KR101786013B1 - 형광검출-모세관 전기영동을 이용하여 단백질 키나제 c 저해제를 스크리닝하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

PKC의 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝하기 위한 CE-LIF 시스템 및 방법에 의하면 PKC의 활성을 변화시키는 물질을 효율적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

형광검출-모세관 전기영동을 이용하여 단백질 키나제 C 저해제를 스크리닝하기 위한 시스템 및 방법{System and method for screening protein kinase C inhibitor using Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence}
본 발명은 형광검출-모세관 전기영동을 이용하여 단백질 키나제 C 저해제를 스크리닝하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC)는 세포 외 신호 조절 인산화 효소(extracellular signal-regulated kinase: ERK) 단백질을 인산화시키는 것으로 ERK 경로의 활성에 관여한다. ERK는 유사분열-활성화 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinase: MAPK) 일종으로 유사분열, 감수분열 등의 조절에 참여하는 효소로 알려져 있다. 특히 암세포에서는 ERK 경로가 붕괴되는 것이 일반적이며, 따라서 항암 치료의 표적으로 연구되고 있다.
이에, 기존의 항암 치료제 스크리닝에서는 PKC에 의해 소모된 ATP 또는 생성된 ADP를 측정하는 것으로 PKC 저해제를 스크리닝하였다. 그러나 이러한 방법은 간접적으로 PKC의 활성을 측정하는 것으로 그 민감도와 정확도가 낮고, 검색시간이 오래 걸리는 단점이 있었다.
일 양상은 PKC, PKC의 기질(substrate), ATP 및 버퍼를 포함하는, PKC의 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝하기 위한 형광검출-모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF) 시스템을 제공한다.
다른 양상은 단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC), PKC의 기질(substrate), ATP, 버퍼 및 후보물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 접촉시키는 단계 이후의 PKC에 의한 기질의 인산화 반응 산물의 수준을 형광검출-모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF)을 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 PKC의 활성을 변화시키는 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 PKC, PKC의 기질(substrate), ATP 및 버퍼를 포함하는, PKC의 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝하기 위한 형광검출-모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF) 시스템을 제공한다.
단백질 키나제 C(protein kinase C)는 세린 또는 트레오닌 아미노산 잔기의 히드록실기를 인산화하는 단백질 키나제 효소 패밀리에 속하는 단백질이다. PKC의 동형 단백질(isoform)은 α, βI, βII, γ, δ, ε, η, θ, ι 및 ξ을 포함한다. PKC는 NCBI Accession No: NP_001303256 또는 XP_006713321의 서열을 갖는 PKC δ일 수 있다. 본 명세서에 있어 PKC는 천연적으로 존재하는 PKC 및 그의 인산화 활성이 존재하는 변이체를 포함하는 것으로 해석된다.
상기 PKC의 기질은 PKC가 인산화시킬 수 있는 세린 또는 트레오닌 아미노산 잔기를 포함하는 단백질을 포함할 수 있다. 또한 상기 PKC의 기질은 ERK, ERK의 일부 서열을 포함하는 펩티드 또는 ERK의 단편을 포함할 수 있다. 상기 PKC의 기질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 T와 Y가 인산화된 것인 펩티드 또는 ERK 단백질을 포함할 수 있다.
상기 PKC의 기질은 검출을 위한 라벨링(labeling)이 된 것일 수 있다. 상기 라벨링은 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 효소 표지, 또는 그 조합을 이용하여 수행된 것일 수 있다. 상기 광학적 표지는 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오레세인(fluorescein), 로다민, 시아닌, 금속 포르피린 복합체, Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 상기 플루오레세인 염료는 6-카르복시플루오레세인(6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인(TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민(JOE), 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인, 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인, 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 포함할 수 있다. 상기 효소 표지는 기질을 발색 물질로 전환하는 것일 수 있다.
상기 버퍼는 용도에 따라 검출 분석을 위한 버퍼, 효소 반응을 위한 버퍼, 또는 세포 용해를 위한 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 버퍼들은 당업계에서 통상적으로 사용되고 상업적으로 구입 가능한 버퍼들일 수 있다. 상기 분석을 위한 버퍼는 MOPS(3-(N-morpholino)propane sulfonic acid), DW (distilled water), H3PO4, 소듐 포스페이트, 보릭산(Boric acid) 및 CAPS(N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid)을 포함할 수 있다. 상기 CAPS의 농도는 0.1 M 내지 2M, 0.5 M 내지 1.5 M, 0.8 M 내지 1.1 M, 또는 0.9 M 내지 1.1 M일 수 있다. 상기 버퍼의 pH는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15, 또는 pH 1 내지 15 사이의 모든 값을 가질 수 있다. 상기 검출 분석을 위한 버퍼의 pH는 9 내지 13, 10 내지 12, 또는 약 11일 수 있다. 상기 검출 분석을 위한 버퍼는 베타인을 더 포함할 수 있다. 상기 베타인은 0.5 M 내지 1.5 M의 농도로 상기 버퍼에 포함될 수 있다.
상기 CE-LIF 시스템은 PKC 활성화제를 더 포함할 수 있다. PKC 활성화제는 DAG, PS, 이들의 유도체 또는 1-올레일-2-아세틸-sn-글리세롤과 같은 이들의 유사체 등의 지질 활성화제를 포함할 수 있다.
