KR101797873B1

KR101797873B1 - Drug delivery system comprising polymer or lipid, α-lipoic acid and photosensitizer

Info

Publication number: KR101797873B1
Application number: KR1020160115673A
Authority: KR
Inventors: 나건; 서은하; 이충성; 김다혜; 이다은
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2017-11-14
Also published as: KR20170031637A

Abstract

본 발명은 고분자 또는 지질, α-리포익산, 광감작제 및 약물을 포함하는 약물전달체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 약물전달체에 광원 조사 시, 광감작제가 활성산소종인 일항산소를 발생시키고, 상기 발생된 일항산소를 약물전달체에 포함된 α-리포익산이 소거하면서 약물이 방출되는 것이 확인됨에 따라, 상기 약물전달체는 α-리포익산의 항산화능과 광감작제의 활성산소종 생성능을 동시에 나타낼 수 있으므로, 선택적인 활성산소종의 발생 및 소거과정을 이용하여 약물방출이 조절되는 신규한 약물전달체로 제공될 수 있다.The present invention relates to a drug delivery system comprising a polymer or lipid, a-lipoic acid, a photosensitizer, and a drug. More particularly, the present invention relates to a drug delivery system for generating an anoxic oxygen, Since it was confirmed that the generated anoxic oxygen was released while the alpha -lipoic acid contained in the drug delivery vehicle was cleared, the drug delivery vehicle simultaneously exhibited the antioxidant ability of alpha -lipoic acid and the active oxygen species production ability of photosensitizer It can be provided as a novel drug delivery system in which drug release is regulated by using selective generation and elimination of reactive oxygen species.

Description

The present invention relates to a drug delivery system comprising a polymer or lipid, a-lipoic acid and a photosensitizer,

본 발명은 고분자 또는 지질, α-리포익산 및 광감작제를 포함하는 약물전달체에 관한 것이다. The present invention relates to a drug delivery vehicle comprising a polymer or lipid,? -Lipoic acid and a photosensitizer.

리포익산(lipoic acid, LA)은 미토콘드리아의 필수요소로서 동물과 식물에 다양하게 존재하며, 주로 미토콘드리아 내의 효소 반응에서 조효소로 작용한다. 모든 세포 내에서 생합성되며, 옥타논산(octanoic acid)이 리포익산의 C-8 지방산 사슬의 전구체가 되고, 시스테인(cysteine)이 황의 공급원이 되어 리포익산의 생합성이 일어난다고 알려져 있다. Lipoic acid (LA) is an essential element of mitochondria and exists in various forms in animals and plants. It acts mainly as a coenzyme in enzymatic reactions in mitochondria. It is known that octanoic acid becomes a precursor of the C-8 fatty acid chain of lipoic acid, and cysteine becomes a source of sulfur and biosynthesis of lipoic acid occurs.

리포익산과 리포익산이 환원된 형태인 디히드로리포산(dihydrolipoic acid)은 항산화제로 잘 알려져 있으며, 비타민 C, E 및 글루타치온을 보호하여 효과를 증진시키고, NF-kB를 억제하여 항염증제로써 자외선에 의한 조직손상을 저해시키는 기능을 한다. Dihydrolipoic acid, which is a form of reduced lipoic acid and lipoic acid, is well known as an antioxidant. It protects vitamin C, E and glutathione, enhances the effect, inhibits NF-kB, It functions to prevent damage.

이러한 리포익산은 오랫동안 약제학 분야에서 다양한 질환에 중요한 약물로서 사용되어 왔는데, 그의 일례로 당뇨병[Ziegler D. et al., Diabetologia, 38:1425-1433, 1995], 간질환[Bode J. Ch. et al., DMW, 112(9): 349-352, 1987], 식욕 억제 효과[독일특허 제19,818,563호], 천식[대한민국 공개특허 제2004-97820호], 편두통[대한민국 공개특허 제2002-60168호]등에 적용된 보고가 있다.Such lipoic acid has long been used as an important drug for a variety of diseases in the pharmaceutical field, including diabetes [Ziegler D. et al., Diabetologia, 38: 1425-1433, 1995], liver disease [Bode J. Ch. et al., DMW, 112 (9): 349-352, 1987], appetite suppression effect [German Patent No. 19,818,563], asthma [Korea Patent Publication No. 2004-97820], migraine [Korean Patent Publication No. 2002-60168 There is a report applied to the call.

그러나 반응성이 큰 -SH(sulfhydryl)기 함유 화합물의 특성상 산화되어 이황화물을 만들기 때문에 용해도가 감소하고 변색, 분해 등 안정성에 문제가 있다고 알려져있다. 또한, 에탄올에는 용해되나, 물에는 용해도가 낮아 생체 이용률에 영향을 미치며 낮은 녹는점으로 인해 제형화에 문제가 있다.However, due to the nature of highly reactive -SH (sulfhydryl) group-containing compounds, they are oxidized to produce disulfides, so that their solubility decreases and there is a problem in stability such as discoloration and decomposition. It is also soluble in ethanol, but it has low solubility in water, which affects bioavailability and is problematic in formulation due to its low melting point.

광감작제(photosensitizer)는 빛 자극에 의해 단 분자 산소, 자유라디칼들 또는 과산화물질들과 같은 세포독성물질을 생산하게 되며, 이러한 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)은 주변의 조직을 파괴시키므로, 악성 종양의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 광감작제를 치료하고자 하는 부위에 국소투여하거나, 광원을 환부에만 국소 조사함으로써 환부에만 선택적으로 치료할 수 있다. 또한, 광감작제는 광원 조사에 의한 특정 파장의 빛의 발생으로 영상화에 의한 종양 진단에 이용되기도 한다.Photoensitizers produce cytotoxic substances such as unicellular oxygen, free radicals or peroxides by light stimulation, and these reactive oxygen species (ROS) destroy surrounding tissues , Can be used to treat malignant tumors. Such a photosensitizer may be administered locally to the site to be treated or selectively treated only at the affected site by locally irradiating the light source only to the affected site. The photosensitizer is also used for tumor diagnosis by imaging due to the generation of light of a specific wavelength by irradiation of a light source.

따라서, 본 발명자들은 알파 리포익산의 항산화능과 광감작제의 활성산소종 생성능을 동시에 사용하여 선택적인 활성산소종의 발생 및 소거에 의한 약물방출조절이 가능한 새로운 약물전달체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have completed the present invention by preparing a novel drug delivery system capable of regulating drug release by selective generation of active oxygen species and elimination by simultaneously using the antioxidative capacity of alpha lipoic acid and the active oxygen species production ability of photosensitizer Respectively.

한국공개특허 제2008-0095182호(2008.10.28)Korean Patent Publication No. 2008-0095182 (2008.10.28)

본 발명은 고분자 또는 지질에 α-리포익산 및 광감작제를 포함하는 약물전달체에 관한 것으로, 상기 약물전달체는 광 조사된 광감작제로부터 생성되는 활성산소종인 일항산소가 α-리포익산의 구조에 영향을 주어 봉입된 약물을 방출시키는 약물전달체를 제공하고자 한다. The present invention relates to a drug delivery system comprising an α-lipoic acid and a photosensitizer in a polymer or lipid. In the drug delivery system, the anoxic oxygen, which is an active oxygen species generated from a light-irradiated photosensitizer, And to provide a drug delivery system that releases the sealed drug by influencing the drug delivery system.

본 발명은 고분자 또는 지질, α-리포익산, 광감작제 및 약물을 포함하는 약물전달체를 제공한다.The present invention provides a drug delivery system comprising a polymer or lipid, a-lipoic acid, a photosensitizer, and a drug.

상기 약물전달체는 고분자 또는 지질, α-리포익산, 광감작제 및 약물을 혼합하여 고분자 또는 지질 내로 α-리포익산, 광감작제 및 약물을 봉입시킨 것일 수 있다.The drug delivery system may be a polymer or lipid, a-lipoic acid, a photosensitizer, and a drug, which are mixed with a polymer or a lipid and α-lipoic acid, a photosensitizer and a drug are encapsulated.

상기 약물전달체는 고분자 또는 지질에 α-리포익산을 화학적으로 결합시키고, 상기 α-리포익산으로 결합된 고분자 또는 지질과 광감작제 및 약물을 혼합하여 고분자 또는 지질 내로 광감작제 및 약물을 봉입시킨 것일 수 있다.The drug delivery system chemically binds a polymer or lipid to? -Lipoic acid, mixes the? -Lipoic acid-bound polymer or lipid with the photosensitizer and the drug, encapsulates the photosensitizer and the drug into the polymer or lipid Lt; / RTI >

상기 약물전달체는 고분자 또는 지질에 광감작제를 화학적으로 결합시키고, 상기 광감작제로 결합된 고분자 또는 지질과 α-리포익산 및 약물을 혼합하여 고분자 또는 지질 내로 α-리포익산 및 약물을 봉입시킨 것일 수 있다.The drug delivery system may be one in which a photosensitizer is chemically bonded to a polymer or lipid, a polymer or lipid bound to the photosensitizer is mixed with a-lipoic acid and a drug to enclose the alpha-lipoic acid and the drug in the polymer or lipid .

상기 약물전달체는 고분자 또는 지질에 α-리포익산 및 광감작제를 화학적으로 모두 결합시킨 α-리포익산 및 광감작제로 개질된 고분자 결합체와 약물을 혼합하여 고분자 또는 지질 내로 약물을 봉입시킨 것일 수 있다.The drug delivery system may be one in which a drug is mixed into a polymer or lipid by mixing a drug with a polymer conjugate modified with? -Lipoic acid and a photosensitizer, both of which are chemically bonded to a polymer or lipid chemically together with? -Lipoic acid and a photosensitizer .

상기 약물전달체는 고분자 또는 지질에 α-리포익산을 화학적으로 결합시킨 제1고분자 결합체, 고분자 또는 지질에 광감작제를 화학적으로 결합시킨 제2고분자 결합체 및 약물을 혼합하여 고분자 또는 지질 내로 약물을 봉입시킨 것일 수 있다.The drug delivery system may include a first polymer conjugate having a polymer or lipid chemically bonded to? -Lipoic acid, a second polymer conjugate having a polymer or lipid chemically bonded with a photosensitizer, and a drug, It can be done.

본 발명에 따르면, 고분자 또는 지질, α-리포익산, 광감작제 및 약물이 포함된 약물전달체에 광원 조사 시, 광감작제가 활성산소종인 일항산소를 발생시키고, 상기 발생된 일항산소를 약물전달체에 포함된 α-리포익산이 소거하면서 약물이 방출되는 것이 확인됨에 따라, 상기 약물전달체는 α-리포익산의 항산화능과 광감작제의 활성산소종 생성능을 동시에 나타낼 수 있으므로, 선택적인 활성산소종의 발생 및 소거과정을 이용하여 약물방출이 조절되는 신규한 약물전달체로 제공될 수 있다.According to the present invention, when a light source is irradiated to a drug delivery system containing a polymer or lipid,? -Lipoic acid, a photosensitizer, and a drug, the photosensitizer generates unidirectional oxygen, which is an active oxygen species, Since it is confirmed that the drug is released while the included? -Lipoic acid is cleaved, the drug delivery system can simultaneously exhibit the antioxidative ability of? -Lipoic acid and the active oxygen species production ability of the photosensitizer, Can be provided as a novel drug delivery system in which drug release is controlled by using the generation and elimination processes.

