KR101808391B1 - Composition for determining G6PD activity, kit comprising the same, and method of determining G6PD activity - Google Patents

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Abstract

본 발명은 G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for measuring the activity of G6PD, a kit containing the same, and a method for measuring the activity of G6PD.

Description

G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법{Composition for determining G6PD activity, kit comprising the same, and method of determining G6PD activity}The present invention relates to a composition for measuring the activity of G6PD, a kit containing the same, and a method for measuring the activity of G6PD.

본 발명은 G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for measuring the activity of G6PD, a kit containing the same, and a method for measuring the activity of G6PD.

글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제(Glucose-6-phosphate dehydrogenase; G6PD)는 펜토오스 포스페이트 경로(PPP)의 핵심 효소로서, 글루코스-6-포스페이트(G6P)의 산화 중에 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADP+)를 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; NADPH) 로 환원시킨다. NADPH는 유해한 산화성 대사산물에 대한 보호 기작에 관여하는 환원된 글루타치온을 생성하는 환원 효소로 작용한다. 특히, G6PD는 적혈구에서 NADPH를 생성하는 유일한 소스로서 작용한다. 따라서, G6PD는 세포 생존 및 세포내 산화환원 평형의 유지를 위한 핵심 효소로 간주된다. Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) is a key enzyme of the pentose phosphate pathway (PPP), and it is known that during the oxidation of glucose-6-phosphate (G6P) nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NADP + ) is reduced with nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH). NADPH acts as a reductase to produce reduced glutathione, which is involved in the protective mechanism against deleterious oxidative metabolites. In particular, G6PD acts as the sole source of NADPH in red blood cells. Thus, G6PD is considered to be the key enzyme for cell survival and maintenance of intracellular redox equilibrium.

전 세계적으로 가장 일반적인 인간 효소 결핍증인 G6PD 결핍증은 적혈구 파괴를 유발하고, 감염증, 잠두(fava beans), 및 아스피린, 니트로푸란토인, 퀴니딘, 퀴닌 및 설파 약물을 비롯한 특정 약물에 의해 유발될 수 있는 황달을 동반한 용혈성 빈혈로 이어질 수 있다. 또한, G6PD는 심부전, 제2형 당뇨병 및 고혈압을 비롯한 여러 가지 질병의 발병에 관여한다. 최근에, 종양 조직에서 G6PD의 발현 및 활성은 정상 세포에서의 발현 및 활성보다 높고, 종양 세포에서 G6PD 발현의 억제는 세포자멸사를 유발하고 증식을 감소시키는 것으로 보고되었다. 또한, 종양 억제제인 p53은 G6PD와의 결합 및 활성 다이머(dimer) 형성의 억제를 통해 PPP 및 G6PD 활성을 억제하므로, G6PD는 종양에 대한 가능한 치료 표적 단백질일 뿐만 아니라 진단 도구이다. 따라서, G6PD 활성의 정량적 분석을 위한 고민감도 및 고속처리 분석법의 개발이 필수적이다.G6PD deficiency, the most common human enzyme deficiency worldwide, causes erythropoiesis and is associated with infectious diseases, fava beans, and cancers caused by certain drugs, including aspirin, nitfurantoin, quinidine, quinine, It can lead to hemolytic anemia with jaundice. In addition, G6PD is involved in the onset of various diseases including heart failure, type 2 diabetes and hypertension. Recently, the expression and activity of G6PD in tumor tissues is higher than that in normal cells, and inhibition of G6PD expression in tumor cells has been reported to induce apoptosis and decrease proliferation. In addition, G6PD is a diagnostic tool as well as a possible therapeutic target protein for tumors, since the tumor suppressor p53 inhibits PPP and G6PD activity by binding to G6PD and inhibiting the formation of active dimers. Therefore, it is essential to develop sensitive sensitivity and fast process analysis for quantitative analysis of G6PD activity.

G6PD 결핍증을 진단하기 위해 가장 널리 사용되는 방법들 중 하나는 Ernest Beutler에 의해 개발된 형광 스팟 시험법이다(Beutler, 1966). 이러한 직접적인 시험법에서, G6PD 활성은 비형광성 NADP+의 형광성 NADPH로의 전환에 비례한다. 이러한 시험법은 간단하고 저렴하고, 높은 특이성을 제공하지만, 그의 비교적 낮은 몰 흡광 계수 (6,220 cm-1M-1) 및 양자 수율(<0.015) 로 인해 G6PD 활성의 민감한 정량적 분석을 위한 그의 사용이 제한된다 (Baici et al., 1978; Skala et al., 2007; Williams et al., 2013; Zhu et al., 2009). 레자주린/디히드로게나제 분석법과 같은 간접 분석법은 신호 증폭을 위해 레자주린을 비롯한 염료 분자를 이용하고 더욱 높은 몰 흡광 계수(58,000 cm-1M-1) 또는 양자 수율(0.75) (Zhu et al., 2009)을 갖는다. 그의 더욱 높은 몰 흡광 계수에도 불구하고, 이러한 분석법의 분광분석적 적용은 G6PD 활성의 민감한 검출에서는 제한되는데, 이는 레자주린의 흡수 파장(598 nm)은 레조루핀의 흡수 파장(573 nm)에 매우 근접하여, 두 흡수 스펙트럼 사이의 간섭이 초래되기 때문이다.One of the most widely used methods for diagnosing G6PD deficiency is the fluorescent spot test developed by Ernest Beutler (Beutler, 1966). In this direct assay, G6PD activity is proportional to the conversion of non-fluorescent NADP + to fluorescent NADPH. Although this test method is simple, inexpensive and provides high specificity, its use for sensitive quantitative analysis of G6PD activity due to its relatively low molar extinction coefficient (6,220 cm -1 M -1 ) and quantum yield (<0.015) (Baici et al., 1978; Skala et al., 2007; Williams et al., 2013; Zhu et al., 2009). Indirect analytical methods such as Rezajulin / dehydrogenase assays utilize dye molecules, including Rezazurin, for signal amplification and have higher molar extinction coefficients (58,000 cm -1 M -1 ) or quantum yields (0.75) (Zhu et al , 2009). Despite its higher molar extinction coefficient, the spectroscopic application of this assay is limited in the sensitive detection of G6PD activity because the absorption wavelength (598 nm) of rezazulin is very close to the absorption wavelength (573 nm) of resorufin , Resulting in interference between the two absorption spectra.

한편, 마이크로어레이는 매우 작은 시료 체적, 감소된 반응 시간, 및 더욱 짧은 확산 거리에 따른 증가된 민감도를 필요로 하기 때문에, 효소 활성의 고속 처리 분석 및 분자 상호작용의 고속처리 분석을 위한 유망한 기술이다. 어레이 기술은 단백질 키나제 A, 트랜스글루타미나제 2, 혈액 응고 인자 XIII 및 프로테아제를 비롯한 여러 가지 효소들의 활성을 측정하기 위해 이용되어 왔다. 그러나, 어레이 기반 G6PD 활성 분석법은 레자주린 분자를 어레이 표면상에 고정화하는 것의 어려움으로 인해 보고되지 않았었는데, 이는 고상 어레이의 경우 어레이 표면상에 레자주린과 같은 프로브 분자를 고정화하는 것이 어렵고 액상 어레이의 경우 용이한 증발로 인해 액상에서 어레이를 측정하는 것이 어렵기 때문이다.On the other hand, microarrays are a promising technique for high-throughput analysis of enzyme activity and high-throughput analysis of molecular interactions, since they require very small sample volumes, reduced reaction times, and increased sensitivity with shorter diffusion distances . Array technology has been used to measure the activity of various enzymes including protein kinase A, transglutaminase 2, blood coagulation factor XIII, and protease. However, array-based G6PD activity assays have not been reported due to the difficulty of immobilizing the rezajulin molecule on the array surface, which makes it difficult to immobilize probe molecules such as lazarin on the array surface in the case of solid phase arrays, This is because it is difficult to measure arrays in liquid phase due to easy evaporation.

이에, 본 발명자는, 어레이 표면에 프로브를 고정하지 않고 액상 어레이의 형태로 직접분석이 가능한 액적 어레이를 이용한 온-칩(on-chip) G6PD 활성 분석법을 제공하기 위한 G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법을 발명하여, 인간 혈장내의 G6PD 활성을 분석에 성공적으로 적용하였다. Accordingly, the present inventor has proposed a composition for measuring the activity of G6PD to provide an on-chip G6PD activity assay using a droplet array capable of directly analyzing in the form of a liquid array without fixing the probe on the array surface, And a method for measuring the activity of G6PD, and successfully applied G6PD activity in human plasma to the assay.

