KR101802039B1 - 히알루론산 나노섬유-효소 고정체의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

히알루론산 나노섬유-효소 고정체의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 제조하기 위한 것으로 상기 목적을 달성하기 위해 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법, HRP 효소 고정 방법, HRP 효소 고정체를 이용한 TMB 농도의 측정 방법 등을 제공한다.
본 발명의 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 통해 히알루론산에 고정된 효소의 산화력을 조절하여 보다 정확하게 정량적인 TMB의 청색의 양성 반응 여부를 확인하는 것이 가능해졌다. 또한, 본 발명의 방법을 통해 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체에 HRP 효소의 고정화를 성공하여 인체에 존재하는 다양한 효소들의 고정이 가능함을 확인하였고 이를 통해 미래의 의학적 응용 및 산업적 용도로 활용할 수 있는 계기가 마련될 수 있다.

Description

히알루론산 나노섬유-효소 고정체의 제조 방법 및 이의 용도{Method for Manufacturing of the Hyaluronic Acid Nano-fiber/Enzyme complex and uses thereof}
본 발명은 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조 방법 및 이를 위한 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 히알루론산을 수용액에 첨가하기 전에 PEO(polyethylene oxide)를 DW에 첨가하여 히알루론산의 물 포집력을 감소시켜 HRP와 같은 효소가 히알루론산에 고정될 수 있는 최적의 공극이 존재하는 히알루론산 나노섬유를 제조할 수 있는 방법 및 이의 방법에 의해 제조된 지지체를 제공하고, 또한 상기 방법으로 제조한 히알루론산 나노섬유/효소 고정체로 HRP 효소의 산화력을 조절하여 TMB의 양성 반응 여부를 보다 정확하고 정량적인 측정이 가능하도록 하는 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 고정체에 관한 것이다.
히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 다당류로서 고등 동물의 세포외 기질, 연결조직, 관절, 탯줄 등에서 존재하는 생체 내 물질로 글루크론산(Glucronic Acid)과 N-아세틸클루코사민(N-Acetylglucosamin)이 반복되는 구조로 분자량은 약 10만 내지 1,000만인 생체적합성 고분자 화합물이다. 히알루론산은 세균의 침입이나 독물의 침투를 막고, 세포 부착 및 염증 반응 조절에 관여하며, 관절 내에서는 윤활액의 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 히알루론산은 생체 내 물질이므로 면역성을 유발시키지 않으며, 생체 적합성이 뛰어나고 생분해될 수 있어 조직공학이나 약물전달시스템의 담체로 적용시키기 적합한 물질이다.
종래기술에서 고분자를 사용한 지지체는 체내의 표적 기관에서 독성 유발의 문제가 있어 체내에 잔류하는 경우 체내에 독성 문제가 발생하곤 하였다. 이를 극복하기 위하여 유해한 독성 물질을 발생시키지 않으면서 생분해가 가능한 재료가 필요하게 되었다. 히알루론산 중합체는 인체에 거부 반응을 일으키지 않는 생체 적합성 고분자로 조직공학이나 약물전달시스템의 담체로 활용되고 있다. 히알루론산은 체내에 존재하는 생체 고분자로 이를 이용한 지지체를 제작하여 체내 부작용을 최소화하는 방안을 마련할 필요가 제기되었다.
효소 HRP는 TMB를 산화시켜 양성 반응을 확인할 수 있는데, 보통 2 단계에 걸쳐 산화 반응을 일으켜 1단계에서는 청색으로 산화 여부를 확인 가능하며 다시 두 번째 산화 반응이 진행되면 노란색으로 산화 반응여부를 확인할 수 있다. 그러나 통상의 자유효소 상태에서는 비선택적인 산화 반응이 진행되어 청색을 거쳐 곧바로 노란색으로 산화를 시키기 때문에 산화 반응의 조절이 어려웠다.
본 발명자들은, HRP 효소를 자유효소 상태가 아닌 생체고분자인 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시켜 HRP 효소의 산화 반응을 조절하는 과정을 발명하였다.
이에 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 상기의 방법에 의해 제조한 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 상기의 제조 방법에 의해 제조한 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 이용하여 반응시킨 후 TMB의 흡광도를 분석하여 TMB의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 이용하여 반응시킨 후 TMB의 흡광도를 분석하여 TMB의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법은
(a) D.W(Deionized water)에 PEO(Polyethylene oxide)를 넣고 교반시키는 단계;
(b) 상기 PEO 수용액에 히알루론산 고분자를 넣고 교반시키는 단계; 및
(c) 상기 히알루론산/PEO 수용액을 가교제 및 커플링제가 포함되어 있는 에탄올 배스에 전기 방사시키는 단계;
를 포함한다. 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 완충용액은 D.W(Deionized water), PBS, MES, HEPES, Tris, Tricine, TAPSO, DIPSO, MOPS, BES 및 PIPES로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 용액 또는 2 종 이상의 혼합 용액인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 히알루론산의 첨가량은 0.1 내지 5 w/v%인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서,
상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 PEO의 첨가량은 0.1 내지 20 w/v%인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 히알루론산과 PEO의 첨가비는 1:3 내지 1:5 인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 가교제는 ADH이며, 상기 커플링제는 EDC, EIC 및 DCC 중 어느 하나 또는 2 이상의 혼합물의 커플링제인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 히알루론산은 분자량이 500 kDa 내지 1000 kDA인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 전기 방사단계는 사출 속도가 30~50 ㎕/분이며, 인가전압은 25 내지 30 kV인 것을 포함한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체는 상기의 방법에 의해서 제조된 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체에 있어서, 상기 효소는 HRP(Horseradish Peroxidase)인 것을 포함한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법은
(i) pH가 조절된 완충용액에 커플링제, 활성화제, 효소 및 제 1항의 제조 방법에 의해 제조한 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 넣고 반응시키는 단계; 및
