KR101793899B1 - Mixed culture of adult stem cell and differentiated cell and uses thereof - Google Patents
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
- A23V2200/318—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on skin health and hair or coat
Abstract
본 발명은 성체 줄기세포가 다양한 체세포로 분화할 수 있도록 그 분화를 촉진하고, 세포의 증식을 촉진하는 조성물과 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 줄기세포가 다양한 체세포로 분화되는 효율을 높일 수 있으며, 더 나아가서는 성체 줄기세포를 모발의 성장에 중요한 역할을 하는 모유두 세포로의 분화를 촉진하고, 모낭 형성을 촉진하여 탈모 방지 및 모발 생장에 뛰어난 효과가 있으며, 줄기세포와 모유두 세포를 이용하므로 피부에 대한 자극이나 부작용이 없고 안전하다. 또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 지방유래 줄기세포를 목적하는 체세포로 분화될 수 있도록 유도 및 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 각각 목적하는 질병의 치료 용도로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 세포의 증식을 효과적으로 촉진 시킬 수 있다.The present invention relates to a composition for promoting the differentiation of adult stem cells into various somatic cells and promoting cell proliferation and a method for producing the same.
The composition of the present invention can increase the efficiency of differentiation of stem cells into various somatic cells and further promotes the differentiation of adult stem cells into dermal papilla cells that play an important role in hair growth, It has excellent effect on prevention of hair loss and hair growth. It uses stem cells and dermal papilla cells, so it has no irritation or side effects on the skin and is safe. In addition, the composition provided in the present invention not only can induce and promote adipose stem cells to be differentiated into somatic cells, but also can be used for the treatment of a desired disease. Furthermore, the composition provided by the present invention can effectively promote cell proliferation.
Description
본 발명은 성체 줄기세포와 분화된 세포를 혼합 배양하여 얻어진 혼합 배양액과 이를 제조하는 방법, 상기 혼합 배양액으로부터 분리하여 얻어진 엑소좀(exosome)과 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a mixed culture obtained by mixing and culturing adult stem cells and differentiated cells, a method for producing the same, and a method for producing the exosome separated from the mixed culture.
줄기세포(Stem cell)란, 각종 세포로 분화(differentiation)할 수 있는 줄기성(stemness)을 가지고 있는 미분화 세포들을 총칭하며, 줄기세포는 특정 분화 인자 및/또는 환경에 의해 특정 세포로의 분화가 진행된다. 줄기세포의 종류에는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 암줄기세포(cancer stem cell) 등이 있다. 최근에는 다양한 세포로 분화가 가능한 줄기세포를 이용하여 손상된 조직의 재생, 연골손상 질환, 당뇨병, 백혈병, 신경질환, 심장병, 척수외상, 섬유성 장애 등을 비롯한 다양한 질환을 치료하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있고, 이에 따라 줄기세포를 특정 세포로 분화시키고자 하는 연구들이 시도되고 있다. 또한 분화가 끝난 세포를 역분화를 통해 줄기세포로 만든 역분화줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPS) 등도 세포분화에 사용되고 있다. Stem cells are collectively referred to as undifferentiated cells having stemness capable of differentiating into various cells. Stem cells are classified into various types of stem cells such as differentiation factor and / It proceeds. Types of stem cells include embryonic stem cells, embryonic germ cells, adult stem cells, and cancer stem cells. In recent years, studies have been actively conducted to treat various diseases such as damaged tissue regeneration, cartilage damage disease, diabetes mellitus, leukemia, neurological diseases, heart disease, spinal trauma, fibrotic disorders, etc. using stem cells capable of differentiating into various cells , And thus attempts have been made to differentiate stem cells into specific cells. In addition, stem cells derived from differentiated cells through the differentiation of stem cells (Induced Pluripotent Stem Cell, iPS) are also used for cell differentiation.
일반적으로 줄기세포의 분화를 유도하는 방법으로는 분화 촉진제를 이용하는 방법들이 사용되고 있다. 대표적으로는 레티온산(retionic acid)을 이용하여 배아줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법(Dev. Dyn. (2007) 236: 3255-3266), 액티빈 A(activin A)를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법(Nat. Biotechnol. (2005) 23: 1534-1541), 아스코르브산(ascorbic acid)을 이용하여 심근세포로 분화시키는 방법(Circulation (2003) 107: 1912-1916) 등이 있다.Generally, as a method of inducing the differentiation of stem cells, methods using a differentiation promoter have been used. Typically, embryonic stem cells are differentiated into neurons using retinoic acid (Dev. Dyn. (2007) 236: 3255-3266), and actin A is used to differentiate into hepatocytes (2005) 23: 1534-1541) and a method of differentiating into cardiomyocytes using ascorbic acid (Circulation (2003) 107: 1912-1916).
그러나 종래의 기술은 사이토카인(cytokine)과 같은 고가의 시약을 사용하기 때문에 비용이 많이 든다는 단점뿐만 아니라, 낮은 분화율 및 특정 세포로의 분화만을 촉진하여 다양한 세포로의 분화에 적용이 어렵다는 등의 한계점을 가지고 있다. 따라서 줄기세포의 분화 효율을 높이고, 다양한 세포의 분화에 광범위하게 적용 가능한 일반화된 방법을 개발할 필요가 있다.However, the conventional techniques use expensive reagents such as cytokines, which are not only costly, but also have a low differentiation rate and promote differentiation into specific cells, making it difficult to apply them to differentiation into various cells It has limitations. Therefore, it is necessary to develop a generalized method which can enhance the differentiation efficiency of stem cells and widely applicable to various cell differentiation.
이와 같이 줄기세포를 다양한 분야에서 효과적으로 이용하기 위해서는, 줄기세포를 다양한 세포로 분화시킬 수 있는 저렴하고 용이한 분화 유도 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.In order to effectively utilize stem cells in various fields, development of an inexpensive and easy differentiation inducing method capable of differentiating stem cells into various cells is desired.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 일 목적은 성체 줄기세포를 다양한 체세포로 분화시킬 수 있는 조성물과 이를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made keeping in mind the above problems occurring in the prior art, and an object of the present invention is to provide a composition capable of differentiating adult stem cells into various somatic cells and a method for producing the same.
본 발명의 다른 목적은 성체 줄기세포를 모유두 세포로 분화시켜 탈모를 예방 또는 치료할 수 있는 조성물과 이를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. Another object of the present invention is to provide a composition capable of preventing or treating hair loss by differentiating adult stem cells into dermal papilla cells and a method for producing the same.
본 발명의 또 다른 목적은 성체 줄기세포를 목적하는 체세포로 분화시켜 목적하는 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.It is still another object of the present invention to provide a composition capable of preventing or treating a desired disease by differentiating adult stem cells into somatic cells of interest.
본 발명의 또 다른 목적은 세포의 증식을 촉진할 수 있는 조성물과 이를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.It is another object of the present invention to provide a composition capable of promoting cell proliferation and a method for producing the same.
본 발명의 발명자들은 성체 줄기세포와 분화된 세포의 혼합 배양액 또는 그로부터 분리한 엑소좀(exosome)을 사용하여 성체 줄기세포를 배양하는 경우, 성체 줄기세포가 혼합 배양 시 사용된 분화된 세포로 분화가 촉진되고, 더 나아가 분화된 세포의 증식이 촉진되는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다. The inventors of the present invention have found that when adult stem cells are cultured using a mixed culture solution of adult stem cells and differentiated cells or an exosome isolated therefrom, the adult stem cells are differentiated into differentiated cells used in the mixed culture Promoted, and further promoted the proliferation of differentiated cells, leading to the present invention.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 분화된 세포의 혼합 배양액을 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.According to one embodiment of the present invention, there is provided a composition for promoting differentiation of stem cells, which comprises a mixed culture solution of adult stem cells and differentiated cells.
본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.In the present invention, the adult stem cells are undifferentiated cells having multipotency derived from mammals including humans, preferably human adult cells. Examples of the stem cells include bone marrow, blood, brain, skin, fat , Adipose tissue or fat cells), umbilical cord blood, umbilical cord blood, Wharton's jelly, and the like. In the present specification, the "adult stem cells" include mesenchymal stem cells derived from adult cells.
상기 성체 줄기세포로서, 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있어, 침습적 시술이 필요 없는 지방 유래 줄기세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 상기 지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 조직을 포함하며, 통상의 지방흡입술로부터 손쉽게 얻을 수 있다. As the adult stem cells, fat-derived stem cells which can be obtained by using fat tissues which are commonly used in the liposuction process and which do not require invasive procedures can be preferably used. The adipose-derived stem cells are obtained from mammals including humans, preferably human adipose tissue or adipocytes, according to known methods (for example, International Patent Publication Nos. WO 2000/53795 and WO 2005/042730) Liposuction and sedimentation, treatment of enzymes such as collagenase, removal of floating cells such as red blood cells by centrifugation, and the like. The adipose tissue includes brown or white tissue derived from subcutaneous, mesenteric, visceral, breast gonad or other adipose tissue areas and can be easily obtained from conventional liposuction.
상기 지방조직을 통해 얻을 수 있는 지방 유래 줄기세포(ASCs)는 세포 재생산 치료 등에 흔히 사용되는 골수(bone marrow) 유래 줄기세포에 비하여 비 침습적 방법으로 수득이 가능하고, 많은 양의 줄기세포를 얻을 수 있으며, 수득하는 과정 내에서 환자의 고통이 적고, 동종 개체 등에 비교적 안전하게 이식(transplantation) 될 수 있다는 장점이 존재한다.Derived stem cells (ASCs) that can be obtained through the adipose tissue can be obtained by a non-invasive method as compared with stem cells derived from bone marrow commonly used for cell reproduction therapy, and a large amount of stem cells can be obtained There is an advantage in that the patient's pain is less in the process of obtaining, and can be relatively safely transplanted into allogeneic individuals.
또한, 본 발명에서 상기 분화된 세포는 분화과정이 진행되어 일정 형태 및 기능을 가지게 된 세포를 말하며, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 체세포(somatic cell) 또는 전구세포(progenitor cell)이다. 또한, 바람직하게는 인간에게서 유래한 세포로, 예를 들어 내배엽 유래의 세포인 폐 세포, 췌장 세포, 간 세포, 혈관 세포 등이거나, 중배엽 유래인 모유두 세포, 진피 세포, 근육 세포, 골아세포, 파골 세포, 연골 세포, 근육 세포, 혈액 세포, 심근 세포, 신장 세포 등이거나, 외배엽 유래인 신경 세포, 성상교세포, 신경절 세포, 외피 세포, 각질 세포 등일 수 있고, 더욱 바람직하게는 폐 세포, 연골 세포, 신경 세포, 모유두 세포 또는 성상교세포(astrocyte)일 수 있다.In addition, in the present invention, the differentiated cells are cells that have a certain shape and function due to the progress of differentiation, and are not particularly limited, but are preferably somatic cells or progenitor cells. Preferably, the cell is a human-derived cell, for example, a lung cell, a pancreatic cell, a liver cell, a vascular cell, or the like, which is a cell derived from a mesenchymal stem cell, a mesodermal cell derived from a mesodermal cell, a dermal cell, a muscle cell, The cells may be cells, chondrocytes, muscle cells, blood cells, myocardial cells, kidney cells, or nerve cells derived from ectoderm, astrocytes, ganglion cells, epithelial cells, keratinocytes, A neural cell, a dermal papilla cell, or an astrocyte.
단, 본 발명에서 용어 "분화"란 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말한다. 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 전능성 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포로 변하는 과정도 분화이며, 좁게는 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정도 분화에 해당된다.In the present invention, the term "differentiation" refers to a phenomenon in which the structure or function of a cell is specialized while cells are divided and proliferated and the entire individual is grown. In other words, it refers to a process in which cells, tissues, etc. of a living organism are changed into appropriate forms and functions to perform their respective roles. For example, pluripotent stem cells such as embryonic stem cells are differentiated into ectoderm, mesoderm, and endoderm cells, and narrowly, the processes in which hematopoietic stem cells change into red blood cells, white blood cells, platelets, etc. are also differentiated.
또한, 본 발명에서 용어 "체세포"란 생식세포를 제외한 동식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며 염색체가 2n을 유지한다는 특성이 있다.In the present invention, the term "somatic cell" refers to all cells that have undergone differentiation constituting an animal or plant, excluding germ cells, and that the chromosome maintains 2n.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 줄기세포의 분화 촉진 효과를 더욱 향상시키기 위하여 상기한 조성물은 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀(exosome)을 포함할 수 있다. 이때 상기 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않으나, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의해 분리될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, in order to further enhance the differentiation promoting effect of stem cells, the composition may include an exosome isolated from a mixed culture solution. At this time, the method of isolating the exosome is not particularly limited, but may be separated by, for example, salting out.
본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다.In the present invention, the exosome having a size of 30 to 1,000 nm is preferable because it can further improve the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는, 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in another embodiment, the exosome having a size of 100 to 1,000 nm includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, so that the differentiation of stem cells can be more effectively promoted .