상기 CE-LIF 시스템은 세포를 더 포함할 수 있다. 상기 세포는 PKC 활성화제를 포함하는 세포일 수 있다. 상기 세포는 인간 유래 세포, 또는 인간 유래 암세포일 수 있다. 상기 인간 유래 암세포는 MKN-1 또는 MKN-45 세포주일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형광검출-모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF)"은 모세관 전기영동을 이용하여 분자를 분리한 후, 분리된 분자들에 빛을 조사한 후 방출되는 형광을 이용하여 분자를 검출하는 것을 의미한다.
모세관 전기영동은 전기장에 의해 이온들이 이동하는 현상을 이용하여 전하를 갖는 시료를 모세관에서 분리하는 방법이다. 모세관 전기영동은 당업계에 공지된 방법 및 기기를 이용하여, 기기의 제조사의 메뉴얼에 따라 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 일반적인 전기영동에 비해 신속하고, 효율적이며, 높은 민감성과 재현성을 가지고, 적은 시료의 양으로도 수행할 수 있는 장점이 있다. 그러나 사용되는 버퍼의 종류, 농도, pH, 모세관의 길이, 및 두께 등의 조건에 따라 동일한 시료라 할지라도 결과가 전혀 다르게 나올 수 있다.
모세관 전기영동으로 시료를 분리한 후, 분리된 시료를 UV 검출, 형광 검출, 또는 MS 검출 등의 방법을 이용하여 분리 결과를 측정할 수 있다. 상기 검출 방법은 당업계에 공지된 방법 및 기기를 이용하여, 기기의 제조사의 메뉴얼에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 형광 검출은 모세관에 중수소 램프를 이용하여 UV를 조사한 후, 시료로부터 방출되는 형광 파장을 광전자증배관(photomultiplier)으로 증폭하여 검출하는 방법으로 수행할 수 있다.
다른 양상은 PKC, PKC의 기질, ATP, 버퍼 및 후보물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 접촉시키는 단계 이후의 PKC에 의한 기질의 인산화 반응 산물의 수준을 CE-LIF를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 PKC의 활성을 변화시키는 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 접촉시키는 단계는 상기 PKC, PKC의 기질, ATP, 버퍼 및 후보물질과 세포를 접촉시키는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 세포는 PKC 활성화제를 포함하는 세포일 수 있다. 상기 세포는 인간 유래 세포, 또는 인간 유래 암세포일 수 있다. 상기 인간 유래 암세포는 MKN-1 또는 MKN-45 세포주일 수 있다.
또한 상기 접촉시키는 단계는 상기 PKC, PKC의 기질, ATP, 버퍼 및 후보물질과 PKC 활성화제를 접촉시키는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 측정된 인산화 반응 산물의 수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 인산화 반응 산물 수준과 비교하여 감소한 경우, 상기 후보물질을 항암 치료제 후보물질로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
위암, 유방암, 폐암, 췌장암, 대장암을 포함하는 암의 치료제 또는 심혈관질환(급성심근경색, 협심증)의 치료제를 스크리닝하는 단계에서, 암 또는 심혈관질환의 발생 및 진행에 PKC에 의한 ERK 경로가 관여하고 있음이 널리 알려져 왔으며, 이에 PKC와 ERK의 결합을 저해하는 물질이 치료제 후보물질로서 선별되어 왔다. 따라서, 상기 방법으로 스크리닝한 PKC의 활성을 변화시키는 물질은 항암 치료 후보물질 또는 심혈관질환의 치료 후보물질로 결정할 수 있다.
또한 상기 PKC 활성의 변화는 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하거나, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 99% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.
또한 상기 스크리닝하는 방법은 상기 후보물질의 농도를 변화시키며 반복 수행하여, 다양한 농도의 후보물질의 PKC의 활성에 대한 영향을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또한 상기 스크리닝 방법은 상기 후보물질의 농도별 저해 정도를 측정하여, 후보물질의 IC50을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
상기 인산화 반응 산물의 수준은 인산화 산물을 직접적으로 측정하거나, 또는 인산화 반응을 하지 않고 남은 기질의 수준을 측정하여 간접적으로 측정하는 것으로 수행할 수 있다.
상기 방법은 ATP 감소, ADP 증가를 측정하는 간접측정이 아닌, 기질과 산물의 직접적인 측정이어서, 반응 저해 정도를 정확하게 측정할 수 있다는 점, 면역학적 어세이법에 비해 고가의 항체가 필요 없다는 점, 특히, 항체의 검출 펩티드에 대한 친화도에 따른 영향을 받지 않는다는 점 및 분석시간이 약 30분으로 현저하게 짧다는 점에서 장점이 있다.
상기 진단하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 다른 양상에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은 이미 언급된 설명과 같다.
일 양상에 따른 PKC의 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝하기 위한 CE-LIF 시스템을 이용하면 PKC의 활성을 변화시키는 물질을 효율적으로 스크리닝할 수 있다.
다른 양상에 따른 PKC의 활성을 변화시키는 후보물질을 스크리닝하는 방법에 의하면 PKC의 활성을 변화시키는 물질을 효율적으로 스크리닝할 수 있다.
도 1은 PKC의 인산화 기질로 사용된 펩티드들의 서열 및 구조를 나타낸다.
도 2는 MKN-1 세포에 F-ERK 단독, FAM-Crebtide 또는 F-ERK에 PKC와 ATP를 함께 첨가한 것을 6시간 반응시킨 후 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하여 항-P-ERK 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅한 결과이다.