(ii) 반응 후 효소가 고정된 히알루론산 나노섬유 지지체가 용해된 완충용액을 원심 분리시키는 단계; 및
(iii) 상기 원심 분리된 효소가 고정된 히알루론산 나노섬유 지지체를 완충 용액을 이용하여 세척하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법에 있어서, 상기 pH가 조절된 완충용액은 pH 4 내지 5의 아세트산 나트륨염 완충용액(Sodium acetate buffer)인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법에 있어서, 상기 효소는 HRP(Horseradish Peroxidase)인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법에 있어서, 상기 커플링제는 EDC, EIC 및 DCC 중 어느 하나 또는 2 이상의 혼합물의 커플링제인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법에 있어서, 상기 활성화제는 NHS(N-Hydroxysuccinimide)인 것을 포함한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체는 상기의 방법에 의해서 제조된 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체 인 것을 포함한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB의 농도를 측정하는 방법은 과산화수소와 미지의 농도인 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)가 포함되어 있는 용액에서 본 발명의 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 첨가하여 반응시킨 후 청색으로 변환되는 TMB의 색상도를 판단하는 단계일 수 있다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB의 농도를 측정하는 방법은 과산화수소와 미지의 농도인 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)가 포함되어 있는 용액에서 본 발명의 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 이용하여 반응시킨 후 TMB의 흡광도를 분석하는 단계일 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 효과에 대해서는 다음과 같다.
본 발명의 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 통해 히알루론산에 고정된 효소의 산화력을 조절하여 보다 정확하게 정량적인 TMB의 청색의 양성 반응 여부를 확인하는 것이 가능해진다.
또한, PEO를 이용하여 전기방사시켜 수득한 히알루론산 나노섬유 지지체에 HRP 효소의 고정화를 성공하여 인체에 존재하는 다양한 효소들의 고정이 가능함을 확인하였고 이를 통해 미래의 의학적 응용 및 산업적 용도로 활용할 수 있는 계기가 마련될 수 있게 되었다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유의 제작 및 히알루론산/HRP 효소 고정체의 제조 방법을 보여주는 전체 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 제작하기 위해 히알루론산 수용액을 전기방사하는 과정에 사용되는 전기 방사 장치의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산/PEO의 비율이 1:1인 수용액을 전기방사시켜 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 SEM 이미지이다.
도 4는 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산/PEO의 비율이 1:2인 수용액을 전기방사시켜 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 SEM 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산/PEO의 비율이 1:3인 수용액을 전기방사시켜 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 SEM 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산/PEO의 비율이 1:4인 수용액을 전기방사시켜 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 SEM 이미지이다.
도 7은 순수한 히알루론산 분자의 IR 분석 데이터이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조예 4 수용액을 전기방사하여 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 IR 분석 데이터이다.
도 9는 히알루론산에 HRP 효소를 고정하지 않은 상태에서 반응시켰을 때 TMB의 농도를 달리한 상태에서 샘플의 색상 변화를 확인하는 이미지이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시킨 HRP인 상태에서 반응시켰을 때 TMB의 농도를 달리한 상태에서 샘플의 색상 변화를 확인하는 이미지이다.
도 11은 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시키지 않은 HRP의 효소 반응 후의 흡광도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시킨 HRP의 효소 반응 후에 흡광도 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
비록 제1, 제2 등이 다양한 구성요소들을 서술하기 위해서 사용되나, 이들 구성요소들은 이들 용어에 의해 제한되지 않음은 물론이다. 이들 용어들은 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소와 구별하기 위하여 사용하는 것이다. 따라서, 이하에서 언급되는 제1 구성요소는 본 발명의 기술적 사상 내에서 제2 구성요소일 수도 있음은 물론이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법은 (a) 완충용액에 PEO(Polyethylene oxide)를 넣고 교반시키는 단계; (b) 상기 PEO 완충용액에 히알루론산 고분자를 넣고 교반시키는 단계; 및 (c) 상기 히알루론산/PEO 완충용액을 가교제 및 커플링제가 포함되어 있는 에탄올 배스에 전기 방사시키는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용하는 일 예시적인 완충용액으로 DW(Deionized water)를 사용하고 있으나 이에 국한되는 것은 아니며, Double distilled water, Ultrapure deionzied water를 대체하여 사용할 수 있다. 또한 완충용액으로 PBS, MES, HEPES, Tris, Tricine, TAPSO, DIPSO, MOPS, BES 및 PIPES로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 용액 또는 2 종 이상의 혼합 용액인 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 히알루론산의 첨가량은 0.1 내지 5 w/v%인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서,
