KR101809828B1 - Advanced sensory materials for detecting tyrosine kinase and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화학식 5의 화합물 또는 이의 유사체(analogues)를 포함하는, 타이로신 인산화 효소(tyrosine kinase) 감지용 형광 프로브 조성물, 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 종래 화합물 1(KP1)의 구조적 변화를 통하여 보다 향상된 특성을 가진 형광 프로브, 이를 이용한 세포와 조직 영상화 방법, 살아있는 동물을 대상으로 한 암 진단 및 영상화 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 향상된 민감도와 선택성을 나타내는 진보된 감지 특성으로 인하여, 암조직의 선택적 영상화에 효과적으로 활용될 수 있다.The present invention relates to a fluorescent probe composition for the detection of tyrosine kinase comprising a compound of the formula (5) or analogues thereof, and more particularly to a fluorescent probe composition for detecting tyrosine kinase, And more particularly, to a fluorescence probe having improved characteristics through the use of a fluorescent probe, a cell and tissue imaging method using the same, and a cancer diagnosis and imaging method for living animals. The present invention can be effectively utilized for selective imaging of cancer tissue due to its advanced sensing properties, which exhibit improved sensitivity and selectivity.
Description
본 발명은 화학식 5의 화합물 또는 이의 유사체(analogues)를 포함하는, 타이로신 인산화 효소(tyrosine kinase) 감지용 형광 프로브 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a fluorescent probe composition for the detection of tyrosine kinase, which comprises a compound of the general formula (5) or analogues thereof, and uses thereof.
생체 내의 효소-기질 및 항원-항체간 상호작용, 신경계의 전기적 신호 전달 등 일련의 분자간 상호작용을 감지하기 위해서는 효율적인 분자 프로브(molecular probe) 및 생체 영상화(bioimaging)를 위한 물질이 요구된다. 특히, 분석하고자 하는 특정 기질과 선택적으로 형광(fluorescence) 변화를 동반하는 형광 프로브(fluorescent probe)는 높은 민감도, 정확도와 더불어 빠른 신호제공 등에서 장점을 가진다.In order to detect a series of intermolecular interactions such as in vivo enzyme-substrate and antigen-antibody interactions, and electrical signaling of the nervous system, substances for efficient molecular probes and bioimaging are required. Particularly, the specific substrate to be analyzed and a fluorescent probe, optionally accompanied by a change in fluorescence, are advantageous in providing high sensitivity, accuracy, and fast signal delivery.
최근 특정 질병의 바이오마커를 감지하는 분자 프로브에 대한 활발한 연구가 진행되고 있는데, 그 중에서 다양한 질환과 직접적으로 관련된 단백질인 키나아제(kinase)의 활성을 감지하는 프로브의 개발은 매우 중요한 연구 과제이다. 키나아제는 생체 내 신호전달 체계를 조절하는 가장 중요한 인산화 효소로서, 아데노신 삼인산(ATP; adenosine 5'-triphosphate)의 감마(γ)-인산기를 특정 기질 단백질에 전달해 주는 역할을 한다.Recently, active researches have been conducted on molecular probes for detecting biomarkers of specific diseases. Development of probes for detecting the activity of kinase, which is a protein directly related to various diseases, is a very important research task. Kinase is the most important phosphorylation enzyme that regulates the signal transduction system in vivo and plays a role in transferring gamma (γ) -phosphate of adenosine 5'-triphosphate to specific substrate proteins.
인산화 효소에 과발현이 일어나거나 돌연변이가 발생되면 암, 당뇨, 뇌질환과 같은 다양한 질환이 유발된다고 알려져 있기 때문에, 단백질 인산화 효소의 활성을 효과적으로 감지할 수 있는 분자 프로브의 개발은 암을 포함한 다양한 질환의 진단에 활용될 수 있을 것이다. 또한 신약 개발과 관련하여, 이러한 분자 프로브는 인산화 효소의 활성을 억제하는 작용기전을 갖는 약물탐색에 활용될 수 있다. 암의 경우 일반 세포 및 조직에 비해 특정 키나아제의 높은 활성 및 생성이 나타나고, 따라서 암에서 발현되는 특정 키나아제에 선택적으로 결합하는 분자 프로브의 개발은 암의 선택적 형광 영상화 및 암 진단으로 활용이 가능하다.Since it is known that overexpression of the phosphorylated enzyme occurs or mutation occurs, various diseases such as cancer, diabetes and brain diseases are induced. Therefore, the development of a molecular probe capable of effectively detecting the activity of the protein kinase It can be used for diagnosis. In connection with the development of new drugs, these molecular probes can be used for drug discovery that has a mechanism of action that inhibits the activity of phosphorylase. The development of a molecular probe that selectively binds to a specific kinase expressed in a cancer can be utilized for selective fluorescence imaging and cancer diagnosis of cancer, since cancer shows high activity and production of a specific kinase as compared with normal cells and tissues.
생체 내 물질 분석 및 생체 영상화에 요구되는 유기 형광 물질의 광물리적(photophysical) 특성과 광안정성(photostability) 및 여기(excitation) 광원의 생체 조직 투과성 등 측면에서, 이광자 흡수 형광 물질은 일광자 흡수 형광 물질에 비해 유리하다. 이광자 흡수(two-photon absorption) 현상은 분자 내 전자가 가상의 전이 상태를 통하여 두 개의 광자를 동시에 흡수함으로써 (약 10-16초 이내) 여기 상태로 전이되는 현상이다. In view of the photophysical properties and photostability of the organic fluorescent substance required for in vivo substance analysis and bioimaging, the two-photon absorbing fluorescent substance is a one-photon absorption fluorescent substance . Two-photon absorption is a phenomenon in which electrons in a molecule absorb two photons simultaneously through an imaginary transition state (within about 10 -16 seconds) to an excited state.
이에, 본 발명자들은 생체 내에서 타이로신 인산화 효소와 상호작용하여 형광을 발하는 형광 키나아제 프로브(kinase probe 1; KP1) 화합물을 개발한 바 있다(특허등록 제10-1524915호). 그러나, 이 KP1 화합물은 인산화 효소를 감지할 수 있는 민감도가 다소 낮기 때문에, 이보다 효과적이고 높은 감도로 PDGFRa(혈소판 유래 성장인자 수용체) 인산화 효소를 감지할 수 있는 분자 프로브를 창출하는 것이 또한 중요한 연구 과제로 인식되었다.Accordingly, the present inventors have developed a fluorescent kinase probe 1 (KP1) compound that interacts with a tyrosine kinase in vivo to obtain fluorescence (Patent Registration No. 10-1524915). However, since this KP1 compound has a somewhat low sensitivity to detect phosphorylase, it is also important to develop a molecular probe capable of detecting PDGFRa (platelet-derived growth factor receptor) .
한편, 최근에는 암세포 적중기로 알려진 고리형 아르기닌-글리신-아스파테이트(cyclic arginine-glycine-aspartate, cRGD) 펩티드, 엽산(folic acid), 또는 비오틴(biotin)을 감지계에 도입함으로써 암세포에 보다 많은 감지계를 적중(的中)하는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 본 발명에서도 이러한 암세포 적중기를 KP1 화합물에 도입하여 효율적인 "암세포 적중(cancer cell targeting)" 형광 키나아제 프로브를 제조함으로써, 타이로신 인산화 효소를 보다 효율적으로 감지하는 진보된 감지계를 개발하고자 하였다.Recently, the introduction of cyclic arginine-glycine-aspartate (cRGD) peptide, folic acid, or biotin, which is known as a cancer cell- In the present invention, by introducing such a cancer cell-targeting group into a KP1 compound to produce an efficient "cancer cell targeting" fluorescent kinase probe, the tyrosine kinase is more efficiently To develop an advanced sensing system.
또한, 나노입자(nanoparticles) 또는 고체 지지체(solid-supported materials)를 기반으로 한 감지 플랫폼은 높은 민감도, 안정도 및 표면 개질을 할 수 있다는 측면에서 큰 이점을 지닌다. 나노입자의 표면에 형광 분자 프로브를 기능화 시킨 "나노입자 기반 형광 프로브"는 단분자(單分子, single molecule) 프로브에 비해 응집된 형태를 가지므로 보다 향상된 형광 신호 제공 및 생체 내 높은 안정성, 그리고 증가된 투과 및 잔류 효과(enhanced permeability and retention effect, EPR effect)에 의한 암세포 선택성 등을 나타낼 수 있기 때문에 이를 위한 연구 또한 중요하다. 마이크로 어레이 칩(microarray chip)과 같은 고체 지지체 표면에 형광 분자 프로브를 도입한 감지계의 개발 또한 향상된 형광 신호 및 감지의 편리성을 제공할 수 있다는 장점으로 지속적인 연구가 필요한 분야이다.In addition, sensing platforms based on nanoparticles or solid-supported materials have great advantages in terms of high sensitivity, stability and surface modification. Nanoparticle-based fluorescent probes functionalized with fluorescent molecule probes on the surface of nanoparticles are more agglomerated than single molecule probes, providing more improved fluorescence signals, higher stability in vivo, and increased And the cancer cell selectivity due to the enhanced permeability and retention effect (EPR effect). Development of a sensing system incorporating a fluorescent molecule probe on the surface of a solid support such as a microarray chip is also an area where continuous research is required because it can provide improved fluorescence signal and detection convenience.
따라서, 진보된 감지계의 개발은 암 진단 및 영상화 구현에 있어서 향상된 민감도와 선택성, 정확도, 편리성을 제공함으로써 반드시 수행되어야 할 중요한 연구 과제이다.Thus, the development of advanced sensing systems is an important research task that must be performed by providing enhanced sensitivity, selectivity, accuracy, and convenience in cancer diagnosis and imaging implementations.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하고자, 종래 개발된 KP1 화합물의 구조적 변화를 통해 보다 향상된 특성을 가진 형광 프로브를 제공함과 동시에, 암세포 적중기를 도입함으로써 효율적인 암세포 적중이 가능한 형광 프로브를 제공하는 것을 그 목적으로 하며, 이에 더하여 나노입자 및 고체 지지체 기반의 감지 플랫폼을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.Accordingly, the present inventors have made efforts to provide a fluorescent probe having improved characteristics through structural change of a KP1 compound, which has been conventionally developed, and to provide a fluorescent probe capable of efficiently hitting cancer cells by introducing a cancer cell stacker It is an object of the present invention to provide a sensing platform based on nanoparticles and solid supports.
따라서, 본 발명은 향상된 민감도과 선택성, 정확도, 편리성을 가지는 화합물들을 고안, 이들을 이용하여 세포 및 조직의 영상화 방법과 살아있는 동물에서 암 진단이 가능한 방법을 제공하고자 한다. Accordingly, the present invention contemplates compounds with improved sensitivity, selectivity, accuracy, and convenience, and methods for imaging cells and tissues using them and methods for diagnosing cancer in living animals.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명은 하기 화학식 5의 화합물 또는 이의 유사체(analogues)를 포함하는, 타이로신 인산화 효소(tyrosine kinase) 감지용 형광 프로브 조성물을 제공한다.The present invention provides a fluorescent probe composition for the detection of tyrosine kinase, which comprises a compound of the following general formula (5) or analogues thereof.
[화학식 5][Chemical Formula 5]
(상기 화학식 5에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬, 아릴, 아세테이트, 또는 프로파질기를 나타내며; R3는 포르밀기 또는 아세탈기를 나타내며; R4는 수소, 아세틸, 메틸, 또는 메톡시메틸기를 나타내며; 단, R1 및 R2가 메틸기이면서 R3가 포르밀기이면서 R4가 수소인 경우를 제외한다)(Wherein R 1 and R 2 each independently represent hydrogen, C 1-10 alkyl, aryl, acetate, or a propargyl group, R 3 represents a formyl group or acetal group, R 4 represents hydrogen, acetyl , Methyl or methoxymethyl group with the proviso that when R 1 and R 2 are methyl groups and R 3 is formyl group and R 4 is hydrogen,
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유사체는 상기 화학식 5의 화합물에 고리형 아르기닌-글리신-아스파테이트 펩티드, 엽산 또는 비오틴 같은 세포 적중기가 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the analogue is characterized in that a chemical collider such as a cyclic arginine-glycine-aspartate peptide, folic acid or biotin is connected to the compound of Chemical Formula 5.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 유사체는 상기 화학식 5의 화합물에 실리카 나노입자(silica nanoparticles), 상자성 나노입자(paramagnetic nanoparticles), 또는 강자성 나노입자(ferromagnetic nanoparticles) 같은 고체 지지체에 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the analog is a compound of formula (5) linked to a solid support such as silica nanoparticles, paramagnetic nanoparticles, or ferromagnetic nanoparticles .