단, 본 발명에서 상기 엑소좀(exosome)은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미한다. 엑소좀의 직경은 대략 30 ~ 1,000 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 엑소좀의 대표적인 발현 마커는 HSP70, CD63 및 CD9에 해당한다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 엑소좀은 세포주, 세포의 배양액 또는 생체 시료로부터 유래한 것일 수 있다.However, in the present invention, the exosome refers to a small follicle having a membrane structure that is secreted from various cells. The diameter of the exosome is approximately 30 to 1,000 nm, which means the follicle that is fused to the plasma membrane and released to the extracellular environment. Representative expression markers of exosomes correspond to HSP70, CD63 and CD9. In one embodiment of the present invention, the exosome may be derived from a cell line, a culture medium of cells, or a biological sample.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 분화된 세포를 혼합 배양하여 혼합 배양액을 제조하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a method of preparing a composition for stimulating differentiation of stem cells, comprising culturing adult stem cells and differentiated cells in a mixed culture to prepare a mixed culture solution.
일반적으로 두 종류의 세포를 혼합 배양하는 경우 배양 환경을 제어하기 어려워 일관적인 결과물을 얻기 어려웠다. 하지만, 본 발명에서는 성체 줄기세포와 분화된 세포를 특정한 조건하에서 혼합 배양함으로써 배양 환경을 제어하여 반복적인 실시에도 불구하고 줄기세포의 분화를 촉진할 수 있는 혼합 배양액을 계속하여 생산할 수 있도록 한다.In general, when two kinds of cells are mixed, it is difficult to control the culture environment and it is difficult to obtain a coherent result. However, in the present invention, it is possible to continuously produce a mixed culture medium capable of promoting the differentiation of stem cells despite the repetitive execution by controlling the culture environment by mixing and culturing adult stem cells and differentiated cells under specific conditions.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포 및 분화된 세포를 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 직접 혼합 배양법에 의할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the mixed culture may be performed by a direct mixed culture method comprising inoculating and culturing adult stem cells and differentiated cells on a culture plate.
보다 바람직하게는, 성체 줄기세포를 배양 플레이트 상에 배양하고, 상기 성체 줄기세포 상에 분화된 세포를 접종하여 배양할 수 있다. 여기서 상기 분화된 세포를 성체 줄기세포 상에 단층 배양할 수 있으나, 분화된 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 상기 배양 플레이트에 접종하는 것이 바람직하다. More preferably, the adult stem cells can be cultured on a culture plate, and the differentiated cells on the adult stem cells can be inoculated and cultured. Here, the differentiated cells can be monolayered on adult stem cells. However, it is preferable that the differentiated cells are agglutinated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 탆 and inoculated on the culture plate.
또한, 본 발명의 바람직한 다른 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은, 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포를 배양하는 단계; 및 고분자 필름상에 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 추가로 상기 고분자 필름상에 배양된 분화된 세포를 배양 플레이트에 접촉시켜 혼합 배양하는 단계를 포함하는 간접 혼합 배양법에 의할 수 있다. According to another preferred embodiment of the present invention, the mixed culture comprises culturing adult stem cells on a culture plate; And culturing the differentiated cells on the polymer film. The method may further include a step of mixing and culturing the differentiated cells cultured on the polymer film in contact with the culture plate, have.
본 발명에서는 상기 고분자 필름상에 분화된 세포를 배양할 때 구형 (spheroid)으로 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 분화된 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 배양 플레이트에 접종할 수 있다. In the present invention, when the cells differentiated on the polymer film are cultured, they are preferably cultured in a spheroid. Specifically, the differentiated cells can be agglutinated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 쨉 m and then inoculated on a culture plate.
또한, 본 발명에서 상기 고분자 필름의 종류는 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 폴리염화비닐(Polyvinyl chloride) 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 필름 또는 염화비닐리덴수지(Polyvinylidene Chloride) 필름을 사용할 수 있다. In the present invention, the kind of the polymer film is not particularly limited. For example, a polyvinyl chloride film, a polyethylene terephthalate film or a polyvinylidene chloride film can be used .
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 줄기세포의 분화 촉진 효과를 더욱 향상시키기 위하여 상기 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, further step of separating exosome from the mixed culture fluid may be further included to further enhance the differentiation promoting effect of stem cells.
여기서 상기 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1 M 소디움아세테이트를 최종 농도가 0.05 ~ 0.2 M이 될 때까지 혼합 배양액에 첨가하고, 전하량 차이에 의해 엑소좀을 응축시킨 뒤 4,000 ~ 6,000 g로 원심 분리하여 분리하며 수행할 수 있다.The method for separating the exosome is not particularly limited, but it is preferable to use a salting out method, more preferably 1 M sodium acetate until the final concentration is 0.05-0.2 M And the exosomes are condensed by the difference in the amount of charge, followed by centrifugation at 4,000 to 6,000 g.
또한, 본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 분리하는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다. In addition, in the present invention, it is preferable that the exosome has a size of 30 to 1,000 nm, because it can further enhance the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는, 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in another embodiment, the exosome having a size of 100 to 1,000 nm includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, so that the differentiation of stem cells can be more effectively promoted .
본 발명에서는 상기한 바와 같이 성체 줄기세포와 분화된 세포를 혼합 배양함으로써 성체 줄기세포를 분화된 세포로의 분화를 촉진 시킬 수 있으며, 예를 들어 성체 줄기세포와 모유두 세포를 혼합 배양하는 경우 성체 줄기세포를 모유두 세포로, 성체 줄기세포와 성상교세포를 혼합 배양하는 경우 성체 줄기세포를 성상교세포로, 성체 줄기세포와 연골 세포를 혼합 배양하는 경우 성체 줄기세포를 연골 세포로, 성체 줄기세포와 신경세포를 혼합배양 하는 경우 성체 줄기세포를 신경세포로, 성체 줄기세포와 폐 상피세포를 혼합배양 하는 경우 성체 줄기세포를 폐 상피세포로의 분화를 촉진 시킬 수 있다.In the present invention, adult stem cells can be promoted to differentiate into differentiated cells by culturing adult stem cells and differentiated cells as described above. For example, when adult stem cells and dermal papilla cells are mixed and cultured, When adult cells are mixed with adult stem cells and adult stem cells and astrocytes, when adult stem cells are cultured as astrocytes and adult stem cells and chondrocytes are mixed, adult stem cells are used as chondrocytes, adult stem cells and nerve cells The adult stem cells can be promoted to differentiate into pulmonary epithelial cells when the adult stem cells are mixed with the adult stem cells and the lung epithelial cells are cultured in the mixed culture.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 분화된 세포의 혼합 배양액을 포함하는 세포의 증식 촉진용 조성물을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a composition for promoting cell proliferation comprising a mixed culture solution of adult stem cells and differentiated cells.
본 발명에서 상기 증식 촉진의 대상이 되는 세포의 종류는 특별히 한정하지 않으며, 예를 들어 성체 줄기세포 또는 분화된 세포일 수 있으나, 바람직하게는 분화된 세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 혼합 배양 시 사용된 분화된 세포일 수 있다. In the present invention, the type of cell to be subjected to the proliferation promotion is not particularly limited. For example, it may be an adult stem cell or a differentiated cell, but it may be preferably a differentiated cell, May be the differentiated cells used.
본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.In the present invention, the adult stem cells are undifferentiated cells having multipotency derived from mammals including humans, preferably human adult cells. Examples of the stem cells include bone marrow, blood, brain, skin, fat , Adipose tissue or fat cells), umbilical cord blood, umbilical cord blood, Wharton's jelly, and the like. In the present specification, the "adult stem cells" include mesenchymal stem cells derived from adult cells.
또한, 본 발명에서 상기 분화된 세포는 분화과정이 진행되어 일정 형태 및 기능을 가지게 된 세포를 말하며, 본 발명에서는 증식을 촉진하기 위한 세포와 동일한 종류의 세포를 사용할 수 있다. 그 종류에 특별한 제한은 없으나 예를 들면, 체세포(somatic cell) 또는 전구세포(progenitor cell)일 수 있고, 보다 상세하게는 내배엽 유래의 세포인 폐세포, 췌장세포, 간세포, 혈관세포 등이거나, 중배엽 유래인 모유두 세포, 진피 세포, 근육세포, 골아세포, 파골 세포, 연골세포, 근육세포, 혈액세포, 심근세포, 신장세포 등이거나, 외배엽 유래인 신경세포, 성상교세포, 신경절세포, 외피세포, 각질세포 등일 수 있다.In addition, in the present invention, the differentiated cells are cells that have a certain shape and function due to progress of differentiation. In the present invention, cells of the same kind as the cells for promoting proliferation can be used. There are no particular restrictions on its kind, but it may be, for example, a somatic cell or a progenitor cell, and more specifically, it may be a lung cell, a pancreatic cell, a hepatic cell, a blood vessel cell, The present invention relates to a method for the treatment and prophylaxis of neurodegenerative diseases such as dermal papilla cells, dermal papilla cells, muscle cells, osteoblasts, osteoclasts, cartilage cells, muscle cells, blood cells, myocardial cells, Cells, and the like.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 줄기세포의 분화 촉진 효과를 더욱 향상시키기 위하여 상기한 조성물은 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀(exosome)을 포함할 수 있다. 이때 상기 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않으나, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의해 분리될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, in order to further enhance the differentiation promoting effect of stem cells, the composition may include an exosome isolated from a mixed culture solution. At this time, the method of isolating the exosome is not particularly limited, but may be separated by, for example, salting out.
본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것이 세포의 증식 촉진 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다.In the present invention, the exosome has a size of 30 to 1,000 nm because it can further enhance the proliferation promoting effect of cells.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 분화된 세포를 혼합 배양하여 혼합 배양액을 제조하는 단계를 포함하는 세포의 증식 촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a method of preparing a composition for promoting proliferation of cells, comprising culturing adult stem cells and differentiated cells in a mixed culture to prepare a mixed culture.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포 및 분화된 세포를 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 직접 혼합 배양법에 의할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the mixed culture may be performed by a direct mixed culture method comprising inoculating and culturing adult stem cells and differentiated cells on a culture plate.
보다 바람직하게는, 성체 줄기세포를 배양 플레이트 상에 배양하고, 상기 성체 줄기세포 상에 분화된 세포를 접종하여 배양할 수 있다. 여기서 상기 분화된 세포를 성체 줄기세포 상에 단층 배양할 수 있으나, 분화된 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 상기 배양 플레이트에 접종하는 것이 바람직하다. More preferably, the adult stem cells can be cultured on a culture plate, and the differentiated cells on the adult stem cells can be inoculated and cultured. Here, the differentiated cells can be monolayered on adult stem cells. However, it is preferable that the differentiated cells are agglutinated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 탆 and inoculated on the culture plate.
또한, 본 발명의 바람직한 다른 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포를 배양하는 단계; 및 고분자 필름상에 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 추가로 상기 고분자 필름상에 배양된 분화된 세포를 배양 플레이트에 접촉시켜 혼합 배양하는 단계를 포함하는 간접 혼합 배양법에 의할 수 있다. According to another preferred embodiment of the present invention, the mixed culture comprises culturing adult stem cells on a culture plate; And culturing the differentiated cells on the polymer film. The method may further include a step of mixing and culturing the differentiated cells cultured on the polymer film in contact with the culture plate, have.
본 발명에서는 상기 고분자 필름상에 분화된 세포를 배양할 때 구형 (spheroid)으로 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 분화된 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 배양 플레이트에 접종할 수 있다. In the present invention, when the cells differentiated on the polymer film are cultured, they are preferably cultured in a spheroid. Specifically, the differentiated cells can be agglutinated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 쨉 m and then inoculated on a culture plate.
또한, 본 발명에서 상기 고분자 필름의 종류는 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 폴리염화비닐(Polyvinyl chloride) 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 필름 또는 염화비닐리덴수지(Polyvinylidene Chloride) 필름을 사용할 수 있다. In the present invention, the kind of the polymer film is not particularly limited. For example, a polyvinyl chloride film, a polyethylene terephthalate film or a polyvinylidene chloride film can be used .
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 세포의 증식 촉진 효과를 더욱 향상시키기 위하여 상기 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the step of separating the exosome from the mixed culture liquid may further include the step of further separating the exosome from the mixed culture to further enhance the cell proliferation promoting effect.
여기서 상기 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1 M 소디움아세테이트를 최종 농도가 0.05 ~ 0.2 M이 될 때까지 혼합 배양액에 첨가하고, 전하량 차이에 의해 엑소좀을 응축시킨 뒤 4,000 ~ 6,000 g로 원심 분리하여 분리하며 수행할 수 있다.The method for separating the exosome is not particularly limited, but it is preferable to use a salting out method, more preferably 1 M sodium acetate until the final concentration is 0.05-0.2 M And the exosomes are condensed by the difference in the amount of charge, followed by centrifugation at 4,000 to 6,000 g.
또한, 본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 분리하는 것이 세포의 증식 촉진 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다. In addition, in the present invention, it is preferable that the exosome has a size of 30 to 1,000 nm, because it can further enhance the proliferation promoting effect of cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는, 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in another embodiment, the exosome having a size of 100 to 1,000 nm includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, so that the differentiation of stem cells can be more effectively promoted .