상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 PEO의 첨가량은 0.1 내지 20 w/v%인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 제조하기 위해서는 PEO(polyethylene oxide) 고분자를 먼저 완충용액에 첨가하는 과정의 순서가 중요하다. PEO 고분자를 완충용액에 첨가하기 전에 히알루론산을 먼저 첨가하는 경우에는 첨가된 히알루론산이 곧바로 완충용액의 물을 포획하게 되어 매우 높은 점도를 가지는 히알루론산 겔(Gel)이 형성되어 전기방사를 위한 점도를 만족시키기 어렵다. PEO는 히알루론산의 물 포획 정도를 방해할 수 있으며 PEO의 첨가량 히알루론산의 첨가량의 비율을 조절하는 것을 통해 후에 효소가 지지체 내부에 삽입될 수 있는 적절한 크기의 공극이 생성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 히알루론산과 PEO의 첨가비는 1:3 내지 1:5 인 것을 포함한다. 보다 적절하게는 히알루론산과 PEO의 첨가비율은 1:3 내지 1:4이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 전기 방사법(Electrospinning)은 전기적으로 하전된 고분자 용액 및 점도성 물질의 젯(jet)을 통해 나노 섬유 등을 제조하는 공정이다. 전기 방사 장치는 고전압 파워 서플라이(power supply), 방적돌기(spinneret) 및 섬유를 수집하는 집진판(Collector)를 포함한다. 펌프를 통해 일정 속도로 유입량을 조절하며, 노즐을 통해 토출시킨다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 주사 바늘을 방적돌기로 이용한다. 바늘 끝으로 토출될 물질의 표면장력에 의해 반구형을 이루는데, 고전압을 가하면 표면전하 사이의 상호 정전기적 반발력 및 외부 전기장에 작용된 쿨롱 힘에 의해 액상 방울이 원뿔 형태의 깔대기 형상으로 연신된다. 양전하 또는 음전하 중 어느 하나의 전하가 고분자 용액에 계속 축적되어 같은 전하의 반발력이 표면 장력을 넘어서면 노즐 끝단의 반구 형상의 젯(jet)으로 방사된다. 방사된 섬유는 반대 전하로 하전된 집전판 위로 모이며, 집진판에 도달하기 전에 연신 및 용매 휘발이 함께 수반되면서 집진판 상부에 무작위적으로 배열되어 미세 섬유가 형성된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 가교제는 ADH이며, 상기 커플링제는 EDC, EIC 및 DCC 중 어느 하나 또는 2 이상의 혼합물의 커플링제인 것을 포함한다.
추후 전기방사 후에 커플링제와 가교될 준비가 된 히알루론산 용액이 접촉되면 커플링제에 의해 히알루론산 사슬이 가교제에 의해서 가교된다. 가교시키는 과정의 목적은 히알루론산을 구성하는 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민의 단위체의 반복 서열에 의한 중합체 가닥을 다른 중합체 가닥과 결합시키는 과정을 위함이다. 글루쿠론산의 카복시산(Carboxylic acid) 작용기와 결합하여 아마이드 결합(Amide bond)을 할 수 있도록 아민(Amine)기를 도입할 수 있으며, 가교제로 아디프산 디하이드라지드(Adipic acid dihydrazide, ADH), 헥사메틸렌 디아민(Hexamethylene diamine), 시스타민(Cystamine), 숙신산 디하이드라지드(succinic dihydrazide), 헥시메틸렌 디아민(hexamethylene diamine), 이소프탈릭-디하이드라지드(Isophthalic-dihydrazide) 또는 말론산 디하이드라지드(Malonic dihydrazide) 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 가교제는 아디프산 디하이드라지드(Adipic acid dihydrazide)가 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 따른 아디프산 디하이드라지드는 상기 첨가된 히알루론산과 동량을 첨가하여 히알루론산이 완전히 가교될 수 있도록 충분히 첨가하면 바람직하다.
카복시산과 아민의 아마이드 결합에는 커플링제(Coupling agent)가 필요하다. 커플링제를 첨가하지 않으면, 카복시산과 아민 사이의 산-염기 반응에 의해 염(salt)이 형성되어 아마이드 결합을 형성시킬 수 없으며, 높은 온도로 가열하여야만 탈수 반응이 진행되어 아마이드 결합이 형성될 수 있으나, 히알루론산의 물성에 영향을 줄 수 있고, 보다 온화한 조건에서 반응시키기 위해서 용이하게 아마이드 결합을 형성시키기 위하여 커플링제를 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 커플링제는 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(이하 EDC)와 같은 카보디이미드 시약을 사용하는 것이 바람직하며, 커플링제로 diisopropylcarbodiimide(DIC) 및 Dicyclohexylcarbodiimide(DCC)를 대신 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 히알루론산은 분자량이 1 kDa 내지 1000 kDa인 것을 포함한다.
히알루론산은 글루쿠론산 및 N-아세틸글루코사민의 이당류 단위를 반복적으로 포함하는 생체 고분자로, 분자량은 1 내지 10,000 kDa까지 다양하다. 본 발명의 효소 고정용 히알루론산 나노섬유를 제조하는데 사용되는 히알루론산의 분자량은 약 500 내지 1,000 kDa이며, 보다 바람직하게는 600 kDa 내지 800 kDa인 분자량을 갖는 히알루론산을 사용한다.
공극의 크기와 공극률은 멤브레인의 성능을 결정짓는 중요한 변수로 작동하여 높은 비표면적으로 세포들의 침투에 용이할 수 있다. 나노 섬유의 직경은 고분자 용액의 농도, 전기방사에서의 가하는 전압의 세기, 용액의 유입 속도를 달리하여 조절된다. 고분자 용액의 농도가 높을수록, 전기방사에서 인가하는 전압의 세기가 높을수록, 섬유의 직경이 커진다. 섬유의 직경이 너무 커지게 되면 다공성 효과가 떨어지므로, 고분자 용액의 농도, 전압의 세기, 용액의 유입속도를 동시에 조절하여 최적의 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 제조할 수 있다. 공극은 섬유 내부에 생기는 공극 또는 섬유들이 서로 얽혀 섬유들 사이의 간극에 의해서 생성된다.
전기방사에 있어서 용액의 유입속도를 조절하여 방사 후 집전판에 도달할 때까지 용매가 완벽하게 증발하지 않으면 최종적으로 형성된 섬유 내부에 구슬 형상이 잘 형성되고, 여러 가닥의 섬유가 서로 교차된 구조를 가질 수 있다.
집전판이 담긴 용액은 히알루론산을 잘 용해시키지 않는 용매가 포함되어 있으며, 예컨대 에탄올(Ethanol) 배스(Bath)에 방사시킬 수 있다. 커플링제가 포함되어 있는 에탄올 배스의 pH를 조절하여야 하며, pH 4.5 내지 6의 에탄올 배스 조건 하에서 커플링제와 접촉하도록 한다. 커플링제가 포함되어 있는 에탄올 배스에 히알루론산 섬유를 방사시키면, 그 섬유를 녹이지 않고 형태를 보존시킬 수 있어, 배스에 녹아 있는 커플링제에 의해 실시간으로 가교 반응이 진행되어 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 성공적으로 제조될 수 있다.
전기방사 시 팁과 집전판 사이의 거리는 전기방사 후 다공성 나노 멤브레인을 형성시키기 위해 적합한 거리를 조절한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법에서, 상기 전기 방사단계는 사출 속도가 30~50 ㎕/분이며, 인가전압은 25 내지 30 kV인 것을 포함한다. 또한 팁 거리는 약 15 cm이며, 팁의 직경은 23G(직경 0.33 mm)를 이용한다.
