KR101802316B1

KR101802316B1 - Use of controlling radiation sensitivity using miRNA-30

Info

Publication number: KR101802316B1
Application number: KR1020160063426A
Authority: KR
Inventors: 이수재; 최염홍
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2016-05-24
Publication date: 2017-11-28

Abstract

The present invention relates to a use of miRNA-30 for controlling radiation sensitivity, which inquires that the expression of miR-30 increases in cancer cells when irradiated, thereby inducing the malignancy and radiation resistance of cancer cells; and confirms that miR-30 is a therapeutic target of radiation therapy through a miR-30 inhibitor, so as to apply the results to cancer treatment.

Description

Use of controlling radiation sensitivity of miRNA-30

본 발명은 암세포의 악성화 및 방사선 저항성을 조절하는 miRNA-30의 방사선 민감성 조절 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of modulating radiation sensitivity of miRNA-30 to modulate cancer cell malignancy and radiation resistance.

폐암은 현재 암중에서 가장 많이 발생하는 암중의 하나이다. 폐암의 치료에 있어서 가장 큰 특징은 다른 암에 비하여 방사선치료의 의존도가 높다는 것이다. 다른 암에 비하여 그 효과가 크게 나타나지만 또한 그만큼의 부작용이 동반되고 있다. 이러한 부작용은 암세포의 이질성(heterogenety) 특징에 의하여 발생한다. 폐암세포 중에 방사선저항성을 띄고 있는 세포들이 존재하고 있고, 저항성을 갖는 세포들은 방사선 조사를 받게 되면 치료가 되지 않고, 오히려 침윤성이 좋아진다는 보고가 있다.Lung cancer is one of the most common cancer types in cancer now. The greatest feature of lung cancer treatment is its dependence on radiation therapy compared with other cancers. The effect is greater than other cancers, but it also has side effects. These side effects are caused by the heterogeneity of cancer cells. There are reports of cells with radiation resistance in lung cancer cells, and resistant cells can not be treated if they are exposed to radiation, but rather invasive.

최근 암을 치료하는 방법은 다양해졌다. 다양해진 방법들 중에서도 한 가지 방법을 이용한 치료보다는 여러 가지 방법을 병행하고 있다. 그 방법 중에 항암제와 방사선조사를 같이 진행하는 경우가 있다. 하지만, 이러한 방법들은 항암제를 전신 투여해서 다른 기관에 부작용이 동반될 수 있기 때문에 특이하게 원하는 단백질의 발현을 막을 수 있는 방법이 중요하다.Recently, there are many ways to treat cancer. Among various methods, there are various methods instead of one method. In such a method, an anticancer agent and irradiation with radiation may be carried out together. However, these methods are important because it is possible to prevent the expression of a desired protein because systemic administration of an anticancer agent may cause side effects to other organs.

miRNA은 식물, 동물, 바이러스 등에서 발견되는, 약 22개의 뉴클레오타이드로 구성된 작은 비발현 RNA 분자로, RNA 침묵과 전사 이후의 유전자 발현 조절 등의 기능을 한다(Nature, 431 (7006): 350-5, Cell, 116 (2): 281-97). miRNA은 식물과 동물 등 진핵 생물의 핵에 있는 DNA와, 게놈이 DNA에 기초한 특정 바이러스에 있는 바이러스성 DNA에 의해 암호화되면서, mRNA 분자에 있는 상호보완적인 염기쌍을 통해 기능을 한다.miRNA is a small non-expressed RNA molecule composed of about 22 nucleotides found in plants, animals, viruses, etc., and functions as RNA silencing and gene expression control after transcription ( Nature, 431 (7006): 350-5, Cell, 116 (2): 281-97). miRNAs function through complementary base pairs in mRNA molecules, encoded by DNA in the nucleus of eukaryotes, such as plants and animals, and the viral DNA in the genome-specific DNA based on the virus.

선행 보고들에 따르면, 방사선 저항성을 가지고 있는 폐암 세포주에서 방사선을 조사하게 되면 간엽 표현형(mesenchymal phenotype)으로 전환하는 현상이 나타나게 된다고 알려져 있다(Oncogene. 2015 Feb 2. doi: 10.1038/onc.2014.466). 간엽 타입(Mesenchymal type)을 가진 세포들은 방사선 저항성을 조절한다고 알려져 있다(Cancer Res. 2014 Oct 1;74(19):5520-31). miRNA은 mRNA를 퇴화시키거나 mRNA가 전사되는 것을 억제함으로써 암의 악성화에 관여한다고 알려져 있다(EMBO Mol Med. 2012 Mar; 4(3):143-159, Cancer Biomark. 2012;11(6):269-80). miR-30이 암 종류에 따라 암의 악성화를 억제하거나, 오히려 암의 악성화를 유도한다고 알려져 있다.According to previous reports, it is known that when irradiated from a lung cancer cell line with radiation resistance, it is converted into a mesenchymal phenotype (Oncogene, Oct. 10, 2013 / onc.2014.466). Cells with a mesenchymal type are known to modulate radiation resistance ( Cancer Res . 2014 Oct 1; 74 (19): 5520-31). miRNAs are known to be involved in the malignant transformation of cancer by inhibiting mRNA degradation or mRNA transcription ( EMBO Mol Med. Mar; 4 (3): 143-159, Cancer Biomark . 2012; 11 (6): 269-80). It is known that miR-30 inhibits the malignant transformation of cancer according to the kind of cancer or induces malignancy of cancer rather.