도 1은 풀루란-g-리포익산-클로린 e6(Pullulan-g-lipoic acid-g-chlorin e6)의 구조식과 그 약물전달체의 작용기전을 나타낸 모식도이다.
도 2는 풀루란-g-리포익산-클로린 e6의 합성 구조식을 나타낸 것이다.
도 3은 풀루란-g-리포익산-클로린 e6를 ¹H NMR로 분석한 그래프이다.
도 4는 풀루란-g-리포익산-클로린 e6를 FT-IR로 분석한 그래프이다.
도 5는 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체를 확인한 결과로, 도 5(a)는 광원 조사에 따른 풀루란-g-리포익산-클로린 e6의 리포일링의 변화에 대한 흡광도 결과이며, 도 5(b)는 리포익산의 유무에 의한 일항산소 생성 정도를 확인한 결과이며, 도 5(c)는 광원 조사에 따른 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체의 입자 크기 변화를 확인한 결과이며, 도 5(d)는 광원 조사에 따른 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체의 TEM 이미지이며, 도 5(e)는 광원 조사에 따른 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체의 약물 방출 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 광원 조사에 따른 풀루란-g-리포익산-클로린 e6의 임계 미셸 농도를 확인한 결과로, 도 6(a)는 광원 조사 전의 임계 미셸 농도이며, 도 6(b)는 광원 조사 후의 임계 미셸 농도를 확인한 결과이다.
도 7은 독소루비신이 봉입된 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물 전달체(D-SRN)의 풀루란에 의한 세포 내재화를 확인한 결과로, 도 7(a)는 세포에 따른 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체의 세포 내재화이며, 도 7(b)는 간암 세포(HepG2)에서 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체의 풀루란(pullulan)에 의한 수용체 매개 세포 내재화를 확인한 결과이며, 도 7(c)는 간암 세포(HepG2)에서 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물 전달체의 풀루란에 의한 수용체 매개 세포 내재화를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 8은 독소루비신이 봉입된 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체(D-SRN)의 세포 내에서의 일항산소 생성능을 확인한 결과로, 간암 세포(HepG2)에 D-SRN을 처리하고 일항산소 생성 정도를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 9는 광원 조사에 따른 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체의 약물 방출 효과를 암 주변 및 세포 내부 산도에 따라 확인한 결과로, 도 9(a)는 암 주변 산도인 pH 6.5, 도 9(b)는 세포 내부 산도인 pH 5.0에서 확인한 결과이다.
도 10은 약물전달체의 암세포 내재화를 확인한 결과로, 도 10(a)는 자궁경부암 세포(HeLa)이며, 도 10(b)는 대장암 세포(HCT-116)에서 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체의 풀루란에 의한 수용체 매개 세포 내재화를 확인한 결과이다.
도 11은 약물전달체의 암세포 내재화를 확인한 결과로, 도 11(a)는 자궁경부암 세포(HeLa)이며, 도 11(b)는 대장암 세포(HCT-116)에서 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물 전달체의 풀루란에 의한 수용체 매개 세포 내재화를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 12는 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체의 광화학 내재화(Photochemical Internalization; PCI)를 확인한 결과로, 간암 세포(HepG2)에서 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체를 처리하고 광원 조사 전 및 광원 조사 후 광화학 내재화(Photochemical Internalization; PCI)를 확인한 결과이다.
도 13은 간암 세포(HepG2)에서 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체의 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 14는 약물전달체의 세포 독성을 확인한 결과로, 도 14(a)는 자궁경부암 세포(HeLa)이며, 도 14(b)는 대장암 세포(HCT-116)에서 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물 전달체의 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 15는 약물전달체의 항암효과를 확인한 결과로, 도 15(a)는 간암 세포(HepG2)를 이식한 마우스에서 약물전달체가 암 특이적으로 전달 및 축적되는 것을 형광 이미지로 확인한 결과이며, 도 15(b)는 간암 세포(HepG2)를 이식한 마우스에서 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체(SRN) 또는 독소루비신이 봉입된 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물전달체(D-SRN)를 투여하고 광원 조사 유무에 따른 암의 성장 억제 효과를 확인한 결과이며, 도 15(c)는 세포의 사멸을 조직학적(H&E) 및 면역조직학적(TUNEL)으로 분석한 결과이다.
도 16은 약물전달체의 장기별 전달 및 축적 정도를 확인한 결과로, 간암 세포(HepG2)를 이식한 마우스에 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물 전달체를 처리하고 6시간 후, 장기별로 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 17은 약물전달체에 의한 생리적 변화를 확인한 결과로, 간암 세포(HepG2)를 이식한 마우스에 풀루란-g-리포익산-클로린 e6 약물 전달체를 처리하였을 때, 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 18은 mPEG-g-리포익산(mPEG-g-lipoic acid)과 mPEG-g-클로린 e6(mPEG-g-chlorin e6)가 혼합된 약물전달체의 작용기전을 나타낸 모식도이다.
도 19는 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6의 합성구조식을 나타낸 것이다.
도 20은 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6를 ¹H NMR 분석한 그래프이다.
도 21은 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6를 FT-IR 분석한 그래프이다.
도 22는 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 여러 가지 비율로 혼합된 약물전달체에 광원 조사에 따른 입자 크기의 변화를 확인한 결과이다.
도 23은 광원 조사에 따른 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6 약물전달체의 SEM 이미지이다.
도 24는 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합된 약물전달체의 일항산소 생성능을 확인한 결과로, 상기 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합되었을 때, 리포익산의 유무에 의한 일항산소 생성정도를 확인한 결과이다.
도 25는 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합된 약물전달체의 리포일링 변화를 확인한 결과로, mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합되었을 때, 광원 조사에 따른 리포일링의 변화에 대한 흡광도 값이다.
도 26은 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합된 약물전달체의 약물 방출 효과를 확인한 결과이다.
도 27은 광원 조사에 따른 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6의 임계 미셸 농도를 확인한 결과이다.
도 28은 플루로닉 F68-g-헤마토포르피린(Pluronic F68-g-Hematoporphyrin)의 합성구조식과 리포익산이 내부에 봉입된 약물전달체의 작용기전을 나타낸 모식도이다.
도 29는 플루로닉 F68-g-헤마토포르피린을 ¹H NMR 분석한 그래프이다.
도 30은 플루로닉 F68-g-헤마토포르피린을 FT-IR 분석한 그래프이다.
도 31은 플루로닉 F68-g-헤마토포르피린의 일항산소 생성효과를 확인한 결과로, 일항산소 검출 시약인 DMA를 사용하여 리포익산의 유무와 광원 조사에 따른 플루로닉 F68-g-헤마토포르피린의 일항산소 생성 정도를 확인한 결과이다.
도 32는 DPPC-피오포바이드(Dipalmitoylphosphatidylcholie-Pheophorbide) α-리포익산의 구조식과 약물전달체의 모식도이다.
도 33은 DPPC-피오포바이드 α-리포익산으로 이루어진 약물전달체의 작용기전을 나타낸 모식도이다.
도 34는 DPPC-피오포바이드 α-리포익산 약물전달체를 확인한 결과로, 도 34(a)는 광원 조사에 따른 DPPC-피오포바이드 α-리포익산 약물전달체의 입자 크기 변화를 확인한 결과이며, 도 34(b)는 광원 조사에 따른 DPPC-피오포바이드 α-리포익산의 리포일링 변화에 대한 흡광도 결과이며, 도 34(c)는 광원 조사에 따른 DPPC-피오포바이드 α- 리포익산 약물전달체의 SEM 이미지이다.
도 35는 DSPE-PEG2000-g-피오포바이드 α(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]-Pheophorbide α)와 리포익산이 혼합된 약물전달체의 작용기전을 나타낸 모식도이다.
도 36은 DSPE-PEG2000-g-피오포바이드 α의 합성구조식을 나타낸 것이다.
도 37은 DSPE-PEG2000-g-피오포바이드 α를 ¹H NMR 분석한 그래프이다.
도 38은 DSPE-PEG2000-g-피오포바이드 α를 TLC(Thin Layer Chromatography)로 분석한 그래프이다.
도 39는 DSPE-PEG2000-g-피오포바이드 α 약물전달체의 광원 조사에 따른 입자 크기 변화를 확인한 결과이다.
도 40은 DSPE-PEG2000-g-리포익산과 피오포바이드 α가 혼합된 약물전달체의 작용기전을 나타낸 모식도이다.
도 41은 DSPE-PEG2000-g-리포익산의 합성구조식을 나타낸 것이다.
도 42는 DSPE-PEG2000-g-리포익산을 ¹H NMR 분석한 그래프이다.
도 43은 DSPE-PEG2000-g-리포익산을 FT-IR 분석한 그래프이다.
도 44는 DSPE-PEG2000-g-리포익산 약물전달체의 광원 조사에 따른 입자 크기 변화를 확인한 결과이다.FIG. 1 is a schematic diagram showing a structural formula of pullulan-g-lipoic acid-g-chlorin e6 and a mechanism of action of the drug delivery system.
Fig. 2 shows a synthetic structural formula of pullulan-g-lipoic acid-chlorine e6.
3 is a graph of ¹ H NMR analysis of pullulan-g-lipoic acid-chlorine e6.
4 is a graph showing FT-IR analysis of pullulan-g-lipoic acid-chlorine e6.
Fig. 5 shows the results of absorbance analysis for the change of lipofusing activity of pullulan-g-lipoic acid-choline e6 according to irradiation with light, as a result of confirming the drug delivery system of pullulan-g-lipoic acid-choline e6 , Fig. 5 (b) shows the result of confirming the degree of production of anoxic oxygen by the presence or absence of lipoic acid, and Fig. 5 (c) shows the result of confirming the particle size change of the drug delivery vehicle of pullulan-g-lipoic acid- Fig. 5 (d) is a TEM image of a drug delivery vehicle of pullulan-g-lipoic acid-choline e6 according to a light source irradiation, and Fig. 5 And the drug release effect of the drug delivery system.
Fig. 6 shows the results of confirming the critical micelle concentration of pullulan-g-lipoic acid-chlorine e6 according to the light source irradiation, wherein Fig. 6 (a) is the critical micelle concentration before the light source irradiation, Fig. 6 (b) Michel concentration.
7 shows the results of confirming cell internalization of pullulan-g-lipoic acid-choline e6 drug delivery vehicle (D-SRN) encapsulating doxorubicin by pullulan. Fig. 7 (a) Fig. 7 (b) shows the cell internalization of lipofectamine-choline e6 drug delivery vehicle by pullulan of pullulan-g-lipoic acid-choline e6 drug transporter in liver cancer cells (HepG2) FIG. 7 (c) is a result of confirming receptor-mediated cellular internalization of pullulan-g-lipoic acid-choline e6 drug delivery system in liver cancer cells (HepG2) by confocal microscopy.
8 shows the results of confirming the ability of heparin-g-lipoic acid-choline e6 drug delivery vehicle (D-SRN) encapsulated with doxorubicin to produce an anoxic oxygen in the cells. As a result, D- The degree of oxygen production was confirmed by confocal microscopy.
9 shows the drug release effect of the drug delivery system of pullulan-g-lipoic acid-chlorine e6 according to the light source irradiation according to the cancer surrounding and intracellular acidity. Fig. 9 (a) 9 (b) is the result of confirming the intracellular acidity at pH 5.0.
10 (a) and 10 (b) show cervical cancer cells (HeLa) and cancer cells (HCT-116), respectively, as a result of confirming the internalization of cancer cells of the drug delivery system. Mediated cellular internalization by pullulan of the choline e6 drug delivery system.
11 (a) shows cervical cancer cells (HeLa), and Fig. 11 (b) shows the results of confirming the internalization of cancer cells of drug delivery vehicles. Confocal microscopy confirmed the receptor-mediated cellular internalization by pullulan in the chlorin e6 drug delivery system.
12 shows the results of confirming the photochemical internalization (PCI) of the drug delivery system of pullulan-g-lipoic acid-chlorine e6, and it has been found that the drug delivery system of pullulan-g-lipoic acid-choline e6 is treated in liver cancer cells (HepG2) Photochemical internalization (PCI) was confirmed before and after irradiation of the light source.
FIG. 13 shows the cytotoxicity of pullulan-g-lipoic acid-chlorine e6 drug transporter in liver cancer cells (HepG2).
Fig. 14 shows cytotoxicity of the drug delivery system. Fig. 14 (a) is cervical cancer cell (HeLa) and Fig. 14 (b) It is the result of confirming cytotoxicity of chlorin e6 drug delivery system.
Fig. 15 shows the result of confirming the anticancer effect of the drug delivery system. Fig. 15 (a) shows the fluorescence image of the drug delivery vehicle in a mouse transplanted with liver cancer cells (HepG2) (b) is a graph showing the effect of a pullulan-g-lipoic acid-choline e6 drug delivery vehicle (SRN) or a pullulan-g-lipoic acid-choline e6 drug delivery vehicle (D-SRN) containing doxorubicin in a mouse transplanted with hepatocarcinoma cells FIG. 15 (c) shows the results of histological (H & E) and immunohistological (TUNEL) analysis of cell death.
16 shows the results of confirming the degree of delivery and accumulation of drug carriers by organ. As a result, it was found that 6 hours after treatment of pullulan-g-lipoic acid-choline e6 drug delivery vehicle in mice transplanted with liver cancer cells (HepG2) .
FIG. 17 shows the result of confirming the physiological change by the drug delivery system. As a result, the body weight of the mouse transplanted with heparin cancer cell (HepG2) was examined after treatment with pullulan-g-lipoic acid-choline e6 drug delivery vehicle.
18 is a schematic diagram showing the mechanism of action of a drug delivery system in which mPEG-g-lipoic acid (mPEG-g-lipoic acid) and mPEG-g-chlorin e6 (mPEG-g-chlorin e6) are mixed.
19 shows the synthesis formula of mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-chlorin e6.
20 is a graph of ¹ H NMR analysis of mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-chlorin e6.
21 is a graph showing FT-IR analysis of mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-chlorin e6.
FIG. 22 shows the results of examining the particle size of the drug delivery vehicle in which mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-chlorin e6 were mixed at various ratios according to light irradiation.
23 is an SEM image of mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-choline e6 drug delivery vehicle according to light irradiation.
24 shows the result of confirming the anoxic-producing ability of a drug delivery vehicle in which mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-choline e6 are mixed. When mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g- The results are as follows.
25 shows the results of confirming the lipophilization changes of the drug delivery vehicle in which mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-choline e6 were mixed. When mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g- Lt; RTI ID = 0.0 >%< / RTI >
Fig. 26 shows the results of drug release effect of a drug delivery vehicle in which mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-choline e6 were mixed.
FIG. 27 shows the results of confirming the critical micelle concentration of mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-chlorin e6 according to light irradiation.
FIG. 28 is a schematic diagram showing the synthetic mechanism of Pluronic F68-g-Hematoporphyrin and the mechanism of action of the drug carrier in which lipoic acid is encapsulated therein.
29 is a graph of ¹ H NMR analysis of pluronic F68-g-hematoporphyrin.
30 is a graph showing FT-IR analysis of pluronic F68-g-hematoporphyrin.
FIG. 31 shows the result of confirming the effect of producing an anion oxygen of the F68-g-hematoporphyrin on the floronic F68-g-hematoporphyrin according to the presence or absence of lipoic acid and irradiation of light using DMA, It is the result of confirming the degree of oxygen production of porphyrin.
32 is a schematic diagram of a DPPC-Dipeptidylcholine-Pheophorbide a-lipoic acid and a drug delivery system.
33 is a schematic diagram showing the mechanism of action of a drug delivery system composed of DPPC-phiopoide a-lipoic acid.
34 (a) shows the result of confirming the particle size change of the DPPC-phopopone-alpha-lipoic acid drug delivery vehicle according to the light source irradiation, and Fig. 34 34 (b) is the absorbance of the DPPC-pyoporiboidal-lipoic acid according to the light source irradiation, and FIG. 34 (c) SEM image.
FIG. 35 is a graph showing the effect of a drug (hereinafter referred to as " DSPE-PEG2000-g-phiophorbide alpha (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N- And the mechanism of action of the transporter.
Fig. 36 shows a synthetic structural formula of DSPE-PEG2000-g-phophorbide a.
FIG. 37 is a graph showing the 1H NMR analysis of DSPE-PEG2000-g-pyoprobide a.
FIG. 38 is a graph of TCE (Thin Layer Chromatography) analysis of DSPE-PEG2000-g-pyoporpide a.
FIG. 39 shows the result of confirming the particle size change of the DSPE-PEG2000-g-pyoporpide alpha drug delivery vehicle upon irradiation with a light source.
40 is a schematic diagram showing the mechanism of action of a drug delivery system in which DSPE-PEG2000-g-lipoic acid is mixed with piofoavide [alpha].
41 shows a synthetic structural formula of DSPE-PEG2000-g-lipoic acid.
Fig. 42 is a graph of? H NMR analysis of DSPE-PEG2000-g-lipoic acid.
Figure 43 is a graph of FT-IR analysis of DSPE-PEG2000-g-lipoic acid.
Fig. 44 shows the result of confirming the particle size change of the DSPE-PEG2000-g-lipoic acid drug delivery vehicle upon irradiation with light.