상기 단계 후에 에탄올 배스를 원심분리 후 세척 및 건조시키는 단계를 추가적으로 포함하는 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조 방법을 제공한다. 방사 후에 에탄올 배스에서 원심 분리기를 이용하여 용매를 제거하고, 다시 고순도의 에탄올로 워싱(washing)한다. 이 후에 남은 용매등을 제거하기 위해 건조기를 이용하여 최종 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체 샘플을 수득한다. 이 때 건조기는 진공 오븐을 이용할 수 있다. 또는 50~60 및 상압 조건에서 2~3일 간 건조시키는 것도 가능하다. 샘플 속에 에탄올 및 수분이 모두 증발하여 건조 상태의 히알루론산 지지체를 획득할 수 있다. 수득된 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체가 제대로 수득되었는지 확인하기 위해 FT-IR 스펙트럼과 같은 분광학 기기를 이용하여 측정한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체는 상기의 방법에 의해서 제조된 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체에 있어서, 상기 효소는 HRP(Horseradish Peroxidase)인 것을 포함한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법은, (i) pH가 조절된 완충용액에 커플링제, 활성화제, 효소 및 제 1항의 제조 방법에 의해 제조한 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 넣고 반응시키는 단계; (ii) 반응 후 효소가 고정된 히알루론산 나노섬유 지지체가 용해된 완충용액을 원심 분리시키는 단계; 및 (iii) 상기 원심 분리된 효소가 고정된 히알루론산 나노섬유 지지체를 완충 용액을 이용하여 세척하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법에 있어서, 상기 pH가 조절된 완충용액은 pH 4 내지 5의 아세트산 나트륨염 완충용액(Sodium acetate buffer)인 것을 포함한다. 보다 바람직하게는 pH 4.5의 아세트산 나트륨염 완충용액(Sodium acetate buffer)을 이용한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법에 있어서, 상기 효소는 HRP(Horseradish Peroxidase)인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법에 있어서, 상기 커플링제는 EDC, EIC 및 DCC 중 어느 하나 또는 2 이상의 혼합물의 커플링제인 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/효소 고정체의 제조방법에 있어서, 상기 활성화제는 NHS(N-Hydroxysuccinimide)인 것을 포함한다. NHS는 카복시산에 대한 활성화제로 사용될 수 있으며, NHS는 카복시산과 반응하여 에스터 형태를 이루고 다시 아민 작용기와 반응하여 아마이드 작용기로 변환되는데 사용될 수 있다. 이에 HRP 단백질 내에 존재하는 작용기와 히알루론산 나노섬유 내의 결합기와의 커플링이 보다 활성화될 수 있도록 유도할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 제조하기 위해 상기 반응은 Rotation mixer에서 충분한 시간 동안 반응시킨다. 충분한 시간은 HRP 효소가 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정되는데 충분한 시간을 의미하는 것이며, 본 일 예시적인 시간은 약 2 시간 동안 Rotation mixer에서 반응시키는 것으로 하였으나 해당 시간 및 해당 방법에 의한 고정으로 국한되는 것은 아니며 본 목적을 달성하기 위해 대체할 수 있는 방법 또는 대체 시간으로 변경하는 것도 무방할 것이다. 반응을 완료한 후에 일 예시적으로 5000 rpm, 5 분, 4 조건에서 원심 분리를 실시할 수 있으며, 세척 과정에서 pH가 조절된 아세트산 나트륨염 완충용액(Sodium acetate buffer)을 이용하여 세척시키며 원심 분리 및 세척 과정을 수 차례 반복하여 불순물을 최대한 제거시킨다. 바람직하게는 pH 4.0의 아세트산 나트륨염 완충용액(Sodium acetate buffer)으로 세척과정을 진행한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체는 상기의 방법에 의해서 제조된 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체인 것을 포함한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB의 농도를 측정하는 방법은 과산화수소와 미지의 농도인 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)가 포함되어 있는 용액에서 본 발명의 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 첨가하여 반응시킨 후 청색으로 변환되는 TMB의 색상도를 판단하는 단계일 수 있다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 TMB의 농도를 측정하는 방법은 과산화수소와 미지의 농도인 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)가 포함되어 있는 용액에서 본 발명의 히알루론산 나노섬유/HRP 고정체를 이용하여 반응시킨 후 TMB의 흡광도를 분석하는 단계일 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험예 1: 본 발명에 이용하는 시료들
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유의 제작 및 히알루론산/HRP 효소 고정체의 제조 방법을 보여주는 전체 개략도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예의 효소 고정용 히알루론산 나노섬유의 제작 및 히알루론산 나노섬유/HRP효소 고정체의 제조방법에 사용한 시료로서, 히알루론산(Hyaluronic Acid, 이하 HA라 한다), 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethylene Oxide, 이하 PEO라 한다), 아디프산 디하이드라지드(Adipic acid dihydrazide, 이하 ADH라 한다), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, 이하 EDC라 한다), 에탄올(Ethanol), N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide, 이하 NHS라 한다), 겨자무 과산화수소(Horseradish Peroxidase, 이하 HRP라 한다), 테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine, 이하 TMB라 한다), 기질로 사용되는 과산화수소(Hydrogen Peroxide), 이후 효소 고정 실험에 사용할 시료를 용해할 용매로서 아세트산 나트륨염 완충용액(Sodium Acetate Buffer)를 사용하였다.
HRP 효소는 Thermo Fisher Scientific의 제품을 사용하였으며, 나머지 시료는 Sigma-Aldrich 사의 제품을 사용하였다. 아래의 표에 사용한 시료에 대하여 간략히 기술하였다. 실험을 위한 기구로는 시료를 담을 5 ml 튜브(Tube), 적정량의 시료 채취 및 측정을 위한 피펫, 저울, 시료의 혼합을 위한 볼텍스 믹서(Vortex mixer), 제작한 샘플을 보관할 50ml 팔콘(Falcon), 전기 방사된 샘플을 수집할 페트리 디쉬(Petri dish), 방사에 필요한 10 ml 시린지(Syringe), 23호 팁(tip) (시린지 말단에 결합하여 사용), 전기방사기(Electrospinning Machine), 원심분리기(Centrifuges), 적외선 분광기(IR Spectrometer)를 준비하였다. 하기 표 1에서 시약 종류에 따른 분자 구조 및 분자량, 실제 실험에 사용한 양을 기재하였다.