miR-30 패밀리는 a, b, c, d 및 e로 구성이 되어있다. 암의 종류에 따라 각 miRNA의 기능도 다르게 밝혀지고 있다. PAK1 단백질은 방사선에 의한 EMT 그리고 방사사선 저항성을 조절한다고 알려져 있어(Cancer Res. 2014 Oct 1;74(19):5520-31. doi: 10.1158/0008-5472), EMT와 방사선의 저항성이 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. miRNA-30 패밀리는 유방암세포의 미부착(non-attachment)의 생장을 조절한다고 알려져 있다(Ouzounova et al. BMC Genomics 2013, 14:139). 또한, 중간엽줄기세포가 BMP9에 의한 분화를 miR-30a가 억제를 한다는 것을 알 수 있다(J Mol Histol . 2015 Oct;46(4-5):399-407). 또한 miR-30a가 HP1γ를 조절함으로써 대장암의 진행을 조절한다고 보고되었다(Cancer Res. 2015 Sep 2. pii: canres.3735.2014). miR-30이 integrin ITGB3 또는 ubiquitin conjugating E2 enzyme UBC9를 직접적으로 타겟팅 하면서 암의 악성화를 조절한다고 알려져 있다(Oncogene 29 (29): 4194-204). 또는 miR-30a와 miR30e가 TP53을 조절한다는 보고도 있다(PLoS Genet. 6 (1): e1000795). 하지만 폐암에서 방사선에 대한 miR-30의 효과는 아직 보고된 바 없다.The miR-30 family consists of a, b, c, d, and e. The function of each miRNA is different depending on the type of cancer. PAK1 protein is known to regulate EMT and radiation-induced resistance to radiation ( Cancer Res . 2014 Oct 1; 74 (19): 5520-31. Doi: 10.1158 / 0008-5472) As shown in Fig. The miRNA-30 family is known to regulate non-attachment growth of breast cancer cells (Ouzounova et al., BMC Genomics 2013, 14: 139). It is also known that miR-30a inhibits the differentiation of mesenchymal stem cells by BMP9 ( J Mol Histol . 2015 Oct; 46 (4-5): 399-407). It is also reported that miR-30a regulates the progression of colorectal cancer by modulating HP1γ ( Cancer Res . 2015 Sep 2. pii: canres.3735.2014). It is known that miR-30 directly targets the integrin ITGB3 or the ubiquitin-conjugating E2 enzyme UBC9 ( Oncogene 29 (29): 4194-204). Or miR-30a and miR30e regulate TP53 ( PLoS Genet . 6 (1): e1000795). However, the effect of miR-30 on radiation in lung cancer has not been reported.

본 발명자들은 폐암세포의 방사선을 조사한 후의 악성화에 miR-30가 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀내고 이를 타겟으로 하여 암의 치료에 사용함으로써 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have found that miR-30 plays an important role in malignant transformation after radiation of lung cancer cells, and has been used as a target for the treatment of cancer, thereby completing the present invention.

Nature 431 (7006): 350-5,Cell 116 (2): 281-97 Nature 431 (7006): 350-5, Cell 116 (2): 281-97 Oncogene. 2015 Feb 2. doi: 10.1038/onc.2014.466 Oncogene. 2015 Feb 2. doi: 10.1038 / onc.2014.466 Cancer Res. 2014 Oct 1;74(19):5520-31 Cancer Res. 2014 Oct 1; 74 (19): 5520-31 EMBO Mol Med. 2012 Mar; 4(3): 143-159, EMBO Mol Med. Mar; 4 (3): 143-159, Cancer Biomark. 2012;11(6):269-80 Cancer Biomark. 2012; 11 (6): 269-80 Ouzounova et al. BMC Genomics 2013, 14:139 Ouzounova et al. BMC Genomics 2013, 14: 139 J Mol Histol. 2015 Oct;46(4-5):399-407 J Mol Histol. 2015 Oct; 46 (4-5): 399-407 Cancer Res. 2015 Sep 2. pii: canres.3735.2014 Cancer Res. 2015 Sep 2. pii: canres.3735.2014 Oncogene 29 (29): 4194-204 Oncogene 29 (29): 4194-204 PLoS Genet. 6 (1): e1000795 PLoS Genet. 6 (1): e1000795

본 발명의 목적은 miR-30 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공하고자 한다.It is an object of the present invention to provide a composition for promoting radiation sensitivity comprising a miR-30 inhibitor.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-30 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a composition for promoting radiation sensitivity comprising a miR-30 inhibitor.

본 발명은 기존 방사선 치료에 나타나는 부작용에 miR-30이 관여함을 밝히고, 이로부터 miR-30을 암 치료를 위한 타겟으로 하면서 방사선요법을 병행하여 방사선 저항성을 줄임과 동시에 암 치료적 효과를 증진하는 효과가 있다.The present invention discloses that miR-30 is involved in the side effects that occur in conventional radiation therapy. From this, miR-30 is used as a target for cancer treatment, while radiation therapy is combined to reduce radiation resistance and enhance cancer therapeutic effect It is effective.

도 1A는 폐암세포주, A549와 H1299에 방사선 2 Gy를 3번 조사한 후 콜라겐이 코팅된 조건에서 세포의 형태를 관찰한 결과, 도 1B는 방사선 조사 후 EMT 마커의 발현을 확인한 결과, 도 1C는 면역세포화학법에 의한 EMT 마커의 발현을 확인한 결과, 도 1D는 Boyden chamber assay에 의한 세포의 이동 및 침윤을 확인한 결과, 도 1E는 마우스 모델에 폐암세포주 A549를 접종하고, 방사선 조사하여 폐에 형성된 종양을 확인한 결과, 도 1F는 마우스 모델의 폐에 형성된 종양의 EMT 마커의 발현을 확인한 염색 결과이다.
도 2는 A549 세포에 방사선을 조사한 후 miRNA 마이크로어레이를 수행한 결과(A)와, miR-30 패밀리의 유전자 발현을 확인한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 3은 A549 세포에 방사선을 조사한 후 miR-30b 저해제에 의한 EMT 마커의 발현을 확인한 결과(A), 면역세포화학법에 의한 EMT 마커의 확인 결과(B), 세포의 이동 및 침윤을 확인한 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 4는 A549 세포에 방사선을 조사한 후 miR-30b 저해제에 의한 colonogenic assay에 의한 세포 생존을 확인한 결과이다.FIG. 1A shows the appearance of cells in a lung cancer cell line, A549 and H1299 after irradiation with 2 Gy of radiation three times, and FIG. 1B shows the appearance of EMT markers after radiation irradiation. As a result, FIG. 1E shows the migration and infiltration of cells by the Boyden chamber assay. As shown in FIG. 1E, the mouse model was inoculated with a lung cancer cell line A549, As a result, FIG. 1F shows the results of staining of EMT markers of tumors formed in the lung of a mouse model.
FIG. 2 shows (A) results of performing miRNA microarray after irradiating A549 cells with radiation, and (B) showing gene expression of miR-30 family. FIG.
FIG. 3 shows the result of (A) confirming the expression of EMT marker by the miR-30b inhibitor after irradiating A549 cells with radiation, (B) confirming the EMT marker by immunocytochemistry, (C).
FIG. 4 shows the result of colonization assay of miR-30b inhibitor after cell irradiation with A549 cells.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.