본 발명에서는 상기한 바와 같이 성체 줄기세포와 분화된 세포의 혼합 배양액을 사용하여 성체 줄기세포 또는 분화된 세포 등 다양한 세포로의 증식을 촉진 시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물은 재생의학(Regenerative medicine)은 생체재료(biomaterial), 성장인자(growth factor), 조직의 치료, 대체 또는 재생산을 위한 줄기세포 및 질병이나 외부 자극에 의한 상처를 입은 기관의 치료, 대체 또는 재생산에 적용될 수 있다(Experimental Hematology, 30, 42-48.).In the present invention, as described above, a mixed culture of adult stem cells and differentiated cells can be used to promote the proliferation to various cells such as adult stem cells or differentiated cells. Specifically, the composition according to the present invention is a regenerative medicine that can be used to treat stem cells and diseases for wound healing by biomaterials, growth factors, tissue, It can be applied to the treatment, replacement or reproduction of an organ (Experimental Hematology, 30, 42-48.).
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액을 포함하는 탈모의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a composition for preventing or treating hair loss comprising a mixed culture liquid of adult stem cells and dermal papilla cells.
본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.In the present invention, the adult stem cells are undifferentiated cells having multipotency derived from mammals including humans, preferably human adult cells. Examples of the stem cells include bone marrow, blood, brain, skin, fat , Adipose tissue or fat cells), umbilical cord blood, umbilical cord blood, Wharton's jelly, and the like. In the present specification, the "adult stem cells" include mesenchymal stem cells derived from adult cells.
본 발명에서는 상기한 성체 줄기세포와 함께 모유두 세포를 혼합 배양하고 있는데, 일반적으로 모발의 성장은 모유두 세포(dermal papilla)를 둘러싸고 있는 상피세포(epithelial cell)가 분열하여 모간(hair shaft)을 만들면서 진행되므로 모유두 세포(dermal papilla cell)는 상피세포의 분열을 조절하는 어떤 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다. 특히 남성형 탈모증에서 핵심적인 남성호르몬이 모낭에 작용하는 부위 역시 모유두로서, 모유두 세포는 발모에 중요한 역할을 하는 것으로 되어 있다. In the present invention, the dermal papilla cells are mixed and cultured together with the adult stem cells described above. In general, the hair growth is caused by the division of the epithelial cells surrounding the dermal papilla to create a hair shaft Dermal papilla cells are known to play an important role in regulating the division of epithelial cells. Especially in male alopecia, the site of the male hormone that acts on the hair follicle is also the papillae, and the papilla cells play an important role in the hair growth.
따라서, 본 발명에서는 상기 성체 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액을 직접적으로 사용하거나, 이를 이용해 다시 성체 줄기세포를 배양하는 경우 상기한 성체 줄기세포를 모유두 세포로 분화를 유도하거나 모낭 형성을 촉진하여 발모를 촉진함으로써 탈모를 예방 또는 치료할 수 있다. Therefore, in the present invention, when the adult stem cells are cultured using the mixed culture of the adult stem cells and the dermal papilla cells directly, or when the adult stem cells are cultured again, the adult stem cells are induced to differentiate into dermal papilla cells, Thereby preventing or treating hair loss.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀(exosome)을 사용하는 것이 성체 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 효율을 더욱 향상시키고 모낭 형성 또한 더욱 촉진 시킬 수 있어 바람직하다. 이때 상기 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않으나, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의해 분리될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, use of an exosome isolated from the mixed culture medium is preferable because it further improves the differentiation efficiency of adult stem cells into dermal papilla cells and further promotes hair follicle formation. At this time, the method of isolating the exosome is not particularly limited, but may be separated by, for example, salting out.
본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다.In the present invention, the exosome having a size of 30 to 1,000 nm is preferable because it can further improve the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in another embodiment, the exosome has a size of 100 to 1,000 nm, and includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, thereby more effectively promoting the differentiation of stem cells.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 모유두 세포를 혼합 배양하여 혼합 배양액을 제조하는 단계를 포함하는, 탈모의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a method of preparing a composition for preventing or treating hair loss, which comprises culturing adult stem cells and dermal papilla cells in a mixed culture to prepare a mixed culture liquid.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포 및 모유두 세포를 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 직접 혼합 배양법에 의할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the mixed culture may be performed by a direct mixing culture method comprising inoculating and culturing adult stem cells and dermal papilla cells on a culture plate.
보다 바람직하게는, 성체 줄기세포를 배양 플레이트 상에 배양하고, 상기 성체 줄기세포 상에 모유두 세포를 접종하여 배양할 수 있다. 여기서 상기 모유두 세포를 성체 줄기세포 상에 단층 배양할 수 있으나, 모유두 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 상기 배양 플레이트에 접종하는 것이 바람직하다. More preferably, adult stem cells can be cultured on a culture plate, and inoculated with the dermal papilla cells on the adult stem cells. Here, the dermal papilla cells can be monolayered on adult stem cells. However, it is preferable that the dermal papilla cells are agglomerated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 탆 and inoculated on the culture plate.
또한, 본 발명의 바람직한 다른 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포를 배양하는 단계; 및 고분자 필름상에 모유두 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 추가로 상기 고분자 필름상에 배양된 모유두 세포를 배양 플레이트에 접촉시켜 혼합 배양하는 단계를 포함하는 간접 혼합 배양법에 의할 수 있다. According to another preferred embodiment of the present invention, the mixed culture comprises culturing adult stem cells on a culture plate; And culturing the dermal papilla cells on the polymer film, and further, mixing the dermal papilla cells cultured on the polymer film with the culture plate and culturing the dermal papilla cells.
본 발명에서는 상기 고분자 필름상에 모유두 세포를 배양할 때 구형 (spheroid)으로 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 분화된 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 배양 플레이트에 접종할 수 있다. In the present invention, when the dermal papilla cells are cultured on the polymer film, it is preferable to cultivate spheroids. Specifically, the differentiated cells can be agglutinated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 쨉 m and then inoculated on a culture plate.
또한, 본 발명에서 상기 고분자 필름의 종류는 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 폴리염화비닐(Polyvinyl chloride) 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 필름 또는 염화비닐리덴수지(Polyvinylidene Chloride) 필름을 사용할 수 있다. In the present invention, the kind of the polymer film is not particularly limited. For example, a polyvinyl chloride film, a polyethylene terephthalate film or a polyvinylidene chloride film can be used .
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 효율을 더욱 향상시키고 모낭 형성 또한 더욱 촉진 시킬 수 있도록 상기와 같이 혼합 배양액을 제조한 뒤, 엑소좀을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the method further comprises the step of preparing a mixed culture liquid so as to further improve the differentiation efficiency of adult stem cells into dermal papilla cells and further promote the formation of hair follicles, and then separating the exosome can do.
여기서 상기 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의하는 것이 줄기세포의 분화를 촉진하는 엑소좀을 효과적으로 분리할 수 있어 바람직하다. Here, the method of separating exosome from the mixed culture medium is not particularly limited. For example, salting-out method is preferable because exosome promoting differentiation of stem cells can be effectively separated.
보다 바람직하게는 상기 염석 방법으로는 1 M 소디움아세테이트를 최종 농도가 0.05 ~ 0.2 M이 될 때까지 혼합 배양액에 첨가하고, 전하량 차이에 의해 엑소좀을 응축시킨 뒤 4,000 ~ 6,000 g로 원심 분리하여 분리하며 수행할 수 있다.More preferably, the salting-out method is to add 1 M sodium acetate to the mixed culture until the final concentration reaches 0.05-0.2 M, condense the exosomes according to the charge difference, centrifuge at 4,000-6,000 g to separate And can be performed.
또한, 본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 분리하는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다. In addition, in the present invention, it is preferable that the exosome has a size of 30 to 1,000 nm, because it can further enhance the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다.More preferably, in another embodiment, the exosome has a size of 100 to 1,000 nm, and includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, thereby more effectively promoting the differentiation of stem cells.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 연골세포의 혼합 배양액을 포함하는 연골 손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a composition for preventing or treating cartilage damage diseases comprising a mixed culture medium of adult stem cells and chondrocytes.
본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.In the present invention, the adult stem cells are undifferentiated cells having multipotency derived from mammals including humans, preferably human adult cells. Examples of the stem cells include bone marrow, blood, brain, skin, fat , Adipose tissue or fat cells), umbilical cord blood, umbilical cord blood, Wharton's jelly, and the like. In the present specification, the "adult stem cells" include mesenchymal stem cells derived from adult cells.
본 발명에서는 상기 성체 줄기세포와 연골 세포의 혼합 배양액을 직접적으로 사용하거나, 이를 이용해 다시 성체 줄기세포를 배양하는 경우 상기한 성체 줄기세포를 연골 세포로 분화를 유도하여 연골 손상 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.In the present invention, when the mixed culture of the adult stem cells and the chondrocytes is used directly or when the adult stem cells are cultured by using the mixed culture, the adult stem cells are induced to differentiate into chondrocytes to prevent or treat cartilage damage diseases have.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀(exosome)을 사용하는 것이 성체 줄기세포의 연골 세포로의 분화 효율을 더욱 향상 및 촉진 시킬 수 있어 바람직하다. 이때 상기 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않으나, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의해 분리될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, it is preferable to use an exosome isolated from the mixed culture solution, since the efficiency of differentiation of adult stem cells into chondrocytes can be further enhanced and promoted. At this time, the method of isolating the exosome is not particularly limited, but may be separated by, for example, salting out.
본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다.In the present invention, the exosome having a size of 30 to 1,000 nm is preferable because it can further improve the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in another embodiment, the exosome has a size of 100 to 1,000 nm, and includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, thereby more effectively promoting the differentiation of stem cells.
본 발명에서 상기 연골 손상 질환은 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염 중 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the cartilage damage disease may be any one or more of, but not limited to, degenerative arthritis and rheumatoid arthritis.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 연골 세포를 혼합 배양하여 혼합 배양액을 제조하는 단계를 포함하는, 연골 손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a method of preparing a composition for preventing or treating cartilage damage diseases, comprising culturing adult stem cells and chondrocytes in a mixed culture to prepare a mixed culture.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포 및 연골 세포를 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 직접 혼합 배양법에 의할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the mixed culture may be performed by a direct mixed culture method comprising inoculating and culturing adult stem cells and chondrocytes on a culture plate.
보다 바람직하게는, 성체 줄기세포를 배양 플레이트 상에 배양하고, 상기 성체 줄기세포 상에 연골 세포를 접종하여 배양할 수 있다. 여기서 상기 연골 세포를 성체 줄기세포 상에 단층 배양할 수 있으나, 연골 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 상기 배양 플레이트에 접종하는 것이 바람직하다. More preferably, adult stem cells can be cultured on a culture plate, and chondrocyte cells can be inoculated on the adult stem cells and cultured. Here, the chondrocyte may be monolayered on adult stem cells. However, it is preferable that chondrocyte cells are agglomerated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 쨉 m and then inoculated on the culture plate.
또한, 본 발명의 바람직한 다른 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포를 배양하는 단계; 및 고분자 필름상에 연골 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 추가로 상기 고분자 필름상에 배양된 연골 세포를 배양 플레이트에 접촉시켜 혼합 배양하는 단계를 포함하는 간접 혼합 배양법에 의할 수 있다. According to another preferred embodiment of the present invention, the mixed culture comprises culturing adult stem cells on a culture plate; And culturing the chondrocyte on the polymer film, and further, mixing the chondrocyte cultured on the polymer film with the culture plate and culturing the mixture.
본 발명에서는 상기 고분자 필름상에 분화된 세포를 배양할 때 구형 (spheroid)으로 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 연골 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 배양 플레이트에 접종할 수 있다. In the present invention, when the cells differentiated on the polymer film are cultured, they are preferably cultured in a spheroid. Specifically, the chondrocytes may be agglutinated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 쨉 m, and then inoculated on a culture plate.
또한, 본 발명에서 상기 고분자 필름의 종류는 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 폴리염화비닐(Polyvinyl chloride) 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 필름 또는 염화비닐리덴수지(Polyvinylidene Chloride) 필름을 사용할 수 있다. In the present invention, the kind of the polymer film is not particularly limited. For example, a polyvinyl chloride film, a polyethylene terephthalate film or a polyvinylidene chloride film can be used .
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포의 연골 세포로의 분화 효율을 더욱 향상시킬 수 있도록 상기와 같이 혼합 배양액을 제조한 뒤, 엑소좀을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the method further comprises separating the exosomes after preparing the mixed culture liquid to further improve the differentiation efficiency of adult stem cells into chondrocytes.
여기서 상기 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의하는 것이 줄기세포의 분화를 촉진하는 엑소좀을 효과적으로 분리할 수 있어 바람직하다. Here, the method of separating exosome from the mixed culture medium is not particularly limited. For example, salting-out method is preferable because exosome promoting differentiation of stem cells can be effectively separated.
보다 바람직하게는 상기 염석 방법으로는 1 M 소디움아세테이트를 최종 농도가 0.05 ~ 0.2 M이 될 때까지 혼합 배양액에 첨가하고, 전하량 차이에 의해 엑소좀을 응축시킨 뒤 4,000 ~ 6,000 g로 원심 분리하여 분리하며 수행할 수 있다.More preferably, the salting-out method is to add 1 M sodium acetate to the mixed culture until the final concentration reaches 0.05-0.2 M, condense the exosomes according to the charge difference, centrifuge at 4,000-6,000 g to separate And can be performed.
또한, 본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 분리하는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다. In addition, in the present invention, it is preferable that the exosome has a size of 30 to 1,000 nm, because it can further enhance the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다.More preferably, in another embodiment, the exosome has a size of 100 to 1,000 nm, and includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, thereby more effectively promoting the differentiation of stem cells.