본 발명은 고분자 또는 지질, α-리포익산, 광감작제 및 약물을 포함하는 약물전달체를 제공할 수 있다.The present invention can provide a drug delivery system comprising a polymer or lipid, a-lipoic acid, a photosensitizer, and a drug.

상기 고분자는 풀루란(pullulan), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 히알루론산(hyauronic acid), 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 전분(starch), 키토산(chitosan), 덱스트란(dextran), 펙틴(pectin), 커드란(curdlan), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리아스파르트산(poly-aspartic acid), 폴리락틱산(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(카프로락톤-락타이드) 랜덤 공중합체(PCLA), 폴리(카프로락톤-글리콜라이드) 랜덤 공중합체(PCGA), 폴리(락타이드-글리티콜라이드) 랜덤 공중합체 (PLGA), 폴리에틸린 글라이콜(polyethylene glycol), 플루로닉 F-68(pluronic F-68) 및 플루로닉 F-127(pluronic F-127)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것일 수 있다. The polymer may be selected from the group consisting of pullulan, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, glycol chitosan, starch, chitosan, dextran, pectin, pectin, curdlan, poly-L-lysine, polyaspartic acid, polylactic acid (PLA), polyglycolide (PGA), polycaprolactone (PCLA), poly (caprolactone-lactide) random copolymer (PCLA), poly (caprolactone-glycolide) random copolymer (PCGA) And may be one or more selected from the group consisting of polyethylene glycol, pluronic F-68 and pluronic F-127.

보다 바람직하게는 풀루란(pullulan), 폴리에틸린 글라이콜(polyethylene glycol) 및 플루로닉 F-68(pluronic F-68)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.More preferably, it may be selected from the group consisting of pullulan, polyethylene glycol, and pluronic F-68.

상기 지질은 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글라이콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000], DSPE-PEG2000), 디팔미토일포스파티딜콜린(Dipalmitoylphosphatidylcholie, DPPC), L-α-포스파티딜콜린(L-α-phosphatidylcholine), 1,2-디팔미토일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디스테로일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 및 1,2-디스테로일-sn-글라이세로-3-포스포콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것일 수 있다.The lipid is 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) -2000] (1,2- distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPG), N-[amino (polyethylene glycol) -2000], DSPE-PEG2000, Dipalmitoylphosphatidylcholie (DPPC), L-α-phosphatidylcholine, Glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, and 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Or one or more selected from the group.

상기 광감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상세하게는, 상기 포르피린계 화합물은 피오포바이드 α, 클로린계 화합물은 클로린 e6일 수 있다.The photosensitizer may be selected from the group consisting of a phorphyrins compound, a chlorins compound, a bacteriochlorins compound, a phthalocyanine compound, a naphthalocyanines compound, and a 5- 5-aminoevuline esters) compounds. Specifically, the porphyrin compound may be pyophorbide a, and the chlorine compound may be chlorin e6.

상기 약물은 파크리탁셀, 독소루비신, 젬시타빈, 실로리무스, 에토포사이드, 빈블라스틴, 빈카알칼로이드, 도세탁셀, 시스플라틴, 글리벡, 아드리아마이신, 시클로포스파미드, 테니포사이드, 5-플로오로우라실, 캠토세신, 타목시펜, 아나스테로졸, 플록슈리딘, 류프로리드, 플로타미드, 졸레드로네이트, 빈크리스틴, 스트렙토조토신, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이리노테칸, 비노렐빈, 히도록시우레아, 발루비신, 레티노익산 (retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트, 메클로레타민, 클로람부실, 부술판, 독시플루리딘, 프레드니손, 테스토스테론, 미토산트론, 아스피린, 살리실레이트, 이부프로펜, 나프로센, 페노프로펜, 인도메타신, 페닐부타존, 시클로포스파미드, 메클로에타민, 덱사메타손, 셀레콕시브, 발데콕시브, 니메슐리드, 코르티손, 코르티코스테로이드 및 마이토마이신C로 이루어진 군에서 선택된 항암제, 단백질, 펩타이드 및 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.The drug is selected from the group consisting of paclitaxel, doxorubicin, gemcitabine, silolimus, etoposide, vinblastine, vinca alkaloids, docetaxel, cisplatin, glivec, adriamycin, cyclophosphamide, tenifoside, 5-fluorouracil, , Tamoxifen, anastrozole, fluoxuridine, lufurolide, flotamide, zoledronate, vincristine, streptozotocin, carboplatin, topotecan, velotecan, irinotecan, vinorelbine, hydoroxyurea , Valvocine, retinoic acid series, mesotrexate, mechlorethamine, chlorambucil, bisulfan, doxifluridine, prednisone, testosterone, mitosartron, aspirin, salicylate, ibuprofen, But are not limited to, corticosteroids, corticosteroids, progesterone, fenoprofen, indomethacin, phenylbutazone, cyclophosphamide, mcloethamine, dexamethasone, celecoxib, valdecoxib, nimesulide, cortisone, And anticancer agents, proteins, peptides, and genes selected from the group consisting of Lloyd and mitomycin C can be selected.

상기 약물전달체의 평균입경은 10 nm 내지 100 μm 일 수 있다.The mean particle size of the drug delivery vehicle may be between 10 nm and 100 mu m.

본 발명의 일실시예에 따르면, 일항산소에 의해 DCF(2-deoxycoformycin)로 변하면서 형광을 나타내는 물질인 카복시-H₂DCFDA를 이용하여 간암세포에서 본 발명의 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6 약물전달체의 광조사에 따른 일항산소 생성능을 확인한 결과, 도 8과 같이 독소루비신이 봉입된 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6 약물전달체(D-SRN)에 광원이 조사된 경우, 광원이 조사되지 않은 약물전달체와 비교하여 DCF 형광 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.According to one embodiment of the present invention, a carbohydrate-g-lipoic acid-g of lipofuscin-g-lipoic acid of the present invention is produced in hepatic cancer cells by using carboxy-H ₂ DCFDA, which is a substance that turns into DCF (2-deoxycoformycin) -Chlorin e6 drug delivery system, it was found that when the light source was irradiated to the pullulan-g-lipoic acid-g-chlorin e6 drug delivery vehicle (D-SRN) encapsulating doxorubicin as shown in FIG. 8 , It was confirmed that DCF fluorescence expression was increased compared to a drug delivery vehicle in which the light source was not irradiated.

상기 결과로부터 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6 약물전달체가 광원조사시 암세포에서 일항산소를 효과적으로 생성하는 것이 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the drug delivery system of pullulan-g-lipoic acid-g-chlorine e6 effectively produced unilateral oxygen in cancer cells upon irradiation with light.

따라서, 상기 약물전달체는 광역학 치료제로 적용될 수 있다.Therefore, the drug delivery vehicle can be applied as a photodynamic therapy agent.

상기 광역학 치료란 광감작제, 빛 그리고 산소의 조합에 의한 치료를 말한다. 구체적으로, 먼저 광감작제를 인체에 투여하게 되면 광감작제가 병소 즉, 종양조직에 축적되고 이후 광선을 조사하게 되면 일항산소 또는 자유라디컬의 생산을 최대화하여 종양이 선택적으로 파괴되는 것이다.The photodynamic therapy refers to treatment with a combination of photosensitizer, light, and oxygen. Specifically, when the photosensitizer is first administered to the human body, the photosensitizer is accumulated in the tumor, that is, the tumor tissue, and then irradiated with light to maximize the production of oxygen or free radicals, thereby selectively destroying the tumor.