본 발명은 miR-30 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for promoting radiation sensitivity comprising a miR-30 inhibitor.

본 명세서에서 사용된 용어 "방사선 민감성 증진"은 방사선 저항성을 갖는 세포의 방사선 민감성을 높여서 방사선 요법의 치료 효과를 상승시키는 조성물을 의미하며, 방사선 병용 치료를 위해 이용된다. 암세포의 방사선 민감성이 증진되면, 방사선 요법에 의한 암세포의 살상 및 증식 억제 효과가 증가된다. 아울러, 세포의 방사선 민감도 증가는 저선량의 방사선 조사에도 치료적 효과가 크므로 고선량에 따른 방사선 저항성 내지는 정상세포의 사멸 등의 부작용을 줄이거나 억제할 수 있다.The term " enhancing radiation sensitivity " as used herein means a composition that raises the radiation sensitivity of a cell having radiation resistance to enhance the therapeutic effect of radiation therapy, and is used for radiation therapy. When the radiation sensitivity of the cancer cells is enhanced, the killing and proliferation inhibiting effect of the cancer cells by the radiation therapy is increased. In addition, the increase in the radiation sensitivity of the cells can also reduce or suppress the side effects such as radiation resistance due to high doses or death of normal cells because of the therapeutic effect even at low doses of radiation.

일반적으로, microRNA는 세포 내에서 대부분 염색체의 인트론 등에 존재하며 RNA 폴리머라아제 II에 의해 일차 miRNA(primary miRNA)로 전사된 후, 핵 내에서 RNase III인 드로샤(Drosha)와 파샤(Pasha) 등에 의해 전구체 miRNA(precursor miRNA)로 절단된다. 그 후, 전구체 miRNA는 엑스포틴-5(Exportin-5)에 의해 핵에서 세포질로 이동되고, 세포질 내에서 RNase III인 다이서(Dicer)에 의해 약 22bp 정도 길이의 불완전한 이중가닥 miRNA가 된다. 이 miRNA가 RISC (RNA interference silencing complex)와 결합하여 단일 가닥으로 분리되며, 분리된 단일가닥의 miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)의 염기서열에 상보적으로 결합하여 리보솜에 의해 mRNA가 단백질로 번역되는 과정을 억제하거나 또는 표적 mRNA가 분해되도록 하여 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다(Nature, 425(6956):415-9, 2003; Nature, 432(7014):235-40, 2004; 및 Trends Cell Biol ., 17:118-126, 2007).In general, microRNAs are present in most intracellular chromosomal introns and are transcribed into primary miRNAs by RNA polymerase II and then expressed in RNase III, Drosha and Pasha Gt; miRNA < / RTI > (precursor miRNA). Subsequently, the precursor miRNA is transferred from the nucleus to the cytoplasm by Exportin-5, resulting in an incomplete double-stranded miRNA of about 22 bp in length in the cytoplasm by RNase III, Dicer. This miRNA binds to the RNA interference silencing complex (RISC) and separates into a single strand. The isolated single strand miRNA is complementarily bound to the 3'-UTR (untranslated region) of the target mRNA and ligated to the mRNA ( Nature 425 (6956): 415-9, 2003; Nature 432 (7014): 235-40, 2003). In addition, 2004; and Trends Cell Biol . , 17: 118-126, 2007).

miR-30은 5종으로 구성되며, 암의 종류에 따라 악성화를 유도 내지는 억제하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 miR-30을 발현하는 폐암세포주, A549 및 H1299를 이용하여 6 Gy 또는 10 Gy 방사선 조사 후 miR-30 패밀리의 발현 증가를 확인하였고, 특히, miR-30b, -30c 및 -30d의 발현이 증가하여 이중 miR-30b 저해제를 암세포에 처리한 결과, 방사선 조사에 의해 증가하였던 EMT 마커인 N-카데린과 비멘틴이 감소하여 방사선 조사에 의해 나타났던 EMT 현상이 억제됨을 확인하였다. 또한, 암세포의 이동 및 침윤 역시 miR-30b 저해제에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 또한, miR-30b 저해제의 처리는 암세포의 생존을 감소시킴을 확인하였다. 따라서, miR-30 저해제는 암세포의 방사선 민감도를 향상시킴을 알 수 있었다. 상기 miR-30 저해제는 방사선 저항성이 강한 암세포의 방사선 민감성을 증진시킴으로써 암세포의 방사선 치료 시 방사선 민감성 증진제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.miR-30 is composed of five species and is known to induce or inhibit malignancy depending on the type of cancer. The present inventors confirmed the increase of the expression of miR-30 family after 6 Gy or 10 Gy irradiation using lung cancer cell line expressing miR-30, A549 and H1299, and particularly, expression of miR-30b, -30c and -30d . As a result of treatment of cancer cells with double miR-30b inhibitor, it was confirmed that EMT markers such as N-cadherin and visentin, which were increased by irradiation, were reduced and EMT phenomenon caused by irradiation was suppressed. In addition, it was confirmed that migration and invasion of cancer cells were also inhibited by miR-30b inhibitors. In addition, it was confirmed that the treatment of miR-30b inhibitor reduced the survival of cancer cells. Thus, miR-30 inhibitors have been shown to enhance the radiation sensitivity of cancer cells. The miR-30 inhibitor may be useful as an effective ingredient of the radiation sensitivity enhancer when the radiation therapy of cancer cells improves the radiation sensitivity of cancer cells having high radiation resistance.

