 수 있으며, 바람직하게는 아세트산을 증발시킬 수 있다.

상기 중화 과정은 일반적인 염기성 물질을 사용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 NaOH를 사용할 수 있다.

상기 키토산 은 나노 복합체를 건조하는 단계는 40 내지 70℃에서 수행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 50℃에서는 12시간 건조, 60℃에서는 8시간 건조하는 것일 수 있다.

건조하는 단계의 온도가 70℃를 넘어가게 되면 키토산 은 나노 복합체의 성질이 변할 수 있고, 40℃보다 낮게 되면 아세트산의 증발을 위해 소요되는 시간이 너무 많아질 수 있다.

상기 키토산 은 나노 복합체를 건조하는 단계는 아세트산을 증발시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 은 나노입자의 평균 입자 크기는 200 내지 700 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 상기 키토산 은 나노 필름의 은 함량은 1 내지 25 % (w/w)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조하는 방법을 통해서 제조한 키토산 은 나노 필름은 은 나노입자 (AgNP)를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 방법으로 제조한 CAgNf를 분광 광도계로 분석하여, 키토산 필름들의 색깔이 회색에서 갈색으로 변하는 것을 통해 상기 CAgNf에서 AgNP가 형성됨을 확인하였다 (실험결과 1-1).

본 발명의 일 실시예에서 상기 방법으로 제조한 CAgNf 중에서, CAgNf-52는 CAgNf-12보다 은 나노입자 (AgNP)가 더 많이 형성되었음을 확인하였다 (실험결과 1-1).

본 발명의 일 실시예에서 상기 방법으로 제조한 CAgNf는 CNf에 비해서 물흡수 능력이 감소되어 있으며, AgNP의 양이 증가되어 있음을 확인하였다 (표 1).

키노산에 은을 넣었을 경우 키토산의 물 흡수 능력이 감소하므로 주입한 은 함량이 높은 CAgNf-52의 물 흡수 능력이 CAgNf-12보다 더 낮음을 확인하엿다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 방법으로 제조한 CAgNf (CAgNf-52 및 CAgNf-12)가 향균 활성이 있음을 확인하였고, 구체적으로 상기 CAgNf가 향균 활성이 있음을 확인한 미생물 균주는 어류병원균으로 알려진 A. salmonicida, V. tapetis 와 E. tarda였다 (실험결과 2).

또한, 본 발명의 일 실시예에서 CAgNf-12 및 CAgNf-52이 상기 세 개의 균의 성장을 억제하는 정도는 큰 차이가 없음을 확인하였고, 이러한 결과는 CAgNf-52는 CAgNf-12에 비해 은함량이 높지만, AgNP의 입자 크기는 CAgNf-52 (12 nm)가 CAgNf-12 (9 nm)보다 크기 때문에 발생한 것으로 보인다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 방법으로 제조한 CAgNf가 해수에서 향균 활성이 있음을 확인하였고, 구체적으로 상기 CAgNf가 해수상에서 A. salmonicida균의 성장을 저해함을 확인하였다 (실험결과 3).

상기 결과에서 CAgNf-52가 CAgNf-12보다 A. salmonicida의 생장을 억제하는 활성이 더 높았었는데, 이는 CAgNf-52가 CAgNf-12보다 은 함량이 더 높기 때문인 것으로 판단된다.

본 발명은 상기 제조 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항미생물 필터에 관한 것이다.

상기 미생물은 어류 병원균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 병원균은 A. salmonicida (KCTC 2766), V. tapetis (KCTC 12728) 또는 E. tarda (KCTC 12267)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항미생물 필터는 상기 제조방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 포함하고, 상기 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)은 은 나노입자 (AgNP)를 형성하는 특징이 있다.

본 발명의 항미생물 필터에 포함된 상기 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)은 은 나노입자 (AgNP)를 형성하여 항미생물 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 방법으로 제조된 키토산 은 나노 필름은 항미생물 활성이 있어서 항미생물 필터로 사용가능할 수 있다.

본 발명은 상기 제조 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항진균 (anti-fungal) 필터에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 제조 방법에 의해서 제조된 CAgNf가 향진균 활성이 있음을 확인하였고, 구체적으로 상기 CAgNf가 F. oxysporum 곰팡이에 대하여 항진균 활성이 있음을 확인하였다 (실험결과 4).

본 발명에서 상기 제조 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름은 은 나노입자 (AgNP)를 형성하여 항진균 활성이 있으므로, 상기 제조 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름은 항진균 필터로 사용이 가능할 수 있다.

