KR101782859B1 - Kit for detecting influenza virus using quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex and detecting method using the same - Google Patents

Kit for detecting influenza virus using quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex and detecting method using the same Download PDF

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Abstract

The present invention relates to a composition for detecting an influenza virus including a quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex in which a quantum dot coated with a hydrophilic compound is bonded to a latex bead and an influenza virus antibody is bonded to a surface which is not bonded to the quantum dot in the latex bead, a kit for detecting an influenza virus having the same, and a method for detecting an influenza virus. The quantum dot is a nanoparticle composed of a semiconductor material. The quantum dot nanoparticle not only emits light at a specific wavelength depending on a size, but also simultaneously obtains various signals without overlapping the signal due to a half-width narrower than that of the existing fluorescent material. Especially, according to the present invention, since the quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex can be dried and applied to the kit, the complex is convenient and useful for long-term use as well.

Description

양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 이용한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법{Kit for detecting influenza virus using quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex and detecting method using the same}[0001] KIT FOR DETECTION OF INFLUENZA VIRUS WITH ANTI-LATEX BEAD-INFLUENZA VIRUS ANTIBODY COMPLEX AND METHOD FOR DETECTING THE SAME [0002]

본 발명은 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 이용한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a kit for detecting influenza virus using a quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex and a detection method using the same.

인플루엔자(influenza)는 인플루엔자 바이러스에 의한 호흡기질환이다. 원인병원체인 인플루엔자 바이러스는 상기 바이러스의 뉴클레오단백질 [nucleoprotein(NP)]의 항원성에 의해 A, B, C형으로 분류된다. 사람에게 질환을 일으키는 것은 주로 A형과 B형이다(Sandrock C, Kelly T. Clinical review: update of avian influenza A infections in humans. Crit Care. 2007;11(2):209). Influenza (influenza) is a respiratory disease caused by influenza virus. Influenza virus, the causative agent, is classified into A, B, and C types by the antigenicity of the nucleoprotein (NP) of the virus. The causes of illness in humans are mainly type A and type B (Sandrock C, Kelly T. Clinical review: update of avian influenza A infections in humans. Crit Care 2007; 11 (2): 209).

인플루엔자 바이러스는 구형(직경 80~120nm)의 바이러스로 표면에 주요 항원인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)과 뉴라미니다아제(Neuraminidase; NA) 당단백질의 종류에 따라 여러 가지 아형(subtype)으로 분류된다. A형 인플루엔자의 경우, 총 16가지의 HA와 9가지의 NA가 알려져 있으며, 이들 조합에 의해 총 144종의 아형 발생이 이론적으로 가능하다.Influenza viruses are spherical (80-120 nm in diameter) viruses that can be divided into several subtypes depending on the type of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) . In the case of influenza A, a total of 16 HA and 9 NA are known, and a total of 144 subtypes are theoretically possible by these combinations.

현재 인플루엔자 감염의 진단검사는 바이러스 검출과 바이러스에 대한 환자의 면역반응을 이용한 방법이 주를 이루고 있다. 이에 따라 진단검사는 인플루엔자 바이러스 분리(배양), 바이러스 항원의 검출(신속항원검사, 면역형광법), 바이러스 핵산의 입증(RT-PCR), 혈청학적 검사 등 4가지로 대별된다(이창섭. 인플루엔자의 진단과 치료. 대한의사협회지. 2010; 53(1): pp.43-51).Current diagnosis of influenza infection is mainly based on the detection of virus and the immune response of the patient to the virus. Therefore, diagnostic tests are divided into four categories: influenza virus isolation (culture), detection of virus antigen (rapid antigen test, immunofluorescence), viral nucleic acid confirmation (RT-PCR) and serological test And the treatment of mental illness.

바이러스 배양방법은 2~10일의 시간 소요와 숙련된 전문가가 필요하며 위음성(false negative)이 나올 가능성이 높다는 단점이 있고, PCR법은 각 아형에 맞는 프라이머가 필요하다는 단점이 있다. The virus culture method has a disadvantage of 2 ~ 10 days time required, skilled expert is needed and false negative is likely to occur, and the PCR method has a disadvantage that a primer suitable for each subtype is required.

