KR101791569B1 - microorganism agent for biocontrol plant diseases using Trichoderma virens TR1047 and Trichoderma harzianum TR1048 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물의 균핵병과 흑색썩음균핵병에 대한 길항력을 갖는 새로운 미생물 균주인 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048를 제공하고자 하며, 특히 기존에 알려진 균핵병이나 흑색썩음균핵병의 방제 미생물에 비해 훨씬 뛰어난 길항력을 지니고 있어 단독 사용으로 화학농약을 대체할 수 있는 수준의 새로운 미생물 균주를 제공하고자 한다.The present invention aims to provide a new microorganism strain TRICO DELMARBIRES TR1047 and TRICODELMADHANUM TR1048 which have a dragging power against plant scleroderma and black rot mycorrhiza. Especially, the present invention relates to a microorganism which is resistant to scleroderma or black decay scleroderma It has a much better pathway resistance and is intended to provide a new microorganism strain that can replace chemical pesticides by itself.
Description
본 발명은 균핵과 관련된 질병, 특히 균핵병 및 흑색썩음균핵병의 방제에 관한 것으로, 특히 자연에서 분리한 트리코델마, 분리된 트리코델마를 포함하는 미생물제, 이러한 미생물제의 제조방법, 그리고 이를 이용한 균핵병의 방제방법에 관한 것이다.
The present invention relates to the control of sclerotia-related diseases, in particular sclerotinia and black rot mycotic disease, and more particularly to a microorganism comprising a natural tricortalma, a separated trichoderma, a method for producing such a microorganism, .
균핵(Sclerotium)은 그리스어 skleros(hard, 단단함)에서 유래한 말로 균사가 치밀하게 집합하여 형성된 딱딱한 구형에서 곤봉상의 덩어리로 내부나 그 위에 포자를 만들지 않으며 균핵 위에는 종종 자실체가 형성된다. 많은 곰팡이류가 균핵을 형성하지만 벼과식물에 기생하는 맥각균 Claviceps spp.가 형성하는 균핵에는 맥각 alkaloid가 함유되어 수입 곡식 등에서는 균핵의 혼입이 문제시되고 있다. 농작물, 특히 채소에서는 균핵병균에 의한 병해가 포장에서 잘 발생하며, 발증이 심해지면 흑색의 균핵을 만드는 것이 특징이다, 또한 Aspergillus 속류의 일부에도 균핵을 형성하는 것이 있고, A. flavus , A. ochraceus 등에서는 배지상에서 종종 형성된다. 일번적으로 내구성이 강한 휘면조직으로 건조토양 등의 악조건에서도 살아남고, 호적조건 하에서 자실체, 분생자구조 등을 형성하여 포자를 분산한다.(식품과학기술대사전 참조) Sclerotium is a term derived from Greek skleros (hard). It is a rigid sphere formed by dense aggregation of hyphae. It does not form spores on the inside or on the inside with a clumpy mass, and fruiting bodies are often formed on sclerotia. Although many fungi form sclerotia, Claviceps parasitic on parasitic plants The sclerotia formed by the spp . contains alkaloids of erythrocytes, and the inclusion of sclerotia is a problem in imported grains. In crops, especially vegetables, disease caused by sclerotinia occurs well in the pavement, and it is characterized by black sclerotia when the onset becomes severe. In some parts of Aspergillus , sclerotia is formed, and A. flavus , A. ochraceus Are often formed on the medium. It is a durable tissue with a long durability. It survives the bad conditions such as dry soil, and forms fruiting bodies and spermatogonial structures under hostile conditions to disperse spores (see Food Science and Technology Encyclopedia).
균핵은 예로부터 인간의 건강에 문제를 일으켜왔던 원인체로, 중세에는 Claviceps purpurea의 균핵에 감염된 호밀을 이용하여 구운 빵을 먹고 맥각 중독(ergot poisoning)이 발생하여 수천명의 사람들이 죽거나 불구가 되기도 하였다(1). 맥각은 강한 자궁수축작용, 분만의 촉진 및 분만 때의 지혈작용이 있어 예로부터 의약으로 사용되기도 하였고, 리세르그산 및 그 입체이성질체인 이소리세르그산을 모체로 하는 7쌍의 이성질체로서 14종이 알려져 있고, 리세르그산을 모체로 하는 것은 생리 작용이 강하지만 그 입체이성질체는 생리작용이 약하다. Sclerotia has been a cause of human health problems from ancient times, in the Middle Ages Claviceps Eating roasted bread with rye infected with purpurea sclerotia and ergot poisoning caused thousands of people to die or become deformed (1). The ergot is known to have been used as a medicament since it has a strong uterine contraction function, promotion of labor and hemostatic function at the time of delivery. There are 14 known isomers of seven pairs of isomeric acid, isomeric acid and its stereoisomer, ricerugic acid , Ricergic acid is the parent of the physiological action is strong, but the stereoisomer is weak physiological function.
균핵은 다양한 작물에서 발생하여 농업에서의 피해도 발생시키고 있다. Sclerotinia sclerotiorum과 S. minor에 의해 상추에서 균핵병이 발생하는데 상추 균핵병은 미국에서 1890년에 보고되었고(2), 우리나라에서는 1976년에 처음 보고되었다(3). 미국과 유럽에서는 S. sclerotiorum가 자낭포자를 통해 주로 감염된다(4), 미국, 유럽 등 상추를 생산하는 주요 국가에서는 상추 균핵병이 수량손실을 야기하는 중요한 병으로 알려져 있으며, 미국에서는 매년 175%의 작물손실을 일으키는 병으로 알려져 있다(5). 국내에서 연중 생산되는 상추는 주로 시설 내에서 재배되며, 연작과 늦가을부터 초봄에 이르는 겨울철의 저온 다습한 시설내의 환경은 균핵병의 발생을 조장하여 농가에 경제적 피해를 주고 있다(6).Sclerotia occurs in various crops and causes damage to agriculture. Sclerotinia Sclerotinia is caused by lettuce by sclerotiorum and S. minor . The lettuce sclerotia was reported in the USA in 1890 (2), and it was first reported in 1976 in Korea (3). In the United States and Europe, S. sclerotiorum is mainly infected by ascospores (4). In major countries producing lettuce such as the United States and Europe, lettuce sclerotinia is known to be an important disease causing loss of yield. In the United States, 175% It is known as a disease causing crop loss (5). Lettuce, which is produced all year round in Korea, is mainly cultivated in the facility, and the environment in the cold and humid environment during the winter from late autumn to early spring promotes the occurrence of scleroderma, thereby causing economic damage to farmers.
쪽파나 마늘의 재배 중에 발생하는 흑색썩음균핵병은 안정 생산을 위협하는 중요한 식물병 중의 하나로 알려져 있다. 흑색썩음균핵병의 발생은 여러 지역에서 보고되어 있는데, 영국에서는 생산량의 10%가 흑색썩음균핵병으로 감소하였으며, 멕시코와 브라질에서는 전혀 수확을 할 수 없었던 적도 있었다(7). 캐나다에서는 포장에서 발병주율이 65%에 달할 정도로 발생이 심한 해도 있었으며(8), 에티오피아에서는 2003년과 2004년에 96.6%의 포장에서 흑색썩음균핵병이 발생하기도 하였다(9). 국내에서는 1988년 고흥 지방에서 처음 보고된 이래 백합과 채소를 대상으로 1996년까지 매년 발생이 증가하고 있는 토양병이다(10). 하지만 Kim (2001)에 의하면 2000년 이후부터는 2000년 흑색썩음병이 발생한 발병포장율은 44.7%, 발병주율은 19.6%이었으나, 2001년과 2003년의 발병포장율은 20.4%와 14.3%, 발병주율은 6.0%와 10.1%로 감소하는 경향을 보였다(11, 12).Black rot mycotic disease, which occurs during the cultivation of zephyrum and garlic, is known to be one of the important plant diseases threatening stable production. The incidence of black rot mycotic disease has been reported in several regions. In the UK, 10% of the production was reduced to black rotten sclerotinia, and in Mexico and Brazil, harvesting was not possible at all (7). In Canada, the incidence of the disease in the packaging was 65% (8), and in Ethiopia in 2003 and 2004, 96.6% of the packaged products had black rot mycosis (9). In Korea, since the first reported in Goheung in 1988, lilies and vegetables have been growing up to 1996 (10). However, according to Kim (2001), the incidence of onset of black rot in 2000 was 44.7% and the incidence rate of incidence was 19.6% in 2000. However, the incidence rate of incidence in 2001 and 2003 was 20.4% and 14.3% And 10.1%, respectively (11, 12).