상기 miR-30 저해제는 miR-30에 대한 안티센스 서열로 구성될 수 있다. 바람직하게는 miR-30 저해제는 miR-30a의 안티센스 서열인, SEQ ID NO:1, miR-30b의 안티센스 서열인, SEQ ID NO:2, miR-30c의 안티센스 서열인, SEQ ID NO:3, miR-30d의 안티센스 서열인, SEQ ID NO:4, miR-30e의 안티센스 서열인, SEQ ID NO:5를 가질 수 있다. 또한, 상기 안티센스 서열은 RNA, DNA, PNA(peptide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid)와 같은 형태로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 miR-30 저해제는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, miR-30 저해제의 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, miR-30 핵산분자의 억제제와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.The miR-30 inhibitor may be composed of an antisense sequence for miR-30. Preferably, the miR-30 inhibitor is an antisense sequence of miR-30a, an antisense sequence of SEQ ID NO: 1, miR-30b, an antisense sequence of SEQ ID NO: 5, which is an antisense sequence of SEQ ID NO: 4, miR-30e, which is an antisense sequence of miR-30d. In addition, the antisense sequence may be in the form of RNA, DNA, peptide nucleic acids (PNA), or locked nucleic acid (LNA). In addition, the miR-30 inhibitor used in the present invention can be used as a functional equivalent of the nucleic acid molecule constituting the miR-30 inhibitor, for example, deletion, substitution or insertion of a part of the nucleotide sequence of the miR- insertion of a miR-30 nucleic acid molecule, but variants capable of functionally functioning with an inhibitor of a miR-30 nucleic acid molecule.

본 발명의 조성물은 암의 방사선 민감성을 증진시키기 위해 이용된다. 본 발명의 miR-30 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 방사선 치료를 적용할 수 있는 모든 세포에 적용이 가능하며, 특히 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 데 이용하는 것이 바람직하다.The composition of the present invention is used to enhance the radiation sensitivity of cancer. The composition for enhancing radiation sensitivity comprising the miR-30 inhibitor of the present invention can be applied to all cells to which radiation therapy can be applied, and is particularly preferably used for enhancing radiation sensitivity of cancer cells.

miR-30는 방사선 저항성이 강한 폐암, 대장암, 유방암 등의 세포에서 과발현되어 방사선 저항성을 높이므로, miR-30 저해제에 의한 miR-30 억제는 방사선 민감성을 증진시키는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 두경부암, 전립선암, 자궁암, 전립선암, 뇌종양, 및 림프종으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.Because miR-30 is overexpressed in radiation-resistant cells such as lung cancer, colon cancer and breast cancer, miR-30 inhibition by miR-30 inhibitors has been shown to enhance radiation sensitivity. Thus, the cancer may be selected from but not limited to lung cancer, breast cancer, colon cancer, head and neck cancer, prostate cancer, uterine cancer, prostate cancer, brain tumor, and lymphoma.

상기 miR-30 저해제는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공되거나 또는 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다. 발현 벡터는 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.The miR-30 inhibitor may be provided in an expression vector for intracellular delivery or may be provided in a form introduced into a cell. The expression vector may be a plasmid DNA or a recombinant viral vector.

본 발명의 miR-30 저해제는 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 또는 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The miR-30 inhibitors of the present invention can be introduced into cells using a variety of transformation techniques, and for this, they can be in a form that is contained within a carrier that allows for efficient introduction into cells. The carrier is preferably a vector, and both viral vectors and non-viral vectors are usable. As the viral vector, for example, lentivirus, retrovirus, adenovirus, herpes virus or avipox virus vector can be used. However, But is not limited thereto.

본 발명의 miR-30 저해제는 세포 내로 도입시켜 암세포의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있는데, 여기서 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당해 기술 분야에서 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.The miR-30 inhibitor of the present invention can be introduced into cells to enhance the radiation sensitivity of cancer cells, wherein "introduction" means introducing foreign DNA into cells by transfection or transduction . Transfection can be accomplished by various methods, including calcium phosphate-DNA coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, microinjection, liposome fusion, lipofectamine and protoplast fusion Can be performed by various methods known in the art. Transfection refers to the transfer of genes into cells using virus or viral vector particles as a means of infection.

본 발명의 miR-30 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.The radiation sensitivity enhancing composition comprising the miR-30 inhibitor of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and may be formulated together with the carrier.

본 명세서에서, 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" refers to a carrier or diluent that does not irritate the organism and does not interfere with the biological activity and properties of the administered compound. Examples of the pharmaceutical carrier which is acceptable for the composition to be formulated into a liquid solution include sterilized and sterile water suitable for the living body such as saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants can be additionally added and formulated into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.

본 발명의 miR-30 저해제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있으며, 투여의 용이성과 투여량의 균일화를 위해 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.The composition comprising the miR-30 inhibitor of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier can be applied to any formulation containing it as an active ingredient and can be manufactured into oral or parenteral formulations, The dosage form may be formulated in unit dosage form for uniformity. Formulations of the compositions of the present invention may be formulated for oral, rectal, nasal, topical, subcutaneous, vaginal or parenteral administration, or by inhalation or infusion lt; RTI ID = 0.0 > insufflation. < / RTI >

본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 주사용 제형으로 제조되어 방사선 치료가 적용될 종양 부위에 주사하거나 또는 겔 조성물 또는 경피전달용 조성물의 제형으로 제조되어 종양 부위에 직접 도포하거나 부착시켜서 투여될 수 있고, 좌제 제형이나, 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 제형으로 투여될 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다. The radiation sensitivity-enhancing composition of the present invention may be prepared in a form of injectable preparation, injected into a tumor site to which radiation therapy is to be applied, or prepared as a gel composition or a composition for transdermal delivery and directly applied or adhered to a tumor site, Suppository formulations, or aerosol formulations that allow inhalation through the respiratory tract. For formulation into injectable formulations, the compositions of the present invention may be formulated as solutions or suspensions in water with stabilizers or buffers in water, and formulated for unitary administration of ampoules or vials. For injection into suppositories, it may be formulated into rectal compositions such as suppositories or enema preservatives, including conventional suppository bases such as cocoa butter or other glycerides. When formulated for spraying, such as an aerosol formulation, a propellant or the like may be formulated with the additive such that the water-dispersed concentrate or wet powder is dispersed.

또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-30 저해제를 포함하는 방사선 민감성 조성물을 투여하는 단계 및 방사선 요법을 적용하는 단계를 포함하는, 방사선 저항성 암을 치료하는 방법을 제공한다.In another aspect, the invention provides a method of treating a radiation-resistant cancer, comprising administering a radiation-sensitive composition comprising a miR-30 inhibitor and applying radiation therapy.