항체를 이용한 면역학적 방법은 높은 정확도로 질병의 진단이 가능하다. 면역진단법이 최초개발된 시점에서는 표지자로서 효소를 사용하였지만, 이후의 기술개발에 따라 현재에는 유기형광물질이 보편적으로 사용되고 있다. 그러나, 유기형광물질의 경우 시료의 전처리 조건에 매우 민감할 뿐 아니라 광탈색(photobleaching)에 의한 형광체의 밝기가 급격하게 떨어져 센서의 민감도가 저하되는 문제가 있다.Immunological methods using antibodies can diagnose diseases with high accuracy. At the time of the first development of the immunoassay method, enzymes were used as markers, but organic minerals are now commonly used as a result of technology development. However, the organic minerals are very sensitive to the pretreatment conditions of the sample, and the brightness of the phosphor due to photobleaching sharply drops to degrade the sensitivity of the sensor.

반도체 양자점(semiconductor quantum dot)은 독특한 광학적 및 전자적 성질을 지닌 구형의 물질로서 입자의 크기는 2 ~ 20nm며, 입자의 크기에 따라 각기 다른 파장의 형광을 방출하는 특징을 가지고 있어 그 발광파장 영역은 자외선 영역에서 근적외선 영역까지 다양하다. 다양한 파장의 빛을 내는 양자점들은 하나의 여기(excitation)광원만으로 동시에 여기가 가능하다. 더욱이 레이저와 같이 강한 광원에서도 비교적 안정하며, 반치폭이 약 20 ~ 30nm로 좁기 때문에 유기형광체를 사용하는 경우와 다르게 신호의 중첩 없이 다양한 신호를 동시에 사용할 수 있어 다중의 바이러스 검출에 유리하다.Semiconductor quantum dots are spherical materials with unique optical and electronic properties. The size of the particles is from 2 to 20 nm. Depending on the size of the particles, they emit fluorescence of different wavelengths. It ranges from ultraviolet to near infrared. Quantum dots emitting light of various wavelengths can be excited simultaneously by only one excitation light source. In addition, since it is relatively stable even in a strong light source such as a laser and has a half width of about 20 to 30 nm, unlike the case of using an organic phosphor, various signals can be used simultaneously without overlapping of signals.

양자점을 이용하는 기술로는 한국등록특허 제1512484호에는 마그네틱 비드와 양자점을 이용한 식품 내 노로바이러스의 신속 검출방법에 대하여 개시되어 있고, 국내 저널(Bulletin of Food Tecnology Vol. 22, No. 3, pp. 577-586)에서는 양자점 표지 형광미세비드의 합성 및 응용에 대하여 개시되어 있으나, 본 발명의 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 이용한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법은 개시된 바 없다. Korean Patent No. 1512484 discloses a rapid detection method of norovirus in food using magnetic beads and quantum dots as a technique using quantum dots. Bulletin of Food Tecnology Vol. 22, No. 3, pp. 577-586) discloses the synthesis and application of quantum dot-labeled fluorescent fine beads, but a kit for detecting influenza virus using the quantum dot nanoparticle-latex bead complex of the present invention and a detection method using the kit have not been disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 라텍스 비드에 친수성 화합물이 코팅된 양자점이 결합되고, 상기 라텍스 비드에 추가적으로 인플루엔자 바이러스 항체가 결합된 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트 및 인플루엔자 바이러스 검출방법을 제공하고, 본 발명에 따른 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체가 인플루엔자 바이러스 아형인 H1N1, H7N7, H9N2 또는 H5N3형 바이러스 및 H5N1형 인플루엔자 바이러스 HA 항원을 검출할 수 있다는 것을 확인하였고, H1N1형 신종플루 바이러스감염환자 검체를 적용하여 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 민감도 및 특이도를 산출함으로써, 본 발명을 완성하였다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex in which quantum dots coated with a hydrophilic compound are bonded to a latex bead and an influenza virus antibody is further bound to the latex bead, A latex bead-influenza virus antibody complex according to the present invention is used as an influenza virus subtype of influenza virus subtypes H1N1, H7N7, H9N2 or H5N3 virus, and H5N1 influenza virus HA antigen, and by applying a sample of H1N1 influenza virus infected samples to calculate the sensitivity and specificity of the kit for detecting influenza virus, I completed the name.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라텍스 비드에 친수성 화합물이 코팅된 양자점이 결합되고, 상기 라텍스 비드에 인플루엔자 바이러스 항체가 결합된 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for producing an influenza virus (hereinafter referred to as " influenza virus ") comprising QD-latex bead-influenza virus antibody complex in which QDs coated with a hydrophilic compound are bonded to a latex bead and an influenza virus antibody is bound to the latex bead A composition for detection is provided.