Beutler, E., 1966. A series of new screening procedures for pyruvate kinase deficiency, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, and glutathione reductase deficiency. Blood 28(4), 553-562.Beutler, E., 1966. A series of new screening procedures for pyruvate kinase deficiency, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, and glutathione reductase deficiency. Blood 28 (4), 553-562.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 어레이 표면에 프로브를 고정하지 않고 액상 어레이의 형태로 직접분석이 가능하면서 민감도가 현저히 우수하며, G6PD 활성의 실시간 측정이 가능하며, 매우 소량의 체적의 시료만으로 정확한 분석이 가능한 G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the problems of the prior art as described above, and it is an object of the present invention to provide a method for directly analyzing G6PD activity in a liquid-phase array without fixing a probe on the surface of the array, It is an object of the present invention to provide a composition for measuring activity of G6PD capable of accurate analysis with only a small volume of sample, a kit containing the same, and a method for measuring the activity of G6PD.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, NADP+, G6P, 레자주린(resazurin) 및 디아포라제를 포함하는, G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 G6PD의 활성도 측정방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a composition for measuring the activity of G6PD comprising NADP + , G6P, resazurin and diaphorase, a kit containing the same, and a method for measuring activity of G6PD using the composition .

본 발명의 G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법은 어레이 표면에 프로브를 고정하지 않고 액상 어레이의 형태로 직접분석이 가능할 뿐 아니라, 민감도가 현저히 우수하며, G6PD 활성의 실시간 측정이 가능하며, 매우 소량의 체적의 시료만으로 정확한 분석이 가능하다. 따라서, 본 발명의 G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법을 이용하여, 세포 및 혈액 시료내의 G6PD 효소의 동력학적 파라미터를 고속 처리 방식으로 정량적으로 분석하는데 사용될 수 있고, 여러 가지 G6PD-관련 질환의 진단 및 신약 개발 연구에도 이용될 수 있다. The composition for measuring the activity of G6PD of the present invention, the kit containing the same, and the method for measuring the activity of G6PD can be directly analyzed in the form of a liquid array without fixing the probe on the array surface, and the sensitivity is remarkably excellent. Real-time measurements are possible and accurate analysis is possible with only a very small volume of sample. Therefore, the present invention can be used for quantitatively analyzing kinetic parameters of G6PD enzyme in cells and blood samples using a composition for measuring activity of G6PD, a kit containing the same, and a method for measuring activity of G6PD, It can also be used in the diagnosis of various G6PD-related diseases and in the development of new drugs.

도 1은 본 발명의 G6PD의 활성도 측정용 어레이 키트 및 G6PD의 활성도 측정 방법의 개략도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 G6PD의 활성도 측정용 어레이 키트에서의 어레이 스팟에 대한 RFI에 따른 액상 레조루핀 표준 곡선이고 (a), 레자주린(b) 및 디아포라제(c)의 최적 농도의 측정한 결과이다.
도 3은 G6PD의 활성도 측정용 어레이 키트를 이용한 G6PD의 활성분석의 특성을 나타낸 그래프로, 도 3a는 레조루핀 농도에 따른 액상 G6PD 표준 곡선이며, 도 3b는 세 개의 상이한 어레이 상에서 여러 농도의 G6PD (0 to 50 mU/ml)에 의해 생성된 레조루핀 농도를 분석하여 어레이간 재현성을 측정한 결과로, R2는 측정 계수이다.
도 4는 G6PD의 활성도 측정용 어레이 키트를 이용한 CuCl 에 의한 G6PD의 억제 평가 결과이다.
도 5는 G6PD의 활성도 측정용 어레이 키트를 이용한 실시간 측정에 의한 NADP+ 및 G6P에 대한 G6PD 활성의 동력학적 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 G6PD의 활성도 측정용 어레이 키트를 이용하여, 정상의 건강한 개체 및 염증성 질환 환자 유래의 인간 혈장 시료내의 G6PD 활성의 고속 처리 측정한 결과이다. 도 6a는 G6PD 활성의 분포(***p<0.001)를 나타내고, 도 6b는 염증성 질환 환자 유래의 혈장에 대한 ROC 도를 나타낸다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 의한, G6PD의 활성도 측정용 어레이 키트의 구조를 나타낸 그림이다.1 shows a schematic diagram of an array kit for measuring activity of G6PD of the present invention and a method for measuring the activity of G6PD.
FIG. 2 is a graph showing a liquid resorufinus standard curve according to RFI for an array spot in an array kit for measuring the activity of G6PD of the present invention, wherein (a), (b) and (c) Results.
FIG. 3 is a graph showing the characteristics of the activity analysis of G6PD using an array kit for measuring the activity of G6PD, wherein FIG. 3a is a liquid G6PD standard curve according to the resorufin concentration, and FIG. 3b is a graph showing the concentration of G6PD 0 to 50 mU / ml) and the reproducibility between the arrays was measured. R2 is a measurement coefficient.
FIG. 4 shows the result of inhibition of G6PD by CuCl using an array kit for measuring the activity of G6PD.
FIG. 5 is a kinetic analysis result of G6PD activity on NADP + and G6P by real-time measurement using an array kit for measuring the activity of G6PD.
Fig. 6 shows the result of measurement of G6PD activity in human plasma samples derived from normal healthy individuals and patients with inflammatory diseases at high speed using an array kit for measuring activity of G6PD of the present invention. Figure 6a shows the distribution of G6PD activity (*** p < 0.001), and Figure 6b shows the ROC figure for plasma derived from patients with inflammatory disease.
7 is a diagram showing the structure of an array kit for measuring the activity of G6PD according to an embodiment of the present invention.

본 발명은, NADP+, G6P, 레자주린(resazurin) 및 디아포라제를 포함하는, G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법에 대한 것이다. 본 발명의 G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법은, G6PD 활성의 실시간 측정을 위한 레자주린의 레조루핀으로의 비가역적 환원을 이용한 액적 어레이에 기반한 온-칩 G6PD 활성 분석법으로, 민감도가 높고, 재현가능하고, 정량적이다. 또한, 단지 소량(1 ㎕)의 시료만으로, 정확한 검출이 가능하므로 고속 처리 분석에 적당하다.The present invention relates to a composition for measuring activity of G6PD comprising NADP + , G6P, resazurin and diaphorase, a kit comprising the same, and a method for measuring the activity of G6PD. The composition for measuring the activity of G6PD of the present invention, the kit comprising the same, and the method for measuring the activity of G6PD are characterized in that on-chip G6PD activity based on a droplet array using irreversible reduction of rezurin to rezorufin for real time measurement of G6PD activity It is sensitive, reproducible, and quantitative. In addition, it is suitable for high-speed processing analysis because only a small amount (1 μl) of sample can be accurately detected.

구체적으로, 본 발명에 따른 G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법에서, 정량적 G6PD 활성은 액적(liquid droplet)내의 환원된 레조루핀(resorufin) 농도를 계산함으로써 측정되었다. 본 발명의 분석법의 검출 한계(LOD)는 0.162 mU/ml (2.89 pM)로, 종래의 분석법(0.25 nM) (Preuss et al., 2012; Preuss et al., 2013)보다 약 100배 더 민감하다. 또한, 본 발명을 이용하여, NADP+ 및 G6P에 대한 효소 반응의 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 상수(Km) 및 최대 속도(Vmax), 및 반수 최대 억제 농도(IC50)를 비롯한 동력학적 파라미터들을 측정하였다. Specifically, in the composition for measuring the activity of G6PD according to the present invention, the kit containing the same and the method for measuring the activity of G6PD, the quantitative G6PD activity was measured by calculating the reduced resorufin concentration in the liquid droplet. The detection limit (LOD) of the assay of the present invention is about 100 times more sensitive than the conventional assay (0.25 nM) (Preuss et al., 2012; Preuss et al., 2013) at 0.162 mU / . In addition, the enzymatic reaction for using the present invention, NADP + and G6P Michael-less-menten (Michaelis-Menten) constant (K m) and maximum rates (V max), and half of the maximum, including the inhibitory concentration (IC 50) Kinetic parameters were measured.

이하, 본 발명을 구성별로 상세히 설명한다. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS

본 발명은, G6PD의 활성도 측정용 조성물에 대한 것이다. The present invention relates to a composition for measuring the activity of G6PD.

구체적으로, 본 발명은 NADP+, G6P, 레자주린(resazurin) 및 디아포라제를 포함하는, G6PD의 활성도 측정용 조성물에 대한 것이다. 도 1에서 도시한 바와 같이 본 발명의 조성물은, G6PD 활성이 비형광성 NADP+의 형광성 NADPH로의 전환에 기여하고, NADPH에 의한 비형광성 레자주린(resazurin)의 형광성 레조루핀으로의 비가역적 환원에 기반하여 G6PD 활성을 정량적으로 분석한다. Specifically, the present invention relates to a composition for measuring the activity of G6PD comprising NADP + , G6P, resazurin and diaphorase. As shown in FIG. 1, the composition of the present invention is based on the fact that G6PD activity contributes to the conversion of non-fluorescent NADP + into fluorescent NADPH and is due to the irreversible reduction of non-fluorescent resazurin to fluorescent fluorescent resorcin To quantitatively analyze G6PD activity.

본 발명의 조성물은, 상기 레자주린(resazurin)으로부터 비가역적으로 환원된 레조루핀(resorufin)의 농도를 측정하여 상기 G6PD의 활성도를 측정하는 것일 수 있다. 상기 레자주린 환원에 의해 형성된 레조루핀의 농도는 식(1)을 이용하여 계산할 수 있다. 또한, 상기 레조루핀(resorufin)의 농도는, 도 3a의 표준 곡선에 적용하여 G6PD의 활성도를 측정하는 것 일 수 있다. The composition of the present invention may be one that measures the activity of G6PD by measuring the concentration of resorufin that is irreversibly reduced from the resazurin. The concentration of resorufin formed by the rezazurin reduction can be calculated using Equation (1). In addition, the concentration of resorufin may be determined by measuring the activity of G6PD by applying the standard curve of FIG. 3A.