시약종류
분자 구조
분자량
양

히알루론산(Hyaluronic Acid)
Figure 112015127228822-pat00001
730 KDa
20 mg

PEO
[Polyethylene Oxide]
Figure 112015127228822-pat00002
300 KDa
20~80 mg

ADH
[Adipic acid dihydrazide]
Figure 112015127228822-pat00003
174.20 g/mol
20 mg

EDC
[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide]
Figure 112015127228822-pat00004
191.70 g/mol
20 mg

NHS
[N-hydroxysuccinimide]
Figure 112015127228822-pat00005
115.09 g/mol
0.276 mg

HRP
[Horseradish Peroxidase]

-
305 unit/mg
0.002 mg
(0.6 unit)

TMB
[Tetramethylbenzidine]
Figure 112015127228822-pat00006
240.40 g/mol
0.144 mg

에탄올(Ethanol)
Figure 112015127228822-pat00007
46.07 g/mol
39.45 g
(50 ml)

과산화수소(Hydrogen Peroxide)
Figure 112015127228822-pat00008
4.01 g/mol
0.408 mg
(0.938 μl)
실험예 2: 히알루론산/ PEO 나노 섬유 지지체의 제조
1) 히알루론산/ PEO 수용액의 제조 단계
먼저 5 ml의 튜브에 2 ml의 D.W(Deionized water)을 넣고, 여기에 PEO를 20 내지 80 mg(1 내지 4 w/v%)으로 20 mg 씩 양을 달리하여 각각 첨가(제조예 1 내지 4)하였다. 튜브에 D.W를 넣은 후 히알루론산을 첨가하기 전에 먼저 PEO를 넣는 이유는 히알루론산을 별도의 전처리 없이 D.W에 첨가하게 되면 히알루론산이 수분을 과다하게 포집하여 높은 점도를 형성하게 되면 이후 가교 반응 및 전기 방사에 문제가 발생할 수 있어 히알루론산이 D.W를 포집하는 정도를 약하게 조절하기 위함이다.
튜브 내에 PEO 수용액을 볼텍스 믹서(Vortex mixer)를 이용하여 5분 동안 교반시킨 후 히알루론산(730 kDa, 730,000 g/mol) 20 mg을 첨가하였고 다시 10 분 동안 교반시켜 히알루론산/PEO 수용액을 제조하였다. 하기 표 2에서 히알루론산 첨가량 대비 PEO의 첨가량을 달리한 히알루론산/PEO 수용액의 성분비를 정리하여 나타내었다.

히알루론산 첨가량 (괄호는 w/v%)
PEO 첨가량(괄호는 w/v%)

제조예 1
20 mg(1 w/v%)
20 mg(1 w/v%)

제조예 2
20 mg(1 w/v%)
40 mg(2 w/v%)

제조예 3
20 mg(1 w/v%)
60 mg(3 w/v%)