상기 진균은 퓨자리움 속 (Fusarium)에 포함된 진균을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 키토산 은 나노복합체 (CAgNC)를 형성하는 단계 및 키토산 은 나노복합체를 건조하는 단계를 포함하는 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 제조 방법으로 제조한 키토산 은 나노 필름을 이용하여 항미생물 또는 항진균 필터의 제작에 활용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라서 UV-vis 분광 광도계를 이용하여 대조구 (CNf), CAgNf-12, 및 CAgNf-52의 자외선 흡광 패턴을 확인한 그림이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라서 FE-TEM을 사용하여 CAgNC 콜로이드 용액과 키토산의 입경 크기을 관찰하고, 제타 전위 분포를 확인한 그림이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라서 디지털 및 AFM 포토그래프를 나타낸 것으로서, A 내지 C는 디지털 포토그래프 (A는 CNf, B는 CAgNf-12, 및 C는 CAgNf-52)이고, D 내지 F는 AFM 포토그래프 (D는 CNf, E는 CAgNf-12, 및 F는 CAgNf-52)이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라서 CAgNf의 FE-SEM 이미지를 나타낸 것으로서, A는 CNf, B는 CAgNf-12, 및 C는 CAgNf-52를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라서 marine 아가 플레이트에서 수행한 아가 디스크 확산 분석을 나타내며, A는 A. salmonicida 저지대, B는 V. tapetis 저지대, C는 E.tarda 저지대를 나타내고, D는 아가 디스크 확산 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라서 CAgNf에 의한 해수에서 A. salmonicida 균의 생장 감소를 나타낸 것으로, CFU는 실시예 1의 방법에 의해서 제조한 키토산 필름 (CAgNf-12 및 CAgNf-52 200 ug/uL를 25에서 24시간 배양한 후)을 포함한 인공 해수에서의 세균수을 나타낸다. 막대 그래프의 가운데 선은 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라서 CAgNf의 항진균 활성을 측정한 것을 나타낸다. A와 A’은 CAgNf-12를 처리한 것이며, A는 진균이 자라기 전이며, A’는 A를 10일 동안 배양한 것을 나타낸다. B와 B’은 CAgNf-52를 처리한 것이며, B는 진균이 자라기전, B’는 B를 10일 동안 배양한 것을 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. CAgNf의 제조

키토산 은 나노 필름 (CAgNf) CAgNf-12 및 CAgNf-52 (Ag 함유량으로 구분)은 하기와 같은 방법으로 제작하였다.

구체적으로, 1% (w/v) 키토산 용액 (Showa chemical, Japan / Cat. 0321-6250)은 아세트산 (0.5 M)을 첨가하여 65℃에서 균일한 용액이 될 때까지 연속적으로 교반시키고 (1 % (w/v) 저분자 키토산 용액은 환원제로 사용되었음), 그리고 나서 50 mL 키토산 용액을 95℃로 가열하면서 20 mL의 AgNO3 용액 (Silver nitrate) (각각 12 과 52 mM)을 한 방울씩 첨가하여 교반하며, 이를 통해 얻은 분산액은 3시간 동안 교반시켜 콜로이드 키토산 은 나노 복합체 (CAgNC)를 형성하게 된다. 그리고 나서, 상기 키토산 은 나노 복합체 콜로이드를 25 mL을 배양접시 (내경 9 cm)에 붓고 오븐에서 50℃에서 12시간 건조하여 아세트산을 증발시켜 키토산 은 나노 필름 (CAgNf)을 얻고, 상기 CAgNf는 4% (w/v) NaOH로 중화하고, 탈이온수로 세척한 후 60℃ 실험용 로 (furnace)에서 8시간 건조하고, 사용하기 전까지 어두운 곳에서 보관한다.

대조구인 CNf은 상기 키토산 은 나노 필름의 제작 방법에서 AgNO3 용액 (Silver nitrate)을 넣는 과정을 제외하고 동일한 방법을 사용하여 제조하였다.

실시예 2. CAgNf의 물리화학적 특성 확인

2-1. AgNP의 크기와 형태 분석

CAgNf 매트릭스 안에 은 나노입자 (AgNP)가 형성되는지 여부를 확인하기 위해서, 분광 광도계 (Mecasys, 한국)를 이용하여 실시예 1과 같은 방법으로 제작한 콜로이드 상태의 CAgNC 용액을 300-500 nm 파장범위에서 분석하였다.