본 명세서에서, 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, miR-30 저해제의 바이러스성 또는 비바이러스성 전달체에 의한 운반을 포함한다. 본 발명의 조성물이 암세포 내로 도입되면, 암의 악성화 및 EMT 억제를 통해 방사선 민감성을 증진시키게 된다.As used herein, the term "administering " means introducing a composition of the present invention to a patient in any suitable manner, including delivery of a miR-30 inhibitor by a viral or nonviral delivery vehicle. When the composition of the present invention is introduced into cancer cells, radiation sensitivity is enhanced through cancer malignancy and EMT inhibition.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 해당 조직에 국소 투여한다.The administration route of the composition of the present invention may be administered through various routes of oral or parenteral administration as long as it can reach the target tissues. Specifically, oral administration, rectal administration, topical administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, Transdermal, intranasal, inhalation, intra-ocular or intradermal routes. Preferably topically to the tissue.

본 발명의 방사선 저항성 암을 치료하는 방법은 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료적 유효량은 방사선에 대해 암세포 내의 종양의 민감성을 효과적으로 증진시키는 양을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 방출율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 방사선 민감성 증진용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 방사선 치료 효과를 포함한 항암 효과를 증대시킬 수 있다.A method for treating a radiation resistant cancer of the present invention comprises administering a therapeutically effective amount of the composition for enhancing radiation sensitivity of the present invention. The therapeutically effective amount refers to an amount that effectively enhances the sensitivity of the tumor to radiation in the cancer cells. It will be apparent to those skilled in the art that the appropriate total daily dose may be determined by the attending physician within the scope of sound medical judgment. The specific therapeutically effective amount for a particular patient will depend upon a variety of factors, including the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether or not other agents are used, the age, weight, general health status, sex and diet, The route of administration and the rate of release of the composition, the duration of the treatment, and the amount of radiation to be irradiated, and the similar factors well known in the art of medicine. Therefore, the effective amount of the radiation sensitivity-enhancing composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above-mentioned matters. In addition, the anticancer effect including the radiation therapy effect can be increased by administering the anticancer agent of the present invention together with the composition for enhancing the radiation sensitivity of the present invention together with a known anticancer agent.

또한, 본 발명의 방사선 저항성 암을 치료하는 방법은 miR-30 저해제의 투여에 의한 암세포의 악성화 및 EMT 억제로 인해 방사선 민감성이 증진될 수 있는 대상에 적용가능하며, 이 대상은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 동물을 포함한다. In addition, the method of treating the radiation-resistant cancer of the present invention can be applied to a subject to which radiation sensitivity can be enhanced due to malignancy of cancer cells and EMT inhibition by the administration of a miR-30 inhibitor, , Cows, pigs, sheep, horses, dogs and cats.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 암은 폐암, 유방암, 대장암, 두경부암, 전립선암, 자궁암, 전립선암, 뇌종양, 및 림프종으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the cancer may be selected from, but not limited to, lung cancer, breast cancer, colon cancer, head and neck cancer, prostate cancer, uterine cancer, prostate cancer, brain tumor and lymphoma.

본 발명의 방사선 저항성 암을 치료하는 방법은 암세포에 본 발명의 조성물을 투여하고, 방사선을 조사하는 것을 포함하는데, miR-30 저해제를 통해 방사선 민감성을 증진시키므로 저선량의 방사선 조사에도 효과적으로 암을 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다. 따라서, 방사선 요법에 의한 기존 치료의 단점, 저항성을 줄일 수 있어 치료적 효과를 높일 수 있다. 여기서 "방사선 조사"란 이온화 방사선, 특히, 특별하게는 오늘날 통상 사용하고 있는 선형 가속기(linear accelerators) 또는 방사핵종(radionuclides)에 의해 방사된 감마 방사선을 의미한다. 방사핵종에 의한 종양에의 방사선 요법은 외부적 또는 내부적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, miR-30 저해제를 포함하는 조성물의 투여는 방사선 요법을 적용하기 전에, 바람직하게는, 방사선 요법의 적용 1개월 전, 특히 10일 또는 1주일 전에 개시한다. 또한, 방사선 요법의 적용시, 최초 방사선 조사 시점과 최후 방사선 조사 시점 사이에 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물의 투여를 지속할 수 있다. 또는, 방사선 요법의 적용 후 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물을 투여할 수 있다.The method of treating a radiation-resistant cancer of the present invention includes administering the composition of the present invention to a cancer cell and irradiating the radiation. Since the miR-30 inhibitor enhances radiation sensitivity, the cancer can be effectively treated even at a low dose of radiation . Therefore, it is possible to reduce the disadvantages and resistance of the conventional treatment by radiotherapy, thereby increasing the therapeutic effect. As used herein, the term " irradiation "refers to ionizing radiation, in particular, gamma radiation emitted by linear accelerators or radionuclides, which are commonly used today. Radiation therapy to radionuclide tumors can be done externally or internally. In one embodiment of the invention, administration of a composition comprising a miR-30 inhibitor is initiated prior to applying radiation therapy, preferably one month before application of radiation therapy, especially 10 days or 1 week prior. In addition, when the radiation therapy is applied, administration of the radiation sensitivity-enhancing composition of the present invention can be continued between the initial irradiation time point and the final irradiation time point. Alternatively, the composition for enhancing radiation sensitivity of the present invention may be administered after application of radiation therapy.

투여되는 miR-30 저해제의 양, 방사선 조사량 및 방사선 조사의 빈도는 암의 종류, 암의 위치, 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 환자의 반응과 같은 일련의 요소에 따라 결정된다. 일 구체예에 따르면, 상기 방사선 조사 선량은 2 Gy 내지 20 Gy, 더 구체적으로, 6 Gy 내지 10 Gy일 수 있다.The amount of miR-30 inhibitor administered, the dose of radiation, and the frequency of irradiation are determined by a set of factors such as the type of cancer, the location of the cancer, the chemotherapy, or the patient's response to radiation therapy. According to one embodiment, the dose of radiation may be 2 Gy to 20 Gy, more specifically 6 Gy to 10 Gy.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.(2001)) and Frederick et al. (Frederick et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994)).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 방사선 조사된 폐암세포에서 miR-30의 역할 규명Example 1 Identification of the role of miR-30 in irradiated lung cancer cells

폐암세포주인 A549와 H1299 세포에서 방사선 저항성을 확인하기 위해 , 세포에 방사선을 조사한 후 콜라겐이 코팅된 조건에서 세포의 형태를 관찰하고, 웨스턴 블랏과 면역세포화학법을 통해 간엽 마커인 N-카데린과 비멘틴의 발현을 확인한 다음, 운드 힐링(wound healing)과 침윤 이동 분석법(invasion migration assay)을 이용하여 방사선 조사 후 세포들의 움직임을 관찰하였다.In order to confirm the radiation resistance in lung cancer cell lines A549 and H1299 cells, the cells were irradiated with radiation, and the morphology of the cells was observed under collagen-coated conditions. Western blot and immunocytochemistry were used to measure the nuclear marker N-cadherin And vimentin, and then observed the movement of cells after irradiation by using wound healing and invasion migration assay.