균핵병을 방제하기 위해서는 Trichoderma harzianum과 Bacillus subtilis 등과 같은 미생물을 사용하는 생물적 방법, 토양을 태양열로 소독하는 물리적 방법, 살균제를 처리하는 화학적 방법 등이 사용되고 있다(7, 13). Trichoderma , Bacillus, Burkholderia 등 여러 가지 미생물을 사용하여 우수한 방제효과를 얻었으나, 포장에 따라서 효과가 낮게 나타나거나, 기대에 미치지 못하는 경우도 있다(14, 15, 16). 포장을 비닐 필름으로 덮어 토양의 온도를 높여 균핵의 생존력을 떨어뜨리는 태양열 소독은 포장에서 흑색썩음균핵병에 대한 우수한 방제효과를 보였다(17, 13). 하지만 토양 1 g에 균핵이 1개에서 10개 정도가 존재할 경우 포장에서 발병율이 100%에 도달하고, 0.001개일 경우 소수의 식물체에서 병이 발생하기 때문에 토양에 존재하는 병원균의 밀도가 아주 낮은 정도로 감소되지 않고서는 우수한 효과를 계속적으로 얻기가 힘들다(18, 7). 경종적 방법을 사용하여 병 방제를 하기 위해서 Kim 등(19)은 종구 파종을 10월 중순 이전에 실시하거나, 파종 시 종구의 재식 깊이를 깊게 함으로써 병 발생을 줄이고자 하였다. 또한 석회를 토양에 처리하여 병 발생을 억제하고자 하였지만, 살균제를 처리하여 방제하였을 때만큼 우수하지는 못하였다. 살균제를 사용하는 방법은 가장 보편적인 방법으로 알려져 있으며, dicloran, iprodione, procymidone, tebuconazole과 같은 여러 가지 살균제가 병 방제에 사용되어 왔다. 하지만 처리한 살균제가 토양 중에서 분해되거나, 한 번 처리로 방제가 이루어지지 않기 때문에 다양한 처리 방법으로 또는 주기적으로 계속 처리해야 하거나, 재배 작물 밀도에 따라서 처리하는 양을 달리해야만 만족할 만한 효과를 얻을 수 있었다(20, 21, 9). 다양한 방제 방법이 보고되고 있음에도 불구하고, 균핵병을 방제하기 위해서는 병원균의 생리·생태적인 특징과 병환에 대한 이해가 필요하다. 국내외적으로 균핵병의 방제를 위해 다양한 농약을 이용한 방제 연구가 많이 이루어져 왔으나, 잔류농약 문제와 친환경농산물에 대한 수요가 급증함에 따라 화학적 방제를 대신할 다양한 방법들이 연구되고 있다.In order to control scleroderma, Trichoderma biological methods using microorganisms such as harzianum and Bacillus subtilis , physical methods of disinfecting the soil with solar heat, and chemical methods of treating bactericides have been used (7, 13). Although many microorganisms such as Trichoderma , Bacillus, and Burkholderia have been used to obtain excellent control effects, they have been shown to have low efficacy depending on the package or not meet the expectations (14, 15, 16). Solar disinfection, which reduces the viability of sclerotia by increasing the temperature of the soil by covering the package with a plastic film, showed excellent control effect against black decaying sclerotia in packaging (17, 13). However, when 1 to 10 sclerotides are present in 1 g of soil, the incidence rate reaches 100% in the package and 0.001 in case the disease occurs in a small number of plants, so that the density of the pathogens present in the soil is reduced to a very low level It is difficult to obtain excellent effects continuously (18, 7). Kim et al. (19) used seedling sowing prior to mid-October or sowing seedlings at deep seeding to reduce disease incidence. In addition, lime was applied to the soil to inhibit disease development, but it was not as good as when treated with a disinfectant. The use of disinfectants is known to be the most common method, and various disinfectants such as dicloran, iprodione, procymidone, and tebuconazole have been used for disease control. However, since the treated disinfectant is decomposed in the soil or can not be controlled by the treatment once, it can be satisfactorily effected by various treatment methods or periodically continuous treatment or by varying the amount depending on the density of cultivated crops (20, 21, 9). Despite the reports of various control methods, it is necessary to understand physiological and ecological characteristics of pathogens and disease in order to control sclerotia. In order to control sclerotinia both domestically and externally, various pesticide-based control studies have been conducted. However, as the pesticide residue problem and the demand for environmentally friendly agricultural products have increased, various methods to replace chemical control have been studied.
균핵병이나 흑색썩음균핵병 방제에는 화학농약이 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 화학농약은 토양의 산성화 및 오염문제, 인축에의 독성문제, 농약성분의 잔류로 인한 환경문제 등을 유발한다. 최근 환경문제에 대한 인식제고와 소비자들의 친환경 식품 선호현상으로 인해 화학농약의 사용을 자제하고 대신 친환경농자재의 사용을 확대하고자 하는 추세이다. 친환경농자재로는, 식물에서 추출한 천연물 농약과 미생물을 이용한 생물농약이 주로 사용된다. 친환경농자재에 대한 관심과 사용은 점차 확대되고 있으나, 기존의 화학농약을 대체하기에는 아직 방제력 면에서 부족한 실정이다. Chemical scavengers are the most commonly used to control scleroderma or black decay scleroderma. However, chemical pesticides cause acidification and contamination of the soil, toxicity to the drawing, and environmental problems caused by residual pesticides. Recently, due to environmental awareness raising and consumers' preference for eco-friendly food, it is a tendency to refrain from the use of chemical pesticides and to increase the use of eco-friendly farm materials instead. As environmentally friendly farming materials, natural pesticides extracted from plants and biological pesticides using microorganisms are mainly used. Although the interest and use of environmentally friendly farming materials are gradually expanding, it is still inadequate to replace existing chemical pesticides.
공개특허 제10-2009-0063987호에서는 잿빛곰팡이병, 잿빛썩음병, 검은별무늬병, 고추탄저병, 오이탄저병 등을 유발하는 식물병원균에 항균활성을 갖는 신규의 스트렙토마이세스(Streptomyces)속 균주 및 이를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공하고 있다. 공개특허 제10-2011-0055458호에서는 항진균 활성을 갖는 신규한 자낭균인 자일로곤 가노데르모프쏘라(Xylogone ganodermophthora) 균주, 이를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공하고 있다. 공개특허 제10-2010-0116562호에서는 벼잎집무늬마름병, 토마토잿빛곰팡이병, 토마토역병, 밀붉은녹병, 보리흰가루병, 고추탄저병, 토마토풋마름병, 토마토시들음병, 토마토뿌리혹선충병 등에 대해 길항작용을 나타내는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) G341 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법을 제공하고 있다. 그러나 대부분의 생물농약이 단독사용에서 화학농약을 완전 대체할 수 있을 정도의 방제가를 보이지 못하는 실정으로, 화학농약을 대체할 수 있는 수준의 방제가를 지닌 생물농약에 대한 개발 요구는 계속되고 있다.Open No. 10-2009-0063987 discloses a novel Streptomyces sp. Strain having an antimicrobial activity against a plant pathogenic bacterium that causes gray mold, gray mold rot, black spotted bottle, red pepper anthracnose, And a plant pathogenic bacterium. In patent application No. 10-2011-0055458, a novel microcystic fungus having an antifungal activity, Xylogone ganodermophthora ) and a composition for controlling plant diseases, which comprises the same as an active ingredient. In Patent Application No. 10-2010-0116562, antagonistic action against rice sheath blight, tomato gray mold, tomato plague, wheat red rust, barley powdery mildew, red pepper anthracnose, tomato foot rot, tomato wilt disease and tomato root blight nematode Bacillus velezensis strain G341 and a plant disease control method using the same. However, since most of the biological pesticides can not completely replace the chemical pesticides in the single use, there is a demand for the development of the pesticides having a level of control agent that can replace chemical pesticides .