도 3은 버퍼의 전기적 흐름의 안정성을 측정하기 위한 Ohm's plot 결과이다. 1 M 베타인(pH 11)을 포함한 100 mM CAPS 버퍼에 전기의 전압을 5 kV에서부터 30 kV까지 5 kV씩 올려가면서, 2분 동안의 전기적 흐름의 안정성을 측정한 결과이다. 10 kV에서 가장 안정적인 결과를 보였다.
도 4는 버퍼의 종류 및 pH의 변화에 따른 형광이 부착된 기질의 안정성과 흡광도를 정량분석한 결과이다.
도 5a는 기질인 F-ERK를 용매 DMSO에 용해시켜 CE-DAD로 분석한 기질의 피크를 나타낸다. 검출기를 DAD로 사용하였을 때 DMSO의 검출피크가 매우 커, 기질의 검출감도가 현저히 떨어진다. 도 5b는 기질인 F-ERK를 1 M 베타인이 함유된 100 mM CAPS (pH 11)로 용해하여 CE-DAD로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6a는 기질인 F-ERK와 그 산물인 P-F-ERK의 표준물질을 1 M 베타인이 함유된 100 mM CAPS (pH 11)로 용해하여 CE-LIF로 분석한 결과이다. F-ERK는 약 6.9 ± 0.05분, P-F-ERK는 8.7 ± 0.02분의 이동시간을 보였다. 도 6b는 F-ERK 표준물질의 농도에 따른 피크 높이의 정량 곡선을 나타낸다. 도 6c는 P-F-ERK 표준물질의 농도에 따른 피크 높이의 정량 곡선을 나타낸다.
도 7은 F-ERK를 여러 종류의 버퍼와 pH로 측정한 전기영동도(Electropherogram)이다. 도 7a는 100 mM 보레이트(Borate)(pH 9.3)로, 도 7b는 100 mM CAPS(pH 10.0), 도 7c는 100 mM CAPS(pH 11.0), 그리고 도 7d는 1 M 베타인이 함유된 100 mM CAPS (pH 11)로 분석한 결과이다. 버퍼의 pH를 9.3에서 10로 증가시켰을 때, 검출피크의 절대적인 크기가 2배 증가하였다. pH를 10에서 11로 증가시켰을 때 부가적으로 검출피크의 절대적인 크기가 4배 증가하였다. 베타인을 함유한 버퍼를 사용했을 때는 검출 피크의 크기는 변화하지 않았다.
도 8은 버퍼의 종류와 pH에 따른 이온 크로마토그램의 이론단수와 평균 이동시간이다. 버퍼의 pH를 9.3에서 10으로 증가시켰을 때, 이론단수가 3배 증가하였고, pH를 10에서 11로 증가시켰을 때 이론단수가 2.5배 증가하였다. 베타인을 함유한 버퍼를 사용했을 때는 검출 피크나 이론단수에는 변화가 없었고, 이동시간의 안정도가 40% 이상 향상되었다.
도 9는 MKN-1 세포에 FITC가 라벨링된 ERK를 6시간 동안 인큐베이션한 후 생성된 P-F-ERK 시료와 표준물질 시료를 비교한 결과이다. 도 9a는 PKC 저해제 없이 줄어든 F-ERK와 생성된 P-F-ERK 의 피크(black line)를 어세이 반응 이후에 첨가한 표준품(red line)과 함께 보여주고 있다. 도 9b는 PKC 저해제인 Goe 6983으로 인산화 반응을 억제한 결과이다. 도 9c는 PKC 저해제인 스타우로스포린(Staurosporin)으로 인산화 반응을 억제한 결과이다. 도 9d는 PKC 저해제인 비스인돌릴말레이미드 Ⅱ(Bisindolylmaleimide Ⅱ)으로 인산화 반응을 억제한 결과이다. 도 9e는 PKC 저해제인 로틀레린(Rottlerin)으로 인산화 반응을 억제한 결과이다.
도 10은 PKC 저해제들의 IC50 값을 계산하기 위해 5가지의 다른 농도를 사용하여 형성된 인산화 산물을 CE-LIF로 측정한 결과이다. 도 10a는 Goe6983, 10b는 스타우로스포린, 10c는 비스인돌릴말레이미드 Ⅱ, 10d는 로틀레린을 이용하여 PKC 반응을 억제한 결과를 측정한 전기영동 결과이다.
도 11은 PKC 저해제들의 농도에 따른 PKC δ 저해 능력 곡선(%)을 나타낸다. 도 11a는 Goe6983, 11b는 스타우로스포린, 11c는 비스인돌릴말레이미드 Ⅱ, 11d는 로틀레린으로 PKC 반응을 억제한 경우 측정한 IC50이다.
도 12는 상업적으로 판매하는 ELISA Kit를 이용하여 측정한 PKC 저해제들의 농도에 따른 PKC δ 저해 능력 곡선(%)을 나타낸다. 도 12a는 Goe6983, 12b는 스타우로스포린, 12c는 비스인돌릴말레이미드 Ⅱ, 12d는 로틀레린으로 PKC 반응을 억제한 결과를 IC50 측정곡선으로 표시한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. PKC 델타 저해 효과를 갖는 신약 항암제 후보물질의 스크리닝
1. 실험 재료 및 방법
(1) 버퍼 준비
모세관 전기영동-레이저 유도 형광(Capillary electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF) 분석을 위한 버퍼는 다음과 같이 제조하였다. 먼저 1 M 베타인(Betaine)을 포함하는 1 M N-시클로헥실-3-아미노프로판설포닉산(N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid: CAPS, pH 11)을 0.2 μm 공극 크기의 막에 통과시켰다. 이후 초음파 처리로 가스를 제거한 후 사용하였다.