본 발명에서 상기 연골 손상 질환은 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염 중 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the cartilage damage disease may be any one or more of, but not limited to, degenerative arthritis and rheumatoid arthritis.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 폐 상피세포의 혼합 배양액을 포함하는 섬유성 장애의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a composition for preventing or treating fibrotic disorders comprising a mixed culture solution of adult stem cells and lung epithelial cells.
본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.In the present invention, the adult stem cells are undifferentiated cells having multipotency derived from mammals including humans, preferably human adult cells. Examples of the stem cells include bone marrow, blood, brain, skin, fat , Adipose tissue or fat cells), umbilical cord blood, umbilical cord blood, Wharton's jelly, and the like. In the present specification, the "adult stem cells" include mesenchymal stem cells derived from adult cells.
본 발명에서는 상기 성체 줄기세포와 폐 상피세포의 혼합 배양액을 직접적으로 사용하거나, 이를 이용해 다시 성체 줄기세포를 배양하는 경우 상기한 성체 줄기세포를 폐 상피세포로 분화를 유도하여 섬유성 장애의 예방 또는 치료할 수 있다.In the present invention, when adult stem cells are cultured directly using a mixed culture of adult stem cells and pulmonary epithelial cells, the adult stem cells are induced to differentiate into pulmonary epithelial cells to prevent or prevent fibrotic disorders, Can be treated.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀(exosome)을 사용하는 것이 성체 줄기세포의 폐 상피세포로의 분화 효율을 더욱 향상 및 촉진 시킬 수 있어 바람직하다. 이때 상기 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않으나, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의해 분리될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the use of an exosome isolated from the mixed culture solution is preferable because it can further enhance and promote the differentiation efficiency of adult stem cells into lung epithelial cells. At this time, the method of isolating the exosome is not particularly limited, but may be separated by, for example, salting out.
본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다.In the present invention, the exosome having a size of 30 to 1,000 nm is preferable because it can further improve the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in another embodiment, the exosome has a size of 100 to 1,000 nm, and includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, thereby more effectively promoting the differentiation of stem cells.
본 발명에서 상기 섬유성 장애는 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄 폐질환 및 특발성 폐섬유화증 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the fibrotic disorder may be, but not limited to, acute respiratory distress syndrome, chronic obstructive pulmonary disease, and idiopathic pulmonary fibrosis.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 폐 상피세포를 혼합 배양하여 혼합 배양액을 제조하는 단계를 포함하는, 섬유성 장애의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a method of preparing a composition for preventing or treating fibrous dysfunction, comprising culturing adult stem cells and lung epithelial cells in a mixed culture to prepare a mixed culture.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포 및 폐 상피세포를 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 직접 혼합 배양법에 의할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the mixed culture may be performed by a direct mixing culture method comprising inoculating and culturing adult stem cells and lung epithelial cells on a culture plate.
보다 바람직하게는, 성체 줄기세포를 배양 플레이트 상에 배양하고, 상기 성체 줄기세포 상에 폐 상피세포를 접종하여 배양할 수 있다. 여기서 상기 폐 상피세포를 성체 줄기세포 상에 단층 배양할 수 있으나, 폐 상피세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 상기 배양 플레이트에 접종하는 것이 바람직하다. More preferably, the adult stem cells can be cultured on a culture plate, and the lung epithelial cells can be inoculated on the adult stem cells and cultured. Herein, the lung epithelial cells can be monolayered on adult stem cells. However, the lung epithelial cells are preferably agglomerated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 탆, and then inoculated on the culture plate.
또한, 본 발명의 바람직한 다른 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포를 배양하는 단계; 및 고분자 필름상에 폐 상피세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 추가로 상기 고분자 필름상에 배양된 폐 상피세포를 배양 플레이트에 접촉시켜 혼합 배양하는 단계를 포함하는 간접 혼합 배양법에 의할 수 있다. According to another preferred embodiment of the present invention, the mixed culture comprises culturing adult stem cells on a culture plate; And culturing the lung epithelial cells on the polymer film, and further comprising the step of bringing the lung epithelial cells cultured on the polymer film into contact with the culture plate and culturing them, have.
본 발명에서는 상기 고분자 필름상에 분화된 세포를 배양할 때 구형 (spheroid)으로 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 분화된 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 배양 플레이트에 접종할 수 있다. In the present invention, when the cells differentiated on the polymer film are cultured, they are preferably cultured in a spheroid. Specifically, the differentiated cells can be agglutinated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 쨉 m and then inoculated on a culture plate.
또한, 본 발명에서 상기 고분자 필름의 종류는 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 폴리염화비닐(Polyvinyl chloride) 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 필름 또는 염화비닐리덴수지(Polyvinylidene Chloride) 필름을 사용할 수 있다. In the present invention, the kind of the polymer film is not particularly limited. For example, a polyvinyl chloride film, a polyethylene terephthalate film or a polyvinylidene chloride film can be used .
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포의 폐 상피세포로의 분화 효율을 더욱 향상시킬 수 있도록 상기와 같이 혼합 배양액을 제조한 뒤, 엑소좀을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the method may further include separating the exosomes after preparing the mixed culture liquid to further improve the differentiation efficiency of adult stem cells into lung epithelial cells.
여기서 상기 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의하는 것이 줄기세포의 분화를 촉진하는 엑소좀을 효과적으로 분리할 수 있어 바람직하다. Here, the method of separating exosome from the mixed culture medium is not particularly limited. For example, salting-out method is preferable because exosome promoting differentiation of stem cells can be effectively separated.
보다 바람직하게는 상기 염석 방법으로는 1 M 소디움아세테이트를 최종 농도가 0.05 ~ 0.2 M이 될 때까지 혼합 배양액에 첨가하고, 전하량 차이에 의해 엑소좀을 응축시킨 뒤 4,000 ~ 6,000 g로 원심 분리하여 분리하며 수행할 수 있다.More preferably, the salting-out method is to add 1 M sodium acetate to the mixed culture until the final concentration reaches 0.05-0.2 M, condense the exosomes according to the charge difference, centrifuge at 4,000-6,000 g to separate And can be performed.
또한, 본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 분리하는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다. In addition, in the present invention, it is preferable that the exosome has a size of 30 to 1,000 nm, because it can further enhance the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다.More preferably, in another embodiment, the exosome has a size of 100 to 1,000 nm, and includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, thereby more effectively promoting the differentiation of stem cells.
본 발명에서 상기 섬유성 장애는 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄 폐질환 및 특발성 폐섬유화증 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the fibrotic disorder may be, but not limited to, acute respiratory distress syndrome, chronic obstructive pulmonary disease, and idiopathic pulmonary fibrosis.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 신경세포의 혼합 배양액을 포함하는 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a composition for preventing or treating a neurological disease comprising a mixed culture liquid of adult stem cells and neuron cells.
본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.In the present invention, the adult stem cells are undifferentiated cells having multipotency derived from mammals including humans, preferably human adult cells. Examples of the stem cells include bone marrow, blood, brain, skin, fat , Adipose tissue or fat cells), umbilical cord blood, umbilical cord blood, Wharton's jelly, and the like. In the present specification, the "adult stem cells" include mesenchymal stem cells derived from adult cells.
본 발명에서는 상기 성체 줄기세포와 신경세포의 혼합 배양액을 직접적으로 사용하거나, 이를 이용해 다시 성체 줄기세포를 배양하는 경우 상기한 성체 줄기세포를 신경세포로 분화를 유도하여 신경 질환의 예방 또는 치료할 수 있다.In the present invention, when a mixed culture of adult stem cells and nerve cells is used directly or when adult stem cells are cultured using the same, the adult stem cells may be induced to differentiate into neurons to prevent or treat neurological diseases .
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀(exosome)을 사용하는 것이 성체 줄기세포의 신경세포로의 분화 효율을 더욱 향상 및 촉진 시킬 수 있어 바람직하다. 이때 상기 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않으나, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의해 분리될 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the use of an exosome isolated from the mixed culture solution is preferable because it can further enhance and promote the differentiation efficiency of adult stem cells into neurons. At this time, the method of isolating the exosome is not particularly limited, but may be separated by, for example, salting out.
본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다.In the present invention, the exosome having a size of 30 to 1,000 nm is preferable because it can further improve the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in another embodiment, the exosome has a size of 100 to 1,000 nm, and includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, thereby more effectively promoting the differentiation of stem cells.
본 발명에서 상기 신경질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 및 척추 손상에 의한 중추신경계 질환 중 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the neurological diseases may include, but not limited to, Parkinson's disease, dementia, Alzheimer's disease, and central nervous system diseases caused by spinal cord injury.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 신경 세포를 혼합 배양하여 혼합 배양액을 제조하는 단계를 포함하는, 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다. According to another embodiment of the present invention, there is provided a method of preparing a composition for preventing or treating neurological diseases, which comprises culturing adult stem cells and neuron cells in a mixed culture to prepare a mixed culture solution.
본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포 및 신경세포를 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 직접 혼합 배양법에 의할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the mixed culture may be performed by a direct mixed culture method comprising inoculating and culturing adult stem cells and nerve cells on a culture plate.
보다 바람직하게는, 성체 줄기세포를 배양 플레이트 상에 배양하고, 상기 성체 줄기세포 상에 신경세포를 접종하여 배양할 수 있다. 여기서 상기 신경세포를 성체 줄기세포 상에 단층 배양할 수 있으나, 신경세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 상기 배양 플레이트에 접종하는 것이 바람직하다. More preferably, the adult stem cells can be cultured on a culture plate, and the neural cells can be inoculated on the adult stem cells and cultured. Here, the neuron can be monolayered on adult stem cells. However, neurons are preferably agglomerated and cultured in a spherical form having a diameter of 50 to 150 쨉 m, and then inoculated on the culture plate.
또한, 본 발명의 바람직한 다른 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포를 배양하는 단계; 및 고분자 필름상에 신경세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 추가로 상기 고분자 필름상에 배양된 신경세포를 배양 플레이트에 접촉시켜 혼합 배양하는 단계를 포함하는 간접 혼합 배양법에 의할 수 있다. According to another preferred embodiment of the present invention, the mixed culture comprises culturing adult stem cells on a culture plate; And culturing the neuron on the polymer film. The method may further include a step of mixing and culturing the neuron cultured on the polymer film in contact with the culture plate.
본 발명에서는 상기 고분자 필름상에 신경세포를 배양할 때 구형 (spheroid)으로 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 신경세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 배양 플레이트에 접종할 수 있다. In the present invention, when the neuron is cultured on the polymer film, it is preferable to cultivate a spheroid. Specifically, the neurons may be agglutinated and cultured in the form of spheres having a diameter of 50 to 150 쨉 m and then inoculated on a culture plate.
또한, 본 발명에서 상기 고분자 필름의 종류는 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 폴리염화비닐(Polyvinyl chloride) 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 필름 또는 염화비닐리덴수지(Polyvinylidene Chloride) 필름을 사용할 수 있다. In the present invention, the kind of the polymer film is not particularly limited. For example, a polyvinyl chloride film, a polyethylene terephthalate film or a polyvinylidene chloride film can be used .
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포의 신경 세포로의 분화 효율을 더욱 향상시킬 수 있도록 상기와 같이 혼합 배양액을 제조한 뒤, 엑소좀을 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, it is possible to further separate the exosomes after preparing the mixed culture liquid to further improve the differentiation efficiency of adult stem cells into neurons.
여기서 상기 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의하는 것이 줄기세포의 분화를 촉진하는 엑소좀을 효과적으로 분리할 수 있어 바람직하다. Here, the method of separating exosome from the mixed culture medium is not particularly limited. For example, salting-out method is preferable because exosome promoting differentiation of stem cells can be effectively separated.
보다 바람직하게는 상기 염석 방법으로는 1 M 소디움아세테이트를 최종 농도가 0.05 ~ 0.2 M이 될 때까지 혼합 배양액에 첨가하고, 전하량 차이에 의해 엑소좀을 응축시킨 뒤 4,000 ~ 6,000 g로 원심 분리하여 분리하며 수행할 수 있다.More preferably, the salting-out method is to add 1 M sodium acetate to the mixed culture until the final concentration reaches 0.05-0.2 M, condense the exosomes according to the charge difference, centrifuge at 4,000-6,000 g to separate And can be performed.
또한, 본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 분리하는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다. In addition, in the present invention, it is preferable that the exosome has a size of 30 to 1,000 nm, because it can further enhance the differentiation inducing effect of adult stem cells.
보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다. More preferably, in one embodiment, the exosome has a size of 30 to 100 nm, and includes miRNA and mRNA that regulate the expression of a gene targeting the differentiation, thereby effectively promoting stem cell differentiation have.
보다 바람직하게는 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다.More preferably, in another embodiment, the exosome has a size of 100 to 1,000 nm, and includes proteins or lipids directly involved in the differentiation of stem cells, thereby more effectively promoting the differentiation of stem cells.
본 발명에서 상기 신경질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 및 척추 손상에 의한 중추신경계 질환 중 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the neurological diseases may include, but not limited to, Parkinson's disease, dementia, Alzheimer's disease, and central nervous system diseases caused by spinal cord injury.