본원발명은 이러한 수요에 부응하고자 예의 노력한 결과 우리나라의 토양에서 분리한 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048이 균핵병의 방제에 탁월한 효과를 보이는 것을 발견하였고, 이에 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048을 이용한 식물병 방제 미생물제를 제조하여 발명을 완성하였다.
The present invention has found that TRICO DELMARBIRES TR1047 and TRICO DELMHAMENUM TR1048 isolated from soil in Korea have excellent effect in controlling scleroderma, and found that TRICO DELMARBIRES TR1047 and TRICO DELAMAS The inventors have completed the present invention by producing plant microbial control microorganism using Hyalinum TR1048.
(1) L. R. TULASNE, Annales des Sciences Naturelles, Botanique, 3rd series, vol.20, pp.5-56(1853)(1) L. R. TULASNE, Annales des Sciences Naturelles, Botanique, 3rd series, vol.20, pp.5-56 (1853)
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(3) KIM K. C., Korean J. Plant Protect, vol. 15. pp. 223-243(1976)(3) KIM K. C., Korean J. Plant Protect, vol. 15. pp. 223-243 (1976)
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(5) Purdy, L. H. Phytopathology 69: 875-880(1979)(5) Purdy, L. H. Phytopathology 69: 875-880 (1979)
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(21) Entwistle, A. R., Aspects Appl. Biol., vol. 40, pp. 166-175(1986)
(21) Entwistle, AR, Aspects Appl. Biol., Vol. 40, pp. 166-175 (1986)
본 발명에서는, 식물의 균핵병과 흑색썩음균핵병에 대한 길항력을 갖는 새로운 미생물 균주를 제공하고자 하며, 특히 기존에 알려진 균핵병이나 흑색썩음균핵병의 방제 미생물에 비해 훨씬 뛰어난 길항력을 지니고 있어 단독 사용으로 화학농약을 대체할 수 있는 수준의 새로운 미생물 균주를 제공하고자 한다.The present invention aims to provide a new microorganism strain having a drag resistance against the sclerotinia and black rot mycorrhaphy of plants and has a far superior drag resistance than the known microorganisms of scleroderma or black decay scleroderma, And to provide a new microorganism strain capable of replacing pesticides.
또한, 본 발명에서는 이 방제 미생물 및 이 미생물을 포함하는 균핵병 방제용 미생물 제제와 그 제조방법을 제공하고자 한다.The present invention also provides a microorganism preparation for controlling scleroderma, which comprises the microorganism and the microorganism, and a preparation method thereof.
본 발명의 다른 측면은, 상기 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제용 미생물 제제를 이용한 방제방법을 제공하고자 한다.
Another aspect of the present invention is to provide a method of controlling microorganisms for controlling sclerotinia and black rot mycobacteria.
본 발명에서는, 식물의 균핵병과 흑색썩음균핵병에 대해 길항력을 갖는 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주가 제공된다.In the present invention, Tricodelma virans strain TR1047 and Tricodelma javanum strain TR1048, which have a dragging resistance against scleroderma and black rot mycosis of plants, are provided.
또한, 본 발명에서는, 상기 트리코델마 비렌스 TR1047 또는 트리코델마 하지아눔 TR1048, 이 균주의 배양액 중 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제용 미생물 제제가 제공된다.In addition, the present invention provides a microorganism preparation for controlling scleroderma and black decaying sclerotinia comprising the above-mentioned trico delmareviris TR1047 or tricodelmajalanum TR1048 and a culture solution of the strain as an active ingredient.
또한, 본 발명에서는, 트리코델마 비렌스 TR1047 또는 트리코델마 하지아눔 TR1048을 PDA배지에 15일간 배양하여 포자현탁액을 만든 후 헤모사이토미터를 통해 5x106 spores/ml의 농도로 조절하고, 상추 1포기당 균핵병균을 배양한 보리 2알을 토양에 접종하고 Trichoderma 균주별로 포자현탁액을 상추 1포기당 5ml씩 관주하는 것을 포함하는 균핵병과 흑색썩음균핵병의 방제방법이 제공된다.
In addition, in the present invention, TRICODELMARBIRES TR1047 or TRICO DELMASHANUM TR1048 was cultured in a PDA medium for 15 days to prepare a spore suspension, and the concentration was adjusted to 5x10 6 spores / ml through a hemocytometer. There is provided a method for controlling scleroderma and black decaying scleroderma comprising inoculating two barley cultivated with sclerotinia bacteria into a soil and locating the spore suspension per Trichoderma strain at a rate of 5 ml per 1 lettuce.
본 발명에 따라 얻어진 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제제 조성물은 실시예를 통해 확인되는 바와 같이, 단독으로도 방제가 90% 이상의 뛰어난 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제 활성을 나타내므로, 그간 사용되어온 화학농약을 대체하여 유효한 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제제로 이용될 수 있다. 본 발명의 균핵병 및 흑색썩음균핵병 방제제 조성물은 토양오염, 인체에 대한 독성 문제를 해결할 수 있고 그간 화학농약에 내성을 나타내던 균핵병과 흑색썩음균핵병에도 효과적으로 사용될 수 있는 뛰어난 효과가 있다.
As can be seen from the examples, the composition of sclerotinia and black rot mycotic disease control agent obtained according to the present invention exhibits excellent sclerotinia and black rot mycorrhiza control activity of not less than 90% by itself, And can be used as effective sclerotinia and black decay scleroderma control agents. The sclerotinia and black rot mycotic disease control composition of the present invention has an excellent effect that can solve problems of soil contamination and toxicity to humans, and can be effectively used for sclerotinia and black rot mycorrhiza which have resistance against chemical pesticides.
도 1은 염기서열 유사도(ITS 1 and ITS 2)에 따른 본 발명 균주의 계통도이다.
도 2는 염기서열 유사도(Elongation factor-1a)에 따른 본 발명 균주의 계통도이다.
도 3은 광학현미경으로 본 T. virens TR1047(A), T. harzianum TR1048(B) 균주의 형태적 특성이다.
도 4는 Trichoderma virens TR1047와 T. harzianum TR1048의 균총 및 흑색썩음균핵병균(S. cepivorum)의 균핵 및 균사에 기생한 모습이다.
도 5는 트리코델마균주의 온도별 균핵병균의 균핵에 대한 감염율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 T. virens TR1047 균주의 온도 및 포자농도별 포자발아율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 T. harzianum TR1048 균주의 온도 및 포자농도별 포자발아율을 나타낸 그래프이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 is a flow diagram of the strain of the present invention in accordance with the nucleotide sequence similarity (ITS 1 and ITS 2).
2 is a flow diagram of the strain of the present invention according to nucleotide sequence similarity (Elongation factor-1a).
Fig. 3 shows the morphological characteristics of strains of T. virens TR1047 (A) and T. harzianum TR1048 (B) obtained by optical microscopy.
Figure 4 is a graph virens TR1047 and T. harzianum TR1048, and parasites of sclerotia and hyphae of S. cepivorum .
FIG. 5 is a graph showing the infection rate of Sclerotinia sp.
Fig. 6 is a graph showing the spore germination rate by temperature and spore concentration of T. virens TR1047 strain.
Fig. 7 is a graph showing the spore germination rate by temperature and spore concentration of T. harzianum TR1048 strain.
본 발명은 균핵병과 흑색썩음균핵병에 대하여 방제효과를 갖는 신규 트리코델마비렌스 TR1047, 이의 배양 및 생산 방법, 이를 이용한 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제용 조성물 그리고 이의 제형화 방법 및 방제 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a novel Tricordel mabirence TR1047 having a controlling effect against scleroderma and black rot mycorrhage, a method for culturing and producing the same, a composition for controlling scleroderma and black decaying scleroderma using the same, and a method for the formulation and control thereof.