또한, 본 발명은 (a) 양자점(quantum dots; QDs)의 표면을 친수성 화합물로 코팅하는 단계;(A) coating the surface of quantum dots (QDs) with a hydrophilic compound;

(b) 상기 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드를 아마이드 결합반응을 통해 결합시키는 단계; (b) bonding the hydrophilic compound-coated quantum dot and the latex bead through an amide bonding reaction;

(c) 상기 양자점이 결합된 라텍스 비드의 표면에 존재하는 아미노기와 숙신산무수물(succinic anhydride)을 반응시켜 상기 라텍스 비드 표면을 카르복실기로 치환하는 단계; 및(c) reacting a succinic anhydride with an amino group present on the surface of the latex bead to which the quantum dots are bound to replace the surface of the latex bead with a carboxyl group; And

(d) 상기 단계 (c)에서 치환된 라텍스 비드 표면의 카르복실기와 인플루엔자 바이러스 항체에 포함된 아미노기를 아마이드 결합반응을 통해 결합시킨 후, 원심분리하여 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 수득하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물의 제조방법을 제공한다.(d) binding the carboxyl group on the surface of the latex beads substituted in step (c) with the amino group contained in the influenza virus antibody through an amide bond reaction and then centrifuging to obtain a quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex ; And a method for producing a composition for detecting influenza virus.

또한, 본 발명은 상기 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다. The present invention also provides a kit for detecting influenza virus comprising the composition for detecting influenza virus.

또한, 본 발명은 상기 인플루엔자 바이러스 검출용 키트에 인플루엔자 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 형광빛 띠가 나타나면, 인플루엔자 바이러스 감염을 양성으로 판정하고, 대조선에만 형광빛 띠가 나타나면, 인플루엔자 바이러스 감염을 음성으로 판정하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출 방법을 제공한다. In addition, the present invention is characterized in that when a specimen suspected of containing influenza virus is put into the kit for detecting influenza virus and a fluorescent light band appears on the test line and the test strip of the test strip, the influenza virus infection is judged positive, And when a light band appears, the influenza virus infection is judged to be negative.

본 발명은 라텍스 비드에 친수성 화합물이 코팅된 양자점이 결합되고, 상기 라텍스 비드표면에 인플루엔자 바이러스 항체가 결합된 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트 및 인플루엔자 바이러스 검출방법에 관한 것으로, 미량의 시료를 사용하더라도 인플루엔자 바이러스를 효과적으로 검출할 수 있으며, 건조한 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 항체 복합체를 키트에 적용하는 것이 가능하므로 편리할 뿐만 아니라 장기간 보관할 수 있다는 이점이 있다.The present invention relates to a composition for detecting influenza virus comprising as an active ingredient a quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex in which a quantum dot coated with a hydrophilic compound is bonded to a latex bead and an influenza virus antibody is bound to the surface of the latex bead The present invention relates to a kit for detecting influenza virus and a method for detecting influenza virus, which can effectively detect influenza virus even when a trace amount of sample is used, and it is possible to apply a dry QT-latex bead-influenza antibody complex to a kit However, there is an advantage that it can be stored for a long time.