또한, CagNf는 고체상태이기 때문에 내장된 AgNP의 크기를 측정 할 수 없으므로, 콜로이드 상태(액체 형태)의 CAgNC를 이용하여 CAgNC 용액 안에 존재하는 AgNP의 크기와 형태를 확인하였다. CAgNC 용액 안에 존재하는 AgNP의 크기와 형태를 확인하기 위해서 제조사의 프로토콜에 따라서 TEM (Model Tecnai G2 F30 S-Twin, FEI, 미국)를 사용하여 CAgNC 용액을 전자 현미경으로 관찰했다. 입자크기 (입경)와 제타전위는 Zetasizer S-90 Malvern instruments (Malvern, 영국)를 이용하여, 25℃에서 측정하였다.

　

2-2. CAgNf의 물 흡수 능력, 및 은 함량 분석

CAgNf의 물 흡수 능력 테스트는 하기 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 각 CAgNf 필름마다 3개의 샘플로 weighing balance (HR-250 AZ. Japan)을 이용하여 무게를 측정하고, 상온에서 PBS (pH 7.4)의 10 mL에서 평형을 맞추었다. 24시간 후 각 필름을 꺼내서 물을 닦아내고, 즉시 무게를 측정하였다. CAgNf의 물 흡수 퍼센트(%)는 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.

[수학식 1]

물 흡수% = [(습중량-건중량)/건중량] X 100

CAgNf의 은 함량은 coupled plasma emission spectroscopy (ICP-AES)를 이용하여 하기와 같은 방법으로 측정하였다.

구체적으로, 일정한 양의 CAgNf를 HNO₃산에 녹인 후, 은 함량을 ICP-AES (3300DV, Perkin-Elmer Optima, 미국)를 이용하여 제조사가 제공한 방법에 따라서 측정하였다.

2-3. CAgNf의 표면 구조 분석

CAgNf의 표면 구조는 field emission scanning electron microscopy (FE-SEM)를 사용하여 분석하였다.

구체적으로, CAgNf를 제조사가 제공한 프로토콜에 따라서 이온 스퍼터 코팅기 (Showa chemical, Japan / Cat. 0321-6250)를 이용하여 오스뮴 이온으로 코팅하고, FE-SEM (Hitachi S-4800, 일본)을 5.0 kV의 가속전압으로 작동하여 분석하였다. CAgNf의 AFM 이미지는 scanning prob microscope (Park system XE-100, 한국)을 사용하여 얻었고, CAgNf의 이미지는 digital single lens camera (Canon 1000D, 일본)를 사용하여 얻었다.

AFM (Atomic force microscopy) 이미지는 scanning prob microscope에 의해서 얻을 수 있고, 상기 이미지를 이용하여 대상체의 세부적인 표면 특징을 확인 할 수 있으며, AFM 이미지는 화학적 에칭이나 염색 없이 비전도성 중합체의 표면의 이미지를 얻을 수 있고, 상기 이미지를 얻기 위해서 전자 빔을 사용하지 않으므로 중합체 표면에 손상을 가하지 않고 중합체 표면의 기계적 특징을 확인할 수 있는 장점이 있다.

반면, 일반 필름 이미지는 디지털 단일 렌즈 카메라 (Canon 1000D, 일본)로찍은 것을 의미하며, 시각적 외관을 확인하기 위한 목적으로 이미지를 얻는다.

키토산과 CAgNf의 표면 구조는 Atomic Force Microscopy (AFM)을 통해 확인할 수 있으며, 키토산과 CAgNf의 표면 형태는 서로 다르다.

실시예 3. CAgNf의 항균 활성 측정

CAgNf의 항균 활성 (Antibacterial activity)을 확인하기 위해서 3개의 어류 병원균으로 알려진, A. salmonicida (KCTC 2766), V. tapetis (KCTC 12728) 와 E. tarda (KCTC 12267)세균를 사용하여 CAgNf의 항균 활성을 측정하였다.

상기 모든 세균은 marine 액체 배지 (Dickinson)에서 25℃, 160 rpm에서 배양했고, 향균 활성을 확인하기 위해서 공지된 방법인 아가 디스크 확산 분석법 (Agar disc diffusion assay) 및 변형된 액체배지를 이용한 성장 저해 분석법 (modified liquid growth inhibition assay)을 수행하여 CAgNf의 항균 활성을 확인했다.