또한, 본 발명은 트리코델마 하지아눔 TR1048, 이의 배양 및 생산 방법, 이를 이용한 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제용 조성물 그리고 이의 제형화 방법 및 방제 방법에 관한 것이다. The present invention also relates to a method for culturing and producing TRICO DELMASHANUM TR1048, a composition for controlling scleroderma and black decaying scleroderma using the same, a method of formulating the same, and a method for controlling the same.
본 발명에 따른 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주는 특히 상추 균핵병과 쪽파 흑색썩음균핵병에 대하여 탁월한 방제효과를 가지고 있어, 상추 균핵병과 쪽파 흑색썩음균핵병 등의 식물병을 예방하는 생물농약으로 유용하다.The TRICHL DELMARBIRES TR1047 and TRICODELMADHANUM TR1048 strains according to the present invention have an excellent controlling effect especially on the lettuce sclerotinia and the black rot rot mycorrhizal disease, and thus are useful as a pesticide for preventing plant diseases such as lettuce scurvy, .
본 발명자들은 상추 균핵병과 쪽파 흑색썩음균핵병에 대한 길항균으로 선별된 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주가 상추 균핵병과 쪽파 흑색썩음균핵병의 방제에 우수한 효과가 있음을 밝혀서 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have completed the present invention by discovering that Tricodelma virans TR1047 and TR108 strains selected as antagonistic strains against lettuce sclerotinia and black rot rot mycorrhizae have an excellent effect on control of lettuce sclerotinia and black rot rot mycorrhizae .
우선, 본 발명은 식물병원성 진균에 대하여 우수한 방제 효과를 갖는 신규한 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주를 제공한다. 상기 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주는 특히 상추 균핵병과 쪽파 흑색썩음균핵병에 우수한 방제효과를 보이는 것으로 분리 및 동정된 신규한 균주로서, KACC 93157P 및 KACC 93158P의 수탁번호를 부여받았다.First, the present invention provides novel TRICODELMARE TR1047 and TRICODELMADHANUM TR1048 strains having excellent control effects against phytopathogenic fungi. The TRICHEL DELMARBIRES TR1047 and TRICODELMADHANUM TR1048 strains were newly isolated and identified as having excellent control effects on lettuce sclerotinia and black rot rot mycorrhizae, and were given accession numbers of KACC 93157P and KACC 93158P.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주를 배양하는 방법을 제공한다.In yet another aspect, the present invention provides a method of culturing TRICODEL DEL BIRRENS TR1047 and TRICODELMADHANUM TR1048.
본 발명의 배양 방법에서 사용된 배지는 일반적으로 사용되는 배지들로 cornmeal agar(Difco) + 2% dextrose로 이루어진 CMD배지와 1g KH2PO4, 1g KNO3, 0.5g MgSO47H2O, 0.5g KCl, 0.2g glucose, 0.2g sucrose, 20g agar, 10mg chlorotetracycline, 50mg dihydrostreptomycin sulphate, 100mg penicillin G로 이루어진 SNA배지로 배양을 할 수 있다. The medium used in the culture method of the present invention is a CMD medium consisting of cornmeal agar (Difco) + 2% dextrose and 1 g KH2PO4, 1 g KNO3, 0.5 g MgSO47H2O, 0.5 g KCl, 0.2 g glucose, 0.2 g sucrose, 20 g agar, 10 mg chlorotetracycline, 50 mg dihydrostreptomycin sulphate, and 100 mg penicillin G.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 배양 온도는 25 내지 35, 바람직하게는 30인 것이 좋고, 배양 pH는 4 내지 8, 바람직하게는 5.5 내지 6.5인 것이 좋으며, 배양 시간은 72시간 이내로 하는 것이 좋으며, 보다 바람직하게는 36 시간 내지 52시간 인 것이 좋다. 상기 온도, pH 및 시간의 범위는 실험상 최적 조건으로 얻어진 수치이다.In the culturing method of the present invention, the culture temperature is preferably 25 to 35, preferably 30, and the culture pH is preferably 4 to 8, preferably 5.5 to 6.5, and the incubation time is preferably 72 hours or less, More preferably 36 hours to 52 hours. The range of temperature, pH, and time is a value obtained under the optimum condition under experimental conditions.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 또는 이의 배양물을 포함하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제공한다.In yet another aspect, the present invention provides a composition for controlling phytopathogenic fungi, comprising TRICO DELMARBIRES TR1047 and TRICODELMAZANUM TR1048 or a culture thereof.
상기 식물병원성 진균은 Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum , Fusarium solani와 Pythium ultimum , Phytophthora capsici , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum, Sclerotium sp, Botrytis cinerea으로 구성된 군으로부터 선택된 한 가지 이상일 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용 가능한 식물은 상기한 미생물, 특히, 균핵병과 흑색썩음균핵병이 발생하는 모든 식물체일 수 있으며, 예컨대, 상추, 쪽파, 토마토, 딸기 및 배추 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.The phytopathogenic fungi include Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum , Fusarium solani and Pythium ultimum , Phytophthora capsici , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum, Sclerotium sp, Botrytis cinerea . The plants to which the composition of the present invention can be applied may be any of the above microorganisms, particularly all plants in which scleroderma and black rot mycosis occur, such as lettuce, green pepper, tomato, strawberry and cabbage .
본 발명의 미생물 조성물은 상기 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주 자체를 포함하는 것일 수 있고, 이를 특정의 배지에서 특정 조건하에서 배양하여 얻어진 배양물을 포함하는 것일 수 있다.The microbial composition of the present invention may be one comprising the above-mentioned TRICODELMARAVIRES TR1047 and TRICODELMAZHANUM TR1048 strain itself, and may be a culture obtained by culturing it under a specific condition in a specific medium.
상기 배양물은 당밀, 보리, PDA, 쌀겨 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소원으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 첨가한 배지에서 배양하여 얻어진 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 탄소원 중에서도 보리가 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주의 대량 생산에 효과적인 것으로 나타났다. The culture may be obtained by culturing in a medium supplemented with at least one carbon source selected from the group consisting of carbon sources selected from the group consisting of molasses, barley, PDA, rice bran and the like. In the present invention, among the carbon sources, the barley was found to be effective for the mass production of TRICODELMAVIRUS TR1047 and TRICODELMAHANUM TR1048.
본 발명에 따른 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 식물병원성 세균 및/또는 진균의 방제용 조성물은 생체 고분자 물질, 보호제 및 영양물질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함하여 제형화된 것일 수 있다. 상기 제형화된 조성물은 분무 등의 손쉬운 방법으로 식물체에 용이하게 적용될 수 있는 수화제형 또는 액상 수화제형인 것이 바람직하다.The composition for controlling phytopathogenic bacterium and / or fungi according to the present invention, which contains Tricodelma virans TR1047 and Tricodelma javanum TR1048 strain or a culture thereof, comprises one kind selected from the group consisting of biopolymers, Or may further be formulated including the above additives. The formulated composition is preferably a wettable powder or liquid wettable powder which can be easily applied to plants by an easy method such as spraying.
상기 생체 고분자 물질은 미생물 조성물의 액상 수화제형 제조 시 제형화를 위한 전달매체로 사용되며, 투명하면서도 약흔을 남지기 않고 적절한 점성을 유지할 수 있도록 하는 것으로, 옥수수 전분, 변성전분, 타피오카 전분, 메주가루, 미강, 썬크리미, 썬텐더, 썬사이즈, 썰프리겔, 썬캡, 썬슈퍼겔, 썬배터, 제오실 등으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 본 발명의 조성물 내 생체 고분자 물질의 함량은, 제형화된 조성물이 투명하면서도 약흔을 남지기 않고 적절한 점성을 유지할 수 있도록, 상기 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주 또는 이의 배양물 100 중량부에 대하여 30 내지 50 중량부인 것이 좋다.The biopolymer material is used as a delivery medium for formulation in the preparation of a liquid wettable powder of a microbial composition, and it is transparent and maintains a proper viscosity without remaining a stain. Examples thereof include corn starch, modified starch, tapioca starch, , Sunflower, sunflower, sun cream, suntan, sunshine, low-grade pregel, sun cap, sun super gel, sun batters, zeolite and the like. The content of the biopolymer in the composition of the present invention may be adjusted so that the formulated composition is transparent and maintains a proper viscosity without remaining a trace. The content of the biodegradable polymer in the composition of the present invention is 100 wt. And 30 to 50 parts by weight.