단백질 키나제 C(Protein kinase C: PKC) 반응 버퍼는 25 mM 3-모르폴리노프로판-1-설포닉산(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid: MOPS), 12.5 mM β-글리세롤포스페이트(β-glycerolphosphate), 25 mM MgCl2, 및 5 mM EDTA를 섞어 준비하였다. pH는 NaOH를 사용하여 7.2로 맞추었고, 사용 직전에 0.25 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 첨가하였다.
TNN-EDTA 용해 버퍼는 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% NP40(Nonidet P-40), 1 mM EDTA, 및 200 mM Na3VO4로 만들었고, Protease Inhibitor cocktail(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)를 첨가하여, 세포를 용해시켜 기질과 산물을 녹여내는 용도로 사용하였다.
(2) 세포주 및 세포배양
인간 유래 위암 세포주(MKN-1 및 MKN-45)는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. MKN-1 세포주의 경우에는 60 mm 디시 플레이트(Corning Life Sciences, Acton, MA)에 50,000 세포/cm2을, MKN-45 세포주의 경우에는 25,000 세포/cm2을 배양하고, 배양 24시간 후에 무혈청 배지(serum-free medium)로 교체하여 다시 24시간을 배양한 후 PKC 분석에 사용하였다.
PKC 동종(isotype)들은 활성을 갖기 위해서, 서로 다른 지질 활성화제(lipid activator)를 필요로 한다. 특히 PKC δ의 경우에는 디아실글리세롤(diacylglycerol: DAG)과 포스패티딜세린(phosphatidylserine: PS)을 지질 2차 전달자(lipid second messenger)로 사용한다. MKN-1 또는 MKN-45 세포는 DAG과 PS를 포함하는 지질 활성화제를 충분하게 포함하고 있어, 별도의 PKC 활성화제를 첨가하지 않아도 PKC가 최대한 활성화하는데 도움을 줄 수 있다. 세포 내에 포함되어 있는 PKC에 의해서도 기질의 반응이 일어날 수 있으나, 이는 상대적으로 적은 세포 양, 충분한 양의 기질, 그리고 부가적으로 정제된 재조합 PKC를 사용하여 억제하였으며, 내인성 기질과는 구분되는 FITC가 라벨된 펩티드 기질을 합성하여 사용하였으므로, 기질만의 반응물질을 선택적으로 검출하였다.
(3) PKC δ 및 기질 단백질들의 반응성 확인
재조합 단백질 PKC δ와 리피드 반응 활성화제, ATP, 그리고 기질 (F-PKC)를 사용하는 어세이 시스템이 충분한 반응성을 주지 않기 때문에, PKC 분석을 위해서, MKN-1 세포 시스템의 매트릭스를 함께 사용하였다. 따라서, 사용하는 MKN-1세포의 양을 조절하고, 세포 내 고유의 PKC 반응성을 확인하기 위하여, 인산화 전의 ERK, 인산화된 ERK의 양을 분석하였다. 도 1에 나타나 있는 인산화 기질인 5-FAM-Crebtide (펩티드 1) 또는 F-ERK (펩티드 2)를 단독으로 사용하거나 또는 ATP 및 정제된 재조합 단백질 PKC δ를 함께 배양하여 반응시킨 후 인산화된 세포 내 고유의 ERK양을 분석하여, 세포 내 고유의 ERK 단백질과 펩티드 1, 펩티드 2가 얼마나 경쟁하는지를 확인하였다.
MKN-1 세포주를 트립신-EDTA(TE)를 사용하여 플레이트로부터 분리하고, PBS로 두 번 세척한 후, TNN-EDTA 용해 버퍼(50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.5% NP40 (Nonidet P-40), 1 mM EDTA, 및 200 mM Na3VO4)로 세포를 용해시켰다. 이후 15 분 동안 원심분리하여 상층액을 분리 및 수집하였다. BCA(Bicinchoninic acid kit)(Pierce, Rockford, IL, USA)로 단백질을 정량하고, 250 μg의 단백질을 SDS-PAGE(10% 폴리아크릴아미드 미니겔)로 분리하였다. 니트로셀룰로스 막(Pall Corporation, Pensacola, FL, USA)에 단백질을 운반하고 PBS 복합용액(0.2% Tween 20, 5% 무지방 분유 함유)으로 블록킹하였다. 검출하고자 하는 항체들(phospho-ERK(1:1000), 총 ERK(1:1000), 및 항 β-액틴(1:5000))을 인큐베이션하고, 이차 항체(horseradish peroxidase-labeled secondary antibody, HRP-labeled Ab)를 사용하여, 단백질 밴드를 정량 분석하였다. 형광 기질은 루미날 시약(Santa Cruz Biotechnology, Inc. CA, USA)을 사용하였다.