RFI는 효소적 반응을 통해 레자주린으로부터 전환된 레조루핀의 양에 의존하기 때문에, 본 발명의 G6PD의 활성도 측정용 조성물에 포함된 레자주린의 농도는 G6PD 활성의 고감도 분석에 매우 중요하다. 상기 조성물에 20 mU/ml의 G6PD가 포함된 경우, 레자주린의 농도가 0.2 내지 10 uM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 uM일 수 있다. Since RFI depends on the amount of resorufin converted from rezazurin through an enzymatic reaction, the concentration of rezazurin contained in the composition for measuring activity of G6PD of the present invention is very important for high sensitivity analysis of G6PD activity. When the composition contains 20 mU / ml of G6PD, the concentration of the rezajulin may be 0.2 to 10 uM, and most preferably 5 uM.

G6PD에 대한 레자주린의 비율의 증가에 따라, 0.2 내지 5 uM의 범위의 레자주린을 사용하였을 때 signal/noise 비율은 선형으로 증가하여 5 uM 에서 최대치를 보이고, 10 uM 에서는 다시 감소하였으므로, 5 uM 레자주린이 20 mU/ml까지의 G6PD의 검출 및 G6PD의 동력학적 연구에 최적인 것으로 확인되었다. 10 uM 을 초과하는 레자주린이 포함되는 경우, (signal/noise 비율이 감소)하여 바람직하지 않다. As the ratio of Rezadulin to G6PD increased, the signal / noise ratio increased linearly with maximal value at 5 uM and decreased again at 10 uM when Rezadulin in the range of 0.2 to 5 uM was used, Rezazurin was found to be optimal for detection of G6PD up to 20 mU / ml and kinetic studies of G6PD. If leucadin exceeding 10 uM is included (signal / noise ratio is decreased), it is not preferable.

또한, 상기 조성물에 포함된 디아포라제의 농도가 0.1 내지 1.0 U/ml 인 경우 액적내 환원된 레조루핀의 양이 디아포라제에 대해 농도의존적으로 증가하는 것이 확인되었으므로 디아포라제의 농도가 0.1 내지 1.0 U/ml인 것이 바람직하며, 특히 0.5 U/ml에서 레자주린의 환원율이 최대치를 보이기 때문에 최적인 것으로 확인되었다. In addition, it was confirmed that when the concentration of the diaphorase contained in the composition was 0.1 to 1.0 U / ml, the amount of resorufin reduced in the droplet was increased in a concentration-dependent manner relative to the diaphorase, To 1.0 U / ml, and it was confirmed to be optimal because the reduction ratio of rezazurin is maximized at 0.5 U / ml.

한편, 본 발명은, 효소의 활성도 측정용 어레이 키트에 대한 것이다. On the other hand, the present invention relates to an array kit for measuring enzyme activity.

구체적으로, 본 발명의 어레이 키트는, 반응 어레이; 상기 반응 어레이 상에 도포된 효소 활성도 측정용 조성물과 활성도 측정 대상 시료의 액상 혼합물; 및 상기 액상 혼합물의 증발을 방지하기 위한 커버를 포함한다. Specifically, the array kit of the present invention comprises a reaction array; A liquid mixture of a composition for measuring enzyme activity applied on the reaction array and a sample to be measured; And a cover for preventing evaporation of the liquid mixture.

상기 어레이 키트는, 웰-타입 어레이 키트일 수 있으며, 물방울 형태의 어레이를 사용하는 것일 수 있다. 또한, 상기 웰의 크기는 특별히 제한되지 않는다. 일예로, 도 7의 구조를 갖는 어레이 키트일 수 있다.The array kit may be a well-type array kit and may be an array of water droplets. The size of the well is not particularly limited. For example, it may be an array kit having the structure of FIG.

이와 같은, 본 발명의 어레이 키트의 특징적인 구조에 의해, 어레이 표면에 프로브를 고정하지 않고 액상 어레이의 형태로 직접분석이 가능한 액상 어레이의 형태로 직접분석이 가능하다. 따라서, 종래 어레이 기반 방법이 ELISA기반 방법에 비해 용액의 확산거리가 짧아 반응이 빠르기 때문에 민감도가 증가될 가능성이 높지만, 시료의 양이 작아 증발이 쉽기 때문에 장시간 동안 실시간으로 측정하는 데는 한계가 있는 단점을 획기적으로 개선하였다.By such a characteristic structure of the array kit of the present invention, it is possible to directly analyze in the form of a liquid-phase array which can be directly analyzed in the form of a liquid-phase array without fixing the probe on the array surface. Therefore, the conventional array-based method is more likely to increase the sensitivity because the diffusion distance of the solution is shorter than that of the ELISA-based method. However, since the amount of the sample is small and it is easy to evaporate, .

이에 따라, 본 발명의 어레이 키트는, 활성도 측정 대상 시료의 양이 매우 적은 경우에도, 높은 민감도로 효소 활성도를 측정할 수 있다. 즉, 종래의 multi-well plate 기반의 측정 방법은, 시료의 양이 최소 10 ㎕ 필요하고 민감도가 낮지만, 본 발명의 키트를 사용하면, 시료 양이 1 ㎕만으로도 종래 방법 보다 민감도가 10배 이상 높은 장점이 있다. Thus, the array kit of the present invention can measure the enzyme activity with high sensitivity even when the amount of the sample to be assayed is very small. That is, in the conventional multi-well plate-based measurement method, a minimum amount of 10 μl of sample is required and the sensitivity is low. However, when the kit of the present invention is used, sensitivity of 10 times or more There is a high advantage.

본 발명의 어레이 키트로 활성도를 측정할 수 있는 효소는 프로테아제(protease), 키나아제(kinase), 탈인산화효소(diphosphatase), 탈수소효소(dehydrogenase) 또는 산화환원효소(oxidoreductase)이거나, 이들의 혼합물 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 본 발명의 어레이 키트로 활성도를 측정할 수 있는 효소는 G6PD 일 수 있다. The enzyme capable of measuring activity with the array kit of the present invention may be protease, kinase, diphosphatase, dehydrogenase or oxidoreductase, or a mixture thereof. But are not limited thereto. Preferably, the enzyme capable of measuring activity with the array kit of the present invention can be G6PD.

본 발명의 일 실시예로, G6PD 활성도 측정을 위한 어레이 키트의 경우, 반응 어레이; 상기 반응 어레이 상에 도포된 G6PD의 활성도 측정용 조성물과 활성도 측정 대상 시료의 액상 혼합물; 및 액상 상기 혼합물의 증발을 방지하기 위한 커버를 포함할 수 있다. In one embodiment of the invention, in the case of an array kit for measuring G6PD activity, a reaction array; A liquid mixture of a composition for measuring the activity of G6PD applied on the reaction array and a sample to be measured; And a cover for preventing evaporation of the liquid mixture.

본 발명의 어레이 키트를 이용한 효소 활성 측정은, 효소 활성도 측정용 조성물과 활성도 측정 대상 시료의 반응에 따라 발생하는 형광을 측정하는 것으로, 수행될 수 있다. 이때, 상기 형광 측정은 액상의 형광을 측정할 수 있는 기기를 이용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 초점을 z축 방향으로 움직여서 맞출 수 있는 형광스캐너, 형광현미경 또는 공초점 현미경을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 어레이 키트 하단부로부터 스캐닝 렌즈가 5mm 이상 떨어진 형광스캐너, 형광현미경 또는 공초점 현미경을 사용할 수 있다. The enzyme activity measurement using the array kit of the present invention can be performed by measuring the fluorescence generated according to the reaction between the composition for measuring enzyme activity and the sample to be assayed for activity. At this time, it is preferable to use a device capable of measuring the fluorescence of the liquid phase, and specifically, a fluorescence scanner, fluorescence microscope or confocal microscope capable of moving the focus in the z-axis direction can be used. Preferably, a fluorescence scanner, fluorescence microscope or confocal microscope having a scanning lens separated from the lower end of the array kit by 5 mm or more may be used.

또한, 본 발명은, G6PD의 활성도 측정방법을 제공하며, 구체적으로, 상기의 G6PD의 활성도 측정용 조성물과 G6PD의 활성도 측정 대상 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 조성물의 레자주린(resazurin)으로부터 비가역적으로 환원된 레조루핀(resorufin)의 농도를 측정하여 G6PD의 활성도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. The present invention also provides a method of measuring the activity of G6PD, and more particularly, to a method for measuring the activity of G6PD, comprising the steps of: reacting a composition for measuring activity of G6PD with a sample to be assayed for activity of G6PD; And measuring the activity of G6PD by measuring the concentration of resorufin that is irreversibly reduced from resazurin of the composition.