상기 보호제는 현미유 및 올리브유로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 함량은 상기 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주 또는 이의 배양물 100 중량부에 대하여 2 내지 10 중량부, 바람직하게는 3 내지 7 중량부인 것이 좋다. 또한 상기 영양물질은 수크로오스 및 프룩토오스로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 함량은 상기 트리코델마비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주 또는 이의 배양물 100 중량부에 대하여 1 내지 5 중량%, 바람직하게는 1.5 내지 3.5 중량%인 것이 좋다. 이때, 수크로오스는 길항균의 영양원이 되며, 현미유 및 올리브유는 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048를 피막화시켜 자외선으로부터 보호하고 제제 성분들이 잘 섞이게 하는 유화제로서의 역할을 하는 것으로 사료된다.The protecting agent may be at least one kind selected from the group consisting of brown rice oil and olive oil, and its content is 2 to 10 parts by weight, preferably 2 to 10 parts by weight, per 100 parts by weight of the cultivars TRICODELMARBREX TR1047 and TR1048, Is preferably 3 to 7 parts by weight. The nutrient may be at least one selected from the group consisting of sucrose and fructose. The nutrient may be contained in an amount of 1 to 5 wt.% Based on 100 parts by weight of the cultivars TRICODELMARBIRES TR1047 and TR1048, %, Preferably 1.5 to 3.5 wt%. At this time, sucrose is a nutrient source of antagonistic antigens. It is believed that the flavor and taste of amino acid oil and olive oil are protected from ultraviolet rays by coating Tricodelma virans TR1047 and TR1048 and TR1048, and they act as an emulsifier which mixes the ingredients well.
본 발명의 제형화된 조성물은 식물병원성 진균에 대한 우수한 방제 효과를 가질 뿐만 아니라, 생체에 유해한 화학물질을 포함하지 아니하여 매우 안전하며, 실온에서 3개월 이상 장기간 보관하여도 미생물 개체수가 안정적으로 유지될 수 있어서 보관 안정성도 우수하다.The formulated composition of the present invention not only has a good control effect against phytopathogenic fungi but also does not contain chemicals harmful to living organisms and is very safe. Even if stored for 3 or more months at room temperature, the microorganism population is stable So that the storage stability is excellent.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 식물병원성 세균 및/또는 진균을 방제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방제 방법에 있어서, 상기 조성물의 적용 농도는 적용 대상 작물, 해충 분포 정도 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있으며, 일반적으로 10배 내지 1000배, 바람직하게는 100배 내지 500배로 희석되어 사용될 수 있다.In another aspect, the present invention provides a method of controlling phytopathogenic bacteria and / or fungi using the composition. In the controlling method of the present invention, the application concentration of the composition can be appropriately adjusted in consideration of the crop to be applied, the distribution of insect pests and the like, and is generally diluted to 10 to 1000 times, preferably 100 to 500 times Can be used.
본 발명의 방제 방법이 적용 가능한 식물병원성 진균은 Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum , Fusarium solani와 Pythium ultimum , Phytophthora capsici , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum, Sclerotium sp, Botrytis cinerea으로 구성된 군으로부터 선택된 한 가지 이상일 수 있다. 상기 방제 방법이 가능한 식물은 상기한 균, 특히, 균핵병과 흑색썩음균핵병이 발생하는 모든 식물체일 수 있으며, 예컨대, 상추, 쪽파, 토마토, 딸기 및 배추 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.The phytopathogenic fungus to which the present method of prevention is applicable is Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum , with Fusarium solani Pythium ultimum , Phytophthora capsici , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum, Sclerotium sp , Botrytis cinerea . < / RTI > The plants that can be used for the above-mentioned control method may be those selected from the group consisting of the above-mentioned bacteria, particularly all plants in which sclerotinia and black rot mycosis occur, such as lettuce, side waves, tomatoes, strawberries and cabbages.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 식물병원균에 대하여 방제 효과가 있는 것으로 선별된 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제공한다. 상기 식물 병원성 진균은 Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum , Fusarium solani와 Pythium ultimum , Phytophthora capsici , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum , Sclerotium sp, Botrytis cinerea으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일수 있다.In another aspect, the present invention provides a composition for controlling phytopathogenic fungi, which contains, as an active ingredient, Tricodelma virans TR1047 and TR108 strain selected as having a controlling effect against a plant pathogenic bacterium or a culture thereof do. The phytopathogenic fungi include Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum , Fusarium with solani Pythium ultimum , Phytophthora capsici , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum , Sclerotium sp , Botrytis cinerea . < / RTI >
상기 배양물은 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주를 CMA, SNA 배지에서 배양하여 얻어진 것일 수 있다. 또한, 당밀, 보리, PDA, 쌀겨에 대량배양하여 얻어진 것일 수 있다.The culture may be obtained by culturing Trichoderma virans strain TR1047 and TR10848 strain in a CMA or SNA medium. It may also be obtained by mass-culturing in molasses, barley, PDA or rice bran.
상기 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 또는 이의 배양물을 함유하는 조성물은 생체 고분자 물질, 보호제 및 영양물질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 생체 고분자 물질은 옥수수 전분, 변성전분, 타피오카 전분, 메주가루, 미강, 썬크리미, 썬텐더, 썬사이즈, 썰프리겔, 썬캡, 썬슈퍼겔, 썬배터, 및 제오실로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이고, 상기 보호제는 현미유 및 올리브유로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이며, 상기 영양물질은 수크로오스 및 프룩토오스로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.The composition containing the TRICODEL DEL BIRRENS TR1047 and TRICODELMADHANUM TR1048 or a culture thereof may further contain at least one additive selected from the group consisting of a biopolymer, a protective agent and a nutrient. The biopolymer material may be selected from the group consisting of corn starch, modified starch, tapioca starch, meju powder, rice bran, sun cream, suntaner, sunsize, low-pregel, sun cap, sun super gel, sun batters, At least one selected from the group consisting of sucrose and fructose, and the protective agent is at least one selected from the group consisting of brown rice oil and olive oil, and the nutrient may be at least one selected from the group consisting of sucrose and fructose.
바람직한 구체예에 있어서, 상기 조성물은 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주의 배양물, 및 상기 배양물 100 중량부에 대하여 타피오카전분 30 내지 50 중량부, 올리브오일 2 내지 10 중량부 및 수쿠로오스 1 내지 5 중량부를 포함하는 것일 수 있다.In a preferred embodiment, the composition comprises 30-50 parts by weight of tapioca starch, 2-10 parts by weight of olive oil, and 10-40 parts by weight of a culture of a strain of Trichoderma virans strain TR1047 and Trichoderma japonicum TR1048 and 100 parts by weight of the culture, And 1 to 5 parts by weight of sucrose.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같은 트리코델마 비렌스 TR1047과 트리코델마 하지아눔 TR1048 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum , Fusarium solani와 Pythium ultimum , Phytophthora capsici , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum , Sclerotium sp, Botrytis cinerea으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 식물병원성 진균의 방제 방법을 제공한다. 상기 방제 방법이 가능한 식물은 상기한 진균, 특히, 균핵병 및/또는 흑색썩음균핵병이 발생하는 모든 식물체일 수 있으며, 예컨대, 상추, 쪽파, 토마토, 딸기 및 배추 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.In another aspect, the present invention relates to a method for controlling phytopathogenic fungi, which comprises using the above-mentioned Tricodelma virans TR1047 and TR1048 strain or a culture thereof as an active ingredient, Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum , Fusarium with solani Pythium ultimum , Phytophthora capsici , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum , Sclerotium sp, Botrytis cinerea . < / RTI > The plants which can be used for the above-mentioned control method may be any of the above-mentioned fungi, particularly all plants in which scleroderma and / or black rot mycosis occurs, such as lettuce, side waves, tomatoes, strawberries and cabbages .