본 발명의 약물전달체는 고분자 및 α-리포익산과 광감작제를 포함하여 복합체를 형성한 것으로 약물전달체의 용도와 동시에, 광원조사시 일항산소와 같은 활성산소종을 생성시킬 수 있으므로, 광역학 치료제로서의 용도를 가질 수 있다.The drug delivery system of the present invention comprises a polymer and a-lipoic acid and a photosensitizer to form a complex, which can generate active oxygen species such as oxygen during irradiation of a light source at the same time as the use of the drug delivery system. And the like.

상기 약물전달체는 광 조사에 따라 광감작제가 활성산소종을 생성시키고, 상기 생성된 활성산소종을 α-리포익산이 소거하면서 봉입된 약물을 방출시키는 것일 수 있다.The drug delivery system may be such that the photosensitizer generates active oxygen species upon irradiation with light and releases the encapsulated drug while the generated active oxygen species are cleared of? -Lipoic acid.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 실시예 1에서 제조된 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6 약물전달체의 이동성 및 항종양 효과를 분석하기 위해, 간암세포를 6주령 BALB/C nude 마우스에 피하주사한 동물모델을 준비하고, 상기 약물전달체를 0 및 3일에 정맥주사를 통해 투여한 후, 약물전달체 투여 6시간 후에 광원을 조사하였다. According to another embodiment of the present invention, in order to analyze the mobility and antitumor effect of the drug delivery vehicle of pullulan-g-lipoic acid-g-choline e6 prepared in Example 1, liver cancer cells were cultured in 6-week-old BALB / C An animal model subcutaneously injected into nude mice was prepared, and the drug delivery vehicle was administered via intravenous injection on days 0 and 3, and the light source was irradiated after 6 hours of drug delivery.

그 결과, 도 15(a) 및 도 16과 같이 상기 약물전달체가 간암세포로 잘 전달되는 것이 확인할 수 있었으며 도 15(b)와 같이 독소루비신이 봉입된 실시예 1의 약물전달체가 투여된 동물모델에 광원이 조사된 마우스 실험군에서 적출된 종양조직의 크기가 가장 효과적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다. 도 15(c)의 H&E 염색 및 TUNEL 분석 결과에서도 상기 독소루비신이 봉입된 실시예 1의 약물전달체에 광원이 조사된 경우, 세포 사멸이 효과적으로 유도된 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the drug delivery system was well transferred to hepatocarcinoma cells as shown in FIG. 15 (a) and FIG. 16, and it was confirmed that the drug delivery system of Example 1 in which doxorubicin was enclosed as shown in FIG. It was confirmed that the size of the tumor tissue extracted from the light-irradiated mouse experimental group was most effectively reduced. In the H & E staining and TUNEL analysis of FIG. 15 (c), it was confirmed that when the light source was irradiated to the drug delivery system of Example 1 in which the doxorubicin was encapsulated, apoptosis was effectively induced.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 독소루비신이 봉입된 mPEG(polyethylene glycol)-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합된 약물전달체에 광원이 조사된 경우. 광원이 조사되지 않은 약물전달체와 비교하여 입자 크기가 변화되는 것을 확인할 수 있었다.According to another embodiment of the present invention, when a light source is irradiated to a drug carrier in which doxorubicin-encapsulated mPEG (polyethylene glycol) -g-lipoic acid is mixed with mPEG-g-chlorin e6. It was confirmed that the particle size was changed compared with the untransmitted drug delivery system.

상기 결과로부터 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합된 약물전달체가 광원 조사 시 광감작제에 의해 발생된 일항산소로 인해 α-리포익산이 소거되면서 효과적으로 입자의 크기가 변화하는 것이 확인되었다. From the above results, the drug delivery system in which mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-choline e6 are mixed is effective in reducing the size of alpha-lipoic acid by eliminating? -Lipoic acid due to an oxygen generated by the photosensitizer .

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 독소루비신이 봉입된 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합된 약물전달체에 광원이 조사된 경우. 광원이 조사되지 않은 약물전달체와 비교하여 약물 방출이 더욱 더 효과적으로 되는 것을 확인할 수 있었다.According to another embodiment of the present invention, when a light source is irradiated to a drug carrier in which mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-choline e6 mixed with doxorubicin are mixed. It was confirmed that the drug release was more effective than the drug delivery system in which the light source was not irradiated.

상기 결과로부터 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합된 약물전달체가 광원 조사 시 광감작제에 의해 발생된 일항산소로 인해 α-리포익산이 소거되면서 효과적으로 약물이 방출되는 것이 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the drug delivery system in which mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-choline e6 were mixed effectively released the drug due to the elimination of? -Lipoic acid due to the unreacted oxygen generated by the photosensitizer upon irradiation of the light source .

본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, DPPC, 피오포바이드 α, 리포익산을 봉입한 약물전달체, DSPE-PEG2000-피오포바이드 α와 리포익산이 혼합된 약물전달체 및 DSPE-PEG2000-리포익산과 피오포바이드 α가 혼합된 약물전달체에 광원이 조사된 경우, 광원이 조사되지 않은 약물전달체와 비교하여 광원 조사 시 광감작제에 의해 발생된 일항산소로 인해 α-리포익산이 소거되면서 효과적으로 입자의 크기가 변화하는 것이 확인되었다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising a DPPC, a phyopovid α, a drug carrier encapsulating lipoic acid, a drug carrier mixed with DSPE-PEG 2000 -peopoboid α and lipoic acid, and DSPE-PEG 2000- When a light source is irradiated to a drug delivery vehicle in which phytoopagus a is mixed, compared with a drug delivery vehicle in which a light source is not irradiated, the alpha-lipoic acid is erased due to an anoxic oxygen generated by the photosensitizer, It was confirmed that the size changes.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 피오포바이드 α, 리포익산을 봉입한 약물전달체의 경우 도 34(a)와 같이 상기 약물전달체에 광원 조사 후 리포익산의 리포일링 흡광도 파장대인 336 nm에서 흡광도가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 리포익산의 구조가 변화함을 확인할 수 있었다. According to another embodiment of the present invention, in the case of the drug delivery system in which the phophophobia alpha and lipoic acid are encapsulated, the drug delivery vehicle is irradiated with the light source at 336 nm, which is the lipophilic absorption wavelength range of lipoic acid, It was confirmed that the absorbance was decreased and the structure of lipoic acid was changed.

상기 광 조사는 500 내지 900 nm 파장의 광자를 1 내지 300 J/cm²으로 약물전달체에 조사될 수 있다.The light irradiation may be irradiated to the drug carrier at a photon of 500 to 900 nm at a dose of 1 to 300 J / cm ² .

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.

<< 실시예Example 1> 1> 풀루란Pullulan -g-리포익산-g--g-lipoic acid-g- 클로린Chlorine e6( e6 ( PullulanPullulan -g--g- lipoiclipoic acid-g-chlorin e6) 합성 및 약물전달체 제조 acid-g-chlorin e6) synthesis and drug delivery

1. One. 풀루란Pullulan -g-리포익산-g--g-lipoic acid-g- 클로린Chlorine e6 합성 e6 synthesis

도 2와 같은 과정으로 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6(PuLACe6)를 합성하였다.G-lipoic acid-g-chlorine e6 (PuLACe6) was synthesized by the procedure shown in Fig.

알파 리포익산(α-lipoic acid; 1.94 mmol)을 디클로로메탄(dichloromethane, DCM) 3 mL에 용해시킨 후 디클로로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide, DCC) (리포익산의 1.2 mol배)를 DCM 2 mL에 녹인 용액에 떨어뜨려 24시간 동안 반응시켜 리포일 안하이드라이드(lipoyl anhydride)를 생성하였다. 상기 용액에서 생긴 침전물을 여과하여 제거한 후 DCM 용액을 약 1 mL 정도 남기고 농축하고 풀루란(pullulan; 0.01 mmol)과 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine, DMAP) (리포익산의 1.2 mol배)이 녹아 있는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 19 mL에 혼합하여 2일간 반응시켰다. 상기 용액을 차가운 에탄올에 침전시켜 풀루란-g-리포익산(pullulan-g-lipoic acid; PuLA)를 얻고, 감압 하에 건조하였다. 상기 PuLA(500 mg)과 클로린 e6(chlorin e6; Ce6) (0.012 mmol)를 DCC(Ce6의 1.2 mol배) 및 DMAP(Ce6의 1.2 mol배)와 함께 DMSO 20 mL에 녹여 24시간 동안 빛을 차단하여 반응시켰다. Α-lipoic acid (1.94 mmol) was dissolved in dichloromethane (DCM) (3 mL), and dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (1.2 molar times of lipoic acid) was dissolved in 2 mL of DCM And reacted for 24 hours to produce lipoyl anhydride. The precipitate formed in the solution was removed by filtration, and then about 1 mL of the DCM solution was concentrated, and then pullulan (0.01 mmol) and 4-dimethylaminopyridine (DMAP) (1.2 molar times of lipoic acid) And mixed in 19 mL of dissolved dimethyl sulfoxide (DMSO), followed by reaction for 2 days. The solution was precipitated in cold ethanol to obtain pullulan-g-lipoic acid (PuLA) and dried under reduced pressure. The PuLA (500 mg) and chlorin e6 (0.06 mmol) were dissolved in DMSO (20 mL) together with DCC (1.2 molar times of Ce6) and DMAP (1.2 molar times of Ce6) Lt; / RTI >

상기 용액을 차가운 에탄올에 침전시켜 PuLA-g-Ce6(PuLACe6)을 얻었으며, 상기 PuLA-g-Ce6(PuLACe6)을 감압 하에 건조시켰다.The solution was precipitated in cold ethanol to obtain PuLA-g-Ce6 (PuLACe6). The PuLA-g-Ce6 (PuLACe6) was dried under reduced pressure.

또한, 상기 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6(PuLACe6) 화합물에 대하여 ¹H NMR 및 FT-IR을 확인하여 도 3 및 도 4와 같은 화합물의 특징을 확인하였다.Further, ¹ H NMR and FT-IR of the pullulan-g-lipoic acid-g-chlorine e6 (PuLACe6) compound were confirmed, and the characteristics of the compounds shown in FIGS. 3 and 4 were confirmed.

2. 2. 풀루란Pullulan -g-리포익산-g--g-lipoic acid-g- 클로린Chlorine e6 약물전달체 제조 e6 Drug Delivery Preparation

수용액 내에서 자기조립 된(self-assembled) 리포익산을 유효성분으로 하는 약물 전달체를 제조하기 위하여, DMSO 5 mL에 용해된 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6(10 mg) 및 독소루비신(1 mg)을 증류수에 대해 24시간 동안 투석하였다.G-lipoic acid-g-choline e6 (10 mg) and doxorubicin (10 mg) dissolved in 5 mL of DMSO were added to prepare a drug carrier containing lipoic acid as an active ingredient in a self-assembled aqueous solution 1 mg) was dialyzed against distilled water for 24 hours.

<< 실시예Example 2> mPEG-g-리포익산과 mPEG-g- 2 > mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g- 클로린Chlorine e6 합성 및 mPEG-g-리포익산과 mPEG-g-클로린 e6가 혼합된 약물 전달체 제조 e6 Synthesis and Drug Delivery with Mixed mPEG-g-Lipoic Acid and mPEG-g-Choline e6

1. mPEG-g-리포익산 및 mPEG-g-1. mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g- 클로린Chlorine e6 합성 e6 synthesis

먼저, 알파 리포익산 및 클로린(mPEG의 1.2 mol배)를 각각 DCM 3 mL에 용해시킨 후 DCC(리포익산 및 Ce6의 1.2 mol배)를 DCM 2 mL에 녹인 용액에 떨어뜨려 24시간 동안 반응시켜 안하이드라이드를 생성하였다. 상기 용액에서 생긴 침전물을 여과하여 제거한 후, DCM 용액을 약 1 mL 정도 남기고 농축하고 메톡시-폴리에틸렌글리콜(PEG)-AM(0.5 g) 및 DMAP(리포익산 및 Ce6의 1.2 mol배)와 함께 각각 DMF 20 mL에 녹여 24시간 동안 빛을 차단하여 반응시켰다. 상기 용액을 에테르(ether)에 침전시켜 mPEG-g-리포익산 및 mPEG-g-Ce6를 얻었으며, 상기 mPEG-g-리포익산 및 mPEG-g-Ce6를 감압 하에 건조하였다.First, alpha-lipoic acid and chlorine (1.2 molar times of mPEG) were dissolved in 3 mL of DCM, and then DCC (1.2 molar times of Lipoic acid and Ce6) was dissolved in 2 mL of DCM and reacted for 24 hours. Hydride. The precipitate formed in the solution was removed by filtration, and then concentrated with about 1 mL of DCM solution, followed by addition of methoxy-polyethylene glycol (PEG) -AM (0.5 g) and DMAP (1.2 molar amount of lipoic acid and Ce6) Dissolved in 20 mL of DMF, and reacted by blocking light for 24 hours. The solution was precipitated in ether to give mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-Ce6, and the mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-Ce6 were dried under reduced pressure.