한편, 본 발명의 일 구체예에서, 상기한 탈모의 예방 또는 치료용 조성물은 탈모의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 이용할 수 있다. Meanwhile, in one embodiment of the present invention, the composition for preventing or treating hair loss may be used as a pharmaceutical composition for prevention or treatment of hair loss.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기한 연골 손상 질환 예방 또는 치료용 조성물은 연골 손상 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 이용할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the composition for preventing or treating cartilage damage diseases may be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage damage diseases.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기한 섬유성 장애 예방 또는 치료용 조성물은 섬유성 장애의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 이용할 수 있다.In still another embodiment of the present invention, the composition for preventing or treating fibrous dysfunction may be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrotic disorders.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기한 신경질환 예방 또는 치료용 조성물은 신경질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 이용할 수 있다.In still another embodiment of the present invention, the composition for preventing or treating neurological diseases described above may be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating neurological diseases.
여기서, 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Here, the pharmaceutical composition may further comprise an appropriate carrier, excipient or diluent according to a conventional method. Examples of carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate But are not limited to, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. In addition, the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in the form of oral, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol or the like, oral preparation, suppository or sterilized injection solution, Can be used. More specifically, when formulating the composition, it can be prepared using a diluent or an excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, and the like. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like. Such solid preparations can be prepared by mixing the pharmaceutical composition of the present invention with at least one excipient such as starch, calcium carbonate, Sucrose, lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. in addition to commonly used diluents such as water and liquid paraffin . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.The route of administration of the pharmaceutical compositions according to the present invention may be, but is not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, Sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred. The term "parenteral" as used herein includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques. The pharmaceutical compositions of the present invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention varies depending on various factors including the activity of the specific compound used, age, weight, general health, sex, diet, time of administration, route of administration, rate of excretion, drug combination and the severity of the particular disease to be prevented or treated. And the dose of the pharmaceutical composition may be appropriately selected by a person skilled in the art depending on the condition of the patient, the body weight, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, and may be 0.0001 to 50 mg / kg or 0.001 to 50 mg / kg. The administration may be carried out once a day or divided into several times. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way. The pharmaceutical compositions according to the present invention can be formulated into pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기한 탈모의 예방 또는 치료용 조성물은 탈모 개선용 식품 조성물로 이용할 수 있다. In another embodiment of the present invention, the composition for preventing or treating hair loss may be used as a food composition for improving hair loss.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.The food composition containing the composition of the present invention as an active ingredient may be prepared in the form of various foods such as beverage, gum, tea, vitamin complex, powder, granule, tablet, capsule, . Since the food composition of the present invention is composed of a plant extract having little toxicity and side effects, it can be safely used for prolonged use even for prophylactic purposes.
본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.When the composition of the present invention is contained in the food composition, the amount thereof may be added in a proportion of 0.1 to 50% of the total weight.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.Here, when the food composition is prepared in a beverage form, there are no particular limitations other than those containing the food composition at the indicated ratios and may contain various flavors or natural carbohydrates such as ordinary beverages as an additional ingredient. That is, natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, disaccharides such as fructose, sucrose and the like and sugar sugars such as polysaccharide, dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol can do. Examples of the above-mentioned flavors include natural flavors (such as tau martin and stevia extract (for example, rebaudioside A and glycyrrhizin) and synthetic flavors (for example, saccharine and aspartame).
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.In addition, the food composition of the present invention can be used as a flavoring agent such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, , a pH adjusting agent, a stabilizer, a preservative, a glycerin, an alcohol, a carbonating agent used in a carbonated drink, and the like.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.These components may be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical, but is generally selected in the range of 0.1 to about 50 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 탈모의 예방 또는 치료용 조성물은 탈모 개선용 화장료 조성물로 이용할 수 있다. In another embodiment of the present invention, the composition for preventing or treating hair loss of the present invention can be used as a cosmetic composition for improving hair loss.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제화장용, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누비의료용, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.The cosmetic composition comprising the composition of the present invention as an active ingredient can be used as a skin lotion, a nutritional lotion, a nutrition essence, a massage cream, a cosmetic bath additive, a body lotion, a body milk, a bath oil, a baby oil, Skin lotion, skin cream, sunscreen cosmetics, cleansing milk, hair loss shampoo, face and body lotion, face and body cream, skin whitening cream, hand lotion, hair lotion, cosmetic (Soap), soap, shampoo, hand cleanser, medicinal soap, medical cream, cream soap, facial wash, whole body cleanser, scalp cleaner, hair rinse, cosmetic soap, tooth whitening gel, Toothpaste, and the like. To this end, the composition of the present invention may further comprise a solvent commonly used in the production of a cosmetic composition, or a suitable carrier, excipient or diluent.
본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다. For example, water, saline solution, DMSO, or a combination thereof may be used. Examples of the carrier, excipient or diluent include purified water, oil, wax But are not limited to, fatty acids, fatty acid alcohols, fatty acid esters, surfactants, humectants, thickeners, antioxidants, viscosity stabilizers, chelating agents, buffers, lower alcohols and the like. Further, if necessary, it may contain a whitening agent, a moisturizing agent, a vitamin, an ultraviolet screening agent, a perfume, a dye, an antibiotic, an antibacterial agent, and an antifungal agent.
상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.As the oil, hydrogenated vegetable oil, castor oil, cottonseed oil, olive oil, palm oil, jojoba oil and avocado oil may be used. Examples of the wax include wax, wax, carnauba, candelilla, montan, ceresin, liquid paraffin, Can be used.
지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용 가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다. As the fatty acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid and oleic acid may be used. As the fatty acid alcohol, cetyl alcohol, octyldodecanol, oleyl alcohol, panthenol, lanolin alcohol, stearyl alcohol and hexadecanol may be used As fatty acid esters, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, and butyl stearate may be used. As the surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant and a nonionic surfactant known in the art can be used, and a surfactant derived from a natural material is preferably used.
그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다. In addition, it may contain a hygroscopic agent, a thickening agent, an antioxidant and the like widely known in the field of cosmetics, and the kind and amount thereof are well known in the art.
본 발명에서 제공하는 조성물은 줄기세포가 다양한 체세포로 분화되는 효율을 높일 수 있다.The composition provided by the present invention can enhance the efficiency of differentiation of stem cells into various somatic cells.
또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 성체 줄기세포를 모발의 성장에 중요한 역할을 하는 모유두 세포로의 분화를 촉진하고, 모낭 형성을 촉진하여 탈모 방지 및 모발 생장에 뛰어난 효과가 있으며, 줄기세포와 모유두 세포를 이용하므로 피부에 대한 자극이나 부작용이 없고 안전하다.In addition, the composition provided in the present invention promotes the differentiation of adult stem cells into dermal papilla cells, which play an important role in hair growth, promotes hair follicle formation, and thus has excellent effects on hair loss prevention and hair growth. Because it uses cells, it has no irritation or side effects on the skin and is safe.
또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 성체 줄기세포를 목적하는 연골, 폐 상피 또는 신경 세포로 분화를 촉진 시켜, 손상된 세포에 기인한 다양한 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.In addition, the composition provided in the present invention can promote the differentiation of adult stem cells into a desired cartilage, lung epithelium or neuron, thereby preventing or treating various diseases caused by damaged cells.
또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 세포의 증식 또한 효과적으로 촉진할 수 있다.In addition, the composition provided by the present invention can also effectively promote cell proliferation.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 모유두 세포를 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), 모유두 세포 배양액(DPC), 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM) 및 PC 배양액(PC)에서 각각 배양한 뒤 배양된 세포 수를 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 실시예 2에서 지방 유래 줄기세포에 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), ASC 배양액과 조정 배지의 혼합물(ASC CM), 모유두 세포 배양액과 조정 배지의 혼합물(DPC CM), 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM)을 각각 처리하여 상기 줄기세포의 분화를 유도한 후, RT-PCR 분석을 통하여 모유두 세포의 마커 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 실시예 2에서 지방 유래 줄기세포에 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), ASC 배양액과 조정 배지의 혼합물(ASC CM), 모유두 세포 배양액과 조정 배지의 혼합물(DPC CM), 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM) 각각을 처리하여 상기 줄기세포의 분화를 유도한 후, 웨스턴 블럿 분석을 통해 모유두 세포와 모낭 형성 관련 마커의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포를 4가지 방법으로 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 배양액으로 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR을 통해 모유두 세포의 마커 유전자인 BMP2, BAMBI, APOE, GLI-1, Ptc-1 발현량을 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 본 발명의 실시예 4에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포를 직접 또는 간접 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR 분석을 통하여 모유두 세포의 마커 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10 및 도 11은 본 발명의 실시예 4에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포를 직접 또는 간접 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, 웨스턴 블럿 분석을 통하여 사이토케라틴-6의 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 5에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액으로부터 추출한 엑소좀을 탈모 마우스의 탈모 부위에 도포한 후 시간이 경과함에 따른 육모의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예 5에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액으로부터 추출한 엑소좀을 탈모 마우스의 탈모 부위에 도포한 후 시간이 경과함에 따라 모발의 재생이 유도된 마우스 개체수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다
도 14는 본 발명의 실시예 6에서 지방 유래 줄기세포에 지방 유래 줄기세포 단일 배양액(ASC)과 지방 유래 줄기세포와 연골세포 혼합 배양액(DM) 각각을 연골세포에 처리하여 줄기세포의 분화를 유도한 후, 알시안 염색(alcian stain)을 통한 분화 형태 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 실시예 6에서 지방 유래 줄기세포에 지방 유래 줄기세포 단일 배양액(ASC)과 지방 유래 줄기세포와 연골세포 혼합 배양액(DM) 각각을 연골세포에 처리하여 줄기세포의 분화를 유도한 후, RT-PCR 분석을 통하여 연골세포의 마커 유전자 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16는 본 발명의 실시예 7에서 지방 유래 줄기세포와 연골세포를 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR 분석을 통하여 연골세포의 마커 유전자 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17는 본 발명의 실시예 8에서 지방 유래 줄기세포와 폐상피세포를 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR 분석을 통하여 폐상피세포의 마커 유전자 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 실시예 9에서 지방 유래 줄기세포와 신경세포를 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR 분석을 통하여 신경세포의 마커 유전자 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.FIG. 1 is a graph showing the results obtained by comparing the expression of dermal papilla cells in a single culture medium (ASC), a dermal papilla cell culture medium (DPC), a mixed culture medium of adipose stem cells and dermal papilla cells (co-CM) PC), and the number of cultured cells was compared and shown in a graph.
FIG. 2 and FIG. 3 are graphs showing the effects of the single culture medium (ASC) of fat-derived stem cells, the mixture of ASC medium and conditioned medium (ASC CM), the mixture of the culture medium of papilla cells and the conditioned medium DPC CM), a mixed culture of adipose stem cells and dermal papilla cells (co-CM) to induce the differentiation of the stem cells, and then the amount of marker gene expression in the dermal papilla cells was confirmed by RT-PCR analysis .
Fig. 4 and Fig. 5 are graphs showing the results of a single culture (ASC) of fat-derived stem cells, a mixture of ASC medium and conditioned medium (ASC CM), a mixture of papillary cell culture medium and conditioned medium DPC CM), a mixed culture of adipose derived stem cells and dermal papilla cells (co-CM) to induce differentiation of the stem cells, and then Western blot analysis was performed to determine the expression levels of dermal papilla cells and hair follicle- The results are shown.
FIG. 6 is a schematic diagram of mixed culture of adipose-derived stem cells and dermal papilla cells according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 shows that in Example 3 of the present invention, adipose-derived stem cells and dermal papilla cells are mixed and cultured in four different ways, and then fat-derived stem cells are cultured with the medium. Then, RT-PCR is performed to determine the expression level of BMP2 , BAMBI, APOE, GLI-1 and Ptc-1.
FIG. 8 and FIG. 9 show that in Example 4 of the present invention, fat-derived stem cells and dermal papilla cells were cultured directly or indirectly, and then exosomes extracted therefrom were added to the medium to cultivate adipose stem cells and analyzed by RT-PCR And the expression level of the marker gene of the dermal papilla cell.
FIG. 10 and FIG. 11 show that in Example 4 of the present invention, fat-derived stem cells and dermal papilla cells were directly or indirectly mixed and cultured, and then exosomes extracted from them were cultured in a medium to cultivate adipose stem cells and subjected to Western blot analysis 6 shows the results of confirming the amount of protein expression of cytokeratin-6.
FIG. 12 shows the result of examining the change in hair growth over time after application of exosomes extracted from a mixed culture medium of adipose stem cells and dermal papilla cells to hair loss regions of hairless mouse in Example 5 of the present invention.
FIG. 13 is a graph showing changes in the number of mice in which hair regeneration was induced after application of exosomes extracted from a mixed culture of adipose stem cells and dermal papilla cells to hair loss regions of hairless mice in Example 5 of the present invention Graphically
FIG. 14 is a graph showing the effect of differentiation of adipocyte-derived stem cell (ASC), fat-derived stem cell and chondrocyte-mixed culture medium (DM) on adipose-derived stem cells into chondrocytes in Example 6 of the present invention And then observed the morphology of the morphology through alcian staining.
FIG. 15 is a graph showing the effect of differentiation of adipocyte-derived stem cell (ASC), fat-derived stem cell and chondrocyte-mixed culture medium (DM) on adipose-derived stem cells into chondrocytes in Example 6 of the present invention And then the amount of marker gene expression in chondrocytes was confirmed by RT-PCR analysis.