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1Example 1
균주의 분자생물적 동정Molecular identification of the strain
2균주의 DNA는 Edwards(1991)의 방법에 따라 추출하였다. PDA배지에 3일 배양된 Trichoderma 균사체를 백금이로 떼어내어 microtube(2ml)에 넣고 24시간 동결건조 시킨 후 균사를 고르게 분쇄하였다. Lysis buffer 500를 첨가하고 혼합하여 65에 1시간 반응시킨 후 CTAB 500를 넣어 65에 15분간 반응시켰다. PCI(phenol/chloroform/isoamylalcohol=25:24:1)를 첨가하여 원심분리한 후 상층액을 새로운 microtube에 옮겼다. Isopropanol를 첨가하여 DNA를 침전시키고 70% ethanol 1ml로 washing한 후 pellet을 건조시켰다. pellet을 100 TE buffer (10mM Tris HCl - pH 8.0, 1mM EDTA - pH 8.0)로 용해시킨 후 Rnase(10mg/ml) 2를 첨가하여 60에 30분간 반응시켰다. 추출한 DNA는 -70에 보관하여 실험에 사용하였다. DNA of two strains was extracted according to the method of Edwards (1991). Trichoderma mycelia cultured on PDA medium for 3 days were plated out with platinum, put in microtube (2 ml), lyophilized for 24 hours, and homogenized. Lysis buffer 500 was added, mixed and reacted for 1 hour at 65 ° C. Then, CTAB 500 was added to react at 65 for 15 minutes. After the addition of PCI (phenol / chloroform / isoamylalcohol = 25: 24: 1), the supernatant was transferred to a new microtube. Isopropanol was added to precipitate the DNA, followed by washing with 1 ml of 70% ethanol and drying the pellet. The pellet was dissolved in 100 TE buffer (10 mM Tris HCl - pH 8.0, 1 mM EDTA - pH 8.0), and Rnase (10 mg / ml) 2 was added and reacted at 60 for 30 min. The extracted DNA was stored at -70 and used for the experiment.
PCR 증폭 및 염기서열 분석은 rDNA상의 ITS1과 ITS2 영역에서 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCGCGG-3'), ITS2(5'-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3') primer를 사용하였고(White et al., 1990), Elongation factor-1a gene 영역에서는 EF1-728F(5'-CATCGAGAA GTTCGAGAAGG-3')와 EF1-986R(5'-TACTTGAAGGAACCCTTAC-3') primer를 사용하였다(Druzhinina et al., 2004). genomic DNA 100ng, primer 10pM, Tag DNA polymerase 0.25, 0.2mM dNTP 1, 10x buffer 2, 최종 volume을 50로 멸균수를 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94에서 4분간 denaturation한 후 94에서 1분간 denaturation, 56에서 1분간 annealing, 72에서 2분간 extention의 과정으로 30주기를 실시하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel에 전기영동을 한 후 ethidium bromide로 염색하여 확인하였으며, marker로 100bp DNA ladder를 사용하였다. 이후 PROMEGA PCR Clean-up system kit를 사용하여 정제한 후 sequencing을 하고 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST 검색을 통해 기존의 DNA 염기서열과 비교, 분석하여 정렬하였다. (도 1, 도2) PCR amplification and sequencing were performed using ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCGCGG-3 ') and ITS2 (5'-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3') primers in the ITS1 and ITS2 regions on rDNA (White et al., 1990) EF1-728F (5'-CATCGAGAA GTTCGAGAAGG-3 ') and EF1-986R (5'-TACTTGAAGGAACCCTTAC-3') primers were used in the factor-1a gene region (Druzhinina et al., 2004). PCR was carried out by adding 100 ng of genomic DNA, 10 pM of primer, 0.25 of Tag DNA polymerase, 0.2
선발된 5균주의 ITS 영역과 Elongation factor-1a 영역의 염기서열을 분석한 결과, TR1047과 TR1115 균주는 각각 T. virens와 T. asperellum, TR1048, TR1050, TR1085 균주는 모두 T. harzianum으로 동정되었다. (도 1, 도2)
T. virens , T. asperellum , TR1048, TR1050, and TR1085 strains were identified as T. harzianum in the TR1047 and TR1115 strains, respectively, in the ITS region and elongation factor-1a region of 5 selected strains. (Figs. 1 and 2)
실시예 2Example 2
균주의 형태적 특성 조사Investigation of morphological characteristics of strains
TR1047, TR1048균주를 CMD(corn meal agar + 2% dextrose, Difco)배지에서 20에 2일간 배양하였다. 멸균된 슬라이드 글라스를 50 물한천 배지에 담궈 코팅한 후 물한천 평판배지에 올려 plate를 준비하였다. 준비된 plate의 슬라이드 글라스 위에 선발된 5균주의 균사를 이식하여 25에 5일간 배양한 후 광학현미경하에 분생자경 및 포자의 형태와 크기를 조사하였다. TR1047 and TR1048 were cultured in CMD (corn meal agar + 2% dextrose, Difco) medium at 20 for 2 days. The sterilized slide glass was immersed in 50 water agar medium, coated, and placed on agar plate medium to prepare a plate. Five strains of mycelia were transplanted onto the slide glass of the prepared plate and cultured for 25 days. The shape and size of the sporangia and spores were examined under the light microscope.
결과는 도3에 도시하였다.
The results are shown in Fig.
실시예 3Example 3
균주의 배양적 특성 조사Investigation of culture characteristics of strain
가. 배양온도end. Incubation temperature
선발된 2균주의 배양온도(5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 32, 35, 38, 40)에 따른 균사생장을 조사하기 위하여 20ml의 멸균수에 Trichoderma 균사를 넣어 현탁한 후 PDA 배지에 200씩 도말하여 25에 1일 배양하였다. 배양된 Trichoderma 균총을 직경 5mm 코르크 보러(Cork borer)로 떼어내어 PDA배지 가운데에 치상하고 각 온도별로 48시간 배양한 후 선발균주 균총의 직경을 조사하였다.
In order to investigate mycelial growth according to the culture temperatures (5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 32, 35, 38, 40) of the two selected strains, Trichoderma hyphae were suspended in 20 ml of sterilized water, 200 cells were plated on PDA medium and cultured for 25 days. The cultured Trichoderma fungus was detached with a 5 mm diameter cork borer and dentated in the PDA medium. After culturing for 48 hours at each temperature, the diameter of the starting strain was examined.
48시간배양, PDA배지
48 hours culture, PDA medium
나. pHI. pH
선발된 2균주의 pH(3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0)에 따른 균사생장을 조사하기 위하여 20ml의 멸균수에 Trichoderma 의 포자를 넣어 현탁한 후 PDA 배지에 200씩 도말하여 25에 1일 배양하였다. 배양된 Trichoderma 균총을 직경 5mm 코르크 보러(Cork borer)로 떼어내어 PDA배지 가운데에 치상하고 25에 40시간 배양한 후 선발균주 균사의 직경을 조사하였다.
In order to investigate the mycelial growth of the selected strains according to pH (3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0), Trichoderma spores were added to 20 ml of sterilized water, The cells were cultured on a PDA medium at 200 rpm for 25 days. The cultured Trichoderma fungus was detached with a 5 mm diameter cork borer and placed in the PDA medium. After culturing for 25 to 40 hours, the diameter of the selected strain was examined.
25도, PDA배지 이용하여 40시간후 균총직경 조사(mm).
25 degrees, after 40 hours using the PDA medium, the diameters of the culture media (mm).
다. All. 배지종류Badge type
선발된 2균주의 배지에 따른 균사생장과 포자형성량을 조사하기 위하여 CMD배지에서 20에 2일간 배양하였다. 배양된 Trichoderma 균총을 직경 5mm 코르크 보러(Cork borer)로 떼어내어 PDA, CMD, MEA(malt extract agar, Difco), SNA(Nirenberg, 1976)배지 가운데에 치상하고 온도(15, 20, 25, 30, 35)별로 배양하였다. 실험은 4반복을 하였으며 배양 48시간 후 균총의 직경을 조사하였다.