도 1(A)는 본 발명에서 제공하는 친수성 화합물로 코팅된 양자점-라텍스-항체가 결합된 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제작하는 원리를 나타낸 개략도이며, 도 1(B)는 본 발명에서 제공하는 친수성 화합물로 코팅된 양자점들의 발광파장을 나타내는 것이다.
도 2는 친수성 화합물로 코팅된 양자점과 라텍스 비드의 몰비 혼합비율에 따른 형광검출 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 라텍스 비드, 양자점-라텍스 비드, 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체 크기를 확인한 결과이다.
도 4는 (A) 양자점(QD620nm), (B) 라텍스 비드, (C) 양자점(QD520nm)-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체, (D) 양자점(QD580nm)-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체, (E) 양자점(QD620nm)-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체 및 (F) 양자점(QD640nm)-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체의 투과전자현미경 사진이다.
도 5는 양자점(QD640nm)-라텍스 비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체의 농도에 따른 형광신호값을 나타낸 그래프이다.
도 6는 발광파장이 580nm, 620nm 및 640nm인 양자점-라텍스비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 이용한 H1N1형 인플루엔자 바이러스 검출의 한계를 확인한 결과로, H1N1형 인플루엔자 바이러스 함량에 따른 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 발광파장이 520nm인 양자점-라텍스비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 이용한 H1N1형 인플루엔자 바이러스 검출의 한계를 UV상에서 확인한 결과이다.
도 8은 발광파장이 580nm, 620nm 및 640nm인 양자점-라텍스비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 이용한 H5N3형 인플루엔자 바이러스 검출의 한계를 확인한 결과로, H5N3형 인플루엔자 바이러스 함량에 따른 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9은 발광파장이 520nm인 양자점-라텍스비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 이용한 H5N3형 인플루엔자 바이러스 검출의 한계를 UV상에서 확인한 결과이다.
도 10은 발광파장이 580nm, 620nm 및 640nm인 양자점-라텍스비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 이용한 H7N7형 인플루엔자 바이러스 검출의 한계를 확인한 결과로, H7N7형 인플루엔자 바이러스 함량에 따른 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 발광파장이 520nm인 양자점-라텍스비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를을 이용한 H7N7형 인플루엔자 바이러스 검출의 한계를 UV상에서 확인한 결과이다.
도 12은 발광파장이 580nm, 620nm 및 640nm인 양자점-라텍스비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 이용한 H9N2형 인플루엔자 바이러스 검출의 한계를 확인한 결과로, H9N2형 인플루엔자 바이러스 함량에 따른 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 발광파장이 520nm인 양자점-라텍스비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 이용한 H9N2형 인플루엔자 바이러스 검출의 한계를 UV상에서 확인한 결과이다.
도 14는 발광파장이 620nm인 양자점-라텍스비드-H5N1형 인플루엔자 바이러스 HA항원에 대한 항체 복합체를 이용하여 H5N1형 인플루엔자 바이러스 HA항원 검출의 한계를 확인한 결과로, H5N1형 인플루엔자 바이러스 HA항원 함량에 따른 형광세기의 값을 대조선에서 측정된 형광세기의 값으로 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 발광파장이 640nm인 양자점-라텍스비드-H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 이용한 형광검출 키트로 RT-PCR을 통해 H1N1형 신종플루 인플루엔자 바이러스에 감염됨이 확인된 사람의 비후강 검체 및 H1N1형 신종플루 인플루엔자 바이러스에 감염되지 않음이 확인된 사람의 비후강 검체에 대한 형광값을 나타낸 그래프이다.1 (A) is a schematic view showing a principle for fabricating a composition for detecting influenza virus bound with a quantum dot-latex-antibody coated with a hydrophilic compound provided in the present invention. Fig. 1 (B) The emission wavelength of the quantum dots coated with the compound.
FIG. 2 shows fluorescence detection results according to the mixing ratio of the molar ratio of the quantum dot coated with the hydrophilic compound to the latex bead.
FIG. 3 shows the result of examining the sizes of the latex bead, the quantum dot-latex bead and the quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex according to the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the results of (A) QD620 nm, (B) latex beads, (C) QD520 nm-latex bead- (QD620nm) -Latex Bead-Influenza Virus Antibody Complex and (F) Quantum Point (QD640nm) -Latex Bead-Influenza Virus Antibody Complex.
5 is a graph showing the fluorescence signal values according to the concentration of the antibody complex against the influenza virus nucleoprotein of QD640 nm-latex bead-H1N1, H5N3, H7N7 or H9N2 type.
FIG. 6 shows the limitations of the detection of H1N1 influenza virus using an antibody complex against influenza virus nucleoprotein of the QT-Bead-H1N1, H5N3, H7N7 or H9N2 type having emission wavelengths of 580 nm, 620 nm and 640 nm , Which is a graph showing the change in the value calculated by dividing the value of the fluorescence intensity according to the H1N1 influenza virus content by the value of the fluorescence intensity measured on the control line.
FIG. 7 shows the results of UV detection of the limit of detection of H1N1 influenza virus using an antibody complex against the influenza virus nucleoprotein of the quantum dot-latex bead-H1N1 type, H5N3 type, H7N7 type or H9N2 type having an emission wavelength of 520 nm.
8 shows the limitations of the detection of H5N3 influenza virus using an antibody complex against influenza virus nucleoprotein of QD-H1N1 type, H5N3 type, H7N7 type or H9N2 type having emission wavelengths of 580 nm, 620 nm and 640 nm , Which is a graph showing the change in the value calculated by dividing the value of the fluorescence intensity according to the H5N3 influenza virus content by the value of the fluorescence intensity measured on the control line.
FIG. 9 shows the results of UV detection of the limit of detection of H5N3 influenza virus using an antibody complex against influenza virus nucleoprotein of the quantum dot-latex bead-H1N1 type, H5N3 type, H7N7 type or H9N2 type having an emission wavelength of 520 nm.
FIG. 10 shows the limitations of the detection of H7N7 influenza virus using an antibody complex against the influenza virus nucleoprotein of the QT-Bead-H1N1 type, H5N3 type, H7N7 type or H9N2 type having emission wavelengths of 580 nm, 620 nm and 640 nm , Which is a graph showing the change in the value calculated by dividing the value of the fluorescence intensity according to the H7N7 influenza virus content by the value of the fluorescence intensity measured on the control line.
FIG. 11 is a result of UV detection of the limit of detection of H7N7 influenza virus using an antibody complex against influenza virus nucleoprotein of the quantum dot-latex bead-H1N1 type, H5N3 type, H7N7 type or H9N2 type having an emission wavelength of 520 nm .
FIG. 12 shows the limitations of detection of H9N2 influenza virus using an antibody complex against influenza virus nucleoprotein of QT-Beads-H1N1, H5N3, H7N7 or H9N2 with emission wavelengths of 580 nm, 620 nm and 640 nm , Which is a graph showing the change in the value calculated by dividing the value of the fluorescence intensity according to the H9N2 influenza virus content by the value of the fluorescence intensity measured on the control line.
FIG. 13 is a result of UV detection of the limit of detection of H9N2 influenza virus using an antibody complex against influenza virus nucleoprotein of the quantum dot-latex bead-H1N1 type, H5N3 type, H7N7 type or H9N2 type having an emission wavelength of 520 nm.
FIG. 14 shows the results of confirming the limit of the detection of the H5N1 influenza virus HA antigen using the antibody complex against the quantum dot-latex bead-H5N1 influenza virus HA antigen having an emission wavelength of 620 nm. As a result, And a value obtained by dividing the value of the intensity by the value of the fluorescence intensity measured at the reference line.
15 shows the results of the RT-PCR of a H1N1 influenza virus (H1N1) influenza virus (H1N1) influenza virus using a fluorescent detection kit using an antibody complex against the influenza virus nucleoprotein of the quantum dot-latex bead-H1N1 type, H5N3 type, H7N7 type or H9N2 type having an emission wavelength of 640 nm A graph showing the fluorescence values of hypertrophic specimens of a person who has been confirmed to be infected with a virus and hypertrophic specimens of a person who has been confirmed not to be infected with the H1N1 influenza virus.