도 2는 MKN-1 세포에 F-ERK 단독, FAM-Crebtide 또는 F-ERK에 PKC와 ATP를 함께 첨가한 것을 6시간 반응시킨 후 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하여 항-P-ERK 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅한 결과이다. 도 2의 결과는 MKN-1 세포에 PKC의 기질인 합성 펩티드 F-ERK를 단독 처리 했을 때는, 대조군에 비해서 내인성 단백질 ERK의 인산화가 줄어들었고, 부가적으로 정제된 재조합 단백질 PKC δ와 ATP를 합성 펩티드 F-ERK와 함께 처리했을 때는 내인성 단백질 ERK의 인산화도 대조군과 같은 양으로 회복됨을 보여주는 것이다. 이는 합성 펩티드 기질 F-ERK가 내인성 단백질 ERK와 인산화 과정에 경쟁적으로 참여하여, 부가적인 정제된 재조합 단백질 PKC δ의 첨가 없이는 내인성 단백질 ERK의 인산화가 줄어들고, 부가적인 정제된 재조합 단백질 PKC δ를 첨가했을 때 내인성 단백질 ERK의 인산화가 대조군 수준으로 회복된 것으로 보인다.
ERK와 다른 종류의 기질인 FAM-Crebtide를 처리하였을 때는 부가적으로 정제된 재조합 단백질 PKC δ를 첨가했어도 내인성 단백질 ERK의 인산화 속도가 대조군 수준으로 돌아오지 않았는데, 이는 PKC δ의 촉매 속도가 각각의 기질에 대해 다르기 때문인 것으로 보인다. 예를 들어 FAM-Crebtide의 PKC δ에 의한 인산화 속도가 F-ERK나 내인성 단백질 ERK에 비해 빠른 경우, 일정한 시간 동안 FAM-Crebtide를 먼저 인산화 시켜, 속도가 느린 내인성 단백질 ERK의 인산화는 아주 적게 이루어지는 것으로 보인다.
(4) 모세관 전기영동 분석법 조건의 최적화
모세관 전기영동 분석법을 최적화하기 위하여 분리전압, 버퍼의 종류와 pH를 변화시켜 기질(F-ERK)과 산물(P-F-ERK)의 흡광도가 높고, 안정성이 높은 조건을 확인하였다.
우선 측정에 사용하는 전압을 테스트하였다. 버퍼의 전기적 흐름의 안정성을 Ohm's plot 으로 측정하였다. 1 M 베타인(pH 11)을 포함한 100 mM CAPS 버퍼에 전기의 전압을 5 kV에서부터 30 kV까지 5 kV씩 올려가면서, 2분 동안의 전기적 흐름의 안정성을 측정한 후 2분동안 가장 안정적인 전기적 흐름을 보여주는 분리전압을 선택하였다. 도 3과 같이, 10 kV에서 가장 안정적인 결과를 보였다.
테스트한 버퍼의 종류는 MOPS(3-(N-morpholino)propane sulfonic acid), DW (distilled water), H3PO4, 소듐 포스페이트, 보릭산(Boric acid), CAPS (N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid)이었으며, pH는 2.15에서부터 11까지 (pH 2.15, 3, 7, 8, 9, 10 및 11)를 테스트하였다. 도 4는 버퍼의 종류 및 pH의 변화에 따른 형광이 부착된 기질의 안정성과 흡광도를 정량분석한 결과이다. 도 4에서 알 수 있듯이 버퍼의 종류는 CAPS가 가장 적합한 버퍼로 나타났다. pH가 높고 염도가 높을수록 기질이 안정하고 흡광도가 높았다. 최적화된 분석조건은 1 M 베타인을 포함하는 100 mM CAPS (pH 11)이었다. 기질과 산물을 용해하는 버퍼를 DMSO로 사용하면, 다이오드 어레이 검출기(Diode Array Detector: DAD)를 사용하는데 백그라운드 피크가 너무 크게 나왔다. 따라서, 용해 버퍼도 1 M 베타인을 포함하는 100 mM CAPS(pH 11)를 사용하였다. 도 5a는 기질인 F-ERK를 용매 DMSO에 용해시켜 CE-DAD로 분석하였을 때 DMSO의 검출피크가 매우 커, 기질의 검출감도가 현저히 떨어지는 것을 나타낸다. 도 5b는 기질인 F-ERK를 1 M 베타인이 함유된 100 mM CAPS (pH 11)로 용해하여 CE-DAD로 분석한 결과를 나타낸다.
(5) 모세관 전기영동 측정
분석법의 비교군으로, Protein Kinase C ELISA assay kit (Abcam®, Cambridge, UK)를 사용하였으며, 모세관 전기영동 형광검출기 분석법에는 Protein kinase C delta assay kit(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에서 제공하는 정제된 재조합 단백질 PKC δ 스톡 용액을 사용하였다. 0.1 μg/μl 의 PKC δ 스톡 용액을 키나제 희석 버퍼로 5배 희석한 후, 어세이 시스템에서는 MKN-1 세포, ATP와 함께 최종 농도 0.01 μg/μl의 효소를 사용하였다. MKN-1 세포주가 플레이트 면적의 70% 를 덮을 만큼 자라게 한 후, 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하여 세포를 굶겼다. 여기에 기질만 추가하거나, 또는 인산화 기질, PKC δ, 및 ATP를 함께 추가하여, 생성되는 인산화 산물을 배지로부터 추출하여 정량 분석하였다. 사용한 인산화 기질은 일반적인 단백질 키나제의 기질인 5-FAM-Crebtide(펩티드 1), ERK 단백질, 또는 ERK의 일부 아미노산 시퀀스를 포함하는 펩티드 2(F-ERK)를 이용하였다. 인산화 산물은 수집한 배지로부터 OASIS®HLB extraction cartridge 3 cc(60 mg, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 추출하였다. 이를 질소와 동결 건조기(freeze-dryer)(Martin Christ, Osterode, Germany)로 건조시키고, 50 μl의 CE-LIF 용 버퍼(1 M CAPS, 1 M 베타인, pH 11)로 재용해하여 분석하였다.