상기 mPEG-g-리포익산 및 mPEG-g-Ce6 화합물에 대하여 ¹H NMR 및 FT-IR을 확인하여 도 20 및 도 21과 같은 화합물의 특징을 확인하였다.The mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-Ce6 compounds were characterized by ¹ H NMR and FT-IR, and the characteristics of the compounds shown in FIGS. 20 and 21 were confirmed.

2. mPEG-g-리포익산 및 mPEG-g-2. mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g- 클로린Chlorine e6가 혼합된 약물 전달체 제조 Preparation of drug carrier mixed with e6

수용액 내에서 자기조립 된(self-assembled) 리포익산을 유효성분으로 하는 약물 전달체를 제조하기 위하여, DMSO 5 mL에 용해된 mPEG-g-리포익산(10mg)과 mPEG-g-클로린 e6(1 mg) 및 독소루비신(1 mg)을 증류수에 대해 24시간 동안 투석하였다.To prepare a drug delivery system containing lipoic acid as an active ingredient in a self-assembled aqueous solution, mPEG-g-lipoic acid (10 mg) and mPEG-g-choline e6 dissolved in 5 mL of DMSO (1 mg ) And doxorubicin (1 mg) were dialyzed against distilled water for 24 hours.

<< 실시예Example 3> 3> 풀루로닉Puluronic F68-g- F68-g- 헤마토포르피린Hematoporphyrin ( ( PluronicPluronic F68-g-hematoporphyrin) 합성 및 약물전달체 제조 F68-g-hematoporphyrin synthesis and drug delivery

1. One. 풀루로닉Puluronic F68-g- F68-g- 헤마토포르피린Hematoporphyrin 합성 synthesis

풀루로닉(Pluronic F68) (100 mg)과 헤마토포르피린(hemotoporphyrin; HPP) (30 mg), DCC(HPP의 1.2 mol배), DMAP(HPP의 1.2 mol배)를 DMSO 20 mL 혼합하고 2일간 빛을 차단하여 반응시켰다. 상기 용액을 증류수에 대해 24시간 동안 투석한 후 동결 건조하였다.20 mL of DMSO was mixed with Pluronic F68 (100 mg), hematoporphyrin (HPP) (30 mg), DCC (1.2 molar times of HPP) and DMAP (1.2 molar times of HPP) Light was blocked and reacted. The solution was dialyzed against distilled water for 24 hours and lyophilized.

상기 풀루로닉 F68-g-헤마토포르피린 화합물에 대하여 ¹H NMR 및 FT-IR을 확인하고 도 27 및 도 28과 같이 화합물의 특징을 확인하였다. ¹ H NMR and FT-IR were confirmed for the PULURRONIC F68-g-hematoporphyrin compound, and the characteristics of the compound were confirmed as shown in FIGS. 27 and 28.

2. 2. 풀루로닉Puluronic F68-g- F68-g- 헤마토포르피린Hematoporphyrin 약물전달체 제조 Drug delivery

수용액 내에서 자기조립 된 리포익산을 유효성분으로 하는 약물전달체를 제조하기 위하여, DMSO 5 mL에 용해된 풀루로닉 F68-g-헤마토포르피린(10 mg), 파크리탁셀(1 mg) 및 리포익산(1 mg)을 증류수에 대해 24시간 동안 투석하였다.To prepare a drug delivery vehicle containing lipoic acid self-assembled in aqueous solution as an active ingredient, pululonic F68-g-hematoporphyrin (10 mg), paclitaxel (1 mg) and lipo Iksan (1 mg) was dialyzed against distilled water for 24 hours.

<< 실시예Example 4> 4> DPPCDPPC , , 피오포바이드Piofoboid α, 리포익산을 봉입한 약물전달체 제조 Production of drug carrier containing α, lipoic acid

1. One. DPPCDPPC -- 피오포바이드Piofoboid α-리포익산 봉입 alpha-lipoic acid inclusion

수용액 내에서 자기조립 된 리포익산을 유효성분으로 하는 약물 전달체를 제조하기 위하여 thin-film hydration 방법을 이용하였다. CHCl₃ 5 mL에 DPPC-피오포바이드 α-리포익산(50:1:30 mg)을 충분히 용해시킨 뒤, 회전증발농축기(evaporator)로 용매를 제거하였다. 그 후, 1 mM 암모늄 설페이트 완충용액(ammonium sulfate buffer) 25 mL로 충분히 수화시킨 다음 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 3분 동안 빛을 차단한 상태로 입자를 분쇄시켰다. A thin-film hydration method was used to prepare a drug delivery system containing lipoic acid self-assembled in aqueous solution as an active ingredient. After dissolving DPPC-pyopovide α-lipoic acid (50: 1: 30 mg) sufficiently in 5 mL of CHCl 3, the solvent was removed by a rotary evaporator. Then, the solution was sufficiently hydrated with 25 mL of 1 mM ammonium sulfate buffer, and the particles were pulverized with a sonicator using a sonicator for 3 minutes.

<< 실시예Example 5> 5> DSPEDSPE -- PEG2000PEG2000 -- 피오포바이드Piofoboid α( alpha ( DSPEDSPE -- PEG2000PEG2000 -g--g- PheophorbidePheophorbide α) 합성 및 약물전달체 제조 α) synthesis and drug delivery

1. One. DSPEDSPE -- PEG2000PEG2000 -- 피오포바이드Piofoboid α 합성 alpha synthesis

도 36과 같은 과정으로 DSPE-PEG2000-피오포바이드 α를 합성하였다.DSPE-PEG2000-phophorbide alpha was synthesized by the procedure shown in FIG.

피오포바이드 α(DSPE-PEG2000 의 1.2 mol배)를 CHCl₃ 5 mL에 용해시킨 후 DCC(피오포바이드 α의 1.5 mol배)를 CHCl₃ 5 mL에 녹인 용액에 떨어뜨려 4시간 동안 질소압력(N₂ purge) 하에 반응시킴으로써 안하이드라이드를 생성하였다. 상기 용액에서 생긴 침전물을 여과하여 제거한 후, CHCl₃ 용액을 DSPE-PEG2000(0.05 g) 과 NHS-Hosu(피오포바이드 α의 1.5 mol배)가 녹아 있는 CHCl₃ 10 mL에 혼합하여 48시간 동안 반응시켰다. 상기 용액을 세파덱스 G-25 사이즈 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography; SEC)를 이용하여 DSPE-PEG2000-피오포바이드 α를 얻었으며, 상기 DSPE-PEG2000-피오포바이드 α를 감압 하에 건조하였다.The solution was dissolved in 5 mL of CHCl3, and the solution was poured into a solution of DCC (1.5 molar times of piophoboid α) dissolved in 5 mL of CHCl₃. Nitrogen pressure (N 2 purge ) To produce the anhydride. The precipitate formed in the solution was removed by filtration, and the CHCl3 solution was mixed with 10 mL of CHCl3 in which DSPE-PEG2000 (0.05 g) and NHS-Hosu (1.5 molar times of the phophoboid alpha) were dissolved and reacted for 48 hours. The solution was subjected to Sephadex G-25 Size Exclusion Chromatography (SEC) to obtain DSPE-PEG2000-Piophobide alpha, and the DSPE-PEG2000-Piophobide alpha was dried under reduced pressure.

상기 DSPE-PEG2000-피오포바이드 α 화합물에 대하여 ¹H NMR, 및 TLC(Thin Layer Chormatography)를 확인하여 도 6 및 도 7과 같은 화합물의 특징을 확인하였다.1H NMR and TLC (Thin Layer Chromatography) were confirmed for the DSPE-PEG2000-pyoporpide alpha compound, and the characteristics of the compounds shown in FIGS. 6 and 7 were confirmed.

2. 2. DSPEDSPE -- PEG2000PEG2000 -- 피오포바이드Piofoboid α와 리포익산이 혼합된 약물 전달체 제조 Preparation of Drug Delivery System Mixed with α and Lipoic Acid

수용액 내에서 자기조립 된 리포익산을 유효성분으로 하는 약물 전달체를 제조하기 위하여 thin-film hydration 방법을 이용하였다. CHCl₃ 5 mL에 DSPE-PEG2000-피오포바이드 α(10.2 mg)와 에그 포스파티딜콜린(L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken); 2.3 mg) 및 리포익산(0.21 mg)을 충분히 용해시킨 뒤, 회전증발농축기로 용매를 제거하였다. 그 후, 250 mM 암모늄 설페이트 완충용액 10 mL로 충분히 수화시킨 다음 초음파분쇄기를 이용해서 10분 동안 빛을 차단한 상태로 입자를 분쇄시켰다. 구경 0.2 μm의 폴리카보네이트 멤브레인(PC membrane)으로 5회, 구경 0.1 μm의 폴리카보네이트 멤브레인으로 5회 반복하여 약물 전달체를 작은 크기로 압출 가공(extrusion) 하였다. A thin-film hydration method was used to prepare a drug delivery system containing lipoic acid self-assembled in aqueous solution as an active ingredient. After sufficiently dissolving DSPE-PEG2000-phophorbide alpha (10.2 mg), L-alpha-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) 2.3 mg) and lipoic acid (0.21 mg) in 5 mL of CHCl3, To remove the solvent. Then, it was sufficiently hydrated with 10 mL of a 250 mM ammonium sulfate buffer solution, and the particles were pulverized in a state of being shielded from light for 10 minutes by using an ultrasonic grinder. The drug carrier was extruded 5 times with a polycarbonate membrane (PC membrane) having a diameter of 0.2 μm and 5 times with a polycarbonate membrane having a diameter of 0.1 μm to extrude the drug carrier to a small size.

<< 실시예Example 6> 6> DSPEDSPE -- PEG2000PEG2000 -리포익산 합성 및 약물전달체 제조-Lipoic acid synthesis and drug delivery

1. One. DSPEDSPE -- PEG2000PEG2000 -리포익산 합성- lipoic acid synthesis

도 42와 같은 과정으로 DSPE-PEG2000-리포익산을 합성하였다.DSPE-PEG2000-lipoic acid was synthesized by the procedure shown in FIG.

먼저, 알파 리포익산(DSPE-PEG2000 의 1.5 mol배)를 DCM 3 mL에 용해시킨 후 DCC(리포익산의 1.5 mol배)를 DCM 2 mL에 녹인 용액에 떨어뜨려 24시간 동안 반응시킴으로써 안하이드라이드를 생성하였다. 상기 용액에서 생긴 침전물을 여과하여 제거한 후, DCM 용액을 DSPE-PEG2000(0.1 g)이 녹아져 있는 다른 DCM 용액(3 mL)에 섞어서 48시간 동안 반응시켰다. 상기 용액을 에테르에 침전시켜 DSPE-PEG2000-리포익산을 얻었으며, 상기 DSPE-PEG2000-리포익산을 감압 하에 건조하였다.First, alpha lipoic acid (1.5 molar times of DSPE-PEG2000) was dissolved in 3 mL of DCM, and the reaction was carried out by dropping DCC (1.5 molar times of lipoic acid) in 2 mL of DCM and reacting for 24 hours. Respectively. The precipitate formed in the solution was removed by filtration, and the DCM solution was mixed with another DCM solution (3 mL) in which DSPE-PEG2000 (0.1 g) was dissolved and reacted for 48 hours. The solution was precipitated in ether to give DSPE-PEG2000-lipoic acid, which was dried under reduced pressure.