본 발명은 라텍스 비드에 친수성 화합물이 코팅된 양자점이 결합되고, 상기 라텍스 비드에서 양자점과 결합하지 않는 표면에 인플루엔자 바이러스 항체가 결합된 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an influenza virus comprising a quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex in which a quantum dot coated with a hydrophilic compound is bonded to a latex bead and an influenza virus antibody is bound to a surface not binding to a quantum dot in the latex bead To a composition for detection.

본 발명에서 사용되는 라텍스 비드는 양자점 및 항체가 결합할 수 있는 매개체로서 사용할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 양자점 및 항체가 결합할 수 있도록 다수의 반응성 아미노기가 존재하는 라텍스 비드인 것이 바람직하다.The latex beads used in the present invention are not particularly limited as long as they can be used as mediators capable of binding to quantum dots and antibodies, but are preferably latex beads in which a large number of reactive amino groups exist so that quantum dots and antibodies can be bound.

상기 라텍스 비드의 직경은 10~2,000nm인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 50~1,000nm인 것이며, 더욱더 바람직하게는 100nm인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.The diameter of the latex bead is preferably 10 to 2,000 nm, more preferably 50 to 1,000 nm, and even more preferably 100 nm, but is not limited thereto.

상기 라텍스 비드 및 친수성 화합물이 코팅된 양자점은 1:40~1,000의 몰비로 결합된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1:70~800의 몰비로 결합된 것이며, 더욱더 바람직하게는 1:90의 몰비로 결합한 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.The latex beads and the quantum dots coated with the hydrophilic compound are preferably bound in a molar ratio of 1:40 to 1,000, more preferably in a molar ratio of 1:70 to 800, still more preferably in a molar ratio of 1:90 But is not limited thereto.