FIG. 16 is a graph showing the results of RT-PCR analysis of cultured adipose stem cells obtained by mixing cultured adipose stem cells with chondrocyte cells in Example 7 of the present invention, The results are shown in the results.
FIG. 17 is a graph showing the results of an RT-PCR analysis of lung-derived stem cells obtained by culturing adipose stem cells derived from adipose-derived stem cells and pulmonary epithelial cells in the medium of Example 8, And the amount of marker gene expression was confirmed.
18 shows that in Example 9 of the present invention, fat-derived stem cells and neuron cells are mixed and cultured, and the exosomes extracted therefrom are added to the medium to cultivate adipose stem cells. RT- The results are shown in the results.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태들을 설명한다. 그러나 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. However, the embodiments of the present invention can be modified into various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below. Further, the embodiments of the present invention are provided to more fully explain the present invention to those skilled in the art.
[[ 실시예Example 1] 혼합 배양액의 분화세포 증식에 대한 영향 확인 1] Confirmation of effect of mixed culture on differentiation cell proliferation
본 발명에 따른 혼합 배양액이 분화된 세포의 증식에도 향상되는 효과를 갖는지 검증하기 위하여 모유두 세포를 준비하였다. 모유두 세포는 인간의 두피 진피로부터 분리한 초기 인간 모낭 모유두 세포로서 Promocell사에서 구매하여 계대배양을 실시하였다. 모유두 세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), 모유두 세포 배양액(DPC) 및 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM)을 첨가하여 모유두 세포를 배양하였다. 단, 음성 대조군(Negative control, NC)으로는 무혈청 배지인 DMEM/F12 영양 배지만을 사용하여 모유두 세포를 배양하였다. 각 배양 조건에서 모유두 세포 수의 변화 및 증식률을 계산하여 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다. 이때, 상기 배양 과정에서 배지로는 DMEM/F12 영양 배지를 사용하였고, 배양액은 6웰 플레이트에 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 동안 배양을 실시 하였다.To examine whether the mixed culture solution according to the present invention has an effect of enhancing the proliferation of differentiated cells, dermal papilla cells were prepared. The dermal papilla cells were purchased from Promocell as early human dermal follicular dermal papilla cells isolated from human scalp dermis and subcultured. After the preparation of the dermal papilla cells, the dermal papilla cells were cultured by adding a single culture medium (ASC) of adipose derived stem cells, a dermal papilla cell culture medium (DPC) and a mixed culture medium (co-CM) of adipose stem cells and dermal papilla cells. For the negative control (NC), dermal papilla cells were cultured using DMEM / F12 nutrient medium without serum. The change in the number of the dermal papilla cells and the growth rate of the dermal papilla cells under the respective culture conditions were calculated and shown in Table 1 and FIG. At this time, DMEM / F12 nutrient medium was used as a medium for the culture, and the culture was carried out in a 6-well plate at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator for 72 hours.
상기 표 1 및 도 1에서 보는 바와 같이, 일반적으로 세포 증식에 효과가 있다고 알려진 ASC 단일 배양액에서 모유두 세포를 배양한 경우 대조군에 비하여 증식률이 약 28%가 증가하였지만, 모유두 세포의 단일 배양액에서는 큰 변화가 없었다. 반면 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액에서 배양한 결과, 증식률이 대략 41% 증가한 것을 볼 수 있다. 이를 통하여 기존의 ASC 배양액 보다 본 발명에 따른 혼합 배양액이 모유두 세포의 증식에 더욱 효과적인 것을 알 수 있다. As shown in Table 1 and FIG. 1, when the dermal papilla cells were cultured in the single culture medium of ASC, which is generally known to be effective for cell proliferation, the proliferation rate was increased by about 28% as compared with the control, but in the single culture medium of dermal papilla cells, . On the other hand, when the cells were cultured in a mixed culture medium of adipose stem cells and dermal papilla cells, the proliferation rate was increased by about 41%. As a result, it can be seen that the mixed culture according to the present invention is more effective for the proliferation of the papilla cells than the conventional ASC culture solution.
[[ 실시예Example 2] 2] 혼합 배양액의 지방유래 줄기세포의 Of adipose-derived stem cells of the mixed culture 모유두Dairy cattle 세포 cell 분화능에In the ability to differentiate 대한 영향 확인 Check for impact on
본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 모유두 세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 지방 유래 줄기세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), ASC 배양액과 조정 배지의 혼합물(ASC CM), 모유두 세포 배양액과 조정 배지의 혼합물(DPC CM), 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM) 각각에 첨가하여 14일 간 분화를 유도하였다. 다만, 배양조건 및 첨가 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다.To ascertain whether the mixed culture according to the present invention is effective in differentiating adipose-derived stem cells into dermal papilla cells, adipose-derived stem cells were prepared and cultured in a single culture medium (ASC), ASC culture medium and conditioned medium (ASC CM), a mixture of dermal papilla cell culture medium and conditioned medium (DPC CM), and a mixed culture medium (co-CM) of adipose derived stem cells and dermal papilla cells for 14 days. However, the culturing conditions and the addition conditions were the same as in Example 1.
이후, RT-PCR 분석을 통하여 대조군(NC) 대비 모유두 세포의 마커 유전자인 APOE, BAMBI 및 BMP2의 발현 정도를 확인하여 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 또한, 웨스턴 블럿 분석을 통하여 상기한 모유두 세포의 마커와 모공(hair follicle) 형성과 관련된 단백질인 베르시칸(versican), 트롬보스폰딘 1(trombospondin 1, TBP-1) 및 사이토케라틴 6/75(cytokeratin 6/75)의 발현을 확인하여 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.The expression levels of APOE, BAMBI and BMP2, which are marker genes of dermal papilla cells, were determined by RT-PCR analysis, and the results are shown in FIG. 2 and FIG. In addition, Western blot analysis revealed that the proteins associated with the markers and hair follicle formation of the dermal papilla cells, versican,
도 4 및 도 5에서 보는 바와 같이, 대조군이나 ASC 배양액과 조정 배지의 혼합물(ASC CM) 및 모유두 세포 배양액과 조정 배지의 혼합물(DPC CM)과 대비해 볼 때, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM)에서 지방 유래 줄기세포를 배양한 경우 모유두 세포와 모낭 형성 관련 마커인 베르시칸의 발현량이 증가한 것을 볼 수 있고, 그 외의 단백질로 트롬보스폰딘 1과 사이토케라틴 6/75 모두 현저히 증가한 것을 볼 수 있다. 이때, 상기 베르시칸은 모유두 세포와 모낭 형성 마커에 해당하며, 트롬보스폰딘 1은 신생혈관을 억제하는 마커이며, 사이토 케라틴 6은 모유두 세포 및 케라틴 발현 마커에 해당한다. As shown in FIGS. 4 and 5, when compared with a mixture of a control group or a mixture of an ASC culture medium and a conditioned medium (ASC CM) and a mixture of a dermal papilla cell culture medium and conditioned medium (DPC CM), a mixture of adipose stem cells and dermal papilla cells In the case of adipose-derived stem cells cultured in the culture medium (co-CM), the amount of expression of bovine pancreas and bersican, a hair-related marker, was increased, and other proteins,
따라서 상기한 결과를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액은 기존의 지방 유래 줄기세포 배양액에 비하여 지방 유래 줄기세포의 모유두 세포로의 분화를 현저하게 유도하고, 모유두 세포의 증식 또한 증가시키며 모낭의 형성을 촉진하는 것을 알 수 있다.Thus, the above-mentioned results show that the mixed culture solution according to the present invention significantly induces differentiation of adipose-derived stem cells into dermal papilla cells, increases proliferation of dermal papilla cells, promotes formation of hair follicles, .
[[ 실시예Example 3] 상이한 혼합 배양방법에 따른 배양액으로부터 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 3] When adipose-derived stem cells were cultured from the culture solution according to the different mixed culture method 모유두Dairy cattle 세포의 Cell 마커Marker 유전자의 발현 정도 확인 Identification of gene expression
지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양 방법에 따른 효과를 확인하기 위하여, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포를 다양한 방법으로 혼합 배양하였다. In order to confirm the effect of mixed culture method of adipose - derived stem cells and dermal papilla cells, adipose - derived stem cells and dermal papilla cells were mixed and cultured in various ways.
도 6은 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양 모식도를 나타낸 것으로, 우선 혈청을 포함하는 ASC 배양액을 준비하고, 모유두 세포는 직경이 100㎛인 구형(spheroid)을 이루도록 응집 및 배양시켜 준비하였다.FIG. 6 is a schematic diagram of mixed culture of adipose derived stem cells and dermal papilla cells. First, an ASC culture containing serum was prepared, and the dermal papilla cells were prepared by flocculating and culturing to form a spheroid having a diameter of 100 μm.
그 후, 혼합 배양을 위하여 첫 번째로, 상기 ASC 배양액에 단층의 모유두 세포를 접종하여 직접 혼합 배양을 수행하고(제조예 1, DM), 두 번째로 ASC 배양액에 구형의 모유두 세포 응집을 접종하여 직접 혼합 배양을 수행하였으며 (제조예 2, DS), 세 번째로 단층의 모유두 세포를 PVC 필름에 단층으로 접종한 뒤 모유두 세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양하였고 (제조예 3, IM), 마지막으로 구형의 모유두 세포 응집을 PVC 필름에 접종한 뒤 모유두 세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양하였다 (제조예 4, IS).Thereafter, for the mixed culture, first, a single layer of dermal papilla cells was inoculated into the ASC culture solution, followed by direct mixed culture (Preparation Example 1, DM). Secondly, spherical dermal papilla cell aggregation was inoculated into ASC culture medium (Preparation Example 2, DS). Third, monolayers of monolayers of dermal papilla cells were inoculated on PVC film, and PVC film was placed on ASC culture so that the dermal papilla cells contacted the ASC culture solution (Preparation Example 3, IM). Finally, a spherical dermal papilla cell aggregation was inoculated on a PVC film, and a PVC film was placed on the ASC culture medium so that the dermal papilla cells contacted with the ASC culture medium (Preparation Example 4, IS).
상기와 같은 4가지 방법으로 7일간 지방 유래 줄기세포의 분화를 유도한 후 조정 배지(conditioned media, CM)를 수집하고, 수집한 각 배양액으로 지방 유래 줄기세포를 배양한 후, RT-PCR을 통해 모유두 세포의 마커 유전자인 BMP2, BAMBI, APOE, GLI-1, Ptc-1 발현량을 RT-PCR을 통하여 확인해 그 결과를 도 9에 나타내었다. 단, 대조군으로는 DMEM/F12 영양 배지에서 배양한 지방 유래 줄기세포(ASC)와 모유두 세포(DPC)에서의 상기 단백질 발현량을 분석하였다. After induction of differentiation of adipose-derived stem cells for 7 days by the above-mentioned four methods, conditioned medium (CM) was collected, and adipose stem cells were cultured with each culture medium and then subjected to RT-PCR The expression levels of BMP2, BAMBI, APOE, GLI-1 and Ptc-1, the marker genes of dermal papilla cells, were confirmed by RT-PCR and the results are shown in FIG. As a control group, the amount of protein expressed in adipose derived stem cells (ASC) and dermal papilla cells (DPC) cultured in DMEM / F12 nutrient medium was analyzed.
도 7에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양 시 DPC 마커 유전자들의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 직접 혼합 배양 중 구형의 모유두 세포 응집 접종에 의한 혼합 배양인 제조예 2와 간접 혼합 배양 중 구형의 모유두 세포 응집을 접종에 혼합 배양인 의한 제조예 4에 의한 경우 더욱 유의한 결과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 7, it was confirmed that expression of DPC marker genes was increased in the mixed culture of adipose-derived stem cells and dermal papilla cells. Particularly, it was confirmed that Preparation Example 2, which is a mixed culture by spherical dermal papilla cell co-inoculation during direct mixing culture, and spherical dermal papilla cell aggregation during indirect mixing culture, were more significant according to Production Example 4 by mixed culture in inoculation I could.
[[ 실시예Example 4] 혼합 배양액으로부터 분리한 4] mixed culture 엑소좀으로To exosome 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 When adipose-derived stem cells were cultured 모유두Dairy cattle 세포의 Cell 마커Marker 유전자의 발현 정도 확인 Identification of gene expression
상기 실시예 3에서 효과가 좋았던 직접 혼합 배양에 의한 제조예 2와 간접 혼합 배양에 의한 제조예 4를 통해 얻어진 혼합 배양액으로부터 다음과 같은 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다. 각 혼합 배양액에 1 M 소디움 아세테이트를 최종 농도가 0.1 M이 되도록 처리하고 45분간 4℃에 정치시킨 뒤 5분간 37℃에 정치시킨 후 4,000 g에서 10분간 원심 분리하여 엑소좀을 분리하였다. Exosomes were extracted from the mixed culture obtained in Preparation Example 2 by direct mixed culture and Production Example 4 by indirect mixing culture, which were effective in Example 3, by the following salting-out method. Each mixed culture was treated with 1 M sodium acetate to a final concentration of 0.1 M, allowed to stand at 4 ° C for 45 minutes, allowed to stand at 37 ° C for 5 minutes, and then centrifuged at 4,000 g for 10 minutes to separate exosomes.