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 유사체는 상기 화학식 5의 화합물에 고체 지지체로서 마이크로어레이 칩(microarray chip)이 더 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the analogue is characterized in that a microarray chip is further connected to the compound of Chemical Formula 5 as a solid support.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2의 화합물인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the compound is a compound represented by the following general formula (2).
[화학식 2](2)
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 유사체는 하기 화학식 3의 화합물인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the analogue is a compound of the following formula (3).
[화학식 3](3)
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 유사체는 하기 화학식 4의 화합물인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the analogue is a compound of the following formula (4).
[화학식 4][Chemical Formula 4]
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 화합물 또는 유사체는 일광자 또는 이광자 흡수 형광체인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the compound or the analogue is a one-photon or two-photon absorption phosphor.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 타이로신 인산화효소는 PDGFRa, Src, ABL1(T315I), BRAF, RSK2 및 TYK2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the tyrosine kinase is selected from the group consisting of PDGFRa, Src, ABL1 (T315I), BRAF, RSK2 and TYK2.
또한, 본 발명은, 상기 형광 프로브 조성물을 이용한, 인간을 제외한 동물의 세포 또는 조직을 영상화(imaging)하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for imaging cells or tissues of an animal other than a human using the fluorescent probe composition.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 세포 또는 조직에서 과발현된 타이로신 인산화 효소와 상기 화합물이 결합하여 나타내는 형광을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the method comprises the step of measuring fluorescence represented by binding of the tyrosine phosphorylase enzyme overexpressed in cells or tissues.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 형광은 일광자 형광 현미경 또는 이광자 형광 현미경으로 측정하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the fluorescence is measured by a one-photon fluorescence microscope or a two-photon fluorescence microscope.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 세포 또는 조직은 암세포 또는 암조직인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the cells or tissues are cancer cells or cancer tissues.
또한, 본 발명은, 상기 형광 프로브 조성물을 이용한, 암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.The present invention also provides an information providing method for cancer diagnosis using the fluorescent probe composition.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 프로브 조성물을 샘플에 처리한 후 형광이 관찰될 경우 암으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the method comprises the step of treating the sample with the fluorescent probe composition and judging it as cancer when fluorescence is observed.
본 발명의 형광 프로브는 종래의 KP1 화합물에 비하여 인산화 효소를 감지함에 있어 향상된 민감도와 선택성을 나타내는 진보된 감지 특성을 가지기 때문에, 암조직의 선택적 영상화에 효과적으로 활용될 수 있다.The fluorescent probe of the present invention can be effectively used for selective imaging of cancer tissues because it has advanced detection characteristics showing enhanced sensitivity and selectivity in detecting phosphorylase as compared with the conventional KP1 compound.
또한, 나노입자에 고정화하여 집적화함으로써 칩 기반 분석법(chip-based assay)에 적용할 수 있으며, 이로부터 감지 소자(device)로서 응용하는데 필요한 물질을 제공할 수 있다. In addition, it can be applied to a chip-based assay by immobilizing and integrating the nanoparticles, thereby providing a material necessary for application as a sensing device.
또한, 이광자 여기 특성을 갖기 때문에 깊은 세포 투과성, 낮은 세포 파괴성, 생체내 자가형광 물질에 의한 간섭 영향을 적게 받을 뿐 아니라, 초점 부위만 여기 시키므로 매우 높은 해상도를 구현할 수 있다.In addition, since it has a two-photon excitation characteristic, it is less affected by deep cell permeability, low cell destruction, and interference by the in-vivo autofluorescent material, and excites only the focal region, thereby achieving a very high resolution.
도 1은 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)의 투과형 전자 현미경(transmission electron microscopy) 영상을 나타낸 것이다.
도 2는 화합물 4b, 4c, 4d, 4 및 4a의 제타 전위(zetapotential) 측정값을 나타낸 것이다.
도 3은 10 μM 농도의 화합물 1, 1a, 2, 2a, 3, 3a 및 1 mg/mL 농도의 화합물 4, 4a에 대한 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 1% DMSO 포함)에서의 흡수 스펙트럼(도 3a) 및 형광 방출 스펙트럼(도 3b)을 나타낸 것이다.
도 4는 1 mg/mL 농도의 화합물 4a의 유기 용매의 비율에 따른 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 10 μM 농도의 화합물 1, 1a, 2, 2a 및 1 mg/mL 농도의 화합물 4, 4a에 대한 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 20% MeCN 포함)에서의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 100 μM 농도의 화합물 1(KP1) 및 화합물 2(KP1Pr)의 인산화 효소와 반응 전 및 반응 1시간 후 측정한 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 7은 정상 세포(HEK-293A)와 암 세포(MCF-7, PC3, A549)에 10 μM 농도의 화합물 1, 2, 3 및 1 mg/mL 농도의 화합물 4를 처리한 후 측정한 일광자 광학 현미경 영상을 나타낸 것이다.
도 8은 정상 세포(PNT-2, HEK-293A)와 암 세포(MCF-7, PC3, A549)에 10 μM 농도의 화합물 1(KP1)과 화합물 2(KP1Pr)를 처리한 후 측정한 이광자 광학 현미경 영상 및 형광세기의 정량그래프를 나타낸 것이다.
도 9는 정상 세포(PNT-2, HEK-293A)와 암 세포(MCF-7, PC3, A549)에 10 μM 농도의 화합물 3(KP1Bi)을 처리한 후 측정한 이광자 광학 현미경 영상 및 형광세기의 정량그래프를 나타낸 것이다.
도 10은 정상 세포(PNT-2, HEK-293A)와 암 세포(MCF-7, PC3, A549)에 1 mg/mL 농도의 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)를 처리한 후 측정한 이광자 광학 현미경 영상 및 형광세기의 정량그래프를 나타낸 것이다.
도 11은 정상 세포(PNT-2, HEK-293A)와 암 세포(MCF-7, PC3, A549)에 10 μM 농도의 화합물 1, 2, 3 및 1 mg/mL 농도의 화합물 4를 처리한 후 측정한 이광자 광학 현미경 영상 및 형광세기의 정량그래프를 나타낸 것이다.
도 12는 정상조직(대조군)과 결장암 조직에 대하여 각각 10 μM 농도의 화합물 3(KP1Bi)을 처리한 후 관찰한 이광자 광학 현미경 영상을 나타낸 것이다.
도 13은 살아있는 쥐의 정상조직(대조군)과 암조직에 대하여 100 μM 농도의 화합물 1(KP1) 및 1 mg/mouse 농도의 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)를 처리한 후 관찰한 이광자 광학 현미경 영상(도 13a) 및 형광세기의 정량그래프(도 13b)를 나타낸 것이다.
도 14는 살아있는 쥐의 정상조직(대조군)과 암조직의 광간섭성 단층 촬영(optical coherence tomography, OCT) 영상 및 혈관 촬영 영상을 나타낸 것이다.
도 15는 꼬리 정맥 주사를 통해 100 μM 농도의 화합물 1(KP1) 및 5 mg/mouse 농도의 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)로 주입된 쥐의 뇌, 신장, 폐, 비장, 간, 암조직의 이광자 광학 현미경 영상을 나타낸 것이다.1 is a transmission electron microscopy image of Compound 4 (KP1 NP or nano-KP1).
Figure 2 shows zeta potential measurements of
Figure 3 shows the absorbance of
4 shows fluorescence emission spectra according to the ratio of organic solvent of
Figure 5 shows the fluorescence emission spectra of
6 shows fluorescence intensities measured before and after the reaction with the phosphorylated enzyme of Compound 1 (KP1) and Compound 2 (KP1 Pr ) at a concentration of 100 μM.
FIG. 7 is a graph showing the results of treatment of
FIG. 8 shows the results of treatment of compound 1 (KP1) and compound 2 (KP1 Pr ) at a concentration of 10 μM with normal cells (PNT-2, HEK-293A) and cancer cells (MCF-7, PC3, A549) Optical microscope image and fluorescence intensity.
FIG. 9 is a graph showing the results of two-photon microscope images and fluorescence intensity measured after treatment of 10 μM of Compound 3 (KP1 Bi ) with normal cells (PNT-2, HEK-293A) and cancer cells (MCF-7, PC3 and A549) As shown in Fig.
10 is a graph showing the results of treatment of compound 4 (KP1 NP or nano-KP1) at a concentration of 1 mg / mL with normal cells (PNT-2, HEK-293A) and cancer cells (MCF-7, PC3, A549) Optical microscope image and fluorescence intensity.
FIG. 11 shows the results of treatment of
FIG. 12 shows two-photon microscopic images observed after treatment with Compound 3 (KP1 Bi ) at a concentration of 10 μM for normal tissues (control group) and for colon cancer tissues, respectively.
FIG. 13 is a graph showing changes in the amount of Compound 1 (KP1) at a concentration of 100 μM and Compound 4 (KP1 NP or nano-KP1) at a concentration of 1 mg / mouse on normal tissues (control group) (FIG. 13A) and a quantitative graph of fluorescence intensity (FIG. 13B).
14 shows optical coherence tomography (OCT) images and angiographic images of normal tissues (controls) and cancer tissues of living mice.
FIG. 15 is a graph showing the effect of compound 1 (KP1) at a concentration of 100 μM and compound 4 (KP1 NP or nano-KP1) at a concentration of 5 mg / mouse through tail vein injection in the brain, kidney, lung, spleen, 2 shows an image of a two-photon optical microscope of the tissue.
본 발명은 하기 화학식 5의 화합물 또는 이의 유사체(analogues)를 포함하는, 타이로신 인산화 효소(tyrosine kinase) 감지용 형광 프로브 조성물을 제공한다.The present invention provides a fluorescent probe composition for the detection of tyrosine kinase, which comprises a compound of the following general formula (5) or analogues thereof.
[화학식 5][Chemical Formula 5]
(상기 화학식 5에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬, 아릴, 아세테이트, 또는 프로파질기를 나타내며; R3는 포르밀기 또는 아세탈기를 나타내며; R4는 수소, 아세틸, 메틸, 또는 메톡시메틸기를 나타내며; 단, R1 및 R2가 메틸기이면서 R3가 포르밀기이면서 R4가 수소인 경우를 제외한다).(Wherein R 1 and R 2 each independently represent hydrogen, C 1-10 alkyl, aryl, acetate, or a propargyl group, R 3 represents a formyl group or acetal group, R 4 represents hydrogen, acetyl Methyl, or methoxymethyl group, with the exception that R 1 and R 2 are methyl groups and R 3 is formyl group and R 4 is hydrogen.
본 발명의 상기 화합물 또는 유사체는 오쏘(ortho)-히드록시(hydroxy)-벤즈알데하이드(benzaldehyde) 구조를 포함할 수 있으며, 타이로신 인산화효소와 결합하여 오쏘-히드록시-벤즈알데하이드의 분자 내 수소결합(intra-molecular hydrogen-bonding)이 깨어질 때 형광을 나타낼 수 있다.The compound or analog of the present invention may comprise an ortho-hydroxy-benzaldehyde structure and may be coupled to a tyrosine kinase to form an intramolecular hydrogen bond of ortho-hydroxy-benzaldehyde intra-molecular hydrogen-bonding can break fluorescence.
또한, 상기 유사체는 하기 화학식 6과 같이, 상기 화합물의 R1 또는 R2에 아미드 결합 또는 click chemistry 등을 통하여 암세포 적중기(예: 고리형 아르기닌-글리신-아스파테이트 펩티드, 엽산 또는 비오틴)가 연결될 수 있다. In addition, the analogue may be linked to R 1 or R 2 of the compound by an amide bond or a click chemistry, such as a cyclic arginine-glycine-aspartate peptide, folic acid or biotin, .