구체적으로, 아가 디스크 확산 분석법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. CAgNf (12 mM AgNO3 또는 52 mM AgNO3)는 필름 디스크를 만들기 위해 직경 8 mm로 구멍내고, 120℃에서 30분간 멸균하였고, 상기 각각의 세균 단일 콜로니를 4 mL의 marine 배지에 접종시키고 25℃에서 160rpm에 16시간 배양하였다. 디스크 확산 분석법을 이용하여, 각각의 3개의 세균은 marine 아가 플레이트 (Dickinson)에 200 uL씩 스프레딩 (spreading)하고 밤새 배양하였다.

그리고 나서, 상기 멸균한 필름 디스크를 각각의 세균을 스프레딩한 marine 아가 플레이트에 넣고 25℃에서 24시간동안 배양하였다. 항균 활성을 측정하기 위해서 생육 저지대의 직경 (Diameter of inhibition zone, DIZ)을 측정하고, 각 실험은 3회 반복하였다.

구체적으로, 변형된 액체배지를 이용한 성장 저해 분석법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 20 mL의 marine 액체 배지 (Dickinson)에 각각의 세균을

1:100 희석하여 접종하고 25℃에서 배양했다. 1 X 10⁶ CFU/mL에 도달할 때까지 배양하고 CAgNf (CAgNf-12 또는 CAgNf-52)를 다양한 농도 (25 내지 100 ug/mL)로 처리하였다. 세균의 성장을 저해함을 시각적으로 관찰할 수 있는 가장 낮은 CAgNf 농도 (MIC, 최소저지농도)를 측정하였다.

실시예 4. CAgNf에 의한 해수에서 A. salmonicida 균의 생장 감소

CAgNf의 균 생장 감소 능력 (bacterial reduction capacity)은 병원성 세균 A. salmonicida의 생균수를 세는 방법으로 측정하였다.

구체적으로, 실시예 3과 같은 방법으로 전날 배양한 세균 배양액을 20 mL의 marin 배지에 1:100으로 희석하여 접종하고, OD600 값이 0.6일 때 원심분리(3500 rpm, 4℃, 10분)하여 균을 모았다. 그리고 모아진 균은 10 mL PBS로 재부유한 후 세척하였다. 세균 샘플(1 X 106 cells/mL)은 15 mL 인공 해수 (염분 32 ‰) (Qingdao　 Sea- Salt　 Aqurium Technology Co., Ltd/ No cat.)에 첨가하였고, 필름 샘플은 네모조각 (2.5 x 2.5 cm)으로 잘라서 해수에서 200 ug/mL의 농도가 되도록 상기 세균 샘플을 첨가한 해수 플라스크에 주입하였다.

대조군은 A. salmonicida 배양에 필름을 첨가하지 않은 것을 사용하였다. 모든 샘플들은 호기성 상태에서 25℃에 shaking하여 24시간동안 배양하였다. 균주를 배양중인 플라스크에서 0.1 mL의 배양액을 분주하여 0.1% (v/v) 펩톤수 (Peptone water)로 연속적으로 희석하여, marin 고체 배지에 깔고, CFU를 계산했다. 상기 고체배지는 25℃에서 2일 동안 배양하였다. 각 고체배지에서 자라는 콜로니 수는 colony-forming units per milliliter (CFU/ml)로 계산하였다. 실험은 3번 반복 수행했고, 3번 수행하여 얻은 평균값을 데이터로 사용하였다.

실시예 5. CAgNf의 항진균 활성 측정

CAgNf의 항진균 활성 (Antifungal activity)을 확인하기 위해서 지브라피쉬 시스템 (Zebrafish system)으로부터 Fusarium oxysporum을 분리하였다. 항진균 활성은 하기와 같은 방법으로 진균을 키우는 일반적인 배지인 PDA 배지 (Becton Dickinson, USA, 254920)에서의 진균 성장 저해 여부를 통해 측정하였다.