상기 DSPE-PEG2000-리포익산 화합물에 대하여 ¹H NMR 및 FT-IR을 확인하여 도 12 및 도 13과 같은 화합물의 특징을 확인하였다.The DSPE-PEG2000-lipoic acid compound was characterized by 1H NMR and FT-IR, and the characteristics of the compounds as shown in FIGS. 12 and 13 were confirmed.

2. 2. DSPEDSPE -- PEG2000PEG2000 -리포익산과 - Lipoic acid and 피오포바이드Piofoboid α가 혼합된 약물 전달체 제조 Preparation of Drug Delivery System Mixed with?

수용액 내에서 자기조립 된 리포익산을 유효성분으로 하는 약물 전달체를 제조하기 위하여 thin-film hydration 방법을 이용하다. CHCl₃ 5 mL에 DSPE-PEG2000-리포익산(10 mg)과 에그 포스파티딜콜린(L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken); 5.2 mg) 및 피오포바이드 α(0.6 mg)을 충분히 용해시킨 뒤, 회전증발농축기로 용매를 제거하였다. 그 후, 250 mM 암모늄 설페이트 완충용액 10 mL로 충분히 수화시킨 다음 초음파분쇄기를 이용해서 10분 동안 빛을 차단한 상태로 입자를 분쇄시켰다. 구경 0.2 μm의 폴리카보네이트 멤브레인으로 5회, 구경 0.1 μm의 폴리카보네이트 멤브레인으로 5회 반복하여 약물 전달체를 작은 크기로 압출 가공했다. A thin-film hydration method is used to prepare a drug delivery system containing lipoic acid self-assembled in an aqueous solution as an active ingredient. After dissolving DSPE-PEG2000-lipoic acid (10 mg), L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) 5.2 mg) and phophoboid α (0.6 mg) in 5 mL of CHCl 3, To remove the solvent. Then, it was sufficiently hydrated with 10 mL of a 250 mM ammonium sulfate buffer solution, and the particles were pulverized in a state of being shielded from light for 10 minutes by using an ultrasonic grinder. The drug carrier was extruded to a small size by repeating 5 times with a polycarbonate membrane of 0.2 μm in diameter and 5 times with a polycarbonate membrane of 0.1 μm in diameter.

<< 실험예Experimental Example 1> 리포익산의 1> of lipoic acid 리포일링REPOILING 변화 확인 Confirm change

실시예 1, 2 및 4에서 제조된 약물전달체를 DMSO 상에 희석하고 광원을 시간별로 조사한 후, 리포익산의 리포일링 변화를 ultraviolet-visible(UV-Vis) spectrometry(UV-2450; Shimadzu, Japan)을 이용하여 흡광도 336 nm에서 확인하였다. 리포익산의 리포일링은 336 nm에서 흡광도를 나타내며 리포익산의 구조가 변화하면 흡광도가 사라지는 성질을 이용하여 리포일링의 변화를 확인하였다.UV-Vis spectrometry (UV-2450; Shimadzu, Japan) was used to dilute the drug carrier prepared in Examples 1, 2 and 4 on DMSO and irradiate the light source with time, And the absorbance was confirmed at 336 nm. Lipoylation of lipoic acid showed the absorbance at 336 nm and the change of lipofilling was observed using the property that the absorbance disappears when the structure of lipoic acid changes.

그 결과, 도 5(a)와 같이 상기 실시예 1의 약물전달체에 광원이 조사되었을 때, 336 nm의 흡광도가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 실시예 2 및 실시예 4 약물전달체 역시 도 24 및 도 34(a)와 같이 흡광도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the absorbance at 336 nm decreased when the light source was irradiated to the drug delivery system of Example 1 as shown in FIG. 5 (a), and the drug delivery vehicle of Example 2 and Example 4 was also shown in FIGS. It was confirmed that the absorbance decreases as shown in Fig. 34 (a).

<< 실험예Experimental Example 2> 2> 일항산소Singlet oxygen 소거능Scatters 확인 Confirm

리포익산이 광감작제가 생성한 활성산소종을 소거하는 능력을 확인하기 위해, 활성산소종의 하나인 일항산소를 검출하는 시약인 디메틸안트라센(Dimethylanthracene; DMA)을 사용하였다. Dimethylanthracene (DMA), a reagent for detecting unidentified oxygen, one of the active oxygen species, was used to confirm the ability of lipoic acid to erase the active oxygen species generated by the photosensitizer.

일항산소에 의해 형광이 소거되는 물질인 DMA를 혼합하고 최종적으로 DMA의 농도가 20 μM이 되도록 하였다. 일항산소 생성을 위해 각 약물전달체 용액에 광원을 시간대별로 조사하였을 때, 리포익산의 유무에 따른 일항산소 을 spectrofluorophotometer(RF-5301; Shimadzu, Japan)을 이용하여 분석하였다.The DMA, which is a material whose fluorescence is canceled by atmospheric oxygen, was mixed and finally the DMA concentration was adjusted to 20 μM. When irradiating the light source to each drug delivery solution for time-varying oxygen production, the presence of lipoic acid was analyzed using a spectrofluorophotometer (RF-5301; Shimadzu, Japan).

상기 실시예 1, 2 및 3에서 제조된 약물전달체의 DMA 농도 변화량을 확인한 결과, 도 5(b), 도 23 및 도 29와 같이 상기 약물전달체와 리포익산이 함께 투여된 실험군의 DMA 농도 감소가 상기 약물전달체가 단독으로 투여된 실험군보다 적은 것을 확인할 수 있었다.As a result of examining the amounts of change in DMA concentration of the drug delivery vehicle prepared in Examples 1, 2 and 3, it was found that the decrease of DMA concentration in the experimental group in which the drug carrier and lipoic acid were administered together as shown in FIG. 5 (b), FIG. 23, It was confirmed that the number of drug delivery vehicles was smaller than that of the drug delivery vehicle administered alone.

상기 결과로부터 리포익산이 DMA와 경쟁적으로 일항산소를 소거하는 것이 확인되었으며, 상기 약물전달체 내 리포익산이 광감작제가 생성한 활성산소종을 효과적으로 소거할 수 있음이 확인되었다. From the above results, it was confirmed that lipoic acid competitively cleans oxygen with DMA, and that lipoic acid in the drug delivery system effectively cleans active oxygen species generated by the photosensitizer.

<< 실험예Experimental Example 3> 입자 크기 분포 변화 확인 3> Confirmation of particle size distribution change

상기 실시예에서 제조한 약물전달체에 광을 조사하지 않거나 시간별로 조사하였을 때, 입자 크기 분포를 dynamic light scattering(DLS; ZetasizerNano ZS, Malvern Instruments Ltd., U.K.)을 사용하여 측정하였다.The particle size distribution was measured by dynamic light scattering (DLS; ZetasizerNano ZS, Malvern Instruments Ltd., U.K.) when light was not irradiated to the drug carrier prepared in the above example or irradiation was performed over time.

그 결과, 도 5(c)와 같이 실시예 1에서 제조된 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6 약물전달체는 10 ~ 400 nm의 크기분포로 평균크기는 120 nm였으며, 제타전위는 -28 mW로 확인되었고 광원 조사 후 크기분포가 더 광범위해지는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 5 (c), the drug delivery system of pullulan-g-lipoic acid-g-chlorine e6 prepared in Example 1 had a size distribution of 10-400 nm and an average size of 120 nm. 28 mW, and the size distribution after irradiating the light source becomes wider.

또한, 도 22와 같이 실시예 2에서 제조된 mPEG-g-리포익산 및 mPEG-g-클로린 e6 혼합 약물전달체는 80 ~ 800 nm의 크기분포로 평균 크기는 190 nm 였으며, 광원 조사 후 평균 크기가 100 nm ~ 120 nm로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 22, the mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-chlorine e6 mixed drug carrier prepared in Example 2 had a size distribution of 80 to 800 nm and an average size of 190 nm. 100 nm to 120 nm.

도 34(b)와 같이 실시예 4에서 제조된 DPPC-피오포바이드 α-리포익산 약물전달체는 100 ~ 700 nm의 크기분포로 평균크기는 240 nm로 확인되었고, 광원 조사 후 크기분포가 더 광범위해지는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 34 (b), the DPPC-phophoboidal alpha-lipoic acid drug carrier prepared in Example 4 had a size distribution of 100 to 700 nm and an average size of 240 nm, I can confirm that it is going to disappear.

도 39(a)와 같이 실시예 5에서 대조군으로 제조된 리포익산을 포함하지 않는 DSPE-PEG2000-피오포바이드 α 약물 전달체는 60 ~ 600 nm의 크기분포로 평균크기는 170 nm로 확인되었고, 광원 조사 후 크기분포가 없는 것을 확인할 수 있었다. 이와 대조적으로, 도 39(b)와 같이 실시예 5에서 제조된 DSPE-PEG2000-피오포바이드 α, 리포익산 혼합 약물 전달체는 40 ~ 500 nm의 크기분포로 평균크기는 157 nm로 확인되었고 광원 조사 후 크기분포가 더 광범위해지는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 39 (a), the DSPE-PEG2000-phophorbide alpha drug delivery vehicle without lipoic acid prepared in Example 5 had a size distribution of 60 to 600 nm and an average size of 170 nm, There was no size distribution after irradiation. In contrast, as shown in FIG. 39 (b), the DSPE-PEG2000-phophoboid alpha, lipoic acid mixed drug carrier prepared in Example 5 had a size distribution of 40-500 nm and an average size of 157 nm. The posterior size distribution was found to be wider.

마지막으로, 도 44와 같이 실시예 6에서 제조된 DSPE-PEG2000-리포익산 피오포바이드 α 혼합 약물 전달체는 7 ~ 700 nm의 크기분포로 평균크기는 143 nm로 확인되었고 광원 조사 후 크기분포가 더 광범위해지는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 44, the DSPE-PEG2000-lipoic acid peptoid alpha mixed drug carrier prepared in Example 6 had a size distribution of 7 to 700 nm, an average size of 143 nm, and a size distribution after irradiation And it was confirmed that it became broad.

<< 실험예Experimental Example 4> 형태학적 확인 4> Morphological confirmation

입자 형태를 투과형 전자 현미경(transmission electron microscope, TEM; JEM1010, Jeol, Japan) 및 전계방사형 주사 현미경(field emission scanning electron microscope, FE-SEM; Hitachi s-4800, Japan)을 사용하여 확인하였다. The particle morphology was confirmed using a transmission electron microscope (TEM) (JEM1010, Jeol, Japan) and a field emission scanning electron microscope (FE-SEM; Hitachi s-4800, Japan).

간략하게, 상기 실시예에서 제조된 입자에 빛을 조사하지 않거나 조사한 후 커버 글라스 위에 캐스팅(casting)하여 샘플을 제조하고, 이를 진공에서 건조한 후, 상기 각 샘플의 형태를 TEM 및 FE-SEM으로 이미지화하였다. Briefly, the particles prepared in the above examples were irradiated with no light or irradiated, and then cast on a cover glass to prepare a sample. After dried in a vacuum, the shape of each sample was imaged by TEM and FE-SEM Respectively.

그 결과, 도 5(d)와 같이 상기 실시예 1에서 제조된 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6 약물전달체는 광원 조사 전에는 균일한 크기의 입자 분포를 나타내었으나, 광원조사 후, 입자가 불안정하게 붕괴된 것을 확인할 수 있었다.As a result, the drug delivery vehicle of pullulan-g-lipoic acid-g-chlorine e6 prepared in Example 1 exhibited a uniform particle size distribution before irradiation with light, as shown in FIG. 5 (d) It can be seen that it collapsed unstably.