(6) 분석법의 유의성 검증
CE-LIF를 사용한 PKC δ 어세이법을 비준하기 위하여, 분석대상물질인 F-ERK, P-F-ERK를 10 μg/ml에서부터 연속 희석법(serial dilution)으로 LOQ, LOD값을 얻을 때까지 측정하였다. LOD는 신호 대 잡음 비(signal to noise ratio)가 3, LOQ는 10이 될 때의 값으로 결정하였다. 내부-(Intra-), 상호(Inter-) 검증(validation)을 위해서, 0.25 - 2 μg/ml 의 네 가지 다른 농도의 표준물질로 정량곡선을 만들고, PKC 어세이에 필요한 농도의 동적 범위(dynamic range) 중에서 중고값(medium high) (1.5 μg/ml)과 중저값(medium low) (0.75 μg/ml)을 선택하여, 3일의 서로 다른 날(Interday), 또는 하루 내(Intraday) 세 번, 3중(triplicate)의 시료를 분석하여, 분석법의 정확도, 정밀도, 재현성을 검증하였다.
도 6a는 기질인 F-ERK와 그 산물인 P-F-ERK의 표준물질을 1 M 베타인이 함유된 100 mM CAPS (pH 11)로 용해하여 CE-LIF로 분석한 결과이다. F-ERK는 약 6.9 ± 0.05분, P-F-ERK는 8.7 ± 0.02분의 이동시간을 보였다. 도 6b는 F-ERK 표준물질의 농도에 따른 피크 높이의 정량 곡선을 나타낸다. 도 6c는 P-F-ERK 표준물질의 농도에 따른 피크 높이의 정량 곡선을 나타낸다.
(7) 통계적 분석
실험결과의 통계적인 분석은 OriginPro 8.6.0 (OriginLab, Northampton, MA, USA)를 사용하였으며, t-test와, 선형 회귀 분석을 실시하였다. 계산된 P 값이 0.05 보다 작을 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다. 분석물 이동시간, 피크 높이, 피크 면적은 32 KaratTM 8.0 Software (P/ACETM MDQ, Beckman Coulter)로 기록하였다. 다섯 가지의 다른 농도를 사용하여, 농도의 log scale-X 축에 대한 피크 높이를 plot하고 IC50 값을 계산하였다.
2. PKC δ 저해 효과를 갖는 신약 항암제 후보물질의 스크리닝
위암, 유방암, 폐암, 췌장암, 대장암을 포함하는 암의 치료제 또는 심혈관질환(급성심근경색, 협심증)의 치료제를 개발하기 위해서, PKC δ, ATP, 리피드 반응 활성화제 및 MKN-1 세포를 함께 사용하는 세포성 PKC δ 분석 시스템을 개발하였다. 인산화 기질로는 일반적인 단백질 키나제의 기질인 5-FAM-Crebtide(펩티드 1)(서열번호 1), ERK의 일부 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 2(서열번호 2), ERK(서열번호 3), 또는 펩티드 2의 아미노산 서열 중 아미노산 T와 Y가 인산화 된 산물인 펩티드 3을 이용하였다(도 1). 이들 기질은 CE의 분리조건을 설정하고, 분석법의 최적화 및 유효성을 확인하는데 이용하였다.
도 7은 F-ERK를 여러 종류의 버퍼와 pH로 측정한 전기영동도(Electropherogram)이다. 도 7a는 100 mM 보레이트(Borate)(pH 9.3)로, 도 7b는 100 mM CAPS(pH 10.0), 도 7c는 100 mM CAPS(pH 11.0), 그리고 도 7d는 1 M 베타인이 함유된 100 mM CAPS (pH 11)로 분석한 결과이다. 도 7에서와 같이, 버퍼의 pH를 9.3에서 10로 증가시켰을 때, 검출피크의 절대적인 크기가 2배 증가하였다. pH를 10에서 11로 증가시켰을 때 부가적으로 검출피크의 절대적인 크기가 4배 증가하였다. 베타인을 함유한 버퍼를 사용했을 때는 검출 피크의 크기는 변화하지 않았다.
도 8은 버퍼의 종류와 pH에 따른 이온 크로마토그램의 이론단수와 평균 이동시간이다. 버퍼의 pH를 9.3에서 10로 증가시켰을 때, 이론단수가 3배 증가하였고, pH를 10에서 11로 증가시켰을 때 이론단수가 2.5배 증가하였다. 베타인을 함유한 버퍼를 사용했을 때는 검출 피크나 이론단수에는 변화가 없었고, 이동시간의 안정도가 40% 이상 향상되었다.
결론적으로, 도 7 및 도 8에서와 같이 CE-LIF 분석법에서는 버퍼의 염기도가 높을수록 검출피크의 크기가 2-3배 높아지고 이론단수도 4-3배 증가하였다. 또, 전해질인 베타인을 첨가하는 경우 검출 피크의 검출시간의 재현성이 높아졌다. 최적 농도는 1 M이었다. 따라서, 염기성 버퍼가 분리에 더 적합함을 확인하였다. 100 mM CAPS pH 11에서 최대 피크 높이와 최적의 분리효과를 보였다.