상기 라텍스 비드 및 양자점의 몰비가 1:40 미만인 경우, 양자점이 충분하지 않으므로, 방출하는 형광량이 낮은 문제점이 있고, 1:1000을 초과하는 몰비에서는 형광노이즈가 심할 뿐만 아니라, 라텍스 비드에 대한 인플루엔자 바이러스 항체의 결합 비율이 낮아지는 문제가 있다.When the mole ratio of the latex beads and the quantum dots is less than 1:40, there is a problem that the quantum dots are insufficient and the amount of fluorescence emitted is low. In a molar ratio exceeding 1: 1000, fluorescence noises are not only severe but also influenza virus There is a problem that the binding ratio of the antibody is lowered.

상기 라텍스 비드 및 인플루엔자 바이러스 항체는 1:50~500의 몰비로 결합된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1:100~470의 몰비로 결합된 것이고, 더욱더 바람직하게는 1:455의 몰비로 결합된 것이지만 이에 한정하는 것은 아니다. The latex bead and influenza virus antibody are preferably bound in a molar ratio of 1:50 to 500, more preferably in a molar ratio of 1: 100 to 470, and still more preferably in a molar ratio of 1:455 But is not limited thereto.

상기 라텍스 비드와 친수성 화합물이 코팅된 양자점의 결합은 라텍스 비드 표면에 있는 아미노기와 양자점에 포함된 카르복실기 사이의 아마이드 결합인 것이 특징이며, 상기 라텍스 비드와 인플루엔자 바이러스 항체의 결합은 라텍스 비드 표면에 있는 카르복실기와 인플루엔자 바이러스 항체에 포함된 아미노기 사이의 아마이드 결합인 것이 특징이다. The bonding of the latex beads and the quantum dots coated with the hydrophilic compound is characterized by being an amide bond between an amino group on the surface of the latex beads and a carboxyl group contained in the quantum dots. The binding between the latex beads and the influenza virus antibody is caused by a carboxyl group And the amide bond between the amino group contained in the influenza virus antibody.

상기 양자점은 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴설파이드(CdS), 카드뮴텔로리움(CdTe), 징크텔로리움(ZnTe), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크설파이드(ZnS), 징크옥사이드(ZnO), 인듐 인화물(InP), 인듐 비화물(InAs), 머큐리텔로리움(HgTe) 및 머큐리셀레나이드(HgSe) 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. The quantum dots include at least one selected from the group consisting of CdSe, CdS, CdTe, ZnTe, ZnSe, ZnS, ZnO, , Indium phosphide (InP), indium paraffin (InAs), mercuritolium (HgTe), and mercury selenide (HgSe).

상기 양자점의 직경은 1~30nm인 것이 바람직하지만, 더 바람직하게는 2~20nm이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.The diameter of the quantum dot is preferably 1 to 30 nm, more preferably 2 to 20 nm, but is not limited thereto.

상기 양자점의 발광파장은 450~700nm인 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.The emission wavelength of the quantum dot is preferably 450 to 700 nm, but is not limited thereto.

상기 인플루엔자 바이러스 항체는 H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오단백질(NP) 또는 H5N1형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)을 특이적으로 인식하는 것이 바람직하지만, 특별히 이에 제한하는 것은 아니며, 타겟 바이러스 특이적인 항체는 어느 것이든 무방하게 적용할 수 있다. It is preferable that the influenza virus antibody specifically recognizes hemagglutinin (HA) of H1N1, H5N3, H7N7 or H9N2 influenza virus nucleoprotein (NP) or H5N1 influenza virus, But the present invention is not limited thereto, and any target virus-specific antibody can be applied freely.

상기 친수성 화합물은 시스테아민(cysteamine), 머캅토숙신산(mercaptosuccinic acid), 머캅토프로피온산(mercaptopropionic acid), 글루타티온(glutathion), 시스테인(cysteine), 티올-함유 실란 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.The hydrophilic compound may be any one selected from the group consisting of cysteamine, mercaptosuccinic acid, mercaptopropionic acid, glutathione, cysteine and thiol-containing silane, But is not limited to.