In order to investigate the mycelial growth and spore formation according to the selected strains, CMD medium was cultured at 20 for 2 days. The cultured Trichoderma fungus was detached with a 5 mm diameter Cork borer and dipped in the medium of PDA, CMD, MEA (malt extract agar, Difco) and SNA (Nirenberg, 1976) 35). The experiment was repeated 4 times and the diameter of the microflora was examined after 48 hours of incubation.
실시예 4
Example 4
식물병원균에On plant pathogens
미치는 영향 Impact
가. 균사 생육 억제 및 end. Mycelial growth inhibition and 균핵형성Sclerotization 조사 Research
Trichoderma 속균에 대하여 토양전염성병원균 Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum , Fusarium solani와 Pythium ultimum , Phytophthora capsici 는 25의 항온기내에서, 그리고 Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum , Sclerotium sp, Botrytis cinerea는 직경 88mm의 페트리디쉬에 분주한 PDA배지에 각각의 균총을 대치배양하여 20의 항온기내에서 20일간 배양하여 균사생육 및 균핵형성 여부를 조사하였다.
A soil-infectious pathogen Rhizoctonia against Trichoderma sp. solani , Fusarium oxysporum , Fusarium solani and Pythium ultimum , Phytophthora The capsici was incubated in 25 thermostats, and Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor, Sclerotium cepivorum , Sclerotium sp , Botrytis Cinerea was cultured in a thermostat for 20 days in a PDA medium, which had been placed in a 88 mm diameter Petri dish, and cultured for 20 days to investigate mycelial growth and sclerotial formation.
나. I. 균핵기생성Sclerogenesis 검정 black
Sclerotinia sclerotiorum 등 7균주를 보리배지에 20에서 15일간 배양후 균핵을 수거 하여 5에서 10일간 보관 후 분리 균주의 포자현탁액을 제조하여 균핵을 침지한 20초 후에 처리한 균핵을 WA(물한천배지)배지에 10개씩 치상하여 3반복으로 20 항온기에 보관하면서 균핵의 감염여부를 해부현미경과 칼로 절단하여 기생성을 조사하였다.
Sclerotinia sclerotiorum were cultivated in barley medium for 20 to 15 days. Sclerotiae were collected and stored for 5 to 10 days. Spore suspension of the isolate was prepared. Sclerotia treated 20 sec after immersion of sclerotin was suspended in WA (water agar medium) , And were kept in a 20 ° C incubator for 3 repetitions. The incidence of sclerotia infection was examined by dissecting with a dissecting microscope and a knife.
균주별 균사 생육 억제 Trichoderma genus
Mycelial growth inhibition by strain
균주별 균핵 형성 억제 Trichoderma genus
Inhibition of sclerotial formation by strain
균주별 균핵에 기생 Trichoderma genus
Parasitic
Trichoderma 속균의 식물병원균 생육에 대한 영향 조사
Trichoderma Investigation of the effect of bacterium on the growth of plant pathogens
: 억제 또는 기생.
: Inhibition or parasitism.
실시예 5Example 5
선발균주의Of the starting strain
균핵병균(Sclerotinia
Sclerotinia sclerotiorumSclerotinia sclerotiorum
)의)of
균핵에 대한 온도별 By scintillation temperature
기생력Parasitic power
검정 black
선발된 2균주를 PDA배지에서 25에 15일간 배양하여 포자현탁액을 만든 후 헤모사이토미터를 통해 5x106 spores/ml의 농도로 조절하였다. S. sclerotiorum의 균핵을 각 선발균주의 포자현탁액에 30초간 침지한 후 물한천 배지에 10개씩 치상하여 15, 20, 25, 28, 30에 배양하였다. 실험은 4반복을 하였고 30일 후 균핵의 상태를 조사하였다.The two selected strains were cultured in PDA medium for 25 days at 15 days, and spore suspension was prepared and then adjusted to a concentration of 5 × 10 6 spores / ml through a hemocytometer. Sclerotia of S. sclerotiorum was immersed in spore suspensions of each of the selected strains for 30 seconds and then cultured on water agar medium at 10, 15, 20, 25, 28, 30 days. The experiment was repeated 4 times and the condition of sclerotia was examined after 30 days.
결과는 도 5에 도시하였다.
The results are shown in Fig.
실시예 6
Example 6
균주의 온도별 포자 발아율 조사 Investigation of spore germination rate by temperature of strain
Trichoderma 2균주의 포자현탁액을 5x105/, 1x106/, 5x106/로 희석하여, 0.25ml/페트리디쉬 씩 물한천배지에 분주하여 도말하여 온도별 배양 14시간 후 포자 발아율을 조사하였다.Spore suspension of Trichoderma 2 strain was diluted to 5 × 10 5 /, 1 × 10 6 /, and 5 × 10 6 /, and 0.25 ml / petri dish was added to water agar medium and sprout germination rate was measured after 14 hours incubation at temperature.
결과는 도 6과 도 7에 도시하였다.
The results are shown in FIG. 6 and FIG.
실시예 7
Example 7
광의 영향 조사 Investigation of light effect
Trichoderma 2균주의 광 종류별 균사생장을 조사하기 위하여 PDA배지에서 2일간 배양한 Trichoderma 균총을 직경 5mm 코르크 보러(Cork borer)로 떼어내어. PDA배지 이랫부분에 치상하고 광은 형광등과 NUV을 12시간 교대로 광처리하였으며, 암처리는 알미늄호일로 싸서 25에서 40시간 배양한 후 선발균주 균총의 직경을 조사하였다.
To investigate the optical type mycelial growth of the Trichoderma strain 2 were removed for 2 days culture the Trichoderma colony on PDA medium with a diameter of 5mm to see cork (Cork borer). The diameter of the selected strain was examined after incubation for 25 to 40 hours with wrapping with aluminum foil.
5% level by DMRT.
5% level by DMRT.
실시예 8
Example 8
TrichodermaTrichoderma
속균의Bacterium
대량배양 방법 개발 Development of mass culture method
여러 부산물을 이용하여 TR1047, TR1048균주의 대량배양을 위하여 PDA배지에서 배양한 직경 5mm 균총을 각 종류별 평판배지에 치상 후에 25에서 72시간 배양 3일후 균총의 직경 조사하였다.
For the mass culture of TR1047 and TR1048 by using various byproducts, 5 mm diameter microflora cultivated in PDA medium was examined on the plate culture media of each kind after the fermentation for 25 to 72 hours after the fermentation.
실시예 9
Example 9
CellulaseCellulase
생성 여부 조사 Investigation of creation
PDA배지에서 생육한 기생성곰팡이의 5mm 균총을 cellulose 함유 배지에 치상한 후 20에서 배양한 후 0.5% congo red 시약으로 각각의 배지를 30분간 염색하고 1M NaCl 용액으로 충분히 헹군 뒤 투명환 생성 여부를 조사하였다.
Cells were incubated at 20 ° C for 5 min with a 5 mM culture medium grown on PDA medium. Cells were cultured at 20 ° C. Cells were stained with 0.5% congo red for 30 min and rinsed thoroughly with 1 M NaCl solution. Respectively.