제조예 4
20 mg(1 w/v%)
80 mg(4 w/v%)
2) 히알루론산/ PEO 가교 단계
히알루론산의 나노섬유 지지체 구조를 형성시키기 위한 가교 결합(crosslinking)을 위하여, 전기 방사를 위해 에탄올 배스에 에탄올 50 ml에 ADH 및 EDC를 각각 20 mg을 첨가하여 준비하였다. 각 가교제의 양은 히알루론산/PEO 수용액을 제조하기 위해 첨가한 히알루론산의 양과 동일한 양을 첨가하였다. 이를 통해 히알루론산이 충분히 가교될 수 있도록 가교제의 양을 추가적으로 첨가하는 것도 가능하다.
3) 전기방사
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 제작하기 위해 히알루론산 수용액을 전기방사하는 과정에 사용되는 전기 방사 장치의 모식도이다.
상기 단계 1) 및 2)에서 제작한 히알루론산/PEO 수용액(제조예 1 내지 제조예4)과 가교제인 ADH 및 커플링제인 EDC가 포함되어 있는 에탄올 배스에 전기방사과정을 진행하여 가교시켰다. 단계 1)에서 제조한 히알루론산/PEO 수용액을 10 ml의 시린지에 옮겨 담은 후 방사 굵기로 분사시키기 위해 말단에 23호 팁(tip)을 결합하였다. 준비한 ADH 및 EDC를 페트리디쉬에 옮겨 담아 준비하였다. 본 발명의 일 실시예에 따른 팁과 페트리 디쉬 사이의 거리는 15 cm로 하였고, 히알루론산과 PEO의 비율을 달리한 제조예 1 내지 제조예 4의 수용액에 대하여 PEO의 농도에 따라 PEO : 히알루론산 = 1 : 1의 제조예 1에서는 30~50 ㎕/분의 사출 속도 및 25 내지 30 kV의 전압을 인가하는 조건에서 전기 방사를 수행하였다. PEO : 히알루론산 = 2 : 1 내지 4 : 1의 제조예 2 내지 제조예 4에서는 50㎕/분의 사출 속도와 25 내지 28 kV의 전압을 인가하는 조건에서 전기 방사를 수행하였다. 방사된 용액은 에탄올 배스로 활용한 페트리 디쉬에 축적되도록 하였으며, 페트리 디쉬 내의 ADH 및 EDC에 의해 가교 반응이 진행되도록 수행하였다. 도 2를 참조하면, 방사된 수용액은 페트리 디쉬 내의 EDC와 먼저 반응이 수행되어 히알루론산과 EDC 사이의 커플링 반응이 먼저 진행된 후 다시 ADH와 가교 반응이 진행되어 히알루론산의 카복시기(-COOH)와 펩타이드 결합(O=C-NH)이 형성되면서 히알루론산과 가교 결합이 완료되었다.
4) 방사 후 처리 단계
상기 단계 3)에서 전기 방사시킨 제조예 1 내지 제조예 4로부터 제작한 샘플을 원심분리기를 사용하여 원심 분리 과정을 진행하였다. 원심 분리 시의 조건은 1000 rpm, 5 분, 5이었다. 원심 분리 후에 생성되는 백색의 침전물을 보존하고 에탄올과 반응에 참여하지 않고 남은 가교제인 ADH 및 EDC 및 기타 불순물이 존재하는 용액을 제거하였다. 용액 제거 후에 고순도의 에탄올을 이용하여 세척 과정을 진행하였고 이를 3회 반복하였다. 다시 50 내지 60, 1 atm 조건에서 2~3일 동안 건조시켜 에탄올 및 수분을 증발시켰다. 이 후 건조된 히알루론산 나노섬유 지지체를 획득하였다.
5) 히알루론산 나노섬유 지지체의 SEM 구조 분석
상기의 단계 4)에서 제작한 히알루론산 나노섬유 지지체의 구조를 분석하기 위해, 주사형 전자 현미경(Scanning Electron Microscopy, 이하 SEM이라 한다)을 이용하여 표면 분석을 확인해 보았다. 상기 제작한 제조예 1 내지 제조예 4의 히알루론산/PEO 수용액에서 PEO 첨가량을 달라한 수용액을 각각 전기방사시켜 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 구조를 SEM을 통해 표면 이미지를 얻었고 이를 도 3 내지 도 6에 표시하였다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산/PEO의 비율이 1:1인 수용액을 전기방사시켜 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 SEM 이미지이며, 도 4는 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산/PEO의 비율이 1:2인 수용액을 전기방사시켜 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 SEM 이미지이며, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산/PEO의 비율이 1:3인 수용액을 전기방사시켜 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 SEM 이미지이며, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산/PEO의 비율이 1:4인 수용액을 전기방사시켜 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 SEM 이미지이다. 상기의 비율은 w/v%로 나타낸 것이며, 본 실험에서는 히알루론산의 첨가량을 20 mg이며 PEO의 첨가량을 20 mg(제조예 1 기준)으로 비율을 조절하였지만 비율을 일정하게 고정한다는 점에서 첨가하는 히알루론산 및 PEO의 양은 자유롭게 증감시킬 수 있음은 당연하다. 도 3 및 도 4 대비 도 5 및 도 6에서 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 이미지에서 지지체 내에서 자리 잡을 수 있는 공극(pore)의 크기가 가장 이상적인 것으로 확인할 수 있었다. 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유 지지체의 제조방법을 통해 획득한 나노섬유 지지체는 후술할 효소를 고정시키기 위한 충분한 공극을 확보하여야 한다. 공극의 크기가 너무 작은 경우 효소의 삽입이 매우 어려울 것이며, 공극의 크기가 너무 큰 경우에는 효소의 삽입에는 문제가 없겠으나 효소가 지지체 내부에 고정되기 어려울 것이므로 가장 이상적인 공극의 크기를 조절하는 것이 중요하며, 이는 PEO의 비율을 달리하여 조절할 수 있다. 도 5 및 도 6의 지지체에서 나타나는 공극의 크기가 효소가 삽입하여 고정되기 적절한 간극인 것으로 확인되었고 이에 히알루론산 대비 PEO의 w/v%는 1:2.5 내지 1:5인 것이 바람직한 것으로 판단된다.
이하 효소를 고정시키기 위한 히알루론산 나노섬유 지지체는 일 선택적으로 제조예 4의 수용액을 전기방사하여 획득한 지지체를 이용하여 후술할 효소 고정의 추가 실험을 진행하였다. 하지만 상기 제시한 PEO의 범위를 달리하여도 효소를 고정시키기 충분한 공극을 제공해 줄 것을 예상할 수 있을 것이므로 반드시 추가 실험에 의해 제한되는 것은 아니다.
6) 히알루론산 나노섬유 지지체의 적외선(Infrared, IR) 분광 데이터
상기 단계 5)에서 확인한 제조예 4의 수용액을 전기방사하여 획득한 나노섬유 지지체를 소량 채취하여 IR 분석을 수행하였다. IR 분석을 위한 샘플을 0.3 mg을 이용하였고, 충분한 크기의 펠렛의 제조를 위해 KBr(Potassium bromide) 50 mg에 상기의 샘플을 첨가하여 펠렛을 제조하였고 IR 데이터를 획득하였다.
도 7은 순수한 히알루론산 분자의 IR 분석 데이터이며, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조예 4 수용액을 전기방사하여 획득한 히알루론산 나노섬유 지지체의 IR 분석 데이터이다. 도 7에서는 알코올 작용기에서 나타나는 파수가 3200 내지 3550 cm-1의 신축 진동(Stretching vibration)의 흡수 피크 및 아마이드 결합에서 나타나는 1550 내지 1640 cm-1의 굽힘 진동(bending vibration) 수치 및 약 600 cm-1에서의 C-O-C 신축 진동의 흡광을 확인되어 통상적인 히알루론산 나노섬유 지지체에서 나타나는 흡수 피크를 확인할 수 있었다. 도 8에서는 히알루론산과 ADH의 가교 결합을 통해 펩타이드 결합(O=C-N-H)을 생성하게 되므로 상기의 데이터 수치에 더하여 C=O의 신축 진동 피크인 1710 cm-1에서 흡수 피크가 나타남을 확인할 수 있었다. 또한 펩타이드 결합의 경우에서도 N-H의 굽힘 진동 피크인 1550 내지 1640 cm-1의 흡수 피크가 확인되어 히알루론산과 ADH의 가교 결합이 성공적으로 나타나게 된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 히알루론산 나노섬유/ HRP 효소 고정체 제작
1) 효소 고정 단계
본 히알루론산 나노섬유/HRP 효소 고정체 제작을 위해 히알루론산 나노섬유 지지체 2 mg, HRP 효소 1 unit, EDC 1 mM, NHS 4 mM의 비율인 샘플을 준비하였다. 상기 시료들을 pH 4.5로 조절한 아세트산 나트륨염 완충용액(Sodium acetate buffer)에 각각 녹여 사용하였다. 보다 구체적으로 히알루론산 40 ㎕, HRP 40 ㎕, EDC 10 ㎕ 및 NHS 10 ㎕을 혼합하여 전체 100 ㎕인 샘플을 제조하였다. EDC는 HRP 효소 내의 1차 아민과 공유결합을 이루도록 커플링제로 사용하였다. 이를 통해 EDC의 커플링 반응이 효율적으로 이루어질 수 있다. 상기 샘플에 대하여 히알루론산 지지체를 포함하는 경우(실험예 1 내지 5)와 히알루론산 지지체가 없는 경우(비교예 1 내지 5)의 TMB 농도에 따른 반응성을 확인하기 위해 각각 6 개의 실험 조건을 달리 하여 진행하였으며, 상온에서 Rotation Mixer에서 약 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 용액을 5,000 rpm, 5 분, 4 조건에서 원심 분리를 실시하였다. 이 후 pH 4.0의 아세트산 나트륨염 완충용액을 이용하여 세척하였다. 원심 분리 및 세척 과정을 다시 3회 반복하여 HRP 효소를 히알루론산 지지체에 고정시키는 과정을 수행하였다.
2) 효소 고정 실험 단계
본 발명의 일 실시예에 따른 HRP 효소 고정 과정에서 단계 1)에서 제시된 시료들인 히알루론산 40 ㎕, HRP 40 ㎕, EDC 10 ㎕ 및 NHS 10 ㎕을 혼합하여 전체 100 ㎕인 조건에서 실시한 실시예 1 내지 5의 조건 및 오직 HRP(자유 효소) 100 ㎕의 조건에서 준비한 비교예 1 내지 5의 조건을 세팅하여 효소를 고정시켰다.
HRP 효소는 TMB가 기질인 과산화수소(Hydrogen peroxide)에 전자를 제공하여 2H+ + H2O2 2H2O가 되는 반응에 관여한다. 이 때 필요한 양성자(H+)는 TMB에서 제공받으며 양성자를 잃은 TMB는 TMB+, TMB2 +로 변환되는데 이 때 TMB+는 청색을 띠고, TMB2+는 노란색을 띤다.
히알루론산 지지체에 고정된 HRP 효소가 전자를 제공하는 능력에 어떠한 변화가 나타났는지를 확인하기 위해 TMB를 pH 4.0의 아세트산 나트륨염 완충용액에 하기 표 3에 기재되어 있는 시료들을 각각 용해시켜 제작하였다.