또한, 본 발명은, 상기의 G6PD의 활성도 측정용 조성물을 포함하는 G6PD 결핍증 진단용 바이오마커 또는 시약을 제공한다. The present invention also provides a biomarker or reagent for G6PD deficiency diagnosis comprising the composition for measuring the activity of G6PD.

상기 G6PD 결핍증은 G6PD 결핍에 의한 염증성 질환, 감염증, 잠두(fava beans), 용혈성 빈혈, 심부전증, 제2형 당뇨병, 알도스테론-유발 내피세포 기능부전, 고혈압 및 종양 중 하나 이상의 질병일 수 있다. The G6PD deficiency may be one or more diseases of inflammatory disease, infection, fava beans, hemolytic anemia, heart failure, type 2 diabetes, aldosteron-induced endothelial dysfunction, hypertension and tumor due to G6PD deficiency.

종래의 G6PD 분석법에서는, 에서의 민감도의 한계로 인해 인간 혈장 시료에 대하여 적용이 극히 어려웠으나, 본 발명에서는 인간 혈장 시료(n=60)에서의 G6PD 활성을 성공적으로 측정했고, G6PD 활성은 G6PD 결핍에 의한 염증성 질환 등에 대한 가능한 바이오마커 또는 진단용 시약으로 활용 가능하다. In the conventional G6PD assay, it was extremely difficult to apply to human plasma samples because of the sensitivity limit at, but in the present invention, G6PD activity in human plasma samples (n = 60) was successfully measured and G6PD activity was measured by G6PD deficiency As a possible biomarker or diagnostic reagent for inflammatory diseases caused by inflammatory diseases or the like.

본 발명에 따른 G6PD의 활성도 측정용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 G6PD의 활성도 측정방법은 그 높은 민감도로 인해, 이러한 온-칩 분석법은 정상의 건강한 개체 및 염증 환자 유래의 인간 혈장(n=60)에서의 G6PD 활성의 정량적 측정을 위해 성공적으로 사용되었다. 즉, 본 발명의 실험결과에 의하면, 정상의 건강한 개체(n=30) 및 염증 환자(n=30) 유래의 인간 혈장에서 G6PD 활성을 측정하기 위해 이러한 새로운 분석법을 성공적으로 적용하였으며, 염증군은 정상군보다 아주 더 높은 G6PD 활성을 나타냈는데(p<0.001), 0.939의 높은 곡선하 면적값을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 새로운 활성 분석법은 동력학적 연구(kinetic study)를 이용한 G6PD-관련 질환의 진단에 적용 가능함을 실험적으로 확인하였다. Since the composition for measuring the activity of G6PD according to the present invention, the kit containing the same, and the method for measuring the activity of G6PD have high sensitivity, the on-chip assay can be applied to human plasma (n = 60) Lt; RTI ID = 0.0 &gt; G6PD &lt; / RTI &gt; That is, according to the experimental results of the present invention, this new assay was successfully applied to measure G6PD activity in human plasma derived from healthy normal subjects (n = 30) and inflammatory patients (n = 30) Showed a much higher G6PD activity than the normal group (p <0.001), indicating a high area under the curve of 0.939. Therefore, the novel activity assay of the present invention has been experimentally confirmed to be applicable to the diagnosis of G6PD-related diseases using a kinetic study.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예 및 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples. These Examples and Experiments are only for illustrating the present invention, and thus the scope of the present invention is not construed as being limited by these Examples and Experimental Examples.

참조예Reference Example

(1) 화학적 시약(1) Chemical reagents

NADP+, G6P, 레자주린, 디아포라제(diaphorase) 및 G6PD는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO)로부터 구입했다. 폴리(디메틸실록산) (PDMS) 용액은 세왕 하이테크사(대한민국, 김포)로 부터 수득하였다.NADP + , G6P, Rezazurin, diaphorase and G6PD were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.). The poly (dimethylsiloxane) (PDMS) solution was obtained from Seowang Hi-Tech Co., Ltd. (Kimpo, Korea).

(2) 혈장 시료와 헤모글로빈 및 NADPH 농도의 측정(2) Measurement of plasma sample, hemoglobin and NADPH concentration

정상의 건강한 개체{n=30; 남성=16 (연령, 56.8±19.9세) 및 여성=14 (46.6±17.1세)} 및 3 ㎍/ml 이상의 C-반응성 단백질(CRP) 농도를 갖는 염증성 질환 환자{n=30; 남성 =13 (63.9±12.1 세) 및 여성 =17 (71.2±11.9세)}로부터 채취한 혈장 시료는 강원대학교 병원 바이오뱅크(대한민국 국립 바이오뱅크의 멤버)로부터 얻어서 사용시까지 -80°C에서 보관했다. 인간 시료를 이용한 실험은 인간을 대상으로 한 연구에 대한 지방 연구소의 윤리 위원회의 승인 하에 수행하였다.Normal healthy individuals {n = 30; Patients with inflammatory disease {n = 30; male: 16 (age, 56.8 + 19.9 years) and female = 14 (46.6 + 17.1 years)} and C-reactive protein (CRP) Plasma samples taken from male = 13 (63.9 ± 12.1 years old) and female = 17 (71.2 ± 11.9 years old) were obtained from Kangwon National University Hospital Bio Bank (Korea National Biobank) and stored at -80 ° C. until use . Experiments using human samples were conducted under the approval of the ethics committee of the local institute for research on human subjects.

인간 혈장 시료(n=60)내의 헤모글로빈 농도는 Sigma-Aldrich사로부터 얻은 헤모글로빈 분석 키트를 이용하여 제조사의 지시에 따라 분석했다. 60개의 인간 혈장 시료내의 NADPH 농도는, 알려진 방법에 의해 VersaMax Tunable Microplate Reader (Molecular Devices; Sunnyvale, CA)를 이용하여 340 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 측정했다 (Baird et al., 2015).Hemoglobin concentrations in human plasma samples (n = 60) were analyzed using a hemoglobin assay kit from Sigma-Aldrich according to the manufacturer's instructions. NADPH concentrations in 60 human plasma samples were determined by measuring the absorbance at 340 nm using a VersaMax Tunable Microplate Reader (Molecular Devices; Sunnyvale, Calif.) By known methods (Baird et al., 2015).

(3) 데이터 분석(3) Data analysis

Mapix 소프트웨어(Innopsys)를 이용하여 RFI를 정량하고 데이터를 추출했다. G6PD 활성 분석의 LOD는 다음 식을 이용하여 계산했다: LOD = 블랭크 + S.D. × 3. 상기 식에서, S.D.는 블랭크(blank) 시료의 표준 편차이다. 두 집단을 비교하기 위하여, Origin 9.2 Pro 소프트웨어 패키지(Origin Lab, Northampton, MA)를 이용하여 t 테스트를 수행했다. p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. Origin 9.2 Pro 소프트웨어를 이용하여 수신기 작동 특성(ROC) 분석을 수행하여 민감도, 특이도 및 곡선하 면적 (AUC)을 계산했다.Mapix software (Innopsys) was used to quantify the RFI and extract the data. The LOD of the G6PD activity assay was calculated using the following equation: LOD = blank + SD x 3. where SD is the standard deviation of the blank sample. To compare the two groups, a t test was performed using the Origin 9.2 Pro software package (Origin Lab, Northampton, Mass.). A p value <0.05 was considered statistically significant. Receiver operating characteristics (ROC) analysis was performed using Origin 9.2 Pro software to calculate sensitivity, specificity and area under the curve (AUC).

실시예Example 1.  One. G6PD의G6PD's 활성도 측정용 어레이  Arrays for activity measurement 키트의Of kit 제작 및  Production and G6PD의G6PD's 활성도 측정 Activity measurement

도 1은, 본 발명의 G6PD의 활성도 측정용 어레이 키트 및 G6PD의 활성도 측정 방법의 개략도를 나타낸다. 구체적으로, 다음 방법에 따라 본 발명의 G6PD의 활성도 측정용 어레이 키트를 제조하여, G6PD의 활성도를 평가하였다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 shows a schematic diagram of an array kit for measuring the activity of G6PD of the present invention and a method for measuring the activity of G6PD. Fig. Specifically, an array kit for measuring activity of G6PD of the present invention was prepared according to the following method to evaluate the activity of G6PD.

(1) PDMS 가스켓을 이용한 웰-타입 어레이의 제작(1) Fabrication of well-type array using PDMS gasket

웰-타입 어레이를 알려진 방법에 의해 제작했다(Kim et al., 2015). 즉, 유리 슬라이드(75 × 25 mm)를 H2O2/NH4OH/H2O 용액 (1:1:5, v/v)으로 세척했다. 용액이 버블에 의해 흐릿하게 될 때까지 5 g PDMS 기재(base)와 0.5 g 경화제를 혼합하여 PDMS 프리폴리머(prepolymer) 용액을 제조했다. 탈기를 30분간 수행했다. 그 혼합물을 기둥(pole; 1-mm 직경 및 0.3-mm 높이)들이 배열된 크롬 코팅된 구리 몰드에 주입했다. 그 몰드를 84°C에서 90분간 정치하고, 1 mm 직경의 배열된 구멍들을 포함하는 PDMS 가스켓을 분리했다. 깨끗한 유리 슬라이드상에 PDMS 가스켓을 배치하여 웰-타입 어레이를 제작했다.Well-type arrays were made by known methods (Kim et al., 2015). That is, a glass slide (75 x 25 mm) was washed with a H 2 O 2 / NH 4 OH / H 2 O solution (1: 1: 5, v / v). The PDMS prepolymer solution was prepared by mixing 5 g of PDMS base with 0.5 g of curing agent until the solution became blurred by bubbles. Degassing was carried out for 30 minutes. The mixture was injected into a chromium-coated copper mold with poles (1-mm diameter and 0.3-mm height) arranged. The mold was allowed to stand at 84 [deg.] C for 90 minutes, and the PDMS gasket containing aligned holes of 1 mm diameter was separated. A PDMS gasket was placed on a clean glass slide to form a well-type array.