하기 표 1 및 2와 같이, ERK를 DMSO 용매에 녹이기 때문에 CE-DAD(Diode Array Detector)를 이용하였을 때는 기질(F-ERK) 및 인산화 산물(P-F-ERK)의 피크가 상대적으로 너무 낮아 정량분석에 어려움이 있었으며, LOD와 LOQ가 너무 높았다(0.4 - 1.75 μg/ml). CE-LIF를 사용한 F-ERK와 P-F-ERK의 정량분석법은 2 - 12 ng/ml의 매우 민감한 LOD와 LOQ를 보였다.
F-ERK의 CE-DAD 및 CE-LIF 측정법에 따른 LOD 및 LOQ 비교
F-ERK CE-DAD CE-LIF
LOD 0.58 μg/ml 2 ng/ml
LOQ 1.75 μg/ml 6 ng/ml
이동 시간 (분) 5.8 ± 0.1 6.9 ± 0.05
P-F-ERK의 CE-DAD 및 CE-LIF 측정법에 따른 LOD 및 LOQ 비교
F-ERK CE-DAD CE-LIF
LOD 0.40 μg/ml 4 ng/ml
LOQ 1.2 μg/ml 12 ng/ml
이동 시간 (분) 6.3 ± 0.05 8.7 ± 0.02
LOD: 검출 한계(limit of detection)
LOQ: 정량 한계(limit of quantitation)
* 모든 수치는 3회 이상 반복 측정한 것의 평균
반면 하기 표 3 내지 6과 같이, CE-DAD나 CE-LIF 모두 5% 내외의 재현성과 ±15% 내의 정확도를 보여 재현성 및 정확도에서의 차이는 크지 않았다.
CE-DAD로 FITC-ERK을 측정한 경우의 재현성 및 정확도
QC 시료(μg/mL) 재현성(RSD,%) 정확도(%)
30 5.0±0.5 104±4.2
10 4.0±1.3 102±0.5
CE-DAD로 P-FITC-ERK을 측정한 경우의 재현성 및 정확도
QC 시료(μg/mL) 재현성(RSD,%) 정확도(%)
30 4.8±1.2 97±4.6
10 4.3±1.3 108±1.3
CE-LIF로 FITC-ERK을 측정한 경우의 재현성 및 정확도
QC 시료(μg/mL) 재현성(RSD,%) 정확도(%)
1.5 4.6±1.0 99±7.5
0.75 4.9±0.9 111±4.6
CE-LIF로 P-FITC-ERK을 측정한 경우의 재현성 및 정확도
QC 시료(μg/mL) 재현성(RSD,%) 정확도(%)
1.5 1.2±0.9 105±9.6
0.75 3.4±1.4 103±6.1
QC: 질 관리(Qulity Control)
또한, 세포 외에 ATP와 정제된 PKC δ를 첨가하였을 때, F-ERK가 인산화되는 속도가 증가하였다. 10 ng/ml의 정제된 PKC δ와 ATP를 5 X 106 MKN-1 세포(6-웰 플레이트)에 첨가한 시스템을 PKC δ 저해제 스크리닝에 사용하였다. 키나제 반응이 끝난 뒤에 동량의 내부 표준(Internal standard: IS)을 첨가하여, 남은 기질과 인산화 산물의 이동시간을 확인하였다.
도 9는 MKN-1, 정제된 재조합 PKC, ATP에 의해 반응한 후 줄어든 기질 F-ERK와 생성된 P-F-ERK와(검은 선), 및 표준물질이 더해진 결과(빨간 선)를 보여준다. 도 9a의 대조군의 경우는 PKC 저해제 없이 6시간 동안 반응한 결과이고, 도 9b는 Goe6983, 도 9c는 스타우로스포린, 도 9d는 비스인돌릴말레이미드 Ⅱ, 도 9e는 로틀레린 2 μg/ml로 PKC 반응을 억제하고 얻은 전기영동도이다. IS로 검출하고자 하는 피크의 위치를 확인하였으며, 비스인돌릴말레이미드 II를 제외한 세 가지의 저해제가 효과적으로 반응을 억제하여, 생성물의 증가가 훨씬 적었다.
또한, Goe6983, 스타우로스포린, 또는 비스인돌릴말레이미드 II의 경우에는 0.1-1000 nM의 농도를 처리하여 IC50를 측정하였으며, 로틀레린의 경우에는 0.1-1000 μM의 농도를 이용하여, IC50를 측정하였다. 도 10은 CE-LIF로 측정한 각 물질들의 농도별 저해 효과를 나타낸다. 상기 도 10의 결과로부터 계산한 각 신약 후보물질의 농도별 PKC δ 저해 능력(%) 곡선은 도 11과 같다. 각 후보물질의 구체적인 IC50은 하기 표 7과 같으며, ELISA 법으로 측정한 IC50과 비교하였다(도 12). 상기 PKC 저해 효과 분석은 이중으로 3회 반복실험 하였다.