상기 실험을 위한 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.A concrete experimental method for the experiment is as follows.

(세포 배양)(Cell culture)

인간 폐암세포주 A549, H1299(ATCC)로부터 확립되었다. 세포들은 37℃의 가습된 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 인간 폐암세포주인 H1299 A549는 10% 태아 소 혈청, 페니실린(100 unit/mL) 및 스트렙토 마이신(100 g/mL)이 보충된 DMEM에서 배양되었다.Human lung cancer cell line A549, H1299 (ATCC). The cells were incubated at 37 ° C humidified 5% CO ₂ . Human lung cancer cell line H1299 A549 was cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin (100 unit / mL) and streptomycin (100 g / mL).

(시약 및 항체)(Reagents and antibodies)

N-카데린은 Cell SignalingTechnology(Beverly 사)로부터 얻었다. 폴리클로날 항체 비멘틴은 Thermo Science사로부터 얻었다. 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)및 β-액틴에 대한 모노클로날 항체는 Sigma 사로부터 입수하였다. 항-마우스 Alexa Fluor 488 및 항-래빗 Alexa Fluor 488은 Invitrogen사로부터 구입했다. 사이토칸 어레이(cytokine array) 키트는 R&D 사에서 구입하였다.N-cadherin was obtained from Cell Signaling Technology (Beverly). The polyclonal antibody visentin was obtained from Thermo Science. Monoclonal antibodies to 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and beta -actin were obtained from Sigma. Anti-mouse Alexa Fluor 488 and anti-rabbit Alexa Fluor 488 were purchased from Invitrogen. A cytokine array kit was purchased from R & D.

(웨스턴 블랏 분석)(Western blot analysis)

세포 용해물(lysates)은 단백질 분해 효소 억제제가 보충된 용해 버퍼(lysis buffer)[40 mM 트리스-HCL(pH 8.0), 120 mM NaCl, 0.1% Nonidet-P40]로 단백질을 추출하여 준비하였다. 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로 셀룰로스 막(Amersham 사)으로 이동시켰다. 막은 TBS(Tris-buffered saline) 내의 5% 탈지 분유로 차단(blocked)하였고, 4℃에서 하루 동안 1차 항체와 배양하였다. 블랏은 퍼옥시데이즈가 접합된 2차 항체로 수행하였고, 단백질은 제조사의 지침에 따른 강화된 화학발광(ECL) 절차(Amersham 사)를 이용하여 시각화 하였다.Cell lysates were prepared by extracting proteins with lysis buffer (40 mM Tris-HCL (pH 8.0), 120 mM NaCl, 0.1% Nonidet-P40) supplemented with protease inhibitors. Proteins were separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham). The membranes were blocked with 5% defatted milk powder in TBS (Tris-buffered saline) and incubated with primary antibody at 4 ° C for one day. Blots were performed with peroxidase conjugated secondary antibodies, and proteins were visualized using an enhanced chemiluminescence (ECL) procedure (Amersham) according to the manufacturer's instructions.

(면역 세포 화학(EMT 분석)(Immunocytochemistry (EMT analysis)

세포는 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, PBS 상에서 0.1% 트리톤 X-100을 이용하여 투과시켰다. 세포 고정 후, 세포는 4℃에서 하루 동안 1% 태아 소 혈청 및 0.1% 트리톤 X-100과 PBS 용액 상에 적절한 1차 항체와 함께 배양하였다. 사용된 항체는 하기와 같다: 인간 항-E-카데린(anti-E-cadherin)(마우스 폴리클로날 항체, 1:200), 항-N-카데린(마우스 폴리클로날 항체, 1:200) 및 항-비멘틴(Vimentin)(래빗 폴리클로날 항체, 1:200). Cells were fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.1% Triton X-100 on PBS. After cell fixation, the cells were incubated with appropriate primary antibodies on 1% fetal bovine serum and 0.1% Triton X-100 and PBS solution for 4 days at 4 ° C. Antibodies used were as follows: human anti-E-cadherin (mouse polyclonal antibody, 1: 200), anti-N-cadherin (mouse polyclonal antibody, 1: 200 ) And anti-vimentin (rabbit polyclonal antibody, 1: 200).

염색은 항-래빗 또는 항-마우스 Alexa Flour 488(Molecular Probes 사)를 사용해 시각화하였다. 핵(nuclei)은 4, 6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Sigma 사)을 사용하여 대조염색 하였다. 염색된 세포는 형광-현미경(Olympus IX71)을 사용하여 시각화하였다.Dyeing was visualized using anti-rabbit or anti-mouse Alexa Flour 488 (Molecular Probes). Nuclei were counterstained with 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma). The stained cells were visualized using a fluorescence-microscope (Olympus IX71).