(2) G6PD 에 의해 생성된 레조루핀의 정량을 위한 액상 표준 곡선(2) Liquid standard curve for determination of resorufinel produced by G6PD

G6PD에 의해 생성된 레조루핀의 정량적 분석을 위하여, 액상 표준 곡선을 사용했다(Jung and Ha, 2015). 1 ㎕의 50-mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 용해된 여러 농도의 레조루핀을 웰-타입 어레이에 도포했다. 커버슬립을 어레이상에 배치하여 증발을 방지했다. 543-nm 레이저를 구비한 형광 스캐너(InnoScan 300, Innopsys, Carbonne, France)를 이용하여 어레이를 즉시 분석했다. 포함된 소프트웨어를 이용하여 어레이 스팟(array spots)의 상대 형광 세기(RFIs)를 측정했다. 액적 내의 레조루핀 농도는 하기 식(1)을 이용하여 계산했다:For the quantitative analysis of resorufin produced by G6PD, a liquid standard curve was used (Jung and Ha, 2015). Several concentrations of resorufin, dissolved in 1 [mu] l of 50-mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), were applied to a well-type array. The cover slip was placed over the array to prevent evaporation. The array was immediately analyzed using a fluorescent scanner (InnoScan 300, Innopsys, Carbonne, France) equipped with a 543-nm laser. The relative fluorescence intensities (RFIs) of the array spots were measured using the included software. The resorufin concentration in the droplets was calculated using the following equation (1): &lt; RTI ID = 0.0 &gt;

Figure 112015129182722-pat00001
(1)
Figure 112015129182722-pat00001
(One)

상기 식에서, x는 액적 내의 레조루핀 농도이고, A는 선형 회귀를 위한 기울기이고, y 는 시료의 RFI 이다.Where x is the resorufin concentration in the droplet, A is the slope for linear regression, and y is the RFI of the sample.

(3) 물방울 형태의 액적 어레이(liquid droplet arrays)를 이용한 G6PD 활성의 정량적 분석 (3) Quantitative analysis of G6PD activity using liquid droplet arrays

도 1에서 도시한 바와 같이 비형광성 레자주린의 형광성 레조루핀으로의 비가역적 환원에 기반하여 G6PD 활성을 정량적으로 분석했다. 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5)에서 2uM NADP+, 50uM G6P, 5 uM 레자주린, 0.5 U/ml 디아포라제 및 여러 농도의 G6PD (1내지 50 mU/ml의 범위) 또는 2배 희석된 인간 혈장 시료 (n=60)을 함유하는 1 ㎕의 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 30분간 도포했다. 다음에, 형광 스캐너(Innopsys 300)를 이용하여 액적 어레이를 분석했다. 레자주린으로부터 비가역적으로 환원된 레조루핀의 농도를 레조루핀 표준 곡선을 이용하여 계산함으로써 G6PD 활성을 측정했다. G6PD activity was quantitatively analyzed based on irreversible reduction of non-fluorescent rezazoline to fluorescent resorufin, as shown in Fig. 50 mM Tris-HCl buffer, the (pH 7.5) in 2uM NADP +, 50uM G6P, 5 uM leather hungry, 0.5 U / ml Dia Fora claim and G6PD (1 to 50 mU / ml range) in different concentrations, or 2-fold dilution 1 [mu] l of the reaction mixture containing human plasma sample (n = 60) was applied to the well-type array for 30 minutes. Next, the droplet array was analyzed using a fluorescent scanner (Innopsys 300). G6PD activity was measured by calculating the irreversibly reduced resorufinin concentration from the resazurin using the resorufin standard curve.

(4) 물방울 형태의 액적 어레이(liquid droplet arrays)를 이용한 G6PD의 동력학적 연구 (4) Kinetic study of G6PD using liquid droplet arrays

두 가지 기질의 Km을 측정하기 위하여, 여러 농도의 NADP+ (0.1 내지 5 uM) 또는 G6P (5 내지 100 uM)를 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에서 5 uM 레자주린, 0.5 U/ml 디아포라제 및 20 mU/ml G6PD를 함유하는 용액과 혼합했다. 1 ㎕의 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 도포했다. 어레이를 80초 마다 스캐닝했다. 그 효소 용액의 초기 속도를, 반응 시간에 따른 환원 레조루핀 농도의 선형 회귀로부터 얻어지는 기울기로서 측정했다. 하기의 미카엘리스-멘텐 식을 이용하여 미카엘리스 상수를 계산했다:To determine the K m of the two substrates, various concentrations of NADP + (0.1 to 5 uM) or G6P (5 to 100 uM) were incubated in 5 mM Rezadulin, 0.5 U / ml in 50 mM Tris-HCl buffer Diarrhea and 20 mU / ml G6PD. 1 [mu] l of the reaction mixture was applied to a well-type array. The array was scanned every 80 seconds. The initial rate of the enzyme solution was measured as the slope obtained from the linear regression of the reduced resorufin concentration with the reaction time. The Michaelis constant was calculated using the following Michaelis-Menten equation:

V0 = (Vmax[S]) / (Km + [S]) (2)V 0 = (V max [S]) / (K m + [S]) (2)

상기 식에서, V0는 초기 속도이고, Vmax는 최대 초기 속도이고, [S]는 기질 펩티드의 초기 농도이고, Km는 측정된 반응 속도가 Vmax의 절반인 때 얻어지는 값이다.Where V 0 is the initial velocity, V max is the maximum initial velocity, [S] is the initial concentration of the substrate peptide, and K m is the value obtained when the measured reaction rate is half of V max .

실시예Example 2.  2. G6PD의G6PD's 활성도 측정용 어레이  Arrays for activity measurement 키트를Kit 이용한  Used G6PDG6PD 활성 분석의 최적화 Optimization of activity analysis

G6PD 활성의 정량적 분석을 위하여, 도 1에서 예시한 바와 같이 레자주린의 레조루핀으로의 비가역적 환원에 기반한 액적 어레이를 이용하는 온-칩 활성 분석법을 실험하였다. G6PD는 G6P를 6-포스포글루코노-δ-락톤으로 전환하는 효소적 반응 동안 NADPH를 생성한다. G6PD에 의해 생성된 NADPH는 디아포라제에 의해 탈수소화되고, 그 배출된 양자(proton)는 비형광성 레자주린을 형광성 레조루핀으로 화학양론적으로 환원시킨다. 따라서, 환원된 레조루핀의 양은 레자주린 농도 및 G6PD 활성과 밀접한 관련이 있다.For quantitative analysis of G6PD activity, an on-chip activity assay using a droplet array based on the irreversible reduction of resazurin to resorufin, as illustrated in FIG. 1, was performed. G6PD produces NADPH during an enzymatic reaction that converts G6P to 6-phosphoglucono-delta-lactone. The NADPH produced by G6PD is dehydrogenated by diaphorase and its released proton stoichiometrically reduces non-fluorescent rezazurin to fluorescent resorpin. Thus, the amount of reduced resorufin is closely related to the resazurin concentration and G6PD activity.

(1) G6PD 활성 분석을 위한 최적 레자주린 농도 분석(1) Optimum Rezazurin Concentration for G6PD Activity Assay

액적내 G6PD 활성에 의해 레자주린으로부터 환원된 레조루핀의 정량 분석을 위하여, 레조루핀 농도와 RFI 사이의 선형 회귀를 이용하여 정량적 G6PD 활성 분석법을 위한 액상 표준 곡선을 만들었다. 구체적으로, 상기 식(1)을 이용하여 어레이 스팟의 RFI에 대한 액상 레조루핀 표준 곡선을 만들었다. 액적 내의 레조루핀 농도는 0 내지 5 uM의 범위였고 RFI를 투여량 의존적으로 증가시켰다. 이를 통해 작성한 어레이 스팟에 대한 RFI에 따른 액상 레조루핀 표준 곡선을 도 2a에 나타내었다 (도 2a). For quantitative analysis of resorufin reduced from rezazurin by G6PD activity in the droplet, a linear standard curve for quantitative G6PD activity assay was generated using linear regression between resorufin concentration and RFI. Specifically, a liquid resorufinin standard curve for the RFI of the array spot was prepared using the above equation (1). The resorufin concentration in the droplets ranged from 0 to 5 uM and increased RFI dose-dependently. A liquid resorufinin standard curve according to the RFI for the array spot created by this is shown in Fig. 2A (Fig. 2A).