또한, 도 34(c)와 같이 상기 실시예 1에서 제조된 DPPC-피오포바이드 α-리포익산 약물전달체는 광원 조사 전에는 균일한 크기의 입자 분포를 나타내었으나, 광원조사 후, 입자가 불안정하게 붕괴된 것을 확인할 수 있었다.34 (c), the DPPC-phophoboidal? -Lipoic acid drug delivery vehicle prepared in Example 1 exhibited a uniform particle size distribution before the light source irradiation, but after the light source irradiation, the particles unstably collapsed .

<< 실험예Experimental Example 5> 약물방출 효과 확인 5> Confirm drug efficacy

상기 실시예 1에서 제조된 약물전달체를 투석막에 넣어준 뒤, 각각 pH 7.4, 6.5, 5.0의 인산완충용액(phosphate buffer saline, PBS) 또는 phosphate-citrate buffer에 넣고 50 rpm의 속도로 37°에서 약물 방출 시험을 수행하였다. 정해진 시간마다 버퍼를 교체해주고, 3시간째에 광원을 세기별로 조사하였을 때의 결과를 DMSO에 8:2로 희석하여 fluorescence multi-plate reader(TecanGenios, NC, U.S.A.)를 이용하여 확인하였다.The drug carrier prepared in Example 1 was placed in a dialysis membrane and then placed in phosphate buffer saline (PBS) or phosphate-citrate buffer (pH 7.4, 6.5, 5.0) Emission test. The buffer was replaced at every fixed time, and the result of illuminance measurement at 3 hours was diluted to 8: 2 in DMSO and confirmed using a fluorescence multi-plate reader (TecanGenios, NC, U.S.A.).

그 결과, 도 5(e)와 같이 실시예 1에서 제조된 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6 약물전달체에 광원을 조사하지 않은 실험군은 12시간 동안 20 내지 25%의 약물이 방출되었지만, 광원이 조사된 실험군에서는 12시간 동안 35 내지 45%로 약물 방출량이 증가된 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 5 (e), in the experimental group in which the light source was not irradiated to the drug delivery vehicle of pullulan-g-lipoic acid-g-chlorine e6 prepared in Example 1, 20 to 25% , And in the experimental group irradiated with the light source, the drug release amount was increased to 35 to 45% for 12 hours.

또한, 실시예 2에서 제조된 mPEG-g-리포익산 및 mPEG-g-클로린 e6 혼합 약물전달체 역시 상기 동일한 방법으로 pH 7.4의 인산완충용액에서 약물 방출량을 확인한 결과, 도 25와 같이 광원이 조사되지 않은 약물전달체 실험군의 경우, 24시간 동안 약 60%의 약물이 방출되었으나, 광원일 조사된 약물전달체 실험군의 경우, 24시간 동안 약 80 내지 90%로 약물 방출량이 증가된 것을 확인할 수 있었다.Also, the mPEG-g-lipoic acid and mPEG-g-choline e6 mixed drug carrier prepared in Example 2 were also examined for drug release amount in a phosphate buffer solution of pH 7.4 in the same manner as described above. As a result, In the untreated drug delivery group, about 60% of the drug was released in 24 hours, but in the drug delivery group irradiated with the light source, it was confirmed that the drug release amount increased to about 80 to 90% over 24 hours.

<< 실험예Experimental Example 6> 임계 미셸 농도(Critical Micelle Concentration; 6 > Critical Micelle Concentration; CMCCMC ) 확인) Confirm

약물전달체 내에 Hoechst 33342 형광물질을 봉입하여 농도가 낮을 때에는 약물전달체를 형성하지 못해 형광을 띄다가 일정량의 농도 이상에서 약물전달체가 형성되면서 Hoechst 33342의 형광이 사라지는 성질을 이용하여 임계 미셸 농도를 확인하였다.Hoechst 33342 fluorescent substance was enclosed in the drug delivery system. When the concentration was low, the drug delivery system could not be formed and fluorescence was observed. The drug delivery system was formed at a concentration higher than a certain level, and the threshold micelle concentration was confirmed using the disappearance of fluorescence of Hoechst 33342 .

상기 실시예에서 제조된 약물전달체를 광원 조사 유무에 따라 증류수를 이용하여 0.00025 내지 1 g/L의 농도로 각각 희석하였고, 이후 희석된 약물전달체 용액을 취해서 spectrofluorephotometer를 이용하여 형광 정도를 확인하였다.The drug carriers prepared in the above examples were respectively diluted with distilled water to a concentration of 0.00025 to 1 g / L depending on whether light sources were irradiated or not, and then the diluted drug carrier solution was taken and the degree of fluorescence was confirmed using a spectrofluorephotometer.

그 결과, 도 6과 같이 실시예 1에서 제조된 풀루란-g-리포익산-g-클로린 e6 약물전달체의 CMC가 0.014 g/L에서 광원 조사 후, 0.037 g/L로 증가하였다.As a result, as shown in FIG. 6, the cumulus-g-lipoic acid-g-chlorine e6 drug delivery vehicle prepared in Example 1 had an increase in the CMC from 0.014 g / L to 0.037 g / L after irradiation of the light source.

<< 실험예Experimental Example 7> 약물전달체의 암세포 내 유입 확인 7> Confirmation of drug delivery into cancer cells

상기 실시예에서 제조된 약물 전달체가 암세포 특이적으로 유입되는 것을 조사하기 위해, 시험관 내에서 배양된 암세포를 대상으로 하기 실험을 수행하였다.In order to investigate the specific introduction of cancer cells into the drug carrier prepared in the above examples, the following experiment was conducted on cancer cells cultured in vitro.

상기 실시예 1에서 제조된 약물전달체의 세포 내 유입을 확인하기 위해, 간암 세포(HepG2), 자궁경부암 세포(HeLa), 대장암 세포(HCT-116)를 배양하고 실시예 1에서 제조한 약물 전달체를 1시간 동안 처리한 후, 완충용액으로 세척하고 fluorescence multi-plate reader 및 유세포 분석기(Flow cytometer)를 이용하여 상기 약물전달체의 세포 내 유입 특성을 분석하였으며, 상기 동일한 조건에서 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정하고 세포 내 약물 전달체의 분포를 공초점 현미경을 이용하여 시각적으로 확인하였다.Hepatocellular carcinoma cells (HepG2), cervical cancer cells (HeLa), and colon cancer cells (HCT-116) were cultured in order to confirm intracellular inflow of the drug delivery vehicle prepared in Example 1, Was treated for 1 hour, washed with buffer solution, analyzed for intracellular influx of the drug delivery vehicle using a fluorescence multi-plate reader and flow cytometer, and analyzed under the same conditions with 4% paraformaldehyde Cells were fixed and the distribution of intracellular drug delivery system was visually confirmed using a confocal microscope.

간암세포와 특이적으로 결합하는 고분자로 알려진 풀루란과 실시예 1의 약물전달체의 세포 내재화 효과를 비교하기 위해, 경쟁적 대조군으로 실시예 1의 약물전달체와 풀루란을 함께 간암세포에 상기 동일한 방법으로 처리하여 약물전달체의 세포 유입 정도를 확인하였다.In order to compare the cell internalization effects of pullulan, which is known as a polymer specifically binding to liver cancer cells, and the drug delivery system of Example 1, pullulan was administered to hepatocarcinoma cells together with the drug delivery system of Example 1 as a competitive control And the degree of cell entry into the drug delivery system was confirmed.

그 결과, 도 7(a)와 같이 다른 암세포보다 간암 세포에 상대적으로 약물전달체의 유입이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 상기 약물전달체가 풀루란과 유사한 수준으로 간암세포에 유입되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 7 (a), it was confirmed that the influx of the drug transporter relative to liver cancer cells was increased compared to other cancer cells, and that the drug transporter was introduced into hepatocellular carcinoma cells at a level similar to that of pullulan.

상기 결과를 확인하기 위해 유세포 분석 결과, 도 7(b)와 같이 간암세포에서 실시예 1의 약물전달체의 세포 내재화를 확인할 수 있었다. 또한, 공초점 현미경 분석 결과인 도 7(c)와 같이 간암세포에서 실시예 1의 약물전달체가 효과적으로 내재화된 것을 확인할 수 있었다.As a result of flow cytometry analysis to confirm the above results, the cell internalization of the drug delivery system of Example 1 was confirmed in liver cancer cells as shown in FIG. 7 (b). In addition, it was confirmed that the drug carrier of Example 1 was efficiently internalized in liver cancer cells as shown in Fig. 7 (c), which is a result of confocal microscopy.

상기 결과로부터 실시예 1의 약물전달체는 풀루란을 이용한 수용체 매개 작용을 통한 세포 내재화 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the drug delivery system of Example 1 exhibited cell internalization effect through receptor mediated action using pullulan.

또한, 도 10 및 도 11과 같이 자궁경부암 세포(HeLa) 및 대장암세포(HCT-116)에서도 실시예 1의 약물전달체가 효과적으로 세포 내로 유입되는 것을 확인할 수 있었다.Also, as shown in FIGS. 10 and 11, it was confirmed that the drug delivery system of Example 1 was effectively introduced into the cells of cervical cancer cells (HeLa) and colon cancer cells (HCT-116).

<< 실험예Experimental Example 8> 약물전달체의 암세포 내 8> In cancer cells of drug delivery 일항산소Singlet oxygen 생성능Generation 확인 Confirm

상기 실시예 1에서 제조된 약물 전달체가 간암세포에 특이적으로 유입되어 간암세포 내에서 일항산소 생성 정도를 확인하기 위하여 시험관 내에서 배양된 간암세포를 대상으로 하기 실험을 수행하였다.The following experiments were performed on hepatocarcinoma cells cultured in vitro in order to confirm the degree of production of oxygen in the hepatocarcinoma cells by specifically introducing the drug carrier prepared in Example 1 into hepatocarcinoma cells.

상기 실시예 1의 약물 전달체에 독소루비신을 봉입하고 배양된 간암 세포에 처리한 후 1시간 후에 완충용액으로 세척하였다. 그 후, 카복시-H₂DCFDA(25 μM)를 처리하고 마지막 5분 동안 Hoechst 33342(1 μM)을 처리하였다. 30분 후 완충용액으로 세척하고 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정하고 공초점 현미경을 이용하여 세포 내 약물 전달체의 일항산소 생성능을 시각적으로 확인하였다.The drug delivery system of Example 1 was filled with doxorubicin, treated with the cultured liver cancer cells, and washed with the buffer solution 1 hour later. Carboxy-H ₂ DCFDA (25 μM) was then treated and Hoechst 33342 (1 μM) was treated for the last 5 minutes. After 30 minutes, the cells were washed with buffer solution, fixed with 4% paraformaldehyde, and visually confirmed by the confocal microscope.

카복시-H₂DCFDA는 일항산소에 의해 DCF(2-deoxycoformycin)으로 변하면서 형광을 나타내는 물질로, 상기 약물전달체에 1.2 J/cm²의 광원을 조사하고 DCF 형광 발현 정도를 확인하여 일항산소 생성능을 확인하였다.Carboxy-H ₂ DCFDA was transformed into DCF (2-deoxycoformycin) by a singlet oxygen and exhibited fluorescence. Irradiation of the drug carrier with a light source of 1.2 J / cm ² and confirming the degree of DCF fluorescence expression, Respectively.

그 결과, 도 8과 같이 독소루비신이 봉입된 실시예 1의 약물전달체(D-SRN)에 광원이 조사된 경우, 광원이 조사되지 않은 약물전달체와 비교하여 DCF 형광 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.As a result, when the light source was irradiated to the drug delivery vehicle (D-SRN) of Example 1 in which doxorubicin was encapsulated as shown in FIG. 8, it was confirmed that the DCF fluorescence expression was increased as compared with the drug delivery vehicle in which the light source was not irradiated.

상기 결과로부터 실시예 1의 약물전달체가 광원조사시 암세포에서 일항산소를 효과적으로 생성하는 것이 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the drug delivery system of Example 1 efficiently produced unilateral oxygen in cancer cells upon irradiation with a light source.