Tryptone ........................................................... 5.0g
Yeast extract ................................................... 5.0g
CaCl2 ................................................................ 1.0g
Agar ................................................................. 20.0gCM-cellulose ............................................... ..... 5.0g
Tryptone ................................................. .......... 5.0g
Yeast extract ................................................ ... 5.0g
CaCl2 ................................................. ............... 1.0 g
Agar ................................................. ................ 20.0g
배지 조성
Medium composition
실시예 10
Example 10
TrichodermaTrichoderma
균주의 Strain
식물병Plant disease
방제 효과 검정 Control Effectiveness
(1) (One)
분리균주의Isolate
상추 균핵병에 대한 방제효과 검정 Effect of controlling the control of lettuce sclerotinia
적축면상추(선풍포찹) 종자를 바로커상토와 원예육묘상토를 1:1 비율로 혼합하여 넣은 50공 트레이포트에 30주씩 파종한 후 본엽이 3엽기가 전개될 때 실험하였다. 균핵병균은 보리배지에 40일간 배양하여 균핵을 형성시켰다. S. sclerotiorum의 균핵에 대한 기생력이 우수 Trichoderma 7균주는 PDA배지에 15일간 배양하여 포자현탁액을 만든 후 헤모사이토미터를 통해 5x106 spores/ml의 농도로 조절하였다. 그리고, 상추 1포기당 균핵병균을 배양한 보리 2알을 토양에 접종하고 Trichoderma 균주별로 포자현탁액을 상추 1포기당 5ml씩 관주하였다. 균핵병 발생조사는 처리 10일 후 이병주율로 조사하였다. The experiment was conducted when the third leaf stage was developed after 30 weeks' sowing in a 50 - tray tray pot mixed with a 1: 1 ratio of the lettuce and lettuce seeds. Sclerotinia were cultivated in barley medium for 40 days to form sclerotia. Excellent parasitic power against sclerotia of
분리균주의 균핵병 방제 효과
Effect of isolated strains on the control of scleroderma
(2) (2)
선발균주의Of the starting strain
상추 균핵병에 대한 방제효과 검정 Effect of controlling the control of lettuce sclerotinia
적축면상추(선풍포찹) 종자를 바로커상토와 원예육묘상토를 1:1 비율로 혼합하여 넣은 50공 트레이포트에 30주씩 파종한 후 본엽이 3엽기가 전개될 때 실험하였다. 균핵병균은 보리배지에 40일간 배양하여 균핵을 형성시켰다. 상추균핵병에 방제효과가 우수한 Trichoderma 2균주는 PDA배지에 15일간 배양하여 포자현탁액을 만든 후 헤모사이토미터를 통해 1x106 spores/ml과 5x106 spores/ml의 농도로 조절하였다. 그리고, 상추 1포기당 균핵병균을 배양한 보리 2알을 토양에 접종하고 Trichoderma 균주별로 포자현탁액을 상추 1포기당 5ml씩 관주하였다. 균핵병 발생조사는 처리 12일후 이병주율로 조사하였다.
The experiment was conducted when the third leaf stage was developed after 30 weeks' sowing in a 50 - tray tray pot mixed with a 1: 1 ratio of the lettuce and lettuce seeds. Sclerotinia were cultivated in barley medium for 40 days to form sclerotia. Superior control effect of lettuce sclerotinia 2 Trichoderma strains was made after adjusting the spore suspension and cultured 15 days in a PDA medium through hemo cytometer to 1x10 6 spores / ml and 5x10 6 spores / ml concentration. Then, the inoculated barley Al 2 gyunhaekbyeong culturing bacteria per 1 lettuce in soil and the spore suspension was 5ml per infusion by giving 1 lettuce by Trichoderma strains. The incidence of scleroderma was investigated at 12 days after treatment.
선발 균주의 균핵병 방제 효과Effect of selective strains on the control of scleroderma
(2) 쪽파 (2)
흑색썩음균핵병Black decay scleroderma
발생 억제효과 조사 Investigation of the inhibitory effect
Trichoderma 2균주는 대량배양한 시제품을 사용하였다. 처리구당 면적은 2.4㎡이며, 모든 처리는 3반복으로 파종하였다. Trichoderma 균주는 대량배양한 시제품 T. virens TR1047 (7.5×108cfu/g), T. harzianum TR1048 (8.4×108cfu/g)을 쪽파 종구에 습분의(10g/종구 kg)한 후에 파종하였다. 대조구로 화학약제 플로퀀코나졸수화제를 2g/kg(쪽파종구)으로 분의처리하여 파종하였다. 상품성이 없는 병든 쪽파를 제외하고 전처리구의 수량을 조사하였다.
The Trichoderma 2 strain was used as a prototype. The area per treatment was 2.4 m 2, and all treatments were sown in three replicates. The Trichoderma strain was inoculated after the mass cultured T. virens TR1047 (7.5 × 10 8 cfu / g) and T. harzianum TR1048 (8.4 × 10 8 cfu / g) . As a control, the chemical drug Florenconazole wettable powder was sowed by treatment with 2 g / kg (side wave). The quantity of pretreatment waters was investigated except for the sickly sappan which had no commerciality.
(Kg)In building
(Kg)
TrichodermaTrichoderma
속균Mycelium
처리한 쪽파의 Treated side wave
흑색썩음균핵병Black decay scleroderma
발생 억제 효과 및 And
건물중In building
실시예 11
Example 11
작물 생육촉진에 미치는 영향 조사Survey on the effect of crop growth promotion
토마토(서광품종)와 고추(마니따) 종자를 50공 트레이포트에 파종하여 Tr1047과 Tr1048의 포자현탁액(5×106/㎖)을 주당 7일 간격으로 10㎖씩 6회 관주처리하여 처리 45일후 생육을 조사하였다. Tomato seedlings and red pepper seeds were sown on a 50-tray tray, and spore suspension (5 × 10 6 / ml) of Tr1047 and Tr1048 was treated with 10 ml each at 7-day intervals per week for 6 times. After 45 days of treatment Growth was investigated.
토마토(tomato(
서광품종Seokwang variety
))
고추(pepper(
마니따Mani Ta
))
본 발명의 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제제는 뛰어난 방제 활성을 나타내므로, 그간 사용되어온 화학농약을 대체하여 유효한 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제제로 이용될 수 있다. 본 발명의 균핵병과 흑색썩음균핵병 방제제는 토양오염, 인체에 대한 독성 문제를 해결할 수 있는 친환경 방제제로서 사용될 수 있고, 그간 화학농약에 내성을 나타내던 균핵병과 흑색썩음균핵병에도 사용될 수 있다.
Since the sclerotinia and black rot mycotic disease control agents of the present invention exhibit excellent control activity, they can be used as an effective sclerotinia and black rot fungicide prevention agent instead of chemical pesticides that have been used in the past. The sclerotinia and black rot mycotic disease controlling agent of the present invention can be used as an environmentally friendly antiseptic agent for solving soil pollution and human toxicity problems and can be used for sclerotinia and black rot mycorrhiza which have resistance against chemical pesticides.
Claims (5)
수탁번호 KACC93157P로 수탁된 트리코델마 비렌스 TR1047 또는 수탁번호 KACC93158P로 수탁된 트리코델마 하지아눔 TR1048.
Sclerotium cepivorum , Botrytis cinerea , Sclerotinia sclerotiorum , Sclerotinia minor , Sclerotinia spp ., Sclerotium spp . , The growth of sclerotia and mycelium is inhibited by parasitization of sclerotia of plant pathogenic bacteria Which is characterized by having the ability to generate cellulase while having a dragging power against scleroderma and black rot mycosis,
TRICO DELMARBINES TR1047 entrusted with accession number KACC93157P or TRICO DELMASHANUM TR1048 entrusted with accession number KACC93158P.
A TRICODELMAVIRUS TR1047 strain deposited with the accession number KACC93157P of claim 1 or a TRICODELMAHANUM TR1048 strain deposited with the accession number KACC93158P and a culture solution of these strains as an active ingredient for scleroderma and black decaying scleroderma Microbial agent
The microorganism preparation according to claim 2, wherein the microbial agent further comprises at least one additive selected from the group consisting of a biopolymer, a protective agent and a nutrient.
상기 배지의 탄소원으로 보리를 포함하며, 암처리상태에서 배양하는 것이 특징인,
균핵병 및 흑색썩음균핵병 방제용 미생물 제제의 대량생산방법.
In the CMD medium consisting of cornmeal agar and 2% dextrose, the culture temperature was 25 to 30, the pH was 5.5 to 6.5, Incubation time is from 36 hours to 52 hours,
Characterized in that the culture medium contains barley as a carbon source of the culture medium and is cultured under a cancer treatment condition.
Methods for mass production of microbial agents for sclerotinia and black rot fungi.
Priority Applications (1)
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