G6PD 활성 분석을 위한 최적 레자주린 농도를 결정하기 위하여, 20 mU/ml G6PD의 존재 또는 부재하에서 0.2 내지 10 uM 농도 범위의 레자주린을 함유하고, 20 mU/ml G6PD를 갖거나 갖지 않는 1 ㎕의 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 30분간 도포하고 30분간 반응시켰다. 이에 따라 수득한 어레이를 형광 스캐너를 이용하여 분석하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2를 참조하면, G6PD의 존재하에서 어레이 스팟의 RFI는 레자주린 농도에 의존적으로 증가했고, 5 uM 레자주린에서 포화된 반면에, G6PD 부재하의 어레이 스팟의 RFI는 유의적으로 변화되지 않았다 (도 2b).In order to determine the optimal rezazurin concentration for the G6PD activity assay, 1 [mu] l of a solution containing resazurin ranging from 0.2 to 10 uM concentration in the presence or absence of 20 mU / ml G6PD, with or without 20 mU / ml G6PD The reaction mixture was applied to a well-type array for 30 minutes and reacted for 30 minutes. The array thus obtained was analyzed using a fluorescent scanner, and the results are shown in Fig. Referring to FIG. 2, in the presence of G6PD, the RFI of the array spot was increased dependent on the concentration of the rezatherine and saturated at 5 uM Rezaulin, whereas the RFI of the array spot without the G6PD was not significantly changed 2b).

(2) G6PD 활성 분석을 위한 최적 디아포라제 농도 분석(2) Analysis of optimum diaphorase concentration for G6PD activity assay

0.01 내지 1 U/ml 의 농도 범위의 디아포라제를 함유하는 1 ㎕의 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 도포함으로써 G6PD 활성 분석을 위한 디아포라제의 최적 농도를 측정하였다. 즉, 상기 농도 범위의 디아포라제 및 20 mU/ml G6PD를 함유하는 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 도포하고 30분간 반응시켰다. 얻어지는 어레이를 형광 스캐너를 이용하여 분석함으로써 상대 형광 세기(RFI)를 측정했다. 결과는 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± S.D.로 나타내었으며, 도 2에 나타내었다. 도 2를 참조하면, 디아포라제는 투여량 의존적으로 RFI를 증가시켰고, 0.5 U/ml 디아포라제에서 포화되었다(도 2c). The optimal concentration of diaphorase for G6PD activity assay was determined by applying 1 [mu] l reaction mixture containing diaphorase ranging from 0.01 to 1 U / ml to a well-type array. That is, the reaction mixture containing the diazapyrase and 20 mU / ml G6PD in the concentration range described above was applied to the well-type array and allowed to react for 30 minutes. Relative fluorescence intensity (RFI) was measured by analyzing the resulting array using a fluorescence scanner. The results are shown as mean ± SD of three independent experiments and are shown in FIG. Referring to FIG. 2, diaphorase increased RFI in a dose dependent manner and saturates at 0.5 U / ml diaphorase (FIG. 2C).

이러한 결과는 G6PD에 의해 생성된 NADPH의 존재하에서 다아포라제-유도 양자(proton)에 의해 레자주린이 환원될 수 있고, 레자주린 및 디아포라제의 최적 농도가 각각 5 uM 및 0.5 U/ml 이라는 것을 나타낸다.These results indicate that rezazurin can be reduced by polyadenylase-inducible proton in the presence of NADPH produced by G6PD, and optimal concentrations of rezazurin and diaphorase are 5 uM and 0.5 U / ml, respectively .

실험예Experimental Example 1.  One. G6PD의G6PD's 활성도 측정용 웰 타입 어레이  Well type array for activity measurement 키트를Kit 이용한  Used G6PD의G6PD's 활성분석의 특성규명 Characterization of the activity assay

레조루핀 농도를 G6PD 활성으로 전환하기 위하여, 1 내지 50 mU/ml 농도 범위의 G6PD를 함유하는 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 도포함으로써 레조루핀 농도에 대한 또 다른 액상 G6PD 표준 곡선을 만들었다. 구체적으로, 상기 농도의 G6PD을 함유하는 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 30분간 도포하고 형광 스캐너를 이용하여 분석했다. 도 2a의 액상 레조루핀 표준 곡선을 이용하여 G6PD 활성을 정량적으로 분석했다. 여러 농도의 G6PD에 의해 생성된 레조루핀의 양은 반응 시간의 증가에 따라 증가했다(데이터 미도시). 또한, 이러한 온-칩 활성 분석법의 LOD를 결정했다. G6PD 활성 분석법의 검출 한계(LOD)를 하기 식을 이용하여 계산했다: LOD = 블랭크 + S.D. × 3 (식 중, S.D.는 블랭크 시료의 표준 편차이다). 그 결과를 도 3b에 나타내었으며, 결과는 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± S.D.로 표시된다. G6PD는 투여량 의존적으로 레조루핀 농도를 증가시켰는데, 50 mU/ml에서 포화되었다(도 3a). 그 LOD는 기존의 G6PD 활성 분석법의 LOD (Preuss et al., 2012; Preuss et al., 2013)보다 약 100배 더 민감한 0.162 mU/ml (2.89 pM; 도 3a)였다.In order to convert the resorufin concentration to G6PD activity, another liquid G6PD standard curve for resorufin concentration was made by applying a reaction mixture containing G6PD ranging from 1 to 50 mU / ml concentration to a well-type array. Specifically, the reaction mixture containing G6PD at the above concentrations was applied to a well-type array for 30 minutes and analyzed using a fluorescence scanner. The G6PD activity was quantitatively analyzed using the liquid resorpinephin standard curve of Figure 2a. The amount of resorufin produced by various concentrations of G6PD increased with increasing reaction time (data not shown). In addition, the LOD of this on-chip activity assay was determined. The detection limit (LOD) of the G6PD activity assay was calculated using the following equation: LOD = blank + S.D. × 3, where SD is the standard deviation of the blank sample. The results are shown in Figure 3b, and the results are expressed as mean ± SD of three independent experiments. G6PD dose-dependently increased resorufin concentration, saturating at 50 mU / ml (Fig. 3a). The LOD was 0.162 mU / ml (2.89 pM; Fig. 3a), about 100 times more sensitive than the LOD of the existing G6PD activity assay (Preuss et al., 2012; Preuss et al., 2013).

어레이간(inter-array) 및 스팟간(inter-spot) 재현성(reproducibility)을 분석함으로써 우리의 어레이 시스템의 재현성을 평가했다. 어레이간 재현성은 세 개의 상이한 어레이 상에서 G6PD의 투여량 의존적 활성을 분석함으로써 측정하였다. 어레이간 재현성은 높았고 평균 상관 계수가 0.997 + 0.002 (n=3; 도 3b)인 것을 확인했다. 또한, 스팟간 재현성은 단일 어레이 상에서 9개의 반복된 스팟들을 분석함으로써 측정하였다. 그 9개 스팟들의 변동(variation) 계수는 6.32% 였다. 이러한 결과는 이러한 어레이 시스템은 민감도가 높고, G6PD 활성을 고속 처리 분석 방법으로 정량적으로 측정하기에 충분하게 재현될 수 있다는 것을 암시하여 준다.We evaluated the reproducibility of our array system by analyzing inter-array and inter-spot reproducibility. Inter-array reproducibility was determined by analyzing the dose-dependent activity of G6PD on three different arrays. The reproducibility between the arrays was high and the average correlation coefficient was found to be 0.997 + 0.002 (n = 3; Fig. 3b). Spot repeatability was also measured by analyzing 9 repeated spots on a single array. The variation coefficient of the nine spots was 6.32%. These results imply that these array systems are highly sensitive and can be replicated sufficiently to quantitatively measure G6PD activity using high throughput assay methods.

실험예Experimental Example 2.  2. G6PD의G6PD's 활성도 측정용 웰 타입 어레이  Well type array for activity measurement 키트를Kit 이용한  Used CuClCuCl 에 의한  On by G6PD의G6PD's 억제 평가 Inhibition assessment

본 발명의 어레이 시스템을 사용하여, 적혈구(RBCs)에서 보고된 억제제인 CuCl의 억제 효과를 조사했다(Baird et al., 2015). 0.1 내지 5 mM의 농도 범위의 CuCl 및 20 mU/ml G6PD를 함유하는 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 30분간 도포했다. G6PD 활성을 측정하여, CuCl을 함유하지 않는 대조 반응의 활성의 백분율로 표시하여 도 4에 나타내었다. IC50 은 반수 최대 억제 농도이다.Using the array system of the present invention, the inhibitory effect of CuCl, an inhibitor reported in red blood cells (RBCs), was investigated (Baird et al., 2015). A reaction mixture containing CuCl and a concentration of 20 mU / ml G6PD in a concentration range of 0.1 to 5 mM was applied to the well-type array for 30 minutes. G6PD activity was measured and is shown in Figure 4 as a percentage of the activity of the control reaction without CuCl. IC 50 is the half maximum inhibitory concentration.