구체적으로, 초기 접종 진균 (직경 3 mm)은 성장 균사체 끝에서부터 얻어서, PDA 배지의 중간에 놓았다 (도 7 A의 3). 그리고 나서, 성장 제한링 (Growth restriction ring) (7.5 mm 내부반경과 15 mm의 외부반경)은 하나는 파라필름 (대조구), 다른 하나는 CAgNf으로부터 만들어진 두 개의 반원형 필름 조각을 초기 진균 접종한 주변에 배치했다 (도 7 A의 4 및 5). 모든 플레이트는 28℃에서 10일간 배양하였고, 항진균 활성을 확인하기 위해서 매일 진균의 배양을 관찰했다. 항진균 활성(A0)을 보기 위한 주요 지표로서 진균에 의해 성장 제한링을 지나서 자라는데 걸리는 시간 (t7.5 mm)과 10일 후 진균이 자란 반지름의 크기 (r10d)를 사용했다. 배양조건, 진균의 종류, 초기 접종의 크기, 제한링 내부 여백의 반지름, 및 제한링의 넓이가 상기 측정 결과에 영향을 줄 수 있으며, CAgNf의 특성 또한 상기 측정 결과에 영향을 줄 수 있다. 진균이 제한링 A0 α t7.5 mm 및 A0 α 1/ r10d 이상으로 성장했을 때, 항진균 활성에 대한 일반적 규칙이 적용가능하다.

실험결과 1. 제조한 CAgNf의 물리화학적 특성

1-1. 제조한 CAgNf의 AgNP 형성 확인

실시예 1과 같은 방법을 사용하여 AgNO3와 저분자 키토산을 이용하여 제작한 CAgNf을 은을 주입하지 않고 제작한 키토산 필름 (CNf, 대조구)과 비교하여 그 물리화학적 특성을 확인하였다.

실시예 1과 같은 방법을 사용하여 제작한 두 가지 타입의 AgNP가 침지 (impregnated)된 CAgNf (키토산 필름)에 대하여 실시예 2-1과 같은 방법을 사용하여 분광 광도계로 분석하여, 키토산 필름들의 색깔이 회색에서 갈색으로 변하는 것을 통해 CAgNf에서 AgNP의 형성됨을 확인할 수 있다.

표면 플라몬 공명 (SPR)을 이용하여 반사되어 나오는 광선과 상호작용으로 금속에서 전도전자의 집단자극을 이용하여 물질의 성분과 양을 측정할 수 있다. 분광광도계를 이용한 분석에서 은의 특징적인 SPR 흡수대 (absorption) (415 nm)를 CAgNf 제조 후 3시간 후에 (필름으로 굳이기 전) CAgNCs의 분산을 측정하여 확인하여 금속성의 AgNP의 존재 및 양적 수준을 확인할 수 있다.

그 결과 도 1에 나타난 것과 같이 415 mm에서 CNf (대조구)에 대한 피크는 보이지 않은 반면 CAgNf-12 용액 및 CAgNf-52 용액에서는 415 mm에서 피크가 나타났고, CAgNf-12 용액과 비교하여 CAgNf-52 용액에서 415 mm에서 피크가 더 높게 확인되었다.

상기 결과를 통해 CAgNf-12 용액 및 CAgNf-52 용액에 AgNP가 형성되었음을확인할 수 있었고, CAgNf-12 용액과 비교하여 CAgNf-52 용액에서 AgNP가 보다 더 많이 형성되었음을 알 수 있었다.

1-2. 제조한 CAgNf의 입자 크기 분포 및 제타 전위 분포 확인

실시예 2-1에서 TEM을 사용하여 CAgNC 용액하여 CAgNf-12 와 CAgNf-52의 입자 크기 분포 및 CNf의 제타 전위 분포를 확인하였다.

그 결과 도 2에 나타난 것과 같이 CAgNf의 TEM 이미지 (FE-TEM)에는 키토산 현탁액 (CNf)에 AgNP의 응집은 관찰되지 않으나, CAgNf-12 및 CAgNf-52에서는 AgNP의 응집을 확인할 수 있었다 (도 2의A, B, 및 C).

필름에 형성된 평균 입자 크기는 실시예 2-1에 기재된 바와 같이 CAgNCs 용액을 사용하고 Zetasizer S-90 Malvern instruments (Malvern, UK)를 이용하여 25℃에서 측정하였다.

그 결과 도 2 D 내지 F 에 나타난 것과 같이, 필름에 형성된 CNf (도 2의 D)의 평균 입자 크기 분포 (610.4 ± 4.6 nm)는 CAgNf-12　 (380.8±10.1 nm) 및 CAgNf- 52　 (480.1±6.1 nm) 보다 더 큰 크기 분포를 나타냈다.