<< 실험예Experimental Example 9> 약물전달체의 광화학 세포질 내재화 확인 9> Confirmation of photochemical cytoplasmic internalization of drug delivery system

상기 실시예 1에서 제조한 약물 전달체가 간암세포에 특이적으로 유입되어 광화학 세포질 내재화를 유도하는 것을 확인하기 위해서 시험관 내에서 배양된 간암세포를 대상으로 하기 실험을 수행하였다.In order to confirm that the drug carrier prepared in Example 1 was specifically introduced into hepatocellular carcinoma cells to induce photochemical cytoplasmic internalization, the following experiment was conducted on liver cancer cells cultured in vitro.

간암 세포를 배양한 후, 상기 실시예 1에서 제조한 약물전달체를 2시간 동안 처리하고 완충용액으로 세척하였다. 세포의 리보솜을 Lysotracker Green DND-26 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)를 사용하여 염색하였으며, 염색된 세포를 공초점 현미경(LSM 710 Meta; Zeiss, Germany)으로 1.2 J/cm²의 광원 조사에 따라 확인하였다.After the liver cancer cells were cultured, the drug carrier prepared in Example 1 was treated for 2 hours and washed with a buffer solution. The ribosomes of cells Lysotracker Green DND-26 were stained using (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA), the stained cells confocal microscope (LSM 710 Meta; Zeiss, Germany ) in 1.2 J / cm ² As shown in Fig.

그 결과, 도 12와 같이 광원을 조사하기 전에는 세포 리보솜의 형광이 뚜렷 확인되었으나, 광원 조사 후에는 리보솜의 형광이 감소된 것을 확인할 수 있었다.As a result, the fluorescence of the cell ribosome was clearly observed before the irradiation of the light source as shown in FIG. 12, but it was confirmed that the fluorescence of the ribosome was decreased after the irradiation of the light source.

상기 결과로부터 상기 약물전달체의 광화학 세포질 내재화가 나타난 것을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the photochemical cellular internalization of the drug delivery system appeared.

<< 실험예Experimental Example 10> 약물전달체의 세포 독성 확인 10> Cytotoxicity of Drug Delivery System

상기 실시예 1에서 제조된 약물전달체에 대하여 광원 조사 유무에 따른 세포 독성 시험을 수행하였다. 시험관 내에서 배양된 간암 세포(HepG2), 자궁경부암 세포(HeLa), 대장암 세포(HCT-116)를 대상으로 하기 실험을 수행하였다.The drug delivery vehicle prepared in Example 1 was subjected to a cytotoxicity test with or without light source irradiation. (HepG2), cervical cancer cells (HeLa), and colorectal cancer cells (HCT-116) cultured in vitro were subjected to the following experiments.

상기 배양된 세포를 96-well 세포 배양 접시에 각각 분주한 뒤 12시간 동안 배양하고, 10 μg/mL 농도의 독소루비신 또는 실시예 1의 약물전달체를 단독으로 처리하거나, 동일한 농도의 독소루비신이 봉입된 약물전달체를 각각 처리하여 4시간 동안 배양하였다.The cultured cells were each divided into 96-well cell culture dishes, cultured for 12 hours, treated with doxorubicin at a concentration of 10 μg / mL or the drug carrier of Example 1 alone, or with a drug containing the same concentration of doxorubicin And then cultured for 4 hours.

그 후, 배양액을 제거하고 1.2 J/cm²의 광원을 조사한 후 48시간 동안 배양하였다. 최종적으로 세포 생존율은 MTT 분석법(Biomaterials, 2013, 34 (36) 9277-9236)에 의해 분석하였다.Thereafter, the culture medium was removed, irradiated with a light source of 1.2 J / cm ² , and cultured for 48 hours. Finally, cell viability was analyzed by MTT assay (Biomaterials, 2013, 34 (36) 9277-9236).

그 결과, 도 13과 같이 독소루비신이 봉입된 실시예 1의 약물전달체(D-SRN)가 처리된 간암세포에 광원을 조사한 경우, 세포 생존률이 50% 이하로 감소되는 것이 확인되었으나, 도 14와 같이 자궁경부암 세포 및 대장암 세포에서는 뚜렷한 독성이 나타나지 않았다.As a result, it was confirmed that when the liver cancer cells treated with the drug delivery vehicle (D-SRN) of Example 1 in which doxorubicin is encapsulated as shown in FIG. 13 were irradiated with a light source, the cell viability was reduced to 50% or less, There was no apparent toxicity in cervical cancer and colorectal cancer cells.

<< 실험예Experimental Example 11> 약물전달체의 항종양 효과 확인 11> Antitumor effect of drug delivery system

상기 실시예 1에서 제조된 약물전달체의 항종양 효과를 분석하기 위해, 간암세포를 6주령 BALB/C nude 마우스에 피하주사한 동물모델을 준비하였다. 접종된 세포의 수는 4 × 10⁶으로 100 μL의 세럼이 포함되지 않은 배양액 상에서 접종하였다. 종양의 크기를 장축 × 단축 × 단축 × 0.5 (단위 = mm³)로 계산하였다.In order to analyze the antitumor effect of the drug delivery vehicle prepared in Example 1, an animal model in which liver cancer cells were subcutaneously injected into 6-week-old BALB / C nude mice was prepared. The number of cells inoculated was 4 × 10 ^6, and inoculated on a culture medium without 100 μL of serum. The size of the tumor was calculated as major axis × minor axis × minor axis × 0.5 (unit = mm ³ ).

상기의 동물모델을 대상으로 나노입자의 항종양 효과를 확인하기 위해서 무작위로 마우스를 6개의 실험군으로 나누고 이하 실험을 진행하였다. 각각의 약물전달체를 0 및 3일에 정맥주사를 통해 투여하였으며, 광원은 약물전달체 투여 6시간 후에 조사하였다. 조사된 광원의 양은 100 J/cm²이였으며, 형광사진은 Image Station 4000 MM(Kodak, U.S.A.)을 통해 촬영되었다.To confirm the antitumor effect of the nanoparticles on the above animal model, mice were randomly divided into 6 experimental groups and the following experiment was carried out. Each drug delivery vehicle was administered intravenously on days 0 and 3, and the light source was examined 6 hours after drug delivery. The amount of irradiated light was 100 J / cm ² , and fluorescence images were taken using Image Station 4000 MM (Kodak, USA).

또한, 조직학적 분석을 위해 H&E 염색을 수행하였다. H & E staining was also performed for histological analysis.

자세하게는, 마우스로부터 추출한 종양조직을 24시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 탈파라핀 과정을 거친 후, 조직을 5 μm의 두께로 분할한 뒤에 헤마토잘린과 에오신으로 염색하였다. In detail, the tumor tissue extracted from the mouse was fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours, followed by deparaffinization, and then the tissue was divided into 5-μm-thick sections and stained with hematozolin and eosin.

면역조직화학적 분석은 TUNEL 분석법으로 수행하였다. Immunohistochemical analysis was performed by TUNEL assay.

자세하게는, 마우스로부터 추출한 종양조직을 24시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정한 후, 조직을 5 μm의 두께로 파라핀 절편하여 분할하였다. 상기 조직을 PBS로 두 번 세척하고, 0.2% Triton X-100 용액으로 10분간 상온에 두었다. 그 후, 조직을 TUNEL assay kit(Promega Corp., WI, USA)로 염색하였다.Specifically, the tumor tissue extracted from the mouse was fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours, and then the tissue was divided by paraffin section to a thickness of 5 탆. The tissue was washed twice with PBS and placed in a 0.2% Triton X-100 solution at room temperature for 10 minutes. The tissues were then stained with the TUNEL assay kit (Promega Corp., WI, USA).

그 결과, 도 15(a) 및 도 16과 같이 실시예 1의 약물전달체가 간암세포로 잘 전달되는 것이 확인되었다. 또한, 도 15(b)을 참고하면, 독소루비신이 봉입된 실시예 1의 약물전달체를 5 mg/kg의 양으로 투여한 동물모델에 광원이 조사된 마우스 실험군에서 적출된 종양조직의 크기가 가장 효과적으로 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 도 15(c)의 H&E 염색 및 TUNEL 분석 결과에서도 상기 독소루비신이 봉입된 실시예 1의 약물전달체에 광원이 조사된 경우, 세포 사멸이 효과적으로 유도된 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the drug delivery system of Example 1 was well transferred to liver cancer cells as shown in Fig. 15 (a) and Fig. 15 (b), in the animal model in which the drug carrier of Example 1 in which doxorubicin was encapsulated was administered at a dose of 5 mg / kg, the size of the tumor tissue extracted from the light-irradiated mouse test group was most effective And the results of H & E staining and TUNEL analysis of FIG. 15 (c) showed that apoptosis was effectively induced when the light source was irradiated to the drug delivery system of Example 1 in which the doxorubicin was encapsulated.

반면, 도 17과 같이 상기 간암세포가 이식된 마우스에 실시예 1의 약물전달체를 투여한 후 광원을 조사하여도 마우스의 몸무게 변화는 나타나지 않았다.On the other hand, as shown in FIG. 17, when the drug transporter of Example 1 was administered to the mice transplanted with liver cancer cells, there was no change in the weight of the mice when the light source was irradiated.

상기 결과로부터 본 발명의 약물전달체는 정상세포에 독성을 나타내지 않으면서 종양 선택적으로 약물을 방출하여 효과적으로 암세포를 사멸시키는 것이 확인됨에 따라 생체 안전성 및 간암 치료 효과가 우수한 약물전달체임이 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the drug delivery vehicle of the present invention was able to effectively kill cancer cells by releasing the drug selectively without tumor toxicity, thus confirming that it is a drug delivery system having excellent biosafety and liver cancer treatment effect.

이상으로 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

Claims

Polymer selected from the group consisting of pullulan, pluronic F-68 and polyethylene glycol, or a polymer selected from the group consisting of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate (Polyethylene glycol) -2000], DSPE-PEG2000) and di (ethylene glycol) -2000] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- Lipids selected from the group consisting of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC); alpha-lipoic acid; Photosensitizers selected from the group consisting of chlorin e6, hemotoporphyrin and pheophorbide; And a drug selected from the group consisting of paclitaxel and doxorubicin.

[Claim 2] The drug carrier according to claim 1, wherein the drug delivery vehicle comprises a mixture of a polymer or lipid, a-lipoic acid, a photosensitizer, and a drug, and encapsulating the α-lipoic acid, the photosensitizer and the drug into the polymer or lipid.

The drug delivery system according to claim 1, wherein the drug delivery vehicle chemically binds a polymer or lipid to α-lipoic acid, mixes the α-lipoic acid-bound polymer or lipid with a photosensitizer and a drug to form a photosensitizer And the drug is encapsulated.

[2] The drug delivery system according to claim 1, wherein the drug delivery vehicle chemically binds a polymer or lipid to a photosensitizer, and the polymer or lipid bound to the photosensitizer is mixed with a-lipoic acid and a drug to form a polymer or lipid, A drug delivery system characterized in that a drug is encapsulated.

[2] The drug delivery system according to claim 1, wherein the drug delivery vehicle is a drug delivery system comprising a polymer or a lipid and a photosensitizer chemically bonded to the polymer or lipid, Wherein the drug delivery system comprises a drug delivery system.

[4] The drug delivery system according to claim 1, wherein the drug delivery vehicle comprises a first polymer conjugate having a polymer or lipid chemically bonded to? -Lipoic acid, a second polymer conjugate having a polymer or lipid chemically bonded with a photosensitizer, A drug delivery system characterized in that a drug is enclosed in lipids.

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The drug delivery system according to claim 1, wherein the drug delivery vehicle has an average particle diameter of 10 nm to 100 μm.

The drug delivery system according to claim 1, wherein the drug delivery vehicle is applied as a photodynamic therapy.

[Claim 2] The drug delivery system according to claim 1, wherein the drug delivery vehicle generates an active oxygen species upon irradiation with light, and releases the encapsulated drug while the generated active oxygen species are cleared of? -Lipoic acid.

[Claim 16] The drug carrier according to claim 13, wherein the light irradiation is performed by irradiating the drug carrier with photons having a wavelength of 500 to 900 nm at 1 to 300 J / cm < ^{2 &} gt ;.