CE-LIF 또는 ELISA로 측정한 각 PKC 저해제들의 IC50
화합물 IC 50 (CE- LIF ) IC 50 (ELISA) 비고
Goe6983 50 nM 60 nM P-F-ERK
스타우로스포린 15 nM 10 nM F-ERK
비스인돌릴말레이미드 Ⅱ 795 nM 70 nM F-ERK
로틀레린 4 μM 6 μM P-F-ERK
*비고: Goe6983과 로틀레린의 경우에는 인산화된 산물 (P-F-ERK)의 양을 정량분석하여 IC50 값을 측정하였다. 스타우로스포린과 비스인돌일말레이미드 II의 경우에는 부산물(by product)이 많고 P-F-ERK의 재현성이 낮아, 기질(F-ERK)의 양이 줄어드는 것을 측정하여 IC50 값을 결정하였다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> System and method for screening protein kinase C inhibitor using Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence <130> PN112699 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Crebtide <400> 1 Lys Arg Arg Glu Ile Leu Ser Arg Arg Pro Ser Tyr Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ERK 196-210 <400> 2 Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 379 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Pro Arg Arg 1 5 10 15 Thr Glu Gly Val Gly Pro Gly Val Pro Gly Glu Val Glu Met Val Lys 20 25 30 Gly Gln Pro Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Gln Leu Gln Tyr Ile 35 40 45 Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Ser Ser Ala Tyr Asp His Val Arg 50 55 60 Lys Thr Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Gln Ile Leu Leu Arg Phe Arg 85 90 95 His Glu Asn Val Ile Gly Ile Arg Asp Ile Leu Arg Ala Ser Thr Leu 100 105 110 Glu Ala Met Arg Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp 115 120 125 Leu Tyr Lys Leu Leu Lys Ser Gln Gln Leu Ser Asn Asp His Ile Cys 130 135 140 Tyr Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala 145 150 155 160 Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile Asn Thr 165 170 175 Thr Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Ala Asp 180 185 190 Pro Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg 195 200 205 Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys 210 215 220 Ser Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser 225 230 235 240 Asn Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His 245 250 255 Ile Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile 260 265 270 Ile Asn Met Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Gln Ser Leu Pro Ser Lys Thr 275 280 285 Lys Val Ala Trp Ala Lys Leu Phe Pro Lys Ser Asp Ser Lys Ala Leu 290 295 300 Asp Leu Leu Asp Arg Met Leu Thr Phe Asn Pro Asn Lys Arg Ile Thr 305 310 315 320 Val Glu Glu Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro 325 330 335 Thr Asp Glu Pro Val Ala Glu Glu Pro Phe Thr Phe Ala Met Glu Leu 340 345 350 Asp Asp Leu Pro Lys Glu Arg Leu Lys Glu Leu Ile Phe Gln Glu Thr 355 360 365 Ala Arg Phe Gln Pro Gly Val Leu Glu Ala Pro 370 375

Claims (17)

  1. 단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC), PKC의 기질(substrate), ATP 및 버퍼를 포함하는, PKC의 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝하기 위한 형광검출-모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF) 시스템으로서,
    상기 PKC의 기질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 및 서열번호 2의 아미노산 서열 중 아미노산 T 및 Y가 인산화 된 것인 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 CE-LIF 시스템.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 PKC의 기질은 형광 검출을 위해 라벨링된 것인 CE-LIF 시스템.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 버퍼는 N-시클로헥실-3-아미노프로판설폰산(N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid: CAPS)를 포함하는 것인 CE-LIF 시스템.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 버퍼 중 CAPS의 농도는 0.8 M 내지 1.2 M인 것인 CE-LIF 시스템.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 버퍼는 pH가 9 내지 13인 것인 CE-LIF 시스템.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 버퍼는 베타인(betaine)을 더 포함하는 것인 CE-LIF 시스템.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 시스템은 세포를 더 포함하는 것인 CE-LIF 시스템.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 시스템은 PKC 활성화제를 더 포함하는 것인 CE-LIF 시스템.
  11. 단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC), PKC의 기질(substrate), ATP, 버퍼 및 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
    상기 접촉시키는 단계 이후의 PKC에 의한 기질의 인산화 반응 산물의 수준을 형광검출-모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence: CE-LIF)을 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 PKC의 활성을 변화시키는 후보물질을 스크리닝하는 방법으로서,
    상기 PKC의 기질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 및 서열번호 2의 아미노산 서열 중 아미노산 T 및 Y가 인산화 된 것인 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 PKC, PKC의 기질, ATP, 버퍼 및 후보물질과 세포를 접촉시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 PKC, PKC의 기질, ATP, 버퍼 및 후보물질과 PKC 활성화제를 접촉시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 측정된 인산화 반응 산물의 수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 인산화 반응 산물 수준과 비교하여 감소한 경우, 상기 후보물질을 항암 치료제 후보물질로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 삭제
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 후보물질의 농도를 변화시키며 반복 수행하는 것인 방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 상기 기질의 인산화 반응 산물의 수준을 CE-LIF로 측정하는 단계는 인산화 반응 이후 남은 기질 또는 생성된 산물의 수준을 측정하는 것으로 수행하는 것인 방법.
KR1020160023648A 2016-02-26 2016-02-26 형광검출-모세관 전기영동을 이용하여 단백질 키나제 c 저해제를 스크리닝하기 위한 시스템 및 방법 KR101786013B1 (ko)

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KR1020160023648A KR101786013B1 (ko) 2016-02-26 2016-02-26 형광검출-모세관 전기영동을 이용하여 단백질 키나제 c 저해제를 스크리닝하기 위한 시스템 및 방법

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Journal of Chromatography A, Vol. 1056, pp. 237-242 (2004.09.02.)*

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