(침윤 이동 분석)(Invasion movement analysis)

세포(4×10⁴ cell/well)를 침윤 및 이동 분석을 위해 0.2 mL의 영양배지에 현탁하였다. 침윤 분석을 위해 세포는 8-mm 포어 크기의 트랜스웰 챔버(Transwell chamber)(Corning Glass 사)의 상부 웰(upper well) 상에 채워 넣었다. 상기 상부 웰은 0.8 mL의 성장배지로 채워진 하부 웰 챔버의 상면(upper side) 상에서 성장 인자-감소된 매트리겔(BD Diosciences 사) 10 mg/mL로 프리코팅되어 있다. 37℃에서 48 시간 배양 후 필터의 상부 표면상의 비침습 세포를 고정하고, Diff-Quick 키트(Fisher 사)로 염색하였고, 20 배율로 촬영하였다. 침습력은 웰당 5 미시 영역에서 세포를 계수하는 것으로 결정하였고, 침습의 규모는 미세 영역당 세포의 평균 수로 표현하였다. 세포는 위상차 현미경(Leica Microsystems 사)으로 이미지화 하였다. 이동 분석을 위하여, 같은 타입의 막을 포함하는 대조 인서트(inserts)를 갖지만 매트리겔 코팅은 갖지 않는 챔버를 사용하였다(24-웰 플레이트의 웰당 하나의 챔버). 성장배지 0.2 mL 내의 4×10⁴ 개의 세포를 각 인서트 상부 끝 측에 첨가하고, 증식배지 0.8 mL를 각 인서트의 기저 측에 첨가하였다. 침습 분석을 위해 위와 같이 인서트를 처리하였다.Cells (4 × 10 ⁴ cells / well) were suspended in 0.2 mL of nutrient medium for invasion and migration analysis. For infiltration analysis, cells were loaded onto the upper well of an 8-mm pore size Transwell chamber (Corning Glass). The upper wells were precoated with 10 mg / mL growth factor-reduced Matrigel (BD Diosciences) on the upper side of the lower well chamber filled with 0.8 mL growth medium. Non-invasive cells on the upper surface of the filter were fixed, incubated at 37 ° C for 48 hours, stained with a Diff-Quick kit (Fisher), and photographed at 20 magnifications. The invasion force was determined to count cells at 5 micro-wells per well, and the magnitude of the invasion was expressed as the average number of cells per micro-area. Cells were imaged with a phase contrast microscope (Leica Microsystems). For migration analysis, chambers with control inserts containing the same type of membrane but without a matrigel coating were used (one chamber per well of a 24-well plate). 4 x 10 ⁴ cells in 0.2 mL of growth medium were added to the upper end of each insert and 0.8 mL of growth medium was added to the basal side of each insert. The inserts were processed as described above for invasive analysis.

(동물실험)(Animal experiment)

사용한 마우스는 5주령차인 BALB/c 누드 마우스를 사용하였다. 각각의 개체는 5마리씩으로 진행하였다. 꼬리 정맥에 1×10⁶ 개의 A549 세포를 주사하였다. 두 달 정도 폐에 암이 형성하는 것을 확인한 뒤 폐에 방사선을 조사하였다. 방사선 조사 후 조직 스테이닝을 실시하였다.BALB / c nude mouse, a 5-week-old vehicle, was used. Each animal was treated with 5 animals. 1 × 10 ⁶ A549 cells were injected into the tail vein. After confirming the formation of cancer in the lung for about two months, the lung was irradiated with radiation. After irradiation, tissue staining was performed.

(형질전환)(Transformation)

siRNA를 세포 내에 형질주입하기 위하여 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 시약(Invitrogen 사)을 이용하였다. 형질주입은 optiMEM을 통하여 6시간 동안 수행하고, 세포배양배지로 바꿔준 다음 48시간 후 세포를 수확하여 실험하였다.Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) was used for transfection of siRNA into cells. The transfection was carried out for 6 hours through optiMEM, changed to cell culture medium, and harvested after 48 hours.

(방사선 조사(Irradiation))(Irradiation)

60-mm 배양접시에 세포를 씨딩한 후 37℃의 가습된 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. ¹³⁷Cs　γ-ray source(Atomic Energy of Canada Ltd, Mississauga, ON, Canada)로 세포에 방사선을 조사하였다. 조사선량은 3.81 Gy/min으로 하였다.Cells were seeded in 60-mm culture dishes and cultured at 37 ° C in humidified 5% CO ₂ . ^The cells were irradiated with a ¹³⁷ Cs gamma-ray source (Atomic Energy of Canada Ltd., Mississauga, ON, Canada). The irradiation dose was 3.81 Gy / min.

(집락형성 분석법(Clonogenic assay))(Clonogenic assay)

1000개 세포를 60-mm 배양접시에 분주하고, 이튿날 방사선을 각각 0 Gy, 1 Gy, 2 Gy, 3 Gy, 4 Gy, 5 Gy를 조사한 후 10일 동안 37℃의 가습된 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양하였다. 10일 뒤 고정 버퍼(메탄올:아세트산=3:1)로 세포를 고정한 다음 Coomassie　Brilliant　Blue로 염색한 후 방사선에 의하여 살아남은 클론의 수를 계수한 후 그래프로 그렸다. 1000 cells were placed in a 60-mm culture dish and irradiated at 0 Gy, 1 Gy, 2 Gy, 3 Gy, 4 Gy, and 5 Gy on the following day, followed by 10 days of humidified 5% CO ₂ Lt; / RTI > cells. Ten days later, the cells were fixed with fixed buffer (methanol: acetic acid = 3: 1), stained with Coomassie Brilliant Blue, counted and counted by counting the surviving clones by radiation.

(통계 분석)(Statistical analysis)

모든 실험 데이터는 평균값으로 기재하였고, 에러 바는 실험적인 표준 오차를 나타낸다. 통계 분석은 비모수 스튜던트 t 검정(non-parametric Student t test)으로 수행하였다.All experimental data are expressed as mean values, and error bars represent experimental standard errors. Statistical analysis was performed with a non-parametric Student t test.

방사선 2 Gy를 하루에 한번씩 3일 연속 조사한 후(총 6 Gy) 콜라겐이 코팅된 조건에서 세포의 형태를 관찰한 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이, 폐암세포의 형태가 간엽 타입의 형태로 변화되는 것을 관찰하였다. 또한, EMT 마커로 알려져 있는 N-카데린과 비멘틴이 방사선 조사에 의해 증가하여 간엽 타입이 증가함을 확인할 수 있었다(도 1B). 이러한 N-카데린과 비멘틴의 증가는 면역세포화학법에 의해서도 확인되었다(도 1C). Boyden chamber assay를 통해 방사선 조사에 의한 세포의 이동 및 침윤이 증가함을 확인할 수 있었다(도 1D). After irradiation of 2 Gy of radiation for 3 consecutive days (total 6 Gy), the morphology of the cells was observed under the condition of collagen coating, and as shown in FIG. 1A, the morphology of lung cancer cells changed into a mesenchymal type . In addition, it was confirmed that N-cadherin and vimentin, which are known as EMT markers, were increased by irradiation and the mesenchymal type was increased (Fig. 1B). This increase in N-cadherin and visentin was also confirmed by immunocytochemistry (Fig. 1C). The Boyden chamber assay showed increased cell migration and invasion by irradiation (FIG. 1D).