이렇게 추출된 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양한 후, RT-PCR을 통해 모유두 세포의 마커 유전자인 LEF1, BAMBI 및 BMP2의 발현을 확인하여 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 또한, 웨스턴 블럿 분석을 통하여 베르시칸, 트롬보스폰딘 1 및 사이토케라틴 6/75과, 모유두 세포 표면 마커인 a-SMA의 발현을 확인하여 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 단, 대조군으로는 DMEM/F12 영양 배지에서 배양한 지방 유래 줄기세포(ASC)와 모유두 세포(DPC)에서의 상기 단백질 발현량을 분석하였다.The exosomes thus extracted were added to the medium to cultivate adipose stem cells, and the expression of LEF1, BAMBI and BMP2 marker genes of the dermal papilla cells was confirmed by RT-PCR. The results are shown in FIGS. 8 and 9 . In addition, Western blot analysis confirmed the expression of bersican,
도 8 및 도 9에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 직접 혹은 간접 혼합 배양액 내 엑소좀을 처리하여 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과, LEF1, BAMBI 및 BMP2의 발현이 모유두 세포 이상으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 8 and FIG. 9, when exogenous exocase was directly or indirectly mixed with adipose stem cells and dermal papilla cells, lipid-derived stem cells were cultured and the expression of LEF1, BAMBI and BMP2 .
또한 도 10 및 도 11에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 직접 혹은 간접 혼합 배양액 내 엑소좀을 처리하여 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과, 베르시칸, 트롬보스폰딘 1, 사이토케라틴 6/75 및 a-SMA 모두가 일반적인 모유두 세포만큼 증가한 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIGS. 10 and 11, when exogenous exo soma was directly or indirectly mixed with adipose-derived stem cells and dermal papilla cells, fat-derived stem cells were cultured. As a result, bersican,
이를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀이 지방 유래 줄기세포를 모유두 세포로 분화를 유도하거나 모낭 형성을 유도하였음을 알 수 있었다. From these results, it can be seen that the exosomes extracted from the mixed culture according to the present invention induced differentiation of follicular stem cells into dermal papilla cells or induction of hair follicle formation.
[[ 실시예Example 5] 혼합 배양액의 생체 내 탈모 효과 확인 5] Confirmation of in vivo hair loss effect of mixed culture
본 발명에 따른 혼합 배양액의 생체 내(in- vivo) 효과를 확인하기 위하여 탈모 마우스 모델을 이용하였다. 구체적으로는 C3H 마우스의 모낭형성 주기를 이용하여 탈모를 유도한 뒤, 상기 실시예 3에서 제조예 2의 직접 혼합 배양액으로부터 추출한 엑소좀(co CMEX)과 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 추출한 엑소좀(ASC CMEX)을 탈모 부위에 도포하여 42일 동안의 변화 양상을 도 12 및 도 13에 나타내었다. A hairless mouse model was used to confirm the in vivo effect of the mixed culture according to the present invention. Specifically, hair loss was induced using the hair follicle-forming cycle of C3H mouse, and then exocom (co CMEX) extracted from the direct mixed culture of Preparation Example 2 in Example 3 and exosome (ASC CMEX) was applied to the unhairing area and the change patterns for 42 days are shown in Figs. 12 and 13. Fig.
도 12 및 13에서 보는 바와 같이, 혼합 배양액으로부터 추출한 엑소좀(co CMEX)을 도포한 경우 약 28일이 경과 하였을 때 전체적으로 모발이 자라는 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 기존에 양모 및 육모 효과가 있다고 알려진 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 추출한 엑소좀(ASC CMEX)을 도포한 경우 42일이 지나서야 비로소 일부 탈모 부위에서 모발 형성이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIGS. 12 and 13, when the exocomex (co CMEX) extracted from the mixed culture was applied, it was confirmed that the hair grows as a whole when about 28 days have elapsed. On the other hand, when exocase (ASC CMEX) extracted from adipocyte stem cell culture fluid known as wool and hair growth effect was applied, it could be confirmed that hair formation takes place in some hair loss regions only after 42 days.
이를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀이 지방 유래 줄기세포를 모유두 세포로 분화를 유도하거나 모낭 형성을 유도하였음을 알 수 있었다.From these results, it can be seen that the exosomes extracted from the mixed culture according to the present invention induced differentiation of follicular stem cells into dermal papilla cells or induction of hair follicle formation.
[[ 실시예Example 6] 연골 세포 혼합 배양액의 지방유래 줄기세포의 6] Stem cell of adipose tissue of chondrocyte mixed culture 분화능에In the ability to differentiate 대한 영향 확인 Check for impact on
본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 연골세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 지방 유래 줄기세포에 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군(NC), 연골세포와 지방유래 줄기세포의 혼합 배양액(DM)을 각각 첨가하여 14일간 분화를 유도하였다. 다만, 배양 조건 및 첨가 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 상기 연골세포는 인간연골육종 세포주인 SW1353 세포로서 ATCC사에서 구매 하여 계대배양 하였다.In order to confirm whether the mixed culture solution according to the present invention is effective for differentiation of adipose-derived stem cells into chondrocytes, a negative control (NC) treated with no adipose-derived stem cells, a mixed culture medium of chondrocytes and adipose stem cells (DM) were added to induce differentiation for 14 days. However, the culturing conditions and the addition conditions were the same as in Example 1. The cartilage cells were purchased from ATCC as a human chondrosarcoma cell line, SW1353, and subcultured.
이후, 알시안 염색(alcian stain)을 통하여 현미경을 통해 각 세포의 연골세포 분화 형태를 확인하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 또한, RT-PCR 분석을 통하여 대조군(NC) 대비 연골세포의 마커 유전자인 MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan, sox-9(YUEH-HSUN YANG. 2012. STEM CELLS TRANSLATIONALMEDICINE 참고)의 발현 정도를 확인하여 그 결과를 도 15에 나타내었다.Thereafter, the morphology of chondrocyte differentiation of each cell was confirmed through an alcian stain through a microscope, and the results are shown in Fig. MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan and sox-9 (see YUEH-HSUN YANG, 2012. STEM CELLS TRANSLATIONALMEDICINE), which are marker genes of cartilage cells compared with control (NC) The degree of expression was confirmed, and the results are shown in Fig.
도 14에서 보는 바와 같이, 대조군(NC)에 비하여 지방유래 줄기세포와 연골세포의 혼합 배양액에서 그 형태에서 메스(mass) 형성이 도드라지게 일어나는 것을 확인 할 수 있었다.As shown in FIG. 14, it can be seen that formation of mass in the mixed culture solution of adipose-derived stem cells and chondrocytes occurs in the form as compared with the control (NC).
또한, 도 15에서 보는 바와 같이, 대조군에 비하여 MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan, sox-9의 유전자 발현이 증가 되는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 압축 하중에 저항 할 수 있는 능력을 갖는 추간판(intervertebral disc) 및 척추간연골(invertebral carilage)를 제공할 수 있는 aggrecan의 경우 무혈청 배지인 DMEM/F12 영양 배지만을 사용하여 배양한 음성 대조군(NC)에 비하여 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 15, the expression of MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan and sox-9 gene was increased in comparison with the control group. In particular, in the case of aggrecan capable of providing an intervertebral disc and invertebral carilage capable of resisting compressive load, a negative control (NC) cultured using DMEM / F12 nutrient medium without serum ), Which is higher than that of the wild type.
따라서 상기한 결과를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액은 기존의 지방유래 줄기세포 배양액에 비하여 지방 유래 줄기세포의 연골세포로의 분화를 현저하게 유도를 촉진하는 것을 알 수 있다.Therefore, it can be seen from the above results that the mixed culture solution according to the present invention promotes the induction of differentiation of adipose-derived stem cells into chondrocytes remarkably as compared with the conventional fat-derived stem cell culture solution.
[[ 실시예Example 7] 혼합 배양액으로부터 분리한 7] mixed culture 엑소좀으로To exosome 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 연골 세포의 When adipose-derived stem cells were cultured, 마커Marker 유전자의 발현 정도 확인 Identification of gene expression
본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 연골 세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 인간연골육종 유래인 SW-1353 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 뒤, ASC 배양액에 단층의 연골 육종 유래 세포를 접종하여 직접 혼합 배양하여 배양액을 얻고, 구형의 폐 상피세포 응집을 PVC 필름에 접종한 뒤 연골 육종 유래 세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양한 배양액을 얻었다. 두 배양액으로부터 상기 실시예 4의 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다. 또한, 대조군으로 지방 유래 줄기세포 및 연골 육종 유래 세포 각각의 단독 배양액으로부터 상기 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다.SW-1353 cells derived from human chondrosarcoma were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS, and then cultured in ASC culture medium , And a PVC film was placed on the ASC culture so that chondrosarcoma-derived cells were in contact with the ASC culture medium after inoculating spherical pulmonary epithelial cell aggregation into PVC film To obtain a cultured mixture. The exosomes were extracted from the two cultures by the salting-out method of Example 4 above. As a control group, exosomes were extracted from the sole culture medium of each of the adipose-derived stem cells and chondrosarcoma-derived cells by the salting-out method.
이렇게 추출된 엑소좀은 지방 유래 줄기세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포 단독 배양액에서 분리된 엑소좀(ASC-EV), 연골세포 단독 배양액에서 분리된 엑소좀(SW1353-EV), 지방 유래 줄기세포와 연골육종유래 세포의 혼합 배양액에서 추출된 엑소좀(coCM-EV)을 각각 첨가하여 14일 간 분화를 유도하였다. 단, 배양조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. SW1353세포는 ATCC사에서 구매하여 계대배양을 실시하였다. The extracted exosomes were prepared from adipocytes (ASC-EV) isolated from fat-derived stem cell culture medium, exo soma (SW1353-EV) isolated from chondrocyte culture medium alone, fat-derived stem cells (CoCM-EV) extracted from a mixed culture of cells derived from chondrosarcoma were induced to differentiate for 14 days. However, the culturing conditions were the same as in Example 1. SW1353 cells were purchased from ATCC and subcultured.
PT-PCR을 통해 연골 세포의 마커 유전자인 MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan, sox-9 의 발현을 확인하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.The expression of MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan and sox-9, which are marker genes of chondrocytes, was confirmed by PT-PCR and the results are shown in FIG.
도 16에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포와 연골 세포의 혼합 배양액 내 엑소좀을 처리하여 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과 음성 대조군(NC)과 비교하였을 때, 지방 유래 줄기세포 단독 배양액으로부터 분리된 엑소좀(ASC-EV) 처리군 및 연골육종 유래 세포 단독 배양액으로부터 분리된 엑소좀(SW1353-EV) 처리군과 비교하여 지방유래 줄기세포와 연골육종 유래 세포 공동 배양액으로부터 분리된 엑소좀(coCM-EV) 처리군에서 MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan, sox-9 의 발현이 유의성 있게 높은 것을 알 수 있었다. 특히 압축 하중에 저항할 수 있는 능력을 갖는 추간판(intervertebral disc)과 척추간연골(invertebral carilage)을 제공할 수 있도록 하는 유전자인 aggrecan의 경우 연골육종 유래 세포(SW1353) 단독 배양보다 높은 비율로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 16, when exogenous stem cells were cultured in the mixed culture medium of adipose-derived stem cells and chondrocytes, adipose-derived stem cells were cultured and compared with the negative control (NC) Derived co-culture of adipocytes (coCM-1) isolated from fat-derived stem cells and chondrosarcoma-derived cell co-culture compared with the exosome (ASC-EV) treated group and the exosome (SW1353-EV) MMP-3, MMP-13, aggrecan, and sox-9 were significantly higher in the control group than in the control group. In particular, aggrecan, a gene capable of providing an intervertebral disc and invertebral carilage capable of resisting compression load, is expressed at a higher rate than a single culture of chondrosarcoma-derived cells (SW1353) .
이를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀이 지방 유래 줄기세포를 연골 세포로 분화할 수 있도록 유도 하였음을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 지방 유래 줄기세포와 연골 세포의 혼합 배양액에서 분리된 엑소좀을 줄기세포에 처리 하였을 때, 연골 세포로의 분화를 촉진시키는 것을 통해 연골 손상 질환 등의 치료 용도로 활용 될 수 있음을 시사한다.From these results, it can be seen that the exosomes extracted from the mixed culture according to the present invention induce the differentiation of adipose-derived stem cells into cartilage cells. Therefore, these results can be utilized for treatment of cartilage damage diseases and the like through promoting the differentiation into chondrocytes when the exoose isolated from the mixed culture medium of adipose stem cells and chondrocytes is treated to stem cells .