본 발명의 용어 항체란 당해 기술 분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로블린이다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 재조합 항체 모두를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다.The term antibody of the present invention is a specific immunoglobulin directed against an antigenic site as a term known in the art. The form of the antibody includes both a polyclonal antibody, a monoclonal antibody and a recombinant antibody, and may include not only all immunoglobulin antibodies but also special antibodies such as humanized antibodies. In addition, the antibody comprises a functional fragment of an antibody molecule as well as a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and can be Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2, Fv and the like.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 라텍스와 직접적으로 또는 링커를 이용하여 간접적으로 결합할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 모든 종류의 항체를 사용할 수 있다. 상기 항체는 항체의 카르복실기와 라텍스의 반응성 아미노기를 반응시켜서 아마이드 결합을 형성함으로써 상기 라텍스와 직접적으로 결합될 수 있는데, 항체의 구조에 따라 이러한 결합이 원활히 수행하지 못하게 될 수도 있다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 펩타이드, 글루타르알데히드, 숙신산 무수화물 등의 링커를 사용하여 간접적으로 항체와 라텍스를 결합시킬 수 있으며, 이때 사용되는 링커는 항체와 라텍스 간의 결합을 매개할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. In the present invention, the antibody is not particularly limited as long as it can bind indirectly to the latex directly or by using a linker, and all kinds of antibodies can be used. The antibody can be directly bound to the latex by reacting the carboxyl group of the antibody with the reactive amino group of the latex to form an amide bond. However, such an antibody may not be able to perform this binding smoothly depending on the structure of the antibody. In order to solve this problem, it is possible to indirectly bind the antibody and the latex by using a linker such as a peptide, glutaraldehyde, succinic anhydride or the like, and the linker used in this case is particularly useful as a mediator between the antibody and the latex It is not limited.

또한, 본 발명은 (a) 양자점(quantum dots; QDs)의 표면을 친수성 화합물로 코팅하는 단계;(A) coating the surface of quantum dots (QDs) with a hydrophilic compound;

(b) 상기 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드를 아마이드 결합반응을 통해 결합시키는 단계; (b) bonding the hydrophilic compound-coated quantum dot and the latex bead through an amide bonding reaction;

(c) 상기 양자점이 결합된 라텍스 비드의 표면에 존재하는 아미노기와 숙신산무수물(succinic anhydride)을 반응시켜 상기 라텍스 비드 표면을 카르복실기로 치환하는 단계; 및(c) reacting a succinic anhydride with an amino group present on the surface of the latex bead to which the quantum dots are bound to replace the surface of the latex bead with a carboxyl group; And

(d) 상기 단계 (c)에서 치환된 라텍스 비드 표면의 카르복실기와 인플루엔자 바이러스 항체에 포함된 아미노기를 아마이드 결합반응을 통해 결합시킨 후, 원심분리하여 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 수득하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.(d) binding the carboxyl group on the surface of the latex beads substituted in step (c) with the amino group contained in the influenza virus antibody through an amide bond reaction and then centrifuging to obtain a quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex ; And a method for producing a composition for detecting influenza virus.

상기 단계 (b) 및 (d)의 아마이드 결합반응은 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS)의 존재하에 수행되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.The amide coupling reaction of steps (b) and (d) is carried out in the presence of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (Sulfo-NHS) But it is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.The present invention also relates to a kit for detecting influenza virus comprising the composition for detecting influenza virus.

상기 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격 이격된 지점에 위치하는 시료 내의 인플루엔자 바이러스 항원과 결합하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 결합부; 상기 결합부로부터 일정간격이 이격된 위치에 상기 인플루엔자 바이러스의 특이적 항체가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. The influenza virus detection kit comprises: a sample injection unit for injecting a sample; An influenza virus binding unit comprising a composition for detecting an influenza virus which binds to an influenza virus antigen in a sample located at a position spaced apart from the sample injecting unit by a predetermined distance; A test line in which the specific antibody of the influenza virus is immobilized at a position spaced apart from the binding portion at a predetermined interval; And a control line to which the anti-mouse IgG is immobilized are sequentially provided. However, the present invention is not limited thereto.

상기 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물은 0.2×10-6~1.0×10- 5nmole인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1.0×10-6~6.0×10- 6nmole이고, 더욱더 바람직하게는 1.76×10-6nmole이지만 이에 한정하는 것은 아니다.Wherein the influenza virus composition for detection is 0.2 × 10 -6 ~ 1.0 × 10 - 5 nmole which it is preferred, more preferably from 1.0 × 10 -6 ~ 6.0 × 10 - 6 nmole , and even more preferably 1.76 × 10 - 6 nmole, but is not limited thereto.