CuCl은 투여량 의존적으로 G6PD를 억제했는데, 5 mM에서 최대 효과를 나타냈다(도 4). CuCl의 반수 최대 억제 농도(IC50)는 0.232 mM 였다. 이러한 결과는 상기 액적 어레이가 억제제의 선별에도 유용하다는 것을 입증한다.CuCl inhibited G6PD in a dose-dependent manner, with maximal effect at 5 mM (Fig. 4). The half-maximal inhibitory concentration (IC 50 ) of CuCl was 0.232 mM. These results demonstrate that the droplet array is also useful for screening inhibitors.

실험예Experimental Example 3.  3. G6PD의G6PD's 활성도 측정용 어레이  Arrays for activity measurement 키트를Kit 이용한 실시간 측정에 의한 NADP+ 및  Using real-time measurements of NADP + and G6P에On G6P 대한  About G6PDG6PD 활성의 동력학적 분석 Kinetic analysis of activity

액적 어레이를 이용한 G6PD 활성의 동력학적 연구를 위하여, 두 가지의 기질인 NADP+ (0.1 내지 5 uM) 및 G6P (5 내지 100 uM)를 반응 혼합물에 첨가했다. 20 mU/ml의 G6PD를 함유하는 1 ㎕의 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 도포한 후 G6PD 활성의 정량적 및 실시간 측정을 수행했다. 상기 농도의 NADP+ (a 및 b) 또는 G6P (c 및 d)를 함유하는 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 도포한 후 즉시 형광 스캐너를 이용하여 80초 마다 스캐닝했다. NADP+ (도 5a) 및 G6P (도 5c)의 나타낸 농도에서 G6PD의 반응 속도를, 반응 시간에 따라 G6PD에 의해 생성된 레조루핀의 선형 회귀를 이용하여 계산했다. 동력학적 파라미터는 G6PD, NADP+ (도 5b) 및 G6P (도 5d)에 대한 두 기질에 대한 초기 반응 속도의 비선형 회귀를 이용하여 계산하여, 도 5에 나타내었다.For kinetic studies of G6PD activity using a droplet array, two substrates, NADP + (0.1 to 5 uM) and G6P (5 to 100 uM) were added to the reaction mixture. Quantitative and real-time measurements of G6PD activity were performed after 1 [mu] l of the reaction mixture containing 20 mU / ml of G6PD was applied to a well-type array. A reaction mixture containing the above concentrations of NADP + (a and b) or G6P (c and d) was applied to a well-type array and immediately scanned every 80 seconds using a fluorescence scanner. The rate of the reaction of G6PD at the indicated concentrations of NADP + (Fig. 5A) and G6P (Fig. 5C) was calculated using linear regression of resorufin produced by G6PD according to the reaction time. The kinetic parameters were calculated using a non-linear regression of the initial reaction rate for both substrates for G6PD, NADP + (Figure 5b) and G6P (Figure 5d) and are shown in Figure 5.

G6PD를 함유하는 반응 혼합물의 RFI는 50초 동안 선형적으로 증가하여, G6PD 활성에 의한 레조루핀의 시간 의존적인 형성이 확인되었다(도 5a 및 도 5c). 나타낸 농도의 NADP+ 및 G6P를 함유하는 각각의 액적 어레이에서의 G6PD의 초기 반응 속도를, 반응 시간에 따른 생성 레조루핀 농도의 선형 맞춤(linear fitting)을 통해 계산했다(도 5a 및 도 5c). NADP+ 및 G6P에 대한 레조루핀 농도와 반응 시간 사이의 상관 계수는 각각 0.992 내지 0.998의 범위 및 0.951 내지 0.999의 범위였다. G6PD의 초기 반응 속도는 NADP+ 및 G6P의 농도의 증가에 따라 증가했다. G6PD 활성의 실시간 측정으로부터 유도된 데이터를 이용하여, 상기 두 기질에 대한 효소 반응의 최대 속도(Vmax) 및 미카엘리스 상수(Km)를 측정했다(도 5b 및 도 5d). NADP+ 및 G6P에 대한 G6PD의 Km 값은 각각 5.147 및 291.2 uM인 반면에, NADP+ 및 G6P에 대한 Vmax 값은 각각 0.256 및 0.534 uM/min 이었다. The RFI of the reaction mixture containing G6PD increased linearly for 50 seconds, confirming the time-dependent formation of resorufin by G6PD activity (FIGS. 5A and 5C). The initial reaction rate of G6PD in each droplet array containing the indicated concentrations of NADP + and G6P was calculated through linear fitting of the generated resorufin concentration to reaction time (FIGS. 5A and 5C). The correlation coefficients between the resorufin concentration and the reaction time for NADP + and G6P ranged from 0.992 to 0.998 and from 0.951 to 0.999, respectively. The initial reaction rate of G6PD increased with increasing concentrations of NADP + and G6P. Using the data derived from the real-time measurement of G6PD activity was measured on the maximum speed (V max) and the Michael-less constant (K m) of the enzyme reaction on the two substrates (Figure 5b and 5d). K m values for the G6PD and NADP + G6P is V max values for the NADP + G6P and, on the other hand are respectively 5.147 and 291.2 uM was respectively 0.256 and 0.534 uM / min.

실험예Experimental Example 4.  4. G6PD의G6PD's 활성도 측정용 어레이  Arrays for activity measurement 키트를Kit 인간 혈장 시료에서  In human plasma samples G6PDG6PD 활성의 고속 처리 측정 Fast process measurement of activity

본 발명의 온-칩 활성 분석법이 인간 혈액 시료를 이용한 진단에 적당한 지의 여부를 평가하기 위하여, 우리는 정상의 건강한 개체(n=30) 및 염증성 질환 환자(n=30)로부터 채취한 인간 혈장 시료내의 G6PD 활성을 측정했다. 정상의 건강한 개체(n=30) 및 염증성 질환 환자(n=30) 유래의 인간 혈장 시료를 함유하는 반응 혼합물을 웰-타입 어레이에 도포했다. 상기 물질 및 방법 부분에서 기재한 바와 같이 표준 곡선을 이용하여 혈장 시료의 G6PD 활성을 정량적으로 측정하여 도 6에 나타내었다.In order to evaluate whether the on-chip activity assay of the present invention is suitable for diagnosis using human blood samples, we used human plasma samples collected from normal healthy individuals (n = 30) and inflammatory diseases patients (n = 30) Lt; / RTI &gt; activity was measured. A reaction mixture containing human plasma samples from normal healthy individuals (n = 30) and inflammatory disease patients (n = 30) was applied to a well-type array. The G6PD activity of plasma samples was quantitatively measured using standard curves as described in the Materials and Methods section, and is shown in FIG.

정상군 및 염증군의 평균 G6PD 활성은 각각 0.05 및 0.70 mU/ml 이었으므로, G6PD 활성은 도 6a에서 도시된 바와 같이 정상군보다는 염증 질환군에서 유의하게 높은(p<0.001) 것으로 확인되었다. 그러나, G6PD 활성은 헤모글로빈 농도(r2=0.168) 또는 혈장 NADPH 농도(r2=0.060)와 관련이 없으므로, 파괴된 RBCs 및 혈장 NADPH는 인간 혈장 시료내의 G6PD 활성에 유의하게 기여하지 않은 것으로 확인되었다.The mean G6PD activities of the normal and inflammatory groups were 0.05 and 0.70 mU / ml, respectively, indicating that G6PD activity was significantly higher in the inflammatory disease group than in the normal group (p < 0.001) as shown in FIG. 6a. However, since G6PD activity was not associated with hemoglobin concentration (r 2 = 0.168) or plasma NADPH concentration (r 2 = 0.060), it was found that destroyed RBCs and plasma NADPH did not significantly contribute to G6PD activity in human plasma samples .

염증 바이오마커로서의 G6PD 활성의 유용성을 평가하기 위하여 염증 질환군의 ROC 분석을 수행했다. 염증에 대한 G6PD 활성의 민감도 및 특이도는 0.176 mU/ml의 컷오프 값에서 각각 93.4% 및 86.7% 였는데, 도 6b에서 도시된 바와 같이 0.939의 높은 AUC 값 (95% 신뢰구간, 0.845-0.984)이 확인되었다. To assess the usefulness of G6PD activity as an inflammatory biomarker, ROC analysis of inflammatory disease groups was performed. The sensitivity and specificity of G6PD activity for inflammation were 93.4% and 86.7% at a cutoff value of 0.176 mU / ml, respectively, and a high AUC value (95% confidence interval, 0.845-0.984) of 0.939 as shown in Figure 6b .