[화학식 6][Chemical Formula 6]
이로써 암세포 특이적인 표적화를 달성할 수 있다. 이때, 상기 적중기는 본 특허에서 구체적으로 예를 든 것 외에 보편적이고 적절한 링커(linker)를 통하여 제한 없이 연결될 수 있다.Thus, cancer cell-specific targeting can be achieved. At this time, the hitting machine can be connected without limitation through a universal and suitable linker other than the concrete examples in the present patent.
또한, 상기 유사체는 하기 화학식 7과 같이, 상기 화합물의 R1 또는 R2에 아미드 결합 또는 click chemistry를 통하여 실리카 나노입자, 상자성 나노입자, 강자성 나노입자와 같은 나노입자, 마이크로어레이칩과 같은 고체 지지체가 더 연결될 수 있다. In addition, the analogue may be amide bonded to R 1 or R 2 of the compound or may be chemically bonded to a solid support such as a silica nanoparticle, a paramagnetic nanoparticle, a ferromagnetic nanoparticle, Can be further connected.
[화학식 7](7)
이로써 더 높은 민감도, 안정도 및 표면 개질을 제공할 수 있다. 즉, 이러한 나노입자 또는 고체지지체 기반 형광 프로브는 단분자 프로브에 비해 보다 향상된 형광 신호 제공 및 생체 내 높은 안정성, 그리고 증가된 투과 및 잔류 효과(EPR effect)에 의한 암세포 선택성 등을 나타낼 수 있다. 이때, 상기 나노입자 또는 고체지지체는 적절한 링커(linker)를 통하여 제한 없이 연결될 수 있다.Thereby providing higher sensitivity, stability and surface modification. That is, such nanoparticle or solid support-based fluorescent probes can exhibit more improved fluorescence signal and higher stability in vivo than monomolecular probes, and cancer cell selectivity due to increased permeation and residual effect (EPR effect). At this time, the nanoparticles or the solid support may be connected without limitation through an appropriate linker.
본 발명의 상기 화학식 5의 화합물은 이광자 흡수 형광체로서 특별한 제한은 없으나, 하기 화학식 2의 화합물인 것이 바람직하다.The compound of the formula (5) of the present invention is not particularly limited as a two-photon absorbing phosphor, but it is preferably a compound of the following formula (2).
[화학식 2](2)
또한, 본 발명의 상기 화학식 5의 화합물의 유사체(analogues)는 일광자 또는 이광자 흡수 형광체로서, 상기 화학식 5의 화합물 또는 이것의 보호된 형태로부터 보편적인 지식에 의해서 합성될 수 있는 모든 유도체들을 포함하나, 하기 화학식 3 또는 4의 화합물인 것이 바람직하다.The analogues of the compounds of formula (5) of the present invention include single-photon or two-photon absorption phosphors, including all derivatives which can be synthesized by common knowledge from the compound of formula (5) or a protected form thereof , Or a compound represented by the following general formula (3) or (4).
[화학식 3](3)
[화학식 4][Chemical Formula 4]
이때, 상기 화학식 3의 화합물은, 화학식 5의 화합물에 테트라에틸렌글리콜로부터 유도된 링커(linker)를 통하여 말단에 비오틴이 연결되어 있는 구조이다.In this case, the compound of formula (3) has a structure in which biotin is linked to the end of the compound of formula (5) via a linker derived from tetraethylene glycol.
또한, 상기 화학식 4의 화합물은, 화학식 5의 화합물에 테트라에틸렌글리콜로부터 유도된 링커(linker)를 통하여 말단에 실리카 나노입자가 연결되어 있는 구조이다.The compound of formula (4) has a structure in which silica nanoparticles are connected to the compound of formula (5) through a linker derived from tetraethylene glycol.
본 발명에 있어서, 상기 타이로신 인산화효소는 특별한 제한이 없으며, PDGFRa, Src, ABL1(T315I), BRAF, RSK2 및 TYK2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, PDGFRa, Src 또는 ABL1(T315I)인 것이 바람직하고, PDGFRa인 것이 가장 바람직하다.In the present invention, the tyrosine phosphorylase may be selected from the group consisting of PDGFRa, Src, ABL1 (T315I), BRAF, RSK2 and TYK2 without particular limitation, but preferably PDGFRa, Src or ABL1 (T315I) , And most preferably PDGFRa.
또한, 본 발명은 상기 형광 프로브 조성물을 이용하여 세포 및 조직의 영상화 방법을 제공한다. 즉, 세포 또는 조직에서 과발현된 타이로신 인산화 효소와 본 발명의 화합물이 결합하면 형광을 증가시키기 때문에, 일광자 또는 이광자 광학 현미경을 통하여 형광정도를 측정함으로써, 인산화 효소의 존재 및 활성 여부를 확인할 수 있다. In addition, the present invention provides a method for imaging cells and tissues using the fluorescent probe composition. That is, binding of the tyrosine phosphorylase overexpressed in a cell or a tissue to the compound of the present invention increases fluorescence, so that the presence or absence of the phosphorylase can be confirmed by measuring the degree of fluorescence through a one-photon or two-photon optical microscope .
본 발명에서 개발된 화합물에 의하면 자체로는 형광을 내지 않지만, 특정 타이로신 인산화 효소와 결합을 할 때는 분자 내 수소결합이 깨어지고 인근 효소의 작용기와 분자 간 수소결합을 하여 발광을 하는 특이한 발광 특성을 나타내게 된다. 이러한 특성은 전자주게-전자받게 구조의 형광단의 특성에 분자 내 수소결합을 도입함으로써 구현될 수 있었다. The compounds developed in the present invention do not fluoresce themselves, but when bound to specific tyrosine phosphorylases, the intramolecular hydrogen bonds are broken and the specific luminescent properties of luminescence by intermolecular hydrogen bonding with the functional groups of nearby enzymes . This property could be realized by introducing intramolecular hydrogen bonding to the properties of the fluorescent end of the electron donor-acceptor structure.
따라서, 본 발명은 상기 형광 프로브 조성물을 이용하여 암을 진단하는 방법을 제공한다. 즉, 암세포 또는 암조직은 타이로신 인산화 효소가 과발현되어 있기 때문에, 형광 영상화를 통하여 암 진단에 유용하게 이용될 수 있다. 특히 본 발명은 살아있는 동물을 대상으로 형광 프로브 조성물을 이용하여 세포 및 조직을 영상화함으로서, 암 진단이 가능한 특징을 가지는 것이다. Accordingly, the present invention provides a method for diagnosing cancer using the fluorescent probe composition. That is, since cancer cells or cancer tissues are overexpressed with tyrosine phosphorylase, they can be usefully used for cancer diagnosis through fluorescence imaging. In particular, the present invention is characterized in that living organisms can be diagnosed as cancer by imaging cells and tissues using a fluorescent probe composition.
본 발명에서 형광 프로브 조성물 내의 유효성분으로서 상기 형광 프로브의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태 등에 의하여 적절하게 조정할 수 있으며, 1 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 5 내지 10 mg/kg, 가장 바람직하게는 10 mg/kg일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the content of the fluorescent probe as an active ingredient in the fluorescent probe composition can be appropriately adjusted depending on the mode and purpose of use, the patient's condition and the like, and is in the range of 1 to 20 mg / kg, preferably 5 to 10 mg / 0.0 > mg / kg, < / RTI >
또한, 상기 조성물은 인간, 마우스, 랫트, 돼지, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 또는 염소 등을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼 등의 경구형 제형, 경피제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.In addition, the composition can be administered to mammals including humans, mice, rats, pigs, rabbits, guinea pigs, hamsters, dogs, cats, cattle or chlorine in various routes. The mode of administration may be any manner conventionally used and may be administered, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine, or intracerebroventricular injection. The composition of the present invention can be formulated into parenteral formulations in the form of powders, tablets, capsules, suspensions, emulsions and the like, transdermal preparations, suppositories, and sterilized injection solutions according to a conventional method.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예 1 :Example 1:
7-(벤질(메틸)아미노)나프탈렌-2-올(7-benzyl(methyl)amino)naphthalen-2-ol); 화합물 2c의 합성7- (benzyl (methyl) amino) naphthalen-2-ol (7-benzyl (methyl) amino) naphthalen-2-ol); Synthesis of Compound 2c
화합물 2c의 합성 경로는 하기 반응식 1에 나타내었다.The synthesis route of Compound 2c is shown in
[반응식 1][Reaction Scheme 1]
구체적으로, 출발 물질인 2b 화합물(3.0 g, 18.7 mmol, Sigma-aldrich, D116408)과 소디움 메타바이설파이트(Na2S2O5, 7.11 g, 37.4 mmol)가 들어있는 밀폐용기(sealed-tube)에 물(H2O, 15.0 mL)과 N-메틸벤질아민(N-methylbenzylamine, 4.82 mL, 37.5 mmol)을 첨가하고 용기를 막았다. 이 혼합물을 실리콘 오일 용기를 이용하여 140 ℃에서 6 시간 교반시켰다. 다음에 상온(25 ℃)으로 반응물의 온도를 낮춘 후 용기를 열어 다이클로로메탄(dichloromethane, 100 mL), 물(100 mL), 포화 소금물(30 mL)을 넣고 분별 깔때기를 이용하여 유기층을 추출하고, 유기층을 무수황산나트륨(Na2SO4, 5 g)으로 건조하였다. 40 mbar 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 이용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatograph, 직경 6 cm, 높이 15 cm)로 정제하여(전개액은 20% EtOAc/Hexane) 흰색의 고체 화합물 2c(2.61 g, 53%)를 얻었다.Specifically, a sealed-tube ( 2 g) containing the starting material, 2b compound (3.0 g, 18.7 mmol, Sigma-aldrich, D116408) and sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 5 , 7.11 g, ) Was added water (H 2 O, 15.0 mL) and N-methylbenzylamine (4.82 mL, 37.5 mmol) and the vessel was closed. This mixture was stirred at 140 占 폚 for 6 hours using a silicone oil container. Next, the temperature of the reaction mixture was lowered to room temperature (25 ° C.), and the vessel was opened. Dichloromethane (100 mL), water (100 mL) and saturated brine (30 mL) were added to the reaction mixture. , And the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate (Na 2 SO 4 , 5 g). The solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar and then purified by column chromatography (column chromatography,
실시예 2 :Example 2:
N-N- 벤질benzyl -7-(-7- ( 메톡시메톡시Methoxymethoxy )-N-메틸나프탈렌-2-) -N-methylnaphthalene-2- 아민Amine (N-benzyl-7-((N-benzyl-7- ( methoxymethoxy메 옥 로 옥시소 )-N-methylnaphthalen-2-amine); 화합물 2d의 합성) -N-methylnaphthalen-2-amine); Synthesis of Compound 2d
화합물 2d의 합성 경로는 하기 반응식 2에 나타내었다.The synthesis route of Compound 2d is shown in the following
[반응식 2][Reaction Scheme 2]