또한, 도 2 D 내지 F에 나타난 것과 같이, CAgNf-52에서 AgNP 분포의 입자크기 (12 nm)는 CAgNf-12에서 AgNP 분포의 입자크기 (9 nm)에 비해서 더 높았는데, 이는 CAgNf-52에서 입자 집합체 (Agglomeration)의 형성이 더 많이 이뤄졌기 때문으로 보인다.

제타 전위 (Zeta potential)는 표면 전하이며, 제타 전위는 부유액에서 입자들 사이에 전기적 반발을 통해 입자 안정성에 상당한 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다.

각 필름 용액(CAgNf-12 and CAgNf-52)의 제타 전위를 측정하기 위해서 실시예 2-1 방법을 이용하여 실험을 수행하였다.

그 결과 도 2의 G 내지 I에 나타난 것과 같이, CNf의 현탁액의 표면은 약 42.8 ±3.1mV 양전하를 가지고 있었고, CAgNf-12 와 CAgNf-52 키토산 현탁액에 존재하는 AgNP는 각각 약 44.8 ± 8.6mV, 및 49.2 ±7.1 mV이었다. 상기 양전하는 입자 주위의 키토산 분자에 존재하는 수소화된 아미노 그룹 (-NH3+)에 의해서 형성된 것으로 보인다.

상기 결과를 통해서 CAgNf-12 와 CAgNf-52는 서로 물리적 특성의 차이가 있음을 확인할 수 있었다.

상기 실험결과 2-1, 및 2-2를 종합하여, CAgNf-12와 CAgNf-52의 키토산 필름에는 CNf에 비해서 AgNP가 균일하게 분포하고 AgNP이 더 많이 형성됨을 알 수 있었다.

1-3. 제조한 CAgNf의 물 흡수 능력, 및 은 함량 확인

제조한 CAgNf의 물리화학적 특성을 확인하기 위해서, 실시예 2-2방법을 사용하여, CAgNf의 물 흡수 능력, 및 AgNP 분석을 수행하였다.

그 결과 표 1에 나타난 것과 같이, CAgNf는 CNf에 비해서 물 흡수 능력이 감소되어 있으며, AgNP의 양이 증가되어 있었다.

CAgNf의 물 흡수 정도와 관련해서, 키노산에 은을 넣었을 경우, 키토산의 물 흡수 능력이 감소하므로 주입한 은 함량이 높은 CAgNf-52의 물 흡수 능력이 CAgNf-12보다 더 낮았다.

필름 형태	물 흡수 (%)	AgNP의 양 (w/w %) (이론적)	Amount of AgNP (w/w %) (실제 ICP-AES)
CNf	42.4± 5.3	0	0
CAgNf-12	34.3± 2.4	5	4.62± 0.28
CAgNf-52	28.4±1.4	18	16.86± 0.36

또한, 실시예 2-3방법을 사용하여 CAgNf의 표면 구조를 분석하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 것과 같이, 도 3의 A-C (A는 CNf, B는 CAgNf-12, 및 C는 CAgNf-52는 일반적인 DSL 사진으로써, 상기 결과를 통해서 CNf, CAgNf-12, 및 CAgNf-52 색의 변화가 다름을 알 수 있는데 이는 은의 양과 관련이 있으며, 은이 많이 들어 갈수록 색은 더 진해지며, CAgNf-12 와 CAgNf-52의 표면은 각각 엷은 노란색과 갈색으로 보였다. 투명도는 AgNP의 농도와 반비례했다. CAgNf-12 와 CAgNf-52는 AFM로 분석하면, 다른 표면 지형이 존재하며, CAgNf의 형태는 표면의 구성과 분자량, 전체 두께, 용매증발, 고분자 용해도를 포함하여 여러 요소에 영향을 받는다.

실험결과 2. CAgNf의 항균 활성 측정 결과

실시예 1과 같은 방법으로 제작한 CAgNf의 향균 활성을 어류병원균으로 알려진 A. salmonicida, V. tapetis 와 E. tarda를 이용하여 실시예 3과 같은 방법으로 측정하였다.

아가 디스크 확산 분석법을 수행한 도 5에 나타난 것과 같이, 두 개의 CAgNf 필름은 AgNP이 없는 키토산 필름과 비교하여 A. salmonicida, V. tapetis 와 E .tarda 균의 성장을 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 CAgNf-12 및 CAgNf-52이 상기 세 개의 균의 성장을 억제하는 정도는 큰 차이가 없었는데, 이는 CAgNf-52는 CAgNf-12에 비해 은함량이 높지만, AgNP의 입자 크기는 CAgNf-52 (12 nm)가 CAgNf-12 (9 nm)보다 크기 때문에 발생한 것으로 보인다.