[[ 실시예Example 8] 혼합 배양액으로부터 분리한 8] mixed culture 엑소좀으로To exosome 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 내배엽 세포의 When adipose-derived stem cells were cultured, 마커Marker 유전자의 발현 정도 확인 Identification of gene expression
본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 내배엽 세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 인간의 폐 상피세포(A549)를 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양한 뒤, ASC 배양액에 단층의 폐 상피세포를 접종하여 직접 혼합 배양하여 배양액을 얻고, 구형의 폐 상피세포 응집을 PVC 필름에 접종한 뒤 폐상피세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양한 배양액을 얻었다. 두 배양액으로부터 상기 실시예 4의 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다. 또한, 대조군으로 지방 유래 줄기세포 및 폐 상피세포 각각의 단독 배양액으로부터 상기 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다.Human lung epithelial cells (A549) were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS, and cultured in ASCs to determine whether the mixed culture medium according to the present invention was effective for the differentiation of endodermal stem cells into endoderm cells. The culture medium was obtained by inoculating monolayer lung epithelial cells into the culture medium, obtaining a culture solution, inoculating spherical pulmonary epithelial cell aggregate into PVC film, placing the PVC film on the ASC culture medium so that the lung epithelium contacts the ASC culture medium To obtain a cultured culture. The exosomes were extracted from the two cultures by the salting-out method of Example 4 above. As a control group, exosomes were extracted from the sole culture solution of each of adipose-derived stem cells and lung epithelium cells by the salting-out method.
이렇게 추출된 엑소좀은 지방 유래 줄기세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포 단독 배양액에서 분리된 엑소좀(ASC-EV), 폐 상피세포 단독 배양액에서 분리된 엑소좀(A-549-EV), 지방 유래 줄기세포와 폐상피세포의 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀(coCM-EV)을 각각 첨가하여 14일 간 분화를 유도하였다. 다만, 배양 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 내배엽 신경세포는 인간의 폐 상피세포 A-549로서, ATCC사에서 구매하여 계대배양을 실시하였다. The exosomes thus obtained were prepared from adipocytes (ASC-EV) isolated from fat-derived stem cell single culture medium, exosome (A-549-EV) isolated from pulmonary epithelial cell single culture, Exocomes (coCM-EV) extracted from a mixed culture of stem cells and lung epithelial cells were added to induce differentiation for 14 days. However, the culturing conditions were the same as in Example 1. Endoderm neurons were purchased from ATCC as human lung epithelial cell A-549 and subcultured.
이렇게 추출된 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방유래 줄기세포를 배양한 후, RT-PCR을 통해 폐 상피세포의 마커인 유전자 cytokeratin-5(CK-5), cytokeratin-8(CK-8), zonula occludens-1(ZO-1)의 발현을 확인하여 그 결과를 도 17에 나타내었다. The cytokeratin-5 (CK-5), cytokeratin-8 (CK-8), and zonula (CK-8) genes, which are markers of lung epithelial cells, were obtained by RT-PCR after culturing adipose- The expression of occludens-1 (ZO-1) was confirmed and the results are shown in Fig.
도 17에서 보는 바와 같이, 지방유래 줄기세포 단독 배양액 및 폐 상피세포 단독 배양액에서 추출한 엑소좀을 처리한 군과 비교하였을 때 지방유래 줄기세포와 폐 상피세포 혼합 배양액으로부터 분리한 엑소좀을 처리한 군에서 CK-5, CK-8, ZO-1의 유전자 발현이 높음을 확인하였다.As shown in FIG. 17, when compared with the group treated with exosomes extracted from adipocyte-derived stem cell culture alone and pulmonary epithelial cell culture medium, exosomes isolated from adipose-derived stem cell and lung epithelium mixed cultures were treated , CK-5, CK-8, and ZO-1 were highly expressed.
상기 결과를 통하여 지방유래줄기세포와 폐 상피세포의 혼합배양을 통해 얻어진 엑소좀이 특정한 종류의 세포에 국한되지 않고, 내배엽 세포에서도 그 분화유도가 가능함을 알 수 있었다.From the above results, it can be seen that the exosomes obtained through the mixed culture of adipose stem cells and lung epithelial cells are not restricted to specific kinds of cells but can induce their differentiation even in endoderm cells.
이를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀이 지방 유래 줄기세포를 폐 상피세포로 분화할 수 있도록 유도하였음을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 지방 유래 줄기세포와 폐 상피세포의 혼합 배양액에서 분리된 엑소좀을 줄기세포에 처리하였을 때, 폐 상피 세포로의 분화를 촉진 시키는 것을 통해 섬유성 장애 등의 치료 용도로 활용될 수 있음을 시사한다.Thus, it was found that the exosomes extracted from the mixed culture according to the present invention induced the differentiation of adipose stem cells into lung epithelial cells. Thus, these results indicate that when the exocose isolated from the mixed culture of adipose stem cells and lung epithelium is treated to stem cells, it can be used for treatment of fibrotic disorders by promoting differentiation into lung epithelial cells .
[[ 실시예Example 9] 혼합 배양액으로부터 분리한 9] mixed culture 엑소좀으로To exosome 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 외배엽 세포의 When adipose-derived stem cells were cultured, 마커Marker 유전자의 발현 정도 확인 Identification of gene expression
본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 외배엽 세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 인간 신경모세포(IMR-32)를 30% FBS를 포함한 EMEM 배지에서 배양하였다. ASC 배양액에 단층의 신경모세포를 접종하여 직접 혼합 배양한 배양액 및 구형의 신경세포 응집을 PVC 필름에 접종한 뒤 신경세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양한 배양액으로부터 상기 실시예 4의 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다. 또한, 대조군으로 지방 유래 줄기세포 및 신경세포 각각의 단독 배양액으로부터 상기 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다.In order to confirm whether the mixed culture according to the present invention is effective for the differentiation of adipose stem cells into ectodermal cells, human neuroblastoma (IMR-32) was cultured in EMEM medium containing 30% FBS. ASC cultures were inoculated with monolayers of neuroblasts, and inoculated culture media of spherical neuron aggregates and spherical neuron aggregates. The PVC film was placed on ASC culture so that the neurons contacted the ASC culture medium. The exosomes were extracted by the salting method of Example 4 above. As a control group, exosomes were extracted from the sole culture medium of each of the adipose-derived stem cells and neurons by the salting-out method.
이렇게 추출된 엑소좀은 지방 유래 줄기세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포에서 분리된 엑소좀(ASC-EV), 신경세포에서 분리된 엑소좀(neural cell-EV), 지방 유래 줄기세포와 신경세포의 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀(coCM-EV)을 각각에 첨가하여 14일간 분화를 유도하였다. 다만, 배양조건 및 첨가 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 외배엽 신경세포는 신경모세포 IMR-32로서, ATCC사에서 구매하여 계대배양을 실시하였다. The exosomes thus obtained were prepared from adipose tissue (ASC-EV) separated from fat-derived stem cells, neural cell-EV separated from neurons, fat-derived stem cells and nerve cells (CoCM-EV) was added to each of the cells to induce differentiation for 14 days. However, the culturing conditions and the addition conditions were the same as in Example 1. Ectodermal nerve cells were purchased from ATCC as neuroblast IMR-32, and subcultured.
이렇게 추출된 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방유래 줄기세포를 배양한 후, RT-PCR을 통해 신경세포의 마커인 유전자 MAP-1, MAP-2, NSE(neuron-specific enolase)의 발현을 확인하여 그 결과를 도 18에 나타내었다. After extracting the exosomes in the medium, the adipose stem cells were cultured and RT-PCR was performed to confirm the expression of neuronal markers, MAP-1, MAP-2 and NSE (neuron-specific enolase) The results are shown in Fig.
도 18에서 보는 바와 같이, 신경 생성 단계에 필수적인 마이크로튜블(microtubule) 에 포함되는 MAP-1, MAP-2 의 발현이 지방 유래 줄기세포와 신경모세포의 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀(coCM-EV) 그룹에서 양성 대조군인 신경세포(neural cell)의 발현양과 유사한 정도로 음성대조군(NC)에 비하여 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만아니라, 신경모세포 이외의 모든 종류의 신경세포에서 발현이 확인되는 NSE도 양성대조군과 유사할 정도로 높게 발현되는 것을 확인 할 수 있었다.As shown in FIG. 18, the expression of MAP-1 and MAP-2 contained in the microtubule essential for the neuron production step was significantly lower than that of the exosome (coCM-EV) group extracted from the mixed culture of adipose stem cells and neuroblastoma (NC), similar to the amount of neural cells expressing the positive control group. In addition, NSE, which is expressed in all types of neurons other than neuroblasts, was found to be highly expressed similar to the positive control.
상기 결과를 통하여 지방유래줄기세포와 신경모세포의 혼합배양을 통해 얻어진 엑소좀이 특정한 종류의 세포에 국한되지 않고, 외배엽 세포인 신경모세포에서도 그 분화 유도가 가능함을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 지방 유래 줄기세포와 신경세포의 혼합 배양액에서 분리된 엑소좀을 줄기세포에 처리하였을 때, 신경세포로의 분화를 촉진 시키는 것을 통해 신경질환 등의 치료 용도로 활용될 수 있음을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the exosomes obtained through the mixed culture of adipose stem cells and neuroblasts are not limited to specific kinds of cells but can induce their differentiation even in the neural stem cells of ectodermal cells. Thus, these results indicate that when the exoose isolated from the mixed culture of adipose stem cells and nerve cells is treated with stem cells, it can be used for treatment of neurological diseases through promoting differentiation into neurons Able to know.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is clearly understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be taken by way of limitation, It is to be understood that the invention may be practiced within the scope of the appended claims.
Claims (36)
상기 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀을 포함하는 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물. The method according to claim 1,
A composition for promoting the differentiation of stem cells into dermal papilla cells comprising the exosome isolated from the mixed culture solution.
상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물.3. The method of claim 2,
Wherein the exosome has a size of 30-1,000 nm. The present invention also provides a composition for promoting differentiation of stem cells into dermal papilla cells.
상기 성체 줄기세포는 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방, 제대혈 및 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 중 적어도 하나로부터 유래된 것인 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물. The method according to claim 1,
Wherein said adult stem cells are derived from at least one of bone marrow, blood, brain, skin, fat, umbilical cord blood and umbilical cord blood wharton's jelly.
상기 모유두 세포는 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형(spheroid)의 형태로 응집시켜 배양된 것인 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물. The method according to claim 1,
Wherein the dermal papilla cells are cultured in the form of a spheroid having a diameter of 50 to 150 탆 and cultured in the form of a spheroid.
상기 성체 줄기세포 상에, 구형(spheroid)으로 응집되어 배양 되어진 모유두 세포를 직접 접종하여 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물의 제조방법.Culturing adult stem cells on a culture plate; And
A method for preparing a composition for promoting differentiation of stem cells into dermal papilla cells, comprising the step of directly inoculating and culturing the adult dermal papilla cells grown and aggregated spheroidly on the adult stem cells.
상기 모유두 세포를 직접 접종하여 배양하는 단계 이후, 염석 방법(salting out)에 의해 엑소좀을 분리하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물의 제조방법.9. The method of claim 8,
Further comprising the step of directly isolating the exosome by salting out after the step of directly inoculating and culturing the dermal papilla cells, wherein the step of isolating the exosome by salting-out is a method for producing a composition for promoting differentiation into dermal papilla cells.
상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물의 제조방법.10. The method of claim 9,
Wherein the exosome has a size of 30 to 1,000 nm.
상기 모유두 세포는 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형(spheroid)의 형태로 응집시켜 배양된 것인, 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물의 제조방법.9. The method of claim 8,
Wherein the dermal papilla cells are cultured in the form of a spheroid having a diameter of 50 to 150 mu m by agglutination and cultured.
고분자 필름상에 구형으로 응집되어 배양 되어진 모유두 세포를 배양하는 단계; 및
상기 고분자 필름상에 배양된 모유두 세포를 배양 플레이트 상에 접촉시킨 뒤, 배양하여 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물을 제조하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물의 제조방법.Culturing adult stem cells on a culture plate;
Culturing a dermal papilla cell which has been spherically aggregated and cultured on a polymer film; And
Contacting the dermal papilla cells cultured on the polymer film on a culture plate and culturing the dermal papilla cells to prepare a composition for promoting differentiation of dermal papilla cells into dermal papilla cells to promote the differentiation of stem cells into dermal papilla cells ≪ / RTI >
상기 모유두 세포는 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형(spheroid)의 형태로 응집시켜 배양된 것인, 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물의 제조방법.13. The method of claim 12,
Wherein the dermal papilla cells are cultured in the form of a spheroid having a diameter of 50 to 150 mu m by agglutination and cultured.
상기 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물을 제조하는 단계 이후, 염석 방법(salting out)에 의해 엑소좀을 분리하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물의 제조방법.13. The method of claim 12,
Preparing a composition for promoting differentiation of stem cells into dermal papilla cells, further comprising the step of separating exosome by salting out after the step of preparing a composition for promoting differentiation of said stem cells into dermal papilla cells; Way.
상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 모유두 세포로의 분화 촉진용 조성물의 제조방법.17. The method of claim 16,
Wherein the exosome has a size of 30 to 1,000 nm.
상기 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀을 포함하는 탈모의 예방 또는 치료용 약학 조성물. 19. The method of claim 18,
A pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss comprising exosome isolated from said mixed culture solution.
상기 모유두 세포는 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형(spheroid)의 형태로 응집시켜 배양된 것인, 탈모의 예방 또는 치료용 약학 조성물. 19. The method of claim 18,
Wherein the dermal papilla cells are cultured in the form of a spheroid having a diameter of 50 to 150 탆 and cultured.
상기 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀을 포함하는 모유두 세포의 증식 촉진용 조성물. 36. The method of claim 35,
A composition for promoting proliferation of dermal papilla cells comprising exosome isolated from said mixed culture liquid.
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