구체적으로, N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide, 16.5 mL) 용매에 수소화나트륨(NaH, sodium hydride, 261 mg, 10.90 mmol)를 넣고 아르곤(argon) 풍선을 꽂아 준 후, 포화 소금물과 얼음을 이용하여 -15℃로 온도를 낮추어 주었다. 이 혼합 용액에 상기 실시예 1을 통해 얻어진 화합물 2c(2.61 g, 9.39 mmol)를 DMF (16.5 mL)에 녹인 후, 온도를 유지한 상태에서 약 5분간 천천히 넣어주었다. 이 과정에서 발생하는 수소 기체는 실리콘 오일 트랩 (silicon oil trap)을 거친 후 옥외로 배출시켰다. 동일한 온도에서 1시간 교반시킨 후, 트랩에서 수소 기체가 더 이상 발생하지 않는 것을 확인하였다. 이어서, 클로로메틸 메틸 에테르 (chloromethyl methyl ether, 0.75 mL, 9.91 mmol)를 약 5분간 천천히 넣어주었다. 주입이 완료되면, 온도를 상온(25 ℃)으로 바꾸어주고, 6시간을 교반시켰다. 6시간 후, 에틸아세테이트(EtOAc, 200 mL), 물(100 mL), 포화 소금물(30 mL)을 넣고 분별 깔때기를 이용하여 유기층을 추출하고, 유기층을 무수황산나트륨(Na2SO4, 5 g)으로 건조하였다. 40 mbar 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 이용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatograph, 직경 6 cm, 높이 15 cm)로 정제하여(전개액은 5% EtOAc/Hexane) 흰색의 고체 화합물 2d(2.43 g, 80%)를 얻었다.Specifically, sodium hydride (261 mg, 10.90 mmol) was added to N, N-dimethylformamide (16.5 mL) and argon balloon was inserted. And ice was used to lower the temperature to -15 ° C. The compound 2c (2.61 g, 9.39 mmol) obtained in Example 1 was dissolved in DMF (16.5 mL), and the mixture was slowly added for about 5 minutes while maintaining the temperature. The hydrogen gas generated during this process was discharged through the silicon oil trap. After stirring at the same temperature for 1 hour, it was confirmed that hydrogen gas was no longer generated in the trap. Then, chloromethyl methyl ether (0.75 mL, 9.91 mmol) was slowly added for about 5 minutes. When the injection was completed, the temperature was changed to room temperature (25 DEG C) and stirred for 6 hours. After 6 hours, the organic layer was extracted with ethyl acetate (EtOAc, 200 mL), water (100 mL) and saturated brine (30 mL) using a separatory funnel. The organic layer was washed with anhydrous sodium sulfate (Na 2 SO 4 , Lt; / RTI > The solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar and then purified by column chromatography (column chromatography,
실시예 3 :Example 3:
6-(6- ( 벤질(메틸)아미노Benzyl (methyl) amino )-3-() -3- ( 메톡시메톡시Methoxymethoxy )-2-)-2- 나프탈알데히드Naphthalaldehyde (6-((6- ( benzyl(methyl)aminobenzyl (methyl) amino )-3-(methoxymethoxy)-2-naphthaldehyde); 화합물 2e의 합성) -3- (methoxymethoxy) -2-naphthaldehyde); Synthesis of Compound 2e
화합물 2e의 합성 경로는 하기 반응식 3에 나타내었다.The synthesis route of Compound 2e is shown in the following
[반응식 3][Reaction Scheme 3]
구체적으로, 100 mL 둥근 바닥 플라스크 (round-bottom flask)에 상기 실시예 2를 통해 얻어진 화합물 2d(1.49 g, 4.85 mmol)을 넣은 후, 아르곤 풍선을 꽂아주었다. 이어서 디에틸 에테르(Et2O, 24 mL)을 넣어주고, 포화된 소금물과 얼음을 이용하여 온도를 -20℃로 낮추었다. 3차 부틸리튬(tert-BuLi, 4.28 mL, 7.28 mmol)을 약 30분에 걸쳐 천천히 넣어주었다. 이때 색깔은 서서히 짙은 갈색으로 바뀌며, 주입이 완료되면 같은 온도에서 2시간을 교반시켰다. 2시간 교반 후, N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide, DMF, 0.64 mL, 8.25 mmol)를 약 5분에 걸쳐 서서히 한 방울씩 넣어주었다. 주입이 완료되면 동일한 온도에서 1시간을 교반하며, 이때 색깔은 점차 밝은 노란색으로 변했다. 1시간 교반 후, 차가운 1차 증류수(10 mL)를 넣어주고 10분간 교반했다. 10분 후, 에틸아세테이트(EtOAc, 200 mL), 물(100 mL), 포화 소금물(30 mL)을 넣고 분별 깔때기를 이용하여 유기층을 추출하고, 유기층을 무수황산나트륨(Na2SO4, 5 g)으로 건조하였다. 40 mbar 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 이용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatograph, 직경 6 cm, 높이 15 cm)로 정제하여(전개액은 5% EtOAc/Hexane) 노란색의 고체 화합물 2e(1.22 g, 75%)를 얻었다.Specifically, compound 2d (1.49 g, 4.85 mmol) obtained in Example 2 was placed in a 100 mL round-bottom flask, and an argon balloon was inserted thereinto. Diethyl ether (Et 2 O, 24 mL) was then added and the temperature was lowered to -20 ° C using saturated brine and ice. Tert-butyllithium (tert-BuLi, 4.28 mL, 7.28 mmol) was slowly added over about 30 minutes. At this time, the color gradually changed to dark brown. When the injection was completed, the mixture was stirred at the same temperature for 2 hours. After stirring for 2 hours, N, N-dimethylformamide (DMF, 0.64 mL, 8.25 mmol) was slowly added dropwise over about 5 minutes. Upon completion of the injection, the mixture was stirred at the same temperature for 1 hour, at which time the color gradually turned bright yellow. After stirring for 1 hour, cold primary distilled water (10 mL) was added and stirred for 10 minutes. After 10 minutes, the organic layer was extracted with ethyl acetate (EtOAc, 200 mL), water (100 mL) and saturated brine (30 mL) using a separatory funnel. The organic layer was washed with anhydrous sodium sulfate (Na 2 SO 4 , Lt; / RTI > The solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar and then purified by column chromatography (column chromatography,
실시예 4: 화합물 2g의 합성Example 4: Synthesis of Compound 2g
화합물 2g의 합성 경로는 하기 반응식 4에 나타내었다.The synthesis route of the compound 2g is shown in
[반응식 4][Reaction Scheme 4]
<4-1> N-≪ 4-1 > N- 벤질benzyl -6-(1,3-디옥산-2-일)-7-(-6- (1, 3-dioxan-2-yl) -7- ( 메톡시메톡시Methoxymethoxy )-N-메틸나프탈렌-2-) -N-methylnaphthalene-2- 아민Amine (N-benzyl-6-(1,3-dioxan-2-yl)-7-(methoxymethoxy)-N-methylnaphth미두-2-amine; 화합물 2f의 합성2-yl) -7- (methoxymethoxy) -N-methylnaphthmido-2-amine; Synthesis of Compound 2f
상기 실시예 3을 통해 얻어진 화합물 2e (100 mg, 0.30 mmol), 트리에틸 오쏘포메이트(triethyl orthoformate, 55 μL, 0.33 mmol)와 1,3-프로판 디올(1,3-propane diol, 86 μL, 1.2 mmol)을 0℃에서 디클로로메탄(1.5 mL)에 녹인 후, 테트라부틸암모늄 트리브롬화물(tetrabutylammonium tribromide, 7.23 mg, 0.015 mmol)을 넣어주었다. 이 혼합물을 상온에서 1.5시간 교반한 후, 에틸 아세테이트(2 x 10 mL)로 추출하였다. 유기층을 물(10 mL), 포화 소금물(10 mL)로 씻고 무수황산나트륨으로 건조하였다. 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거한 후, 별도의 정제과정 없이 다음 단계를 진행하였다.(100 mg, 0.30 mmol), triethyl orthoformate (55 μL, 0.33 mmol) obtained in Example 3, 1,3-propanediol (86 μL, 1.2 mmol) was dissolved in dichloromethane (1.5 mL) at 0 ° C, and then tetrabutylammonium tribromide (7.23 mg, 0.015 mmol) was added thereto. The mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours and then extracted with ethyl acetate (2 x 10 mL). The organic layer was washed with water (10 mL), saturated brine (10 mL), and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar, and the next step was carried out without further purification.
<4-2> 6-(1,3-디옥산-2-일)-7-(≪ 4-2 > Synthesis of 6- (1,3-dioxan-2-yl) 메톡시메톡시Methoxymethoxy )-N-메틸나프탈렌-2-) -N-methylnaphthalene-2- 아민Amine (6-(1,3-(6- (1,3- dioxandioxan -2--2- ylyl )-7-(mehtoxymethoxy)-N-methylnaphthalen-2-amine); 화합물 2g의 합성) -7- (mehtoxymethoxy) -N-methylnaphthalen-2-amine); Synthesis of Compound 2g
50 mL 둥근 바닥 플라스크에 상기 실시예 4-1을 통해 얻어진 화합물 2f(95 mg, 0.24 mmol)과 팔라듐 히드록시드(palladium hydroxide on carbon, 20 wt%, Degussa type, 9.5 mg)를 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran, THF, 6 mL)에 녹인 후, 수소 풍선을 꽂아 상온에서 3시간 교반하였다. 수소를 제거한 후, 혼합물을 셀라이트(celite)로 여과하였다. 여과액을 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 이용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatograph, 직경 1 cm, 높이 12 cm)로 정제하여(전개액은 5% EtOAc/Hexane) 투명한 액체 화합물 2g(58.5 mg, 80%)를 얻었다.Compound 2f (95 mg, 0.24 mmol) obtained in Example 4-1 and palladium hydroxide on carbon (20 wt%, Degussa type, 9.5 mg) were added to a 50 mL round bottom flask in tetrahydrofuran tetrahydrofuran, THF, 6 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After removing the hydrogen, the mixture was filtered through celite. The solvent was distilled off under reduced pressure of 40 mbar and the residue was purified by column chromatography (column chromatography, 1 cm in diameter, 12 cm in height) using silica gel (Merck-
실시예 5 : 화합물 2a의 합성Example 5: Synthesis of
화합물 2a의 합성 경로는 하기 반응식 5에 나타내었다.The synthesis route of
[반응식 5][Reaction Scheme 5]
<5-1> 6-(1,3-디옥산-2-일)-7-(<5-1> 6- (1,3-dioxan-2-yl) -7- ( 메톡시메톡시Methoxymethoxy )-N-) -N- 메틸methyl -N-(-N- ( 프로프Professional -2-인-1-일)나프탈렌-2-2-yn-1-yl) naphthalene-2- 아민Amine (6-(1,3-dioxan-2-yl)-7-(methoxymethoxy)-N-methyl-N-(prop-2-yn-1-yl)naphthalen-2-amine); 화합물 2h의 합성(6- (1,3-dioxan-2-yl) -7- (methoxymethoxy) -N-methyl-N- (prop-2-yn-1-yl) naphthalen-2-amine; Synthesis of Compound 2h
상기 실시예 4를 통해 얻어진 화합물 2g(836 mg, 2.75 mmol)와 무수탄산 칼륨(potassium carbonate, K2CO3) (1.9 g, 13.78 mmol)을 상온에서 아세토니트릴(acetonitrile, MeCN, 30 mL)에 녹인 후, 80% 프로파질 브로마이드(propargyl bromide, 1.0 mL, 8.27 mmol)를 넣어주었다. 이 혼합물을 40℃에서 환류교반 후, 상온으로 식히고 에틸 아세테이트(2 x 50 mL)로 추출하였다. 유기층을 물(20 mL), 포화 소금물(20 mL)로 씻고 무수황산나트륨으로 건조하였다. 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거한 후, 별도의 정제과정 없이 다음 단계를 진행하였다.2 g of the compound obtained in Example 4 (836 mg, 2.75 mmol) and potassium carbonate (K 2 CO 3 ) (1.9 g, 13.78 mmol) were added to acetonitrile (MeCN, 30 mL) After dissolving, 80% propargyl bromide (1.0 mL, 8.27 mmol) was added. The mixture was refluxed at 40 DEG C, cooled to room temperature, and extracted with ethyl acetate (2 x 50 mL). The organic layer was washed with water (20 mL), saturated brine (20 mL), and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar, and the next step was carried out without further purification.