왜냐하면, 입자 크기가 크면 투과성이 떨어지므로 일반적으로 입자 크기가 작고, 은 함량이 클수록 향균 활성이 높아지는데, CAgNf-52는 CAgNf-12에 비해 은함량이 높지만, AgNP의 입자 크기는 CAgNf-52 (12 nm)가 CAgNf-12 (9 nm)보다 크기 때문이다.

실시예 3과 같은 방법으로 변형된 액체배지를 이용한 성장 저해 분석법을 수행하여 얻은 각 세균에서 MIC (Minimum Inhibitory Concentration, 최소저지농도)와 MBC (Minimum Bactericidal Concentration) 값은 하기 표 2에 나타나 있다.

필름 형태	세균 이름	MIC (ug/mL)	MBC (ug/mL)
CAgNf-12	A. salmonacida	75	75
	V. tapatis	75	125
	E. tarda	50	75
	Bacteria Name	MIC (ug/mL)	MBC (ug/mL)
CAgNf-52	A. salmonacida	50	50
	V. tapatis	75	100
	E. trada	25	50

CAgNf-12 와 CAgNf-52의 가장 낮은 MIC 값은 E. tarda에서 각각 50과 25 ug/mL이고, CAgNf-12 와 CAgNf-52 75 ug/mL를 처리했을 때 A. salmonicida, V. tapetis균 모두에 대해서 가시적 성장을 억제했다.

상기 세 개의 균에 대하여 CAgNf-12의 MBC값은 A. salmonacidar균에 대하여 75 ug/mL, V. tapatis균에 대하여 125 ug/mL, E. trada에 대하여 75 ug/mL였고, 반면에 CAgNf-52의 MBC의 값은 A. salmonacidar균에 대하여 50 ug/mL, V. tapatis균에 대하여 100 ug/mL, E. trada에 대하여 50 ug/mL였다.

상기 결과를 통해서 실시예 1의 방법으로 제작한 CAgNf가 항균 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

실험결과 3. 해수에서 CAgNf에 의한 세균 억제 활성 측정 결과

양식 시스템에서 중금속과 유기화합물, 최소한의 미생물 수준을 유지하는 것은 질병 방어를 위해 중요하다. 키토산은 독특한 분자 구조를 가지고 있으며, 오염된 물에 존재하는 독성물질 및 미생물을 제거하는 기능이 있다. 따라서, 실시예 1의 방법으로 제작한 두 가지의 필름 (CAgNf)이 세균 억제 활성이 있는지 여부를 확인하였다.

실시예 4와 같은 방법으로 실험을 수행한 결과, 도 6에 나타난 것과 같이 CAgNf (CAgNf-12 및 CAgNf-52)는 AgNP없는 대조군 필름 (CNf)과 비교하여 A. salmonicida 수를 현저하게 감소시킴을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해서, CAgNf-12 및 CAgNf-52는 A. salmonicida 균 생장 억제 활성이 있음을 확인할 수 있었고, CAgNf-52가 CAgNf-12보다 A. salmonicida의 생장을 억제하는 활성이 더 높음을 확인할 수 있었다. 이는 CAgNf-52가 CAgNf-12보다 은 함량이 더 높기 때문인 것으로 보인다.

상기 결과에서 대조구인 키토산 필름이 A. salmonicida 세균의 생장을 억제하지 않았던 결과를 근거로, CAgNf에 의한 A. salmonicida 세균의 생장을 억제효과는 CAgNf에 존재하는 AgNP에 의한 것이라고 판단할 수 있다.

실험결과 4. CAgNf의 항진균 활성 측정 결과

실시예 1과 같은 방법으로 제작한 CAgNf (CAgNf-12 및 CAgNf-52)를 실시예 4와 같은 방법으로 실험을 수행하여 CAgNf (CAgNf-12 및 CAgNf-52)의 항진균 활성을 측정하였다. 실험에 사용한 F. oxysporum은 곰팡이이며, 독소를 배출하고, 상기 독소의 양은 수질 오염의 척도로 간주된다

그 결과는 도 7에 나타나 있다. 도 7 A의 (1)은 페트리 접시 경계를 나타내고, (2)는 PDA 배지를 나타내고, (3)은 F. oxysporum은 곰팡이를 접종한 것을 나타내고, (4)는 반 원형 성장 장벽 (Semi-circular growth barrier) (파라필름/대조구)을 나타내고 (5)는 반 원형 성장 장벽 (Semi-circular growth barrier) (CAgNf)을 나타내고, (6)은 10일 후 반 원형 성장 장벽을 지나 퍼져나가고 있는 진균의 성장을 나타낸다. 도 7B의 A’은 CAgNf-12의 F. oxysporum은 곰팡이 접종 10일 후 항진균 활성을 나타내고, B’은 CAgNf-52의 F. oxysporum은 곰팡이 접종 10일 후 항진균 활성을 나타내며, 각각의 대조구는 A 및 B로 나타나 있다.