번호
비율
TMB 농도 및 양
H2O2 농도 및 양

실시예 1






HA-HRP 100 μl
0.8 mM, 100 μl













10 mM, 100 μl

실시예 2
0.6 mM, 100 μl

실시예 3
0.4 mM, 100 μl

실시예 4
0.2 mM, 100 μl

실시예 5
0 mM, 100 μl

비교예 1





HRP 100 μl
0.8 mM, 100 μl

비교예 2
0.6 mM, 100 μl

비교예 3
0.4 mM, 100 μl

비교예 4
0.2 mM, 100 μl

비교예 5
0 mM, 100 μl
3) 효소 반응 실험 및 결과
상기의 실시예에서 제작한 샘플 내에서 과산화수소와 농도를 달리한 TMB를 이용하여 히알루론산 지지체에 고정시킨 HRP(실시예 1 내지 5)와, 히알루론산 지지체 없는 자유 효소 조건인 HRP(비교예1 내지 5)에서의 효소 반응 과정 후 샘플의 색상 변화를 확인하였고 이를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9는 히알루론산에 HRP 효소를 고정하지 않은 상태에서 반응시켰을 때 TMB의 농도를 달리한 상태에서 샘플의 색상 변화를 확인하는 이미지이다. 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시킨 HRP인 상태에서 반응시켰을 때 TMB의 농도를 달리한 상태에서 샘플의 색상 변화를 확인하는 이미지이다.
도 9 및 도 10을 참조하면, 히알루론산 나노섬유 지지체 없는 HRP는 두 개의 전자를 제공하여 적은 양의 기질인 과산화수소와 반응하여 적은 양의 TMB가 완전히 산화되어 노란색을 띠는 것을 확인할 수 있었고 TMB의 농도가 높을수록 노란색이 점점 진하게 나타남을 확인할 수 있었다. 반면에 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정된 HRP는 한 개의 전자만을 제공하여 TMB로부터 오직 하나의 양성자만을 받도록 조절하였고 그 결과 청색 색상이 나타남을 확인할 수 있었다. 이론적으로 산화된 정도에 따라 무색 청색 노란색의 순으로 변화하는 것과 일치한다.
또한, 동일한 시간 동안 산화 반응을 진행시킨 결과 지지체에 고정하지 않은 HRP 효소의 반응 후 색상은 상대적으로 엷은 노란색이 나타나는 것이 반하여, 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시킨 HRP는 보다 진한 청색으로 나타남을 확인할 수 있었다. 이는 비교예에서의 고정되지 않은 자유 HRP가 TMB를 포착하지 못하여 비교적 소량의 TMB와 반응한 결과이며, 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정된 HRP는 보다 많은 TMB와 반응하여 더 많은 양의 TMB+ 중간체를 생성한 것으로 해석할 수 있다. 결과적으로 히알루론산 나노섬유 지지체에 HRP를 고정시키면 산화력을 약하게 조절할 수 있을 뿐만 아니라 TMB와 산화도가 증가하여 매우 낮은 농도의 TMB의 변화를 효율적이면서 정확하게 체크할 수 있다. 즉, 자유효소인 상태보다 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정된 효소의 반응이 보다 정확하게 민감하게 확인할 수 있음을 의미한다.
4) 효소 반응에 대한 흡광도 분석
비교예 1 내지 5에 대한 효소 반응 후 및 실시예 1 내지 5에 대한 효소 반응 후의 샘플의 흡광도를 각각 측정하였고 이를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
도 11은 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시키지 않은 HRP의 효소 반응 후의 흡광도 변화를 나타낸 그래프이다. 도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시킨 HRP의 효소 반응 후에 흡광도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11 및 도 12를 참조하면, 효소 반응 실험에 사용하였던 TMB+ 중간체는 380 nm와 640 nm의 파장을 흡수하면, TMB2 + 중간체는 450 nm의 파장을 흡수한다. 도 11 및 도 12에서 x축을 파장, y축을 흡수율로 놓고 판단한다. 결과를 해석하면, 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시키지 않은 HRP는 샘플 내의 TMB를 많이 포착하지 못하여 상대적으로 소량의 TMB와만 반응하게 되는데, 따라서 일정 농도 이상에서는 TMB의 농도를 정확하게 판단할 수 없음을 확인할 수 있었다. 도 11에서 0.6 mM TMB와 0.8 mM TMB의 흡광도 그래프는 정확하게 일치하고 있음을 확인할 수 있는데 자유 효소 상태인 HRP는 TMB의 농도 변화를 정확하게 판단할 수 없음을 의미하는 것이다.
반면에 도 12에 나타난 바와 같이 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시킨 HRP의 효소 반응 결과 흡광도 변화 정도를 분석해 보면 도 11과 달리 0.2 mM 내지 0.8 mM의 TMB의 농도 변화에 따른 효소 반응 정도가 그대로 반영되어 샘플 내에 존재하는 TMB의 농도 정도가 그대로 반영되고 있음을 확인할 수 있었다. 만일 TMB의 농도가 미지의 값인 상태에서 히알루론산 나노섬유 지지체에 고정시킨 HRP를 이용하면 기준이 되는 흡광도의 값을 이용하여 확인하고자 하는 TMB의 농도를 근사한 범위 내에서 정확하게 측정하는 데에 이용될 수 있을 것이다.
이상, 본 발명을 실시예에 기초하여 설명하였다. 상기 실시예는 어디까지나 예시에 불과하며, 각종 변형예가 가능할 수 있으며, 또한 이러한 변형예도 본 발명의 범위에 속한다는 것을 당업자가 이해하여야 한다.