본 발명의 실험결과를 참조하면, 정상의 건강한 개체(n=30) 및 염증성 질환 환자(n=30)로부터 채취한 인간 혈장 시료내의 G6PD 활성을 분석함으로써 염증성 질환 등에 대한 바이오마커로서의 G6PD 활성의 유용성을 평가한 결과, 염증성 질환군은 3 ㎍/ml 이상의 CRP 농도를 갖는 개체로부터 채취한 혈장 시료를 포함했다. CRP는 급성기 단백질로서, 통상적인 염증 진단뿐 아니라 심혈관 질환의 발생에 대한 위험 요인으로 평가되는 저등급 염증의 진단을 위해 널리 사용된다. 염증성 질환군의 평균 G6PD 활성은 건강한 대조군의 평균 G6PD 활성보다 유의하게 높았다(p<0.001). 그러나, 혈장 G6PD 활성은 헤모글로빈 및 혈장 NADPH 농도와 관련이 없었으므로, 혈장내의 파괴된 RBCs 및 NADPH는 G6PD 활성에 기여하지 않은 것으로 확인되었다. ROC 분석에서, 염증성 질환군에 대한 G6PD 활성의 측정은 민감도 및 특이도가 높았고, 0.176 mU/ml의 컷오프 값에서 높은 AUC 값을 가졌다. 그러나, G6PD 활성은 정상의 건강한 인간 혈청에서는 검출될 수 없었다. G6PD activity in human plasma samples collected from normal healthy individuals (n = 30) and inflammatory disease patients (n = 30) is analyzed to determine the usefulness of G6PD activity as a biomarker for inflammatory diseases and the like , The inflammatory disease group included plasma samples collected from individuals having a CRP concentration of 3 μg / ml or more. CRP is an acute-phase protein widely used for the diagnosis of low-grade inflammation, which is assessed as a risk factor for the development of cardiovascular disease as well as for the diagnosis of normal inflammation. The mean G6PD activity of inflammatory disease group was significantly higher than that of healthy control group (p <0.001). However, since plasma G6PD activity was not associated with hemoglobin and plasma NADPH concentrations, it was found that destroyed RBCs and NADPH in plasma did not contribute to G6PD activity. In the ROC analysis, the measurement of G6PD activity for inflammatory disease groups was highly sensitive and specific, and had a high AUC value at a cutoff value of 0.176 mU / ml. However, G6PD activity could not be detected in normal healthy human serum.

이러한 결과는 G6PD 활성이 염증 질환의 진단을 위한 가능한 마커라는 것을 암시하여 준다.These results suggest that G6PD activity is a possible marker for the diagnosis of inflammatory diseases.

Claims (15)

반응 어레이; 상기 반응 어레이 상에 도포된 NADP+, G6P, 레자주린(resazurin) 및 디아포라제를 포함하는, G6PD의 활성도 측정용 조성물과 활성도 측정 대상 시료의 액상 혼합물; 및 상기 액상 혼합물의 증발을 방지하기 위한 커버를 포함하는 어레이 키트로서,
상기 G6PD 활성도는 0.162 내지 50 mU/ml인, 어레이 키트. Reaction array; A liquid mixture of a composition for measuring the activity of G6PD and a sample to be assayed, comprising NADP +, G6P, resazurin and diaphorase applied on the reaction array; And a cover for preventing evaporation of the liquid mixture,
Wherein the G6PD activity is 0.162 to 50 mU / ml. 청구항 1에 있어서,
상기 레자주린(resazurin)으로부터 비가역적으로 환원된 레조루핀(resorufin)의 농도를 측정하여 상기 G6PD의 활성도를 측정하기 위한 것인, 어레이 키트.The method according to claim 1,
Wherein the concentration of resorufin irreversibly reduced from the resazurin is measured to measure the activity of the G6PD. 청구항 2에 있어서,
상기 레조루핀(resorufin)의 농도를, 하기 도 3a의 표준 곡선에 적용하여 G6PD의 활성도를 측정하는 것인, 어레이 키트.
(도 3a)
Figure 112017018046810-pat00017

The method of claim 2,
The concentration of resorufin is applied to the standard curve of Figure 3A below to determine the activity of G6PD.
(Fig. 3A)
Figure 112017018046810-pat00017

 청구항 1에 있어서,
상기 조성물에 20 mU/ml의 G6PD가 포함된 경우, 레자주린의 농도가 0.2 내지 10 uM인, 어레이 키트. The method according to claim 1,
Wherein the concentration of Rezadulin is from 0.2 to 10 uM when the composition comprises 20 mU / ml G6PD. 청구항 1에 있어서,
상기 조성물에 20 mU/ml의 G6PD가 포함된 경우, 디아포라제의 농도가 0.1 내지 1 U/ml 인, 어레이 키트. The method according to claim 1,
Wherein the concentration of diaphorase is 0.1 to 1 U / ml when the composition comprises 20 mU / ml of G6PD. 청구항 1에 있어서,
상기 G6PD의 활성도 측정용 조성물과 활성도 측정 대상 시료의 액상 혼합물은 1 ㎕ 이하로 포함되는 것을 특징으로 하는, 어레이 키트.The method according to claim 1,
Wherein the liquid mixture of the composition for measuring the activity of G6PD and the sample for activity measurement is contained in an amount of not more than 1 占 퐇. 청구항 1에 있어서,
상기 어레이 키트는 G6PD 결핍증 진단용인 것을 특징으로 하는, 어레이 키트. The method according to claim 1,
Wherein the array kit is for G6PD deficiency diagnosis. 청구항 7에 있어서,
상기 G6PD 결핍증은 G6PD 결핍에 의한 염증, 잠두(fava beans) 및 용혈성 빈혈 중 하나 이상의 질병인, 어레이 키트.The method of claim 7,
Wherein said G6PD deficiency is one or more diseases of inflammation due to G6PD deficiency, fava beans and hemolytic anemia. 청구항 1에 있어서,
상기 어레이 키트는 G6PD 관련 질병 진단용으로서, 상기 G6PD 관련 질병은 염증성 질환, 심부전증, 제2형 당뇨병, 알도스테론-유발 내피세포 기능부전, 고혈압 및 종양 중 하나 이상의 질병인, 어레이 키트. The method according to claim 1,
Wherein the array kit is for diagnosing G6PD-related diseases, wherein the G6PD-related disease is one or more diseases selected from the group consisting of inflammatory diseases, heart failure, type 2 diabetes, aldosteron-induced endothelial dysfunction, hypertension and tumors. 청구항 1 내지 9중 어느 한항에 있어서,
상기 G6PD의 활성도 측정은, 상기 G6PD의 활성도 측정용 조성물과 활성도 측정 대상 시료의 반응에 따라 발생하는 형광을, 액상의 형광을 측정할 수 있는 기기를 이용하여 측정하는 것인, 어레이 키트. The method according to any one of claims 1 to 9,
Wherein the activity of the G6PD is measured by using a device capable of measuring fluorescence in a liquid state, the fluorescence generated by the reaction between the composition for measuring the activity of G6PD and the sample to be assayed for activity. 청구항 1 내지 9중 어느 한항에 기재된 반응 어레이 키트를 사용하여, 반응 어레이 상에 도포된 NADP+, G6P, 레자주린(resazurin) 및 디아포라제를 포함하는, G6PD의 활성도 측정용 조성물과 G6PD의 활성도 측정 대상 시료를 반응시키는 단계; 및
상기 조성물의 레자주린(resazurin)으로부터 비가역적으로 환원된 레조루핀(resorufin)의 농도를 측정하여 G6PD의 활성도를 측정하는 단계를 포함하는, G6PD의 활성도 측정방법.Using the reaction array kit described in any one of claims 1 to 9, the activity of G6PD and the composition for measuring the activity of G6PD, including NADP +, G6P, resazurin and diaphorase applied on the reaction array Reacting a target sample; And
Measuring the activity of G6PD by measuring the concentration of resorufin irreversibly reduced from resazurin of said composition. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 8. &lt; / RTI &gt; 청구항 11에 있어서,
상기 레조루핀(resorufin)의 농도를, 도 3a의 표준 곡선에 적용하여 G6PD의 활성도를 측정하는 것인, 측정방법.
(도 3a)
Figure 112017074342899-pat00018
The method of claim 11,
The concentration of resorufin is applied to the standard curve of Figure 3A to determine the activity of G6PD.
(Fig. 3A)
Figure 112017074342899-pat00018
 청구항 11에 있어서,
상기 조성물에 20 mU/ml의 G6PD가 포함된 경우, 레자주린의 농도가 0.2 내지 10 uM인, 측정방법.The method of claim 11,
Wherein when the composition contains 20 mU / ml of G6PD, the concentration of the ligand is in the range of 0.2 to 10 uM. 청구항 11에 있어서,
G6PD의 활성도 측정용 조성물과 G6PD의 활성도 측정 대상 시료를 반응시키는 단계에서,
상기 G6PD의 활성도 측정용 조성물과 G6PD의 활성도 측정 대상 시료의 액상 혼합물은 1μl 이하로 포함되는 것을 특징으로 하는, 측정방법.The method of claim 11,
In the step of reacting the composition for measuring the activity of G6PD with the sample to be measured of activity of G6PD,
Wherein the liquid mixture of the composition for measuring activity of G6PD and the sample for measuring the activity of G6PD is contained in an amount of 1 mu l or less. 청구항 11에 있어서,
상기 측정방법은 G6PD 관련 질병 진단용으로서, 상기 G6PD 관련 질병은 염증성 질환, 심부전증, 제2형 당뇨병, 알도스테론-유발 내피세포 기능부전, 고혈압 및 종양 중 하나 이상의 질병인, 측정방법.The method of claim 11,
Wherein said measurement method is for diagnosing G6PD-related diseases, wherein said G6PD-related disease is one or more diseases selected from inflammatory diseases, heart failure, type 2 diabetes, aldosteron-induced endothelial dysfunction, hypertension and tumor.
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