대조구와 CAgNf를 처리한 경우에서 진균은 모든 고체 배지에 초기 접종으로부터 3일 동안 내부 성장 원 안쪽으로 균일하게 펴져나갔다. 그러나, 대조구의 경우 초기 접종 후 6일째에 곰팡이 균사체는 7.5 mm 넓은 반원형의 성장 제한 링을 통과해 퍼져나갔으나, CAgNf의 경우 성장 제한 링 절반 안쪽 가장자리에 불규칙 하고 응집한 형태의 균사의 성장이 관찰되었고, 초기 접종로부터 6 일 후 성장 제한 링을 통과 할 수 없었다. 대조구의 성장 제한 링에서 발단된 진균은 배양 십일 후 PDA 배지의 절반에 걸쳐 확산되었다. CAgNf-12 와 CAgNf-52의 성장 제한 링의 바깥쪽 가장자리로부터 측정 대조군 반쪽의 평균 직경의 성장이 각각 17과 16.1 mm 였다. 그러나 초기 접종으로부터 10일 후 CAgNf의 절반의 안쪽 가장자리에 불규칙한 응집은 관찰되었다.

상기 도 7에 나타난 결과를 통해, 실시예 1과 같은 방법으로 제작한 CAgNf (CAgNf-12 및 CAgNf-52)는 대조구에 비교하여 F. oxysporum 성장을 현저하게 억제시킴을 확인 할 수 있었다.

상기 결과를 통해서 CAgNf가 물 필터링 시스템에서 항진균 필름으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (15)

1. 키토산과 아세트산을 혼합한 키토산 용액에 질산 은 용액을 방울씩 첨가하고 교반하여 분산액을 얻고,
   상기 얻는 분산액을 교반하여 키토산 은 나노복합체 콜로이드를 형성하는 단계; 및
   상기 키토산 은 나노복합체 콜로이드를 건조하여 아세트산을 증발시키는 단계를 포함하며,
   평균 입자 크기가 200 내지 700 nm을 갖는 은 나노입자를 함유하는 키토산 은 나노 필름을 제조하는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 키토산 용액의 농도는 0.1 내지 5 % (w/v)인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 질산 은의 농도는 5 내지 100 mM인, 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 키토산 은 나노 복합체를 형성하는 단계는 50 내지 120℃에서 수행되는 것인, 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 키토산 은 나노 복합체를 건조하는 단계는 40 내지 70℃에서 수행되는 것인, 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 상기 키토산 은 나노 필름의 은 함량은 1 내지 25 % (w/w)인, 방법.
10. 제1항, 제3항 내지 제6항, 및 제9항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항미생물 필터로서,
    상기 키토산 은 나노 필름 중의 은 나노입자의 평균 입자 크기가 200 내지 700 nm인 것을 특징으로 하는, 항미생물 필터.
11. 제10항에 있어서, 상기 미생물은 어류 병원균인, 항미생물 필터.
12. 제11항에 있어서, 상기 병원균은 A. salmonicida (KCTC 2766), V. tapetis (KCTC 12728), 또는 E. tarda (KCTC 12267) 인, 항미생물 필터.
13. 제10항에 있어서, 상기 키토산 은 나노 필름은 은 나노입자 (AgNP)를 형성하는 것을 특징으로 하는, 항미생물 필터.
14. 제1항, 제3항 내지 제6항, 및 제9항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의해서 제조된 키토산 은 나노 필름을 포함하는 항진균 (anti-fungal) 필터로서,
    상기 키토산 은 나노 필름 중의 은 나노입자의 평균 입자 크기가 200 내지 700 nm인 것을 특징으로 하는, 항진균 필터.
15. 제14항에 있어서, 상기 진균은 퓨자리움 속 (Fusarium)인, 항진균 필터.
    

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