Claims (18)

  1. (a) 완충용액에 PEO(Polyethylene oxide)를 넣고 교반시키는 단계;
    (b) 상기 PEO 완충용액에 히알루론산 고분자를 넣고 교반시켜 히알루론산/PEO 완충용액을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 히알루론산/PEO 완충용액을 가교제 및 커플링제가 포함되어 있는 에탄올 배스에 전기 방사시켜 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 제조하는 단계로 상기 가교제는 ADH이고, 상기 커플링제는 EDC, EIC 및 DCC 중 어느 하나 또는 2 이상의 혼합물이며;
    (d) pH 4 내지 5의 아세트산 나트륨염 완충용액(Sodium acetate buffer)에 커플링제, 활성화제 및 상기 단계 (c)의 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 넣고 반응시키는 단계;
    (e) 반응 후 HRP(Horseradish Peroxidase)가 고정된 히알루론산 나노섬유 지지체가 용해된 완충용액을 원심 분리 후 고순도 에탄올을 이용하여 세척하는 단계; 및
    (f-1) 상기 세척된 HRP(Horseradish Peroxidase)가 고정된 히알루론산 나노섬유 지지체를 과산화수소와 미지의 농도인 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)가 포함되어 있는 용액에 첨가하여 반응시켜 변환되는 청색의 색상 변환 정도를 확인하여 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)의 농도를 확인하는 단계
    로 구성된 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  2. (a) 완충용액에 PEO(Polyethylene oxide)를 넣고 교반시키는 단계;
    (b) 상기 PEO 완충용액에 히알루론산 고분자를 넣고 교반시켜 히알루론산/PEO 완충용액을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 히알루론산/PEO 완충용액을 가교제 및 커플링제가 포함되어 있는 에탄올 배스에 전기 방사시켜 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 제조하는 단계로 상기 가교제는 ADH이고, 상기 커플링제는 EDC, EIC 및 DCC 중 어느 하나 또는 2 이상의 혼합물이며;
    (d) pH 4 내지 5의 아세트산 나트륨염 완충용액(Sodium acetate buffer)에 커플링제, 활성화제 및 상기 단계 (c)의 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 넣고 반응시키는 단계;
    (e) 반응 후 HRP(Horseradish Peroxidase)가 고정된 히알루론산 나노섬유 지지체가 용해된 완충용액을 원심 분리 후 고순도 에탄올을 이용하여 세척하는 단계; 및
    (f-2) 상기 세척된 HRP(Horseradish Peroxidase)가 고정된 히알루론산 나노섬유 지지체를 과산화수소와 미지의 농도인 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)가 포함되어 있는 용액에 첨가하여 반응시킨 후 TMB의 흡광도를 분석하여 TMB의 농도를 확인하는 단계
    로 구성된 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 완충용액은 D.W(Deionized water), PBS, MES, HEPES, Tris, Tricine, TAPSO, DIPSO, MOPS, BES 및 PIPES로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 용액 또는 2 종 이상의 혼합 용액인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 완충용액은 D.W(Deionized water)인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 히알루론산의 첨가량은 0.1 내지 5 w/v%인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 히알루론산의 첨가량은 0.1 내지 2 w/v%인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 PEO의 첨가량은 0.1 내지 20 w/v%인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 PEO의 첨가량은 0.1 내지 5 w/v%인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 히알루론산/PEO 완충용액에 첨가된 히알루론산과 PEO의 질량비는 그 비율이 1:3 내지 1:5 인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 히알루론산은 분자량이 500 kDa 내지 1000 kDA인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 전기 방사단계는 사출 속도가 30~50 ㎕/분이며, 인가전압은 25 내지 30 kV인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 활성화제는 NHS(N-Hydroxysuccinimide)인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단계 (e)의 용액은 pH 4인 아세트산 나트륨염 완충용액인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.
  14. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 측정하고자 하는 미지의 농도의 TMB는 0 mM 내지 0.8 mM 범위 내의 TMB의 농도인 것을 특징으로 하는 HRP(Horseradish Peroxidase) 고정용 히알루론산 나노섬유 지지체를 이용한 미지의 TMB 농도를 확인하는 방법.



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