<5-2> 3-(≪ 5-2 > 3- (
메톡시메톡시Methoxymethoxy
)-6-() -6- (
메틸(프로프-2-인-1-일)아미노Methyl (prop-2-yn-1-yl) amino
)-2-)-2-
나프탈알데히드Naphthalaldehyde
(3-((3- (
methoxymethoxy메 옥 로 옥시소
)-6-(methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)-2-naphthaldehyde); 화합물 2a의 합성) -6- (methyl (prop-2-yn-1-yl) amino) -2-naphthaldehyde; Synthesis of
상기 실시예 5-1을 통해 얻어진 화합물 2h(12.4 mg,. 0.036 mmol)와 5M 염산(HCl, 0.24 mL)을 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol, IPA, 0.5 mL)과 THF(0.2 mL)가 2.5:1로 섞여있는 혼합 용매에 녹인 후, 상온에서 10분 교반하였다. 혼합물을 포화 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, NaHCO3)로 중화시킨 후, 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거하였다. 이 혼합물을 다시 에틸 아세테이트(2 x 10 mL)로 추출하고, 유기층을 물(10 mL), 포화 소금물(10 mL)로 씻고 무수황산나트륨으로 건조하였다. 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거하였고, 별도의 정제과정 없이 노란색 고체 화합물 10 mg을 얻었다.Compound 2h (12.4 mg, 0.036 mmol) obtained in Example 5-1 and 5M hydrochloric acid (HCl, 0.24 mL) were dissolved in a mixture of isopropyl alcohol (IPA, 0.5 mL) and THF (0.2 mL) 1, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. The mixture was neutralized with saturated sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) and the solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar. The mixture was extracted again with ethyl acetate (2 x 10 mL), and the organic layer was washed with water (10 mL), saturated brine (10 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar and 10 mg of yellow solid compound was obtained without further purification.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K, δ): 10.49(s, 1H), 8.25(s, 1H), 7.77(d, 1H), 7.27(s, 1H), 7.11(dd, 1H), 6.91(d, 1H), 5.38(s, 2H), 4.18(d, 2H), 3.56(d, 3H), 3.15(d, 3H), 2.23(t, 1H). 1 H NMR (CDCl 3 , 300 MHz, 293K,?): 10.49 (s, IH), 8.25 (s, IH), 7.77 2H), 3.58 (d, 3H), 3.15 (d, 3H), 2.23 (t, 1H).
실시예 6 : 화합물 2(KP1Example 6: Compound 2 (KP1 PrPr )의 합성) Synthesis of
화합물 2(KP1Pr)의 합성 경로는 하기 반응식 6에 나타내었다.The synthesis route of Compound 2 (KP1 Pr ) is shown in the following
[반응식 6][Reaction Scheme 6]
<6-1> 6-(1,3-디옥산-2-일)-7-(≪ 6-1 > Synthesis of 6- (1,3-dioxan-2-yl) 메톡시메톡시Methoxymethoxy )-N-) -N- 메틸methyl -N-(-N- ( 프로프Professional -2-인-1-일)나프탈렌-2-2-yn-1-yl) naphthalene-2- 아민Amine (6-(1,3-dioxan-2-yl)-7-(methoxymethoxy)-N-methyl-N-(prop-2-yn-1-yl)naphthalen-2-amine); 화합물 2h의 합성(6- (1,3-dioxan-2-yl) -7- (methoxymethoxy) -N-methyl-N- (prop-2-yn-1-yl) naphthalen-2-amine; Synthesis of Compound 2h
우선, 상기 실시예 5-1과 동일한 과정으로 화합물 2h를 얻었다.First, Compound 2h was obtained in the same manner as in Example 5-1.
<6-2> 3-(히드록시)-6-(<6-2> Synthesis of 3- (hydroxy) -6- ( 메틸(프로프-2-인-1-일)아미노Methyl (prop-2-yn-1-yl) amino )-2-)-2- 나프탈알데히드Naphthalaldehyde (3-((3- ( hydroxyhydroxy )-6-(methyl(prop-2-yn-1-yl)amino)-2-naphthaldehyde), 화합물 2의 합성) -6- (methyl (prop-2-yn-1-yl) amino) -2-naphthaldehyde,
상기 실시예 6-1을 통해 얻어진 화합물 2h(52.4 mg,. 0.018 mmol)와 5M 염산(HCl, 1.20 mL)을 상온에서 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol, IPA, 2.5 mL)과 THF(1.0 mL)가 2.5:1로 섞여있는 혼합 용매에 녹인 후, 40℃에서 3시간 교반하였다. 혼합물을 포화 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, NaHCO3로 중화시킨 후, 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거하였다. 이 혼합물을 다시 에틸 아세테이트(2 x 10 mL)로 추출하고, 유기층을 물(10 mL), 포화 소금물(10 mL)로 씻고 무수황산나트륨으로 건조하였다. 40 mbar의 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 이용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatograph, 직경 1 cm, 높이 12 cm)로 정제하여(전개액은 5% EtOAc/Hexane) 노란색 고체 화합물 2(40.0 mg, 90%)를 얻었다.Isopropyl alcohol (IPA, 2.5 mL) and THF (1.0 mL) were added at room temperature to a solution of compound 2h (52.4 mg, 0.018 mmol) obtained in Example 6-1 and 5M hydrochloric acid 2.5: 1, and the mixture was stirred at 40 ° C for 3 hours. The mixture was neutralized with sodium bicarbonate (NaHCO 3) and the solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar. The mixture was extracted again with ethyl acetate (2 x 10 mL) and the organic layer was washed with water The solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar and the residue was purified by column chromatography using silica gel (Merck-
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K, δ): 10.51(s, 1H), 9.95(s, 1H), 7.96(s, 1H), 7.76(d, 1H), 7.09(dd, 1H), 7.06(s, 1H), 6.84(d, 1H), 4.22(d, 2H), 3.17(s, 3H), 2.27(t, 1H). 13C NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K, δ): 195.57, 156.83, 150.08, 140.36, 137.62, 130.89, 121.42, 119.67, 114.91, 109.44, 105.46, 78.68, 72.47, 42.09, 38.50. HRMS: m/z calcd for C15H13NO2, 239.27; found, 239.0945. 1 H NMR (CDCl 3, 300 MHz, 293K, δ): 10.51 (s, 1H), 9.95 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.09 (dd, 1H), 7.06 (s, IH), 6.84 (d, IH), 4.22 (d, 2H), 3.17 (s, 3H), 2.27 (t, IH). 13 C NMR (CDCl 3 , 300 MHz, 293K,?): 195.57, 156.83, 150.08, 140.36, 137.62, 130.89, 121.42, 119.67, 114.91, 109.44, 105.46, 78.68, 72.47, 42.09, 38.50. HRMS: m / z calcd for C 15
실시예 7 : 화합물 3a의 합성Example 7: Synthesis of
화합물 3a의 합성 경로는 하기 반응식 7에 나타내었다.The synthesis route of
[반응식 7][Reaction Scheme 7]
구체적으로, 테트라에틸렌 글리콜(tetraethylene glycol)로부터 유도된 아민-아지드 말단을 각각 포함하는 연결기(linker)와 비오틴이 아미드 결합을 통해 연결된 화합물 3c(21.3 mg, 0.0480 mmol)와 상기 실시예 5를 통해 얻어진 화합물 2a(13.6 mg, 0.0480 mmol)를 상온에서 증류수(1.5 mL)와 THF(1.5 mL)가 1:1로 섞여있는 혼합 용매에 녹인 후, 초산구리 1수화물(copper acetate monohydrate, 1.9 mg, 9.6 μmol)과 아스코르브산 나트륨(sodium ascorbate, 3.8 mg, 19.2 μmol)을 첨가하여 빛을 차단한 상태로 3시간 교반하였다. Specifically, a compound 3c (21.3 mg, 0.0480 mmol) in which biotin is linked via an amide bond to a linker containing an amine-azide terminal derived from tetraethylene glycol, respectively, and Example 5 The resulting
3시간 교반 후, 에틸아세테이트(EtOAc, 10 mL), 물(10 mL), 포화 소금물(10 mL)을 넣고 분별 깔때기를 이용하여 유기층을 추출하고, 유기층을 무수황산나트륨(Na2SO4, 500 mg)으로 건조하였다. 40 mbar 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 이용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatograph, 직경 1 cm, 높이 8 cm)로 정제하여(전개액은 5% MeOH/CH2Cl2) 노란색의 고체 화합물 3a(5 mg)를 얻었다.After stirring for 3 hours, ethyl acetate (EtOAc, 10 mL), water (10 mL), saturated brine (10 mL) and the mixture extracted and the organic layer using a separating funnel, and anhydrous sodium sulfate (Na 2 SO 4, 500 mg and the organic layer ). The solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar and then purified by column chromatography (column chromatography, 1 cm in diameter and 8 cm in height) using silica gel (Merck-
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K, δ): 10.46(s, 1H), 8.22(s, 1H), 7.73(dd, 1H), 7.48(s, 1H), 7.21(s, 1H), 7.12(dd, 1H) 7.09(d, 1H), 6.82(m, 1H), 5.94(s, 1H), 5.37(s, 2H), 5.03(s, 1H), 4.78(s, 2H), 4.49(m, 3H), 3.83(m, 2H), 3.55(s, 3H), 3.50(m, 12H), 3.16(s, 3H), 3.12(m, 1H), 2.90(m, 1H), 2.86(d, 1H), 2.20(m, 2H), 1.72(m, 6H). 1 H NMR (CDCl 3 , 300 MHz, 293K,?): 10.46 (s, IH), 8.22 (s, IH), 7.73 (dd, 2H), 4.78 (s, 2H), 4.49 (s, 2H), 4.79 (d, 3H), 3.12 (m, 1H), 2.90 (m, 1H), 2.86 (m, 2H), 3.50 , ≪ / RTI > 1H), 2.20 (m, 2H), 1.72 (m, 6H).
실시예 8 : 비오틴 기반 화합물 3(KP1Example 8: Biotin-based compound 3 (KP1 BiBi )의 합성) Synthesis of
화합물 3(KP1Bi)의 합성 경로는 하기 반응식 8에 나타내었다.The synthesis route of Compound 3 (KP1 Bi ) is shown in the following Reaction Scheme 8.
[반응식 8][Reaction Scheme 8]
구체적으로, 테트라에틸렌 글리콜(tetraethylene glycol)로부터 유도된 아민-아지드 말단을 각각 포함하는 연결기(linker)와 비오틴이 아미드 결합을 통해 연결된 화합물 3c(21.3 mg, 0.0480 mmol)와 상기 실시예 6을 통해 얻어진 화합물 2(19.4 mg, 0.0810 mmol)를 상온에서 증류수(1.5 mL)와 THF(1.5 mL)가 1:1로 섞여있는 혼합 용매에 녹인 후, 초산구리 1수화물(copper acetate monohydrate, 3.2 mg, 16.2 μmol)과 아스코르브산 나트륨(sodium ascorbate, 6.4 mg, 32.4 μmol)을 첨가하여 빛을 차단한 상태로 3시간 교반하였다. Specifically, a compound 3c (21.3 mg, 0.0480 mmol) in which biotin is linked via an amide bond to a linker containing an amine-azide terminal derived from tetraethylene glycol, The resulting compound 2 (19.4 mg, 0.0810 mmol) was dissolved in a mixed solvent of distilled water (1.5 mL) and THF (1.5 mL) at room temperature in a mixed solvent of 1: 1, copper acetate monohydrate (3.2 mg, 16.2 and sodium ascorbate (6.4 mg, 32.4 μmol) were added thereto, and the mixture was stirred for 3 hours while blocking light.