다음으로, 누드 마우스 꼬리 정맥에 1×10⁶의 A549 세포를 주사하여 종양을 형성시킨 다음, 2 Gy의 방사선을 하루에 한번씩 5일 동안 연속적으로 국소 조사하고(총 10 Gy), 폐에 형성된 종양의 가장자리 부분을 IHC로 염색하여 N-카데린과 비멘틴을 확인하였다.Next, 1 × 10 ⁶ A549 cells were injected into the nude mouse tail vein to form tumors, and 2 Gy of radiation was continuously irradiated for 5 days (total 10 Gy) once a day, Were stained with IHC to confirm N-cadherin and visentin.

도 1E 및 1F에 나타난 바와 같이, 폐에 형성된 종양에서 N-카데린과 비멘틴의 증가를 확인하였다. As shown in Figs. 1E and 1F, an increase in N-cadherin and vimentin was confirmed in tumors formed in the lungs.

방사선 저항성을 가진 세포들의 EMT를 알기 위해, A549 세포주에 2 Gy의 방사선을 3번 조사한 후 miRNA의 마이크로어레이를 수행하고(도 2A), miR-30 패밀리의 유전자 발현을 확인하였다. To determine the EMT of radiation resistant cells, A549 cell line was irradiated with 3 Gy of 2 Gy and microarray of miRNA was performed (Fig. 2A) to confirm gene expression of miR-30 family.

그 결과, 방사선 조사 후 miR-30 패밀리의 발현이 증가하였고, 특히 miR-30b, c, d의 발현이 두드러졌다. As a result, the expression of miR-30 family was increased after irradiation, and the expression of miR-30b, c, d was remarkable.

상기 결과로부터 방사선 조사에 의해 가장 많이 증가하는 miR-30b의 저해제 (Genolution사 제품, 20 nM 농도)를 A549 세포에 처리한 후 방사선에 의해 증가하였던 EMT 마커의 발현이 감소하는지를 확인하였다. From the above results, it was confirmed that the expression of the EMT marker, which was increased by radiation, was decreased after treatment with the inhibitor of miR-30b (20 nM concentration, product of Genolution) increasing most by irradiation.

그 결과, miR-30b 저해제 처리는 방사선 조사에 의해 증가하였던 EMT 마커, N-카데린과 비멘틴의 발현을 감소시켰다(도 3A). 또한, 방사선 조사에 의해 나타났던 EMT 현상은 miR-30b 저해제 처리에 의해 면역세포화학법에 의한 염색 시 EMT 현상이 억제되는 것을 확인하였다(도 3B).As a result, miR-30b inhibitor treatment reduced the expression of EMT markers, N-cadherin and visentin, which were increased by irradiation (FIG. 3A). In addition, it was confirmed that the EMT phenomenon caused by the irradiation was inhibited by immunocytochemistry by the treatment with the miR-30b inhibitor (FIG. 3B).

또한, 이동 및 침윤 능력 역시 miR-30b 저해제 처리에 의해 감소되었다(도 3C). In addition, migration and invasion capacity was also reduced by miR-30b inhibitor treatment (Figure 3C).

다음으로, 방사선 조사에 의해 EMT를 조절하는 miR-30b가 방사선 저항성에 관여하는지 확인하기 위하여 A549 세포에 miR-30b 저해제를 처리하여 miR-30을 억제한 다음 방사선을 다양한 선량(1 Gy ~ 5 Gy)으로 조사하였다.Next, to determine whether miR-30b, which regulates EMT by irradiation, is involved in radiation resistance, miR-30b inhibitors were treated with A549 cells to inhibit miR-30. The radiation was then irradiated with various doses (1 Gy to 5 Gy ).

도 4에 나타난 바와 같이, 방사선 조사 선량 의존적으로 암세포의 생존이 감소함을 알 수 있었다. As shown in FIG. 4, it was found that the survival of the cancer cells was decreased depending on the irradiation dose.

따라서, miR-30은 방사선 요법에서 중요한 치료적 타겟으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다. Thus, miR-30 could be used as an important therapeutic target in radiotherapy.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Use of controlling radiation sensitivity using miRNA-30 <130> P16U10C0297 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30a antisense sequence <400> 1 cttccagtcg aggatgttta ca 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30b antisense sequence <400> 2 agctgagtgt aggatgttta ca 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30c antisense sequence <400> 3 gctgagagtg taggatgttt aca 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30d antisense sequence <400> 4 acatttgtag gggctgacct tc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30e antisense sequence <400> 5 cttccagtca aggatgttta ca 22 <110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Use of controlling radiation sensitivity using miRNA-30 <130> P16U10C0297 <160> 5 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30a antisense sequence <400> 1 cttccagtcg aggatgttta ca 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30b antisense sequence <400> 2 agctgagtgt aggatgttta ca 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30c antisense sequence <400> 3 gctgagagtg taggatgttt aca 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30d antisense sequence <400> 4 acatttgtag gggctgacct tc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-30e antisense sequence <400> 5 cttccagtca aggatgttta ca 22

Claims

miR-30 inhibitor, wherein the miR-30 inhibitor comprises an antisense sequence that binds complementarily to miR-30.

The method according to claim 1,
The miR-30 inhibitor comprises an antisense sequence that binds complementarily to any one of miR-30b, -30c, and -30d.

The method according to claim 1,
wherein the miR-30 inhibitor is selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-5.

The method according to claim 1,
wherein the miR-30 inhibitor is present in an expression vector for intracellular delivery.

The method according to claim 1,
Wherein the composition is for enhancing radiation sensitivity of the cancer.

6. The method of claim 5,
Wherein the cancer is any one of lung cancer, breast cancer, colon cancer, head and neck cancer, prostate cancer, uterine cancer, brain tumor or lymphoma.