3시간 교반 후, 에틸아세테이트(EtOAc, 10 mL), 물(10 mL), 포화 소금물(10 mL)을 넣고 분별 깔때기를 이용하여 유기층을 추출하고, 유기층을 무수황산나트륨(Na2SO4, 500 mg)으로 건조하였다. 40 mbar 감압조건에서 용매를 제거한 후, 실리카겔(silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 이용한 칼럼 크로마토그래피(column chromatograph, 직경 1 cm, 높이 8 cm)로 정제하여(전개액은 5% MeOH/CH2Cl2) 노란색의 고체 화합물 3(5 mg)를 얻었다.After stirring for 3 hours, ethyl acetate (EtOAc, 10 mL), water (10 mL), saturated brine (10 mL) and the mixture extracted and the organic layer using a separating funnel, and anhydrous sodium sulfate (Na 2 SO 4, 500 mg and the organic layer ). The solvent was removed under reduced pressure of 40 mbar and then purified by column chromatography (column chromatography, 1 cm in diameter and 8 cm in height) using silica gel (Merck-
1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K, δ): 10.59(s, 1H), 9.89(s, 1H), 7.91(s, 1H), 7.69(d, 1H), 7.52(s, 1H), 7.09(dd, 1H), 6.95(s, 1H), 6.73(d, 1H), 6.72(m, 1H), 6.18(s, 1H), 5.23(s, 1H), 4.78(s, 2H), 4.49(m, 2H), 4,29(m, 1H), 3.83(m, 2H), 3.80(m, 12H), 3.38(s, 3H), 3.18(m, 1H), 2.96(m, 1H), 2.85(m, 1H), 2.20(m, 2H), 2.15(m, 6H). 13C NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K, δ): 195.75, 173.50, 163.96, 157.18, 150.55, 144.75, 140.86, 137.98, 131.43, 123.08, 121.27, 119.61, 114.81, 109.27, 104.29, 70.84, 70.61, 70.28, 70.23, 69.77, 62.06, 60.45, 55.77, 50.63, 48.49, 40.85, 39.44, 39.11, 36.19, 30.04, 28.45, 28.39, 25.85. HRMS: m/z calcd for C33H45N7O7S, 683.82; found, 684.3179. 1 H NMR (CDCl 3, 300 MHz, 293K, δ): 10.59 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.69 (d, 1H), 7.52 (s, 1H), 2H), 4.79 (d, IH), 7.01 (d, IH), 6.95 (s, (s, 3H), 3.18 (m, IH), 2.96 (m, IH), 3.83 (m, 2H) 2.85 (m, 1 H), 2.20 (m, 2 H), 2.15 (m, 6 H). 13 C NMR (CDCl 3 , 300 MHz, 293 K, 8): 195.75, 173.50, 163.96, 157.18, 150.55, 144.75, 140.86, 137.98, 131.43, 123.08, 121.27, 119.61, 114.81, 109.27, 104.29, 70.84, 70.61, , 70.23, 69.77, 62.06, 60.45, 55.77, 50.63, 48.49, 40.85, 39.44, 39.11, 36.19, 30.04, 28.45, 28.39, 25.85. HRMS: m / z calcd for C 33 H 45 N 7 O 7 S, 683.82; found, 684.3179.
실시예 9 : 실리카 나노입자 기반 화합물 4a의 합성Example 9 Synthesis of Silica Nanoparticle-based
화합물 4a의 합성 경로는 하기 반응식 9에 나타내었다.The synthesis route of the
[반응식 9][Reaction Scheme 9]
구체적으로, 테트라에틸렌 글리콜(tetraethylene glycol)로부터 유도된 아민-아지드 말단을 각각 포함하는 연결기(linker)와 테트라에틸 오쏘실리케이드(tetraethyl orthosilicate, TEOS)로부터 유도된 이소시아네이트(isocyanate) 말단을 포함하는 실리카 나노입자가 아미드 결합을 통해 연결된 화합물 4d(27 mg)와 상기 실시예 5를 통해 얻어진 화합물 2a(102 mg, 0.360 mmol)를 상온에서 증류수(1.5 mL), THF(1.5 mL), 3차 부탄올(tert-butanol, 1.5 mL)이 1:1:1로 섞여있는 혼합 용매에 녹인 후, 황산 구리(copper sulfate, 19.0 mg, 0.120 mmol)과 아스코르브산 나트륨(sodium ascorbate, 95.0 mg, 0.480 mmol)을 첨가하여 빛을 차단한 상태로 24시간 교반하였다. 24시간 교반 후, 원심분리기(centrifugal separator, 15000 rpm, 20 min)를 이용하여 분리하고 증류수와 에탄올로 씻고 노란색의 고체 화합물 4a를 얻었다.Specifically, silica containing a linker containing an amine-azide end derived from tetraethylene glycol and an isocyanate end derived from tetraethyl orthosilicate (TEOS) The
실시예 10 : 실리카 나노입자 기반 화합물 4(KP1Example 10: Silica nanoparticle-based compound 4 (KP1 NPNP 또는 nano-KP1)의 합성 Or nano-KP1)
화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)의 합성 경로는 하기 반응식 10에 나타내었다.The synthesis route of Compound 4 (KP1 NP or nano-KP1) is shown in the following reaction formula (10).
[반응식 10][Reaction Scheme 10]
구체적으로, 테트라에틸렌 글리콜(tetraethylene glycol)로부터 유도된 아민-아지드 말단을 각각 포함하는 연결기(linker)와 테트라에틸 오쏘실리케이드(tetraethyl orthosilicate, TEOS)로부터 유도된 이소시아네이트(isocyanate) 말단을 포함하는 실리카 나노입자가 아미드 결합을 통해 연결된 화합물 4d(14.4 mg)와 상기 실시예 6을 통해 얻어진 화합물 2(46.1 mg, 0.192 mmol)를 상온에서 증류수(0.8 mL), THF(0.8 mL), 3차 부탄올(tert-butanol, 0.8 mL)이 1:1:1로 섞여있는 혼합 용매에 녹인 후, 황산 구리(copper sulfate, 10.0 mg, 64.0 μmol)과 아스코르브산 나트륨(sodium ascorbate, 51.0 mg, 256 μmol)을 첨가하여 빛을 차단한 상태로 24시간 교반하였다. 24시간 교반 후, 원심분리기(centrifugal separator, 15000 rpm, 20 min x 3)를 이용하여 분리하고 증류수와 에탄올로 씻고 노란색의 고체 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)를 얻었다.Specifically, silica containing a linker containing an amine-azide end derived from tetraethylene glycol and an isocyanate end derived from tetraethyl orthosilicate (TEOS) Compound 14d (14.4 mg) in which nanoparticles were linked via an amide bond and compound 2 (46.1 mg, 0.192 mmol) obtained in Example 6 were dissolved in distilled water (0.8 mL), THF (0.8 mL), tertiary butanol (copper sulfate, 10.0 mg, 64.0 μmol) and sodium ascorbate (51.0 mg, 256 μmol) were dissolved in a mixed solvent of 1: 1: And the mixture was stirred for 24 hours while blocking light. After stirring for 24 hours, the mixture was separated by using a centrifugal separator (15000 rpm, 20 min x 3) and washed with distilled water and ethanol to obtain a yellow solid compound 4 (KP1 NP or nano-KP1).
실시예 11 : 실리카 나노입자 기반 형광 프로브의 특성 확인Example 11: Characterization of silica nanoparticle based fluorescent probe
실리카 나노입자 화합물 4a, 4b, 4c, 4d 및 실리카 나노입자 기반 형광 프로브 화합물 4의 특성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.The following experiment was conducted to confirm the characteristics of the
우선, 합성한 실리카 나노입자 및 실리카 나노입자 기반 형광 프로브의 크기를 확인하기 위해, 증류수에 분산되어 있는 화합물 4(20 μL)를 카본 코팅 구리 그리드(carbon-coated copper grid)에 처리하고 투과형 전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)은 JEOL JEM-2100을 사용하여 나노입자의 크기를 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 측정된 나노입자의 크기는 61.6 ± 6.2 nm로 생체 적용(bioapplication)에 적합함을 확인하였다.First, to confirm the sizes of synthesized silica nanoparticles and silica nanoparticle-based fluorescent probes, Compound 4 (20 μL) dispersed in distilled water was treated on a carbon-coated copper grid, and a transmission electron microscope Transmission electron microscopy (TEM) was carried out by measuring the size of nanoparticles using JEOL JEM-2100. The results are shown in FIG. The size of the measured nanoparticles was 61.6 ± 6.2 nm, which was confirmed to be suitable for bioapplication.
또한, 합성한 실리카 나노입자 및 실리카 나노입자 기반 형광 프로브의 표면 개질 변화를 확인하기 위해, 증류수에 분산되어 있는 화합물 4b(히드록시 말단 실리카 나노입자), 화합물 4c(이소시아네이트 말단 실리카 나노입자), 화합물 4d(아지드 말단 실리카 나노입자), 화합물 4a 및 화합물 4(각 20 μL)와 증류수를 Malverns folded capillary cell에 채우고, Zetasizer Nano Z instrument(Malven Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 나노입자 표면의 전하를 측정함으로써 표면 개질 변화를 정성적으로 확인하였으며, 각각의 제타 전위값(zetapotential; ZP)을 도 2에 나타내었다.In order to confirm the surface modification of the synthesized silica nanoparticles and the silica nanoparticle-based fluorescent probe, the
실시예 12 : 형광 프로브의 흡수 및 형광 특성 확인Example 12 Absorption and Fluorescence Characterization of a Fluorescent Probe
본 발명의 화합물 2(KP1Pr), 화합물 3(KP1Bi), 화합물 4(KP1NP)의 형광 특성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 이때, 대조군으로는 종래 알려진 하기 화합물 1(KP1)을 이용하였다.The following experiments were carried out to confirm the fluorescence properties of Compound 2 (KP1 Pr ), Compound 3 (KP1 Bi ) and Compound 4 (KP1 NP ) of the present invention. At this time, the following known compound 1 (KP1) was used as a control group.
[화합물 1][Compound 1]
구체적으로, 이광자 흡수 형광체의 흡수 및 형광 특성을 확인하기 위해, 10 μM 농도의 화합물 1, 1a, 2, 2a, 3, 3a 및 1 mg/mL 농도의 화합물 4, 4a의 PBS(phosphate buffer silane) 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 1% 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 포함)을 1cm의 통과 길이의 석영 셀에 채워 흡수 스펙트럼(UV/Vis absorption spectrum)을 측정하고, 파장(x축)에 따른 흡광도(y축) 결과를 도 3a에 나타내었다. 또한, 형광 방출 스펙트럼(Photon Technical International Fluorescence System)을 측정하고, 파장(x축)에 따른 형광 세기(y축) 결과를 도 3b에 나타내었다. Specifically, in order to confirm the absorption and fluorescence characteristics of the two-photon absorption phosphors, a PBS (phosphate buffer silane) solution of
이때, 화합물 1a, 2a, 3a, 및 4a는 화합물 1, 2, 3, 및 4의 -OH에 알킬(alkyl)을 도입하여 분자내 수소결합을 제거한 비교 물질이다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 화합물 1, 2, 3 및 4는 모두 370-390 nm에서 최고 흡수값을 나타내었다. 또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 화합물 1a, 2a, 3a, 및 4a는 강한 형광을 방출하는 반면, 화합물 1, 2, 3, 및 4는 형광을 거의 나타내지 않았다. 또한, 종래 개발된 대조군 화합물 1(KP1)과 비교하여 화합물 2(KP1Pr)와 3(KP1Bi)의 경우에는 보다 큰 형광 증가를 확인할 수 있었고, 이는 암 진단 및 영상화 구현에 있어서 향상된 민감도를 제공할 수 있음을 의미하는 것이다.
또한, 100% PBS 완충 용액(100 mM, pH 7.4), 1% 아세토니트릴(acetonitrile, MeCN)이 포함된 PBS 완충 용액, 10% 아세토니트릴이 포함된 PBS 완충 용액, 20% 아세토니트릴이 포함된 PBS 완충 용액에서 1 mg/mL 농도의 화합물 4a의 형광 스펙트럼을 측정하고, 파장(x축)에 따른 형광 세기(y축)를 도 4에 나타내었다. 그 결과, 유기 용매의 비율이 증가함에 따라 형광 세기가 증가하였는 바, 이는 친수성 환경에서 소수성 환경으로 변화함에 따라 형광 프로브의 형광 세기가 증가함을 확인한 것이다.PBS buffer containing 100% PBS buffer (100 mM, pH 7.4), 1% acetonitrile (MeCN), PBS buffer containing 10% acetonitrile, PBS containing 20% acetonitrile Fluorescence intensity of
또한, 10 μM 농도의 화합물 1, 1a, 2, 2a 및 1 mg/mL 농도의 화합물 4, 4a의 PBS 완충 용액(10 mM, pH 7.4, 20% MeCN 포함)에서의 형광 방출 스펙트럼을 도 5에 나타내었다. 그 결과, 유기 용매의 비율의 증가에도 불구하고, 종래 개발된 대조군 화합물 1(KP1)과 비교하여, 본원 화합물 2(KP1Pr)와 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)의 경우에는 보다 큰 형광 증가를 확인할 수 있었고, 이는 본 발명의 화합물이 암 진단 및 영상화 구현에 있어서 향상된 민감도를 제공할 수 있음을 의미하는 것이다.5 shows fluorescence emission spectra of
실시예 13 : 화합물 2(KP1Example 13: Compound 2 (KP1 PrPr )의 PDGFRa 인산화 효소 감지특성 확인) PDGFRa phosphorylase detection characteristics
본 발명의 화합물 2(KP1Pr)과 대조군 화합물 1(KP1)에 대하여 PDGFRa 인산화 효소와의 결합 선택성을 형광 변화를 통해 비교확인하였으며, 구체적인 실험방법은 다음과 같다.The binding selectivity of the compound of the present invention 2 (KP1 Pr ) and the control compound 1 (KP1) to the PDGFRa phosphorylase was confirmed by fluorescence change. Specific experimental methods are as follows.
실험에 사용된 용매로는 완충용액(10 mM HEPES buffer, pH 7.4)을 사용하였고, 인산화효소는 Carna Biosciences 사의 제품을 사용하였으며, 각 인산화효소는 제조사에서 제공한 용매(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 % CHAPS, 1 mM DTT, 10% Glycerol, pH 7.5)와 함께 -80℃에서 보관하였다. 사용된 ATP 및 MgCl2는 Sigma 사의 제품을 사용하였다. 형광 관측 시 사용된 플레이트(plate)는 96-well fluorescence assay plate (SPL life science 사)이며, 관측 장비는 VCITOR 3 multilabel counter (Perkin Elmer-Wellesley 사)를 이용하였다. 관측 장비의 여기파장(excitation wavelength)으로는 355 nm 필터가, 방출파장(emission wavelength)으로는 535 nm 필터가 사용되었다. 교반(incubation)은 NB-205Q model (N-BIOTEK 사)가 사용되었으며, 37℃에서 1 시간 동안 170 rpm의 진동(shaking)으로 진행되었다. 화합물 1(KP1)과 화합물 2(KP1Pr)는 10 mM로 DMSO 용액에 녹여 사용되었으며, 최종 사용되는 용매 조건에서 DMSO의 양이 동일하도록 통제되었다(1% 미만). 사용된 Mg2 + 및 ATP는 각각 100 μM 조건이다. 각 실험값은 동일한 실험 준비 과정을 통하여 실시된 5번의 실험 평균값을 기본으로 하였으며, 사용된 인산화 효소(PDGFRa)의 양은 0.2 μg/mL이다. As the solvent used in the experiment, a buffer solution (10 mM HEPES buffer, pH 7.4) was used. The phosphorylated enzyme was a product of Carna Biosciences. Each phosphorylase was dissolved in a solvent (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% CHAPS, 1 mM DTT, 10% Glycerol, pH 7.5). ATP and MgCl 2 used were Sigma products. The plate used for fluorescence observation was a 96-well fluorescence assay plate (SPL life science) and a
100 μM 농도의 화합물 1과 화합물 2의 인산화 효소와 반응 전 및 반응 1시간 후의 형광 세기를 측정한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 인산화 효소와 반응 후의 형광 세기는 차이가 거의 없지만, 인산화 효소와 반응 전의 화합물 1(KP1) 자체가 나타내는 형광 세기는 화합물 2(KP1Pr) 자체가 나타내는 형광 세기보다 크기 때문에, 결과적으로 화합물 2(KP1Pr)를 생체 영상화에 응용하게 되면 화합물 1(KP1)보다 선명한 영상을 얻을 수 있을 것이다.As a result of measuring the fluorescence intensities before and after the reaction with the phosphorylated enzyme of
실시예 14 : 화합물 2, 3, 4의 처리에 의한 일광자 및 이광자 세포 영상화Example 14: One-photon and two-photon imaging by treatment of
본 발명의 화합물 2, 3, 4 및 대조군 화합물 1에 대하여, 다양한 정상세포(PNT-2, HEK-293A) 및 암세포(MCF-7, PC3, A549)에 처리후 일광자 또는 이광자 광학 현미경을 이용해 형광 켜짐 현상을 확인하였으며, 구체적인 실험방법은 다음과 같다.(PNT-2, HEK-293A) and cancer cells (MCF-7, PC3, A549) were treated with one photon or two-photon optical microscope for the
우선, 일광자 현미경 형광 영상은 정립형태의 공초점 현미경(TCS SP5 II MP with SMD, Leica Microsystems Ltd.)과 40배 대물렌즈(HCX PL APO 40x/ 1.10 W CORRCS, 506341, Leica, Germany)로 구성되어있으며, 405 nm의 일광자 여기파장으로 촬영되었다. 이때, 영상의 가로와 세로 길이는 123 μm 또는 369 μm이며, 눈금 막대바는 25 μm 또는 75 μm의 길이를 뜻한다. First, one-photon microscopy fluorescence images were composed of a confocal microscope (TCS SP5 II MP with SMD, Leica Microsystems Ltd.) and a 40 × objective lens (HCX PL APO 40x / 1.10 W CORRCS, 506341, Leica, Germany) And photographed at a single photon excitation wavelength of 405 nm. At this time, the horizontal and vertical length of the image is 123 μm or 369 μm, and the graduated bar bar means the length of 25 μm or 75 μm.
이광자 광학 현미경은 정립형태의 광학 현미경(upright microscope, BX51, Olypmpus)과 20배 대물렌즈(XLUMPLEN, NA 1.0, Olympus)로 구성되어있으며, 타이타늄:사파이어 레이저(Ti:Sapphire laser; Chameleon Ultra II, Coherent)가 사용되었고, 6 mW의 레이저 출력과 780 nm의 이광자 여기파장으로 관측되었다. 이때, 영상의 가로와 세로 길이는 각각 150 μm이며, 눈금 막대바는 50 μm의 길이를 뜻한다.The two-photon optical microscope is composed of an upright microscope (BX51, Olypmpus) and a 20-times objective lens (XLUMPLEN, NA 1.0, Olympus), and a titanium: sapphire laser (Chameleon Ultra II, Coherent ) Was used and was observed with a laser output of 6 mW and a two photon excitation wavelength of 780 nm. At this time, the horizontal and vertical lengths of the image are 150 μm, respectively, and the scale bar means 50 μm.
2종의 정상 세포인 PNT-2(사람의 전립선 상피 세포), HEK-293A(사람의 신장 세포)와, 3종의 암 세포인 MCF-7(사람의 유방암 세포), PC3(사람의 전립선암 세포), A549(사람의 폐암 세포)가 사용되었다. 각 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium) 배양액으로 37℃에서 배양하였다. 배양된 세포는 12 mm 페트리접시(petri dish)에서 다시 1 × 105 정도의 세포 개수가 생성되도록 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 이후 10 μM의 화합물 1, 2, 3 및 1 mg/mL의 화합물 4를 처리한 후 추가로 1시간 더 배양한 다음, 세포에서 배양액을 제거하고, 4% 포름알데하이드 용액을 넣어주어 세포를 페트리접시에 고정시켰다. Two types of normal cells, PNT-2 (human prostate epithelial cells), HEK-293A (human kidney cells), three types of cancer cells, MCF-7 (human breast cancer cells), PC3 Cells) and A549 (human lung cancer cells) were used. Each cell was cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) at 37 ° C. The cultured cells were cultured in a 12-mm Petri dish at 37 ° C for 24 hours to produce a cell number of about 1 × 10 5 . Then, 10 μM of
그 결과, 도 7, 8 및 11에 나타낸 바와 같이, 화합물 2(KP1Pr)를 처리한 암 세포에 대하여 선택적으로 형광 증가가 나타났을 뿐만 아니라, 암세포에서 화합물 1(KP1)보다 화합물 2(KP1Pr)의 형광 세기가 더 크게 증가함을 확인하였다. 이는 본 발명의 화합물 2(KP1Pr)가 암 세포 내에 존재하는 인산화 효소와 더 잘 결합하여 강한 형광을 나타냄을 알 수 있고, 이를 통해 암 진단 및 영상화의 민감도가 우수함을 확인하였다.As a result, as shown in Figs. 7, 8 and 11, not only the fluorescence increase was selectively observed in the cancer cells treated with Compound 2 (KP1 Pr ), but also Compound 2 (KP1 Pr ) Fluorescence intensities were increased. This indicates that compound 2 (KP1 Pr ) of the present invention binds more strongly to the phosphorylated enzyme present in the cancer cells and shows strong fluorescence, thereby confirming excellent sensitivity to cancer diagnosis and imaging.
또한, 도 7, 9 및 11에 나타낸 바와 같이, 화합물 3(KP1Bi)를 처리한 암 세포에 대하여 선택적으로 형광 증가가 나타났을 뿐만 아니라, 암세포에서 화합물 1(KP1)보다 화합물 3(KP1Bi)의 형광 세기가 더 크게 증가함을 확인하였다. 이는 본 발명의 화합물 3(KP1Bi)가 암 세포 내에 존재하는 인산화 효소와 더 잘 결합하여 강한 형광을 나타냄을 알 수 있고, 이를 통해 암 진단 및 영상화의 민감도가 우수함을 확인하였다.In addition, the compounds 3 (KP1 Bi) selectively not only showed up the fluorescence increase, than that of the compound 3 (KP1 Bi) compound 1 in cancer cells (KP1) with respect to the cancer cells treated for 7, 9 and 11 Of the fluorescence intensity of the sample. This indicates that compound 3 (KP1 Bi ) of the present invention binds more strongly to the phosphorylated enzyme present in the cancer cells and shows strong fluorescence, thereby confirming the excellent sensitivity of cancer diagnosis and imaging.
또한, 도 7, 10 및 11에 나타낸 바와 같이, 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)를 처리한 암 세포에 대하여 선택적으로 형광 증가가 나타났을 뿐만 아니라, 암세포에서 화합물 1(KP1)보다 화합물 4의 형광 세기가 더 크게 증가함을 확인하였다. 이는 본 발명의 화합물 4가 암 세포 내에 존재하는 인산화 효소와 더 잘 결합하여 강한 형광을 나타냄을 알 수 있고, 이를 통해 암 진단 및 영상화의 민감도가 우수함을 확인하였다.7, 10 and 11, fluorescence was selectively increased in cancer cells treated with Compound 4 (KP1 NP or nano-KP1), and in addition, Compound 4 (KP1) Of the fluorescence intensity of the sample. This indicates that
실시예 15 : 화합물 3(KP1Example 15: Compound 3 (KP1 BiBi ) 처리한 쥐 조직의 이광자 광학 현미경 영상화) Two-photon optical microscopic imaging of treated rat tissue
본 발명의 화합물 3(KP1Bi)에 대하여, 동물모델의 조직에 대한 이광자 광학 현미경 영상화를 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.For the
우선, 아족시메탄(azoxymethane, AOM)과 덱스트란 황산 나트륨(dextran sodium sulfate, DSS)을 처리하여 결장암(colorectal cancer)이 발현되도록 쥐를 약 8주간 사육하였고 이 대장암 모델 쥐를 해부하고 용종이 형성된 대장조직을 적출하였다. 그 다음, 대장조직의 안쪽 면(lumen)이 드러날 수 있도록 수술용 가위를 이용하여 잘 펼친 다음 10 μM의 화합물 3(KP1Bi)이 포함된 PBS(100 mM, pH 7.4, 1% DMSO 포함) 완충 용액에 약 30분 동안 담가두어 조직 내로 흡수되어 스며들도록 하였다. 그 후 PBS 용액으로 3회 씻어내어 표면에 잔류하는 화합물 3(KP1Bi)이 제거될 수 있도록 하였다. 준비된 대장 적출조직을 슬라이드 글라스에 대장조직의 안쪽 면이 보일 수 있도록 잘 펼친 후 두께 170 μm 의 커버슬립(coverslip)을 덮고 이광자 여기 레이저 기반 현미경 촬영을 하였다. 대조군으로서 정상 상태의 쥐 대장 적출조직도 함께 준비하여 촬영하였다. 이때, 이광자 광학 현미경 영상은 6 mW의 레이저 출력과 780 nm의 이광자 여기파장으로 관측되었으며, 영상의 가로와 세로 길이는 각각 300 μm이며, 눈금 막대바는 100 μm의 길이를 뜻한다.First, mice were treated with azoxymethane (AOM) and dextran sodium sulfate (DSS) for 8 weeks to express colorectal cancer. The colon cancer model mice were dissected and polyps The formed colon tissue was excised. Then, it was spread out using surgical scissors so that the inner lumen of the colon tissue could be revealed, and then washed with PBS (100 mM, pH 7.4, containing 1% DMSO) buffer containing 10 μM of Compound 3 (KP1 Bi ) And immersed in the solution for about 30 minutes to allow it to absorb and penetrate into the tissue. Then, the solution was washed three times with PBS solution to remove Compound 3 (KP1 Bi ) remaining on the surface. The prepared colonic tissue was spread on a slide glass so that the inside surface of the colon tissue could be seen, then covered with a 170 μm thick coverslip, and photographed under a two-photon excitation laser. As a control group, steady-state mouse colon-derived tissues were also prepared and photographed. At this time, the two-photon optical microscope image was observed with a laser output of 6 mW and a two-photon excitation wavelength of 780 nm. The horizontal and vertical lengths of the image were 300 μm and the scale bar bar was 100 μm long.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 화합물 3(KP1Bi)을 처리한 정상조직에 비하여 암조직에서 밝은 형광 영상이 관찰되었으며, 따라서 화합물 3(KP1Bi)은 암조직 내에 선택적으로 인산화 효소들과 결합하여 형광이 강하게 관측됨을 알 수 있었다.As a result, as shown in Figure 12, bright fluorescent images from cancer tissues were observed as compared to a normal tissue treated with Compound 3 (KP1 Bi), thus compound 3 (KP1 Bi) is with optionally kinases in the cancer tissue It was found that the fluorescence was observed strongly by the combination.
실시예Example 16 : 화합물 1(KP1) 및 화합물 16: Compound 1 (KP1) and compound 4(KP14 (KP1 NPNP 또는 nano-KP1)을 Or nano-KP1) 처리한 살아있는 쥐 조직의 이광자 광학 현미경 영상화 Two-photon microscope imaging of processed live mouse tissue
본 발명의 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1) 및 화합물 1(KP1)에 대하여, 살아있는 동물모델의 조직에 대한 이광자 광학 현미경 영상화를 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.For the compound 4 (KP1 NP or nano-KP1) and the compound 1 (KP1) of the present invention, the following experiment was performed for two-photon microscopic imaging of the tissue of a living animal model.
우선, 상기 실시예 14의 방법으로 얻어진 약 5 × 106개의 A549(사람의 폐암 세포) 세포를 흉선제거마우스(생후 5주, 암컷, BALB/c-nude mice, Orient BIO Inc.)의 왼쪽 넓적다리에 피하 주입하여 암을 발현시켰으며, 영상화 연구는 암 세포 주입 7일 후에 진행되었다. 호흡 마취를 유지하며 모든 실험이 진행되었으며, PBS 완충 용액(100 mM, pH 7.4, 1% DMSO 포함)에 용해된 화합물 1(100 μM/100 μL) 또는 PBS 완충 용액(100 mM, pH 7.4, 1% DMSO 포함)에 분산된 화합물 4(1 mg/100 μL, 1 mg/mouse)를 꼬리 정맥 주사를 통해 쥐에 주입하였다. 화합물 1 또는 화합물 4의 주입 15분 후부터 이광자 여기 레이저 기반 현미경 촬영을 진행하였고, 대조군으로서 같은 방식으로 암이 발현된 쥐에 PBS 완충 용액(100 mM, pH 7.4, 1% DMSO 포함)을 꼬리 정맥 주사하여 조직 영상화를 수행하였다. 이때, 이광자 광학 현미경 영상은 52.5 mW의 레이저 출력과 780 nm의 이광자 여기파장으로 관측되었으며, 영상의 가로와 세로 길이는 각각 300 μm이며, 눈금 막대바는 50 μm 또는 100 μm의 길이를 뜻한다.First, about 5 × 10 6 A549 (human lung cancer cells) cells obtained by the method of Example 14 were cultured in a thymus-removing mouse (5 weeks old, female, BALB / c-nude mice, Orient BIO Inc.) The mice were injected subcutaneously into the legs, and imaging studies were carried out 7 days after cancer cell injection. (100 μM / 100 μL) dissolved in PBS buffer solution (100 mM, pH 7.4, containing 1% DMSO) or PBS buffer solution (100 mM, pH 7.4, 1 mM) in PBS buffer solution Compound 1 (1 mg / 100 μL, 1 mg / mouse), which was dispersed in DMSO, was injected into the mice via a tail vein injection. Two-photon excitation laser-based microscopy was carried out 15 minutes after the injection of
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군으로서 PBS 완충 용액을 꼬리 정맥 주사한 쥐의 경우 정상조직과 암조직에서의 형광 변화가 거의 없었다. 반면에, 화합물 1 또는 화합물 4를 처리한 쥐의 정상조직에 비하여 암조직에서 훨씬 밝은 형광 영상이 관찰되었으며, 따라서 화합물 1 또는 화합물 4는 암조직 내에 선택적으로 인산화 효소들과 결합하여 형광이 강하게 관측됨을 알 수 있었다. 이에 더하여 화합물 1과 화합물 4 연구 결과를 비교해보았을 때, 화합물 1(KP1)의 진보된 형태인 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)는 증가된 투과 및 잔류 효과(EPR effect)에 의한 암세포 적중(targeting) 효과 및 형광 증가 효과가 화합물 1보다 높음을 알 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 13, there was almost no fluorescence change in normal tissues and cancer tissues in rats injected with PBS buffer solution as a control group. On the other hand, a much brighter fluorescence image was observed in cancer tissues as compared with the normal tissues of rats treated with
실시예 17 : 암이 발현된 살아있는 쥐 조직의 광간섭성 단층 촬영 및 혈관 촬영Example 17: Optical coherence tomography and angiography of living mouse tissue expressing cancer
살아있는 쥐 조직에 대한 광간섭성 단층 촬영을 위한 광원으로는 wavelength swept source (SSOCT-1310, AXSUN Technologies)가 사용되었으며, 중심파장은 1310 nm, 파장폭은 107 nm로 500 μm × 500 μm × 225 μm 크기의 영상을 얻었다. 혈관 영상은 앞서 얻어진 영상들을 미분 분산 알고리즘(complex differential variance algorithm)으로 분석함으로써 얻어졌다.A wavelength swept source (SSOCT-1310, AXSUN Technologies) was used as a light source for optical coherence tomography in living mouse tissues. The center wavelength was 1310 nm and the wavelength width was 107 nm, which was 500 μm × 500 μm × 225 μm Sized images. The vascular images were obtained by analyzing the previously acquired images with a complex differential variance algorithm.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 정상조직(대조군)의 구조 영상과 혈관 영상은 일정한 방식으로 나타나는 것을 확인할 수 있다. 반면에 암조직의 구조 영상은 불규칙적이며, 혈관 영상에서는 암조직 주변으로 혈관이 과발현되어 있음을 확인할 수 있다. 이로 인해, 주입한 암세포가 쥐에 효과적으로 발현되어 있다는 것을 알 수 있다.As a result, as shown in Fig. 14, it can be seen that the structural image and the blood vessel image of the normal tissue (control group) appear in a constant manner. On the other hand, the structural image of cancer tissue is irregular, and blood vessels are over-expressed around the cancer tissue. As a result, it can be seen that the injected cancer cells are effectively expressed in rats.
실시예Example 18 : 화합물 1(KP1) 및 화합물 18: Compound 1 (KP1) and compound 4(KP14 (KP1 NPNP 또는 nano-KP1)을 Or nano-KP1) 처리한 쥐 조직의 이광자 광학 현미경 영상화 Two-photon optical microscopy imaging of treated rat tissues
본 발명의 화합물 4(KP1NP 또는 nano-KP1)가 처리된 쥐 조직에 대한 이광자 광학 현미경 영상화를 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.The following experiments were performed for two-photon microscopic imaging of mouse tissues treated with Compound 4 (KP1 NP or nano-KP1) of the present invention.
우선, 상기 실시예 16으로부터 화합물 4(실험군)와 PBS 완충 용액(대조군)을 처리하여 이광자 광학 현미경 영상을 얻는데 사용된 쥐를 경추탈골법(cervical dislocation)을 이용해 즉사시킨 후, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액으로 심장으로부터 관류(perfusion)를 시켜 조직들을 고정시킨다. 쥐의 뇌, 신장, 폐, 비장, 간, 암조직을 해부하고 PBS 완충 용액으로 3회 씻은 후에 조직 영상화를 진행하였다. 이때, 이광자 광학 현미경 영상은 35 mW의 레이저 출력과 780 nm의 이광자 여기파장으로 관측되었으며, 영상의 가로와 세로 길이는 각각 300 μm이며, 눈금 막대바는 50 μm의 길이를 뜻한다.First, the mice used for obtaining the two-photon optical microscope images were treated with cervical dislocation and treated with 4% paraformaldehyde (control group), compound 4 (experimental group) and PBS buffer (control group) (perfusion) of the heart with paraformaldehyde solution to fix the tissues. The mouse brain, kidney, lung, spleen, liver, and cancer tissues were dissected and washed three times with PBS buffer, followed by tissue imaging. At this time, the two-photon optical microscope image was observed with a laser output of 35 mW and a two-photon excitation wavelength of 780 nm. The horizontal and vertical lengths of the image were 300 μm and the scale bar bar was 50 μm long.
PBS 완충 용액이 처리된 대조군 조직의 형광 세기에 대한 화합물 4로 처리된 실험군 조직의 형광 세기를 상대적으로 처리하여 도 15에 나타내었다. 그 결과, 화합물 4가 암조직에 선택적으로 분포함을 확인할 수 있었다.The fluorescence intensity of the experimental group treated with
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.
Claims (15)
[화학식 5]
상기 화학식 5에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬, 아릴, 아세테이트, 또는 프로파질기를 나타내며;
R3는 포르밀기 또는 아세탈기를 나타내며;
R4는 수소, 아세틸, 메틸, 또는 메톡시메틸기를 나타내며;
단, R1 및 R2가 메틸기이면서 R3가 포르밀기이면서 R4가 수소 또는 메톡시메틸기인 경우를 제외한다.
A fluorescent probe composition for detecting tyrosine kinase comprising a compound of the following formula (5) or analogues thereof.
[Chemical Formula 5]
In Formula 5,
R 1 and R 2 each independently represent hydrogen, C 1-10 alkyl, aryl, acetate, or a propargyl group;
R 3 represents a formyl group or an acetal group;
R 4 represents hydrogen, acetyl, methyl, or methoxymethyl;
Except that R 1 and R 2 are methyl groups and R 3 is formyl group and R 4 is hydrogen or methoxymethyl group.
The fluorescent probe composition according to claim 1, wherein the analogue further comprises a cyclic arginine-glycine-aspartate peptide, folic acid or biotin linked to the compound of formula (5).
The method of claim 1, wherein the analogue further comprises silica nanoparticles, paramagnetic nanoparticles, or ferromagnetic nanoparticles connected to the compound of formula (5) Probe composition.
The fluorescent probe composition according to claim 1, wherein the analogue further comprises a microarray chip as a solid support to the compound of formula (5).
[화학식 2]
The fluorescent probe composition according to claim 1, wherein the compound is a compound represented by the following formula (2).
(2)
[화학식 3]
The fluorescent probe composition according to claim 2, wherein the analogue is a compound represented by the following formula (3).
(3)
[화학식 4]
4. The fluorescent probe composition according to claim 3, wherein the analogue is a compound represented by the following formula (4).
[Chemical Formula 4]
The fluorescent probe composition according to claim 1, wherein the compound or the analog is a one-photon or two-photon absorption phosphor.
2. The fluorescent probe composition according to claim 1, wherein the tyrosine phosphorylase is selected from the group consisting of PDGFRa, Src, ABL1 (T315I), BRAF, RSK2 and TYK2.
A method for imaging cells or tissues of an animal other than a human using the fluorescent probe composition of claim 1.
11. The method of claim 10, wherein the method comprises measuring fluorescence exhibited by binding of the compound to tyrosine phosphorylase overexpressed in cells or tissues.
12. The method according to claim 11, wherein the fluorescence is measured with a one-photon optical microscope or a two-photon optical microscope.
11. The method of claim 10, wherein the cell or tissue is a cancer cell or cancer tissue.
A method for providing information for cancer diagnosis using the fluorescent probe composition of claim 1.
15. The information providing method according to claim 14, comprising the step of treating the sample with the fluorescent probe composition and judging it to be cancerous when fluorescence is observed.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| GRNT | Written decision to grant |