상기 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물은 건조 또는 용액상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조상태인 것이지만, 이에 한정하지 않는다.The composition for detecting influenza virus may be in a dry state or a solution state, and is preferably in a dry state, but is not limited thereto.

상기 건조는 실온에서 1시간 동안 자연 건조하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다. The drying is preferably naturally dried at room temperature for 1 hour, but is not limited thereto.

상기 인플루엔자 바이러스 검출용 건조 조성물을 적용한 키트는 안정하여 장기간 보관하는 것이 가능하다.The kit to which the dry composition for detecting influenza virus is applied is stable and can be stored for a long period of time.

본 발명이 제공하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 사람 또는 동물의 비후강 검체 또는 분변 검체시료를 투입할 수 있는 시료주입부가 구비되고, 상기 시료 주입부로부터 일정 간격을 유지하면서 상기 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원의 결합부, 상기 인플루엔자 바이러스 항체와 동일한 항원을 검출할 수 있는 다른 항체가 고정된 검사선, 및 상기 조성물에 포함된 항체를 검출할 수 있는 이차 항체가 고정된 대조선이 순차적으로 구비된 면역스트립 또는 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit)이다.The kit for detecting influenza virus provided by the present invention is a kit for detecting influenza virus, which comprises binding a glass fiber, cotton or cellulose pad to a strip-shaped nitrocellulose membrane to obtain a human or animal thickened or fecal sample A binding portion of an influenza virus antigen including the quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex, and an antigen identical to that of the influenza virus antibody are detected while keeping a predetermined distance from the sample injecting portion Or a fluorescent immunochromatographic test kit (FICT) in which a secondary antibody to which an antibody contained in the composition is immobilized is sequentially provided.

또한, 본 발명은 상기 인플루엔자 바이러스 검출용 키트에 인플루엔자 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 형광빛띠가 나타나면, 인플루엔자 바이러스 감염을 양성으로 판정하고, 대조선에만 형광빛띠가 나타나면, 인플루엔자 바이러스 감염을 음성으로 판정하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출 방법에 관한 것이다. In addition, the present invention is characterized in that when a specimen suspected of containing influenza virus is put into the kit for detecting influenza virus and a fluorescent light band appears on the test line and the test strip of the test strip, the influenza virus infection is judged positive, , The influenza virus infection is judged to be negative by the influenza virus infection.

본 발명에서 민감도(sensitivity)는 감별검사에서 실제로 양성 시료(인플루엔자 바이러스 감염된 시료) 중에서 검사결과가 양성으로 나올 확률로, 검사가 양성 시료를 얼마나 잘 골라내는지를 나타내는 지표이다.In the present invention, the sensitivity is an indicator of how well the test is to pick up positive specimens in a positive test (influenza virus infected specimens) with a probability of positive test results.

또한, 특이도(specificity)는 감별검사에서 실제로 음성 시료(인플루엔자 바이러스가 감염되지 않은 시료) 중에서 검사결과가 음성으로 나올 확률로, 검사가 음성 시료를 얼마나 잘 골라내지를 나타내는 지표이다.
In addition, the specificity is an index indicating how well the test selects a negative sample, with the probability that the test result will be negative in the negative sample (the sample not infected with the influenza virus) in the differential test.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예Example 1. 친수성 화합물이 코팅된  1. Hydrophilic compound coated 양자점Qdot (quantum dots : (quantum dots: QDsQDs )-) - 라텍스비드Latex bead -인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물의 제조- Preparation of Composition for Detecting Influenza Virus Containing Influenza Virus Antibody Complex as Active Ingredient

(1) 친수성 화합물이 코팅된 (1) a hydrophilic compound-coated 양자점Qdot 및 라텍스  And latex 비드가Bead 결합된Combined 복합체의 제조 Manufacture of Composites

친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체를 하기에 기재된 방법에 의해 준비하였다(도 1(A)).A composite in which a quantum dot coated with a hydrophilic compound and a latex bead are bonded was prepared by the method described below (Fig. 1 (A)).

구체적으로 약 100nm 크기의 0.044μM 아미노 라텍스(amine latex, life technology사) 50㎕에 세척완충액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH8)을 가하여 1회 세척하고, 친수성 화합물로 코팅된 0.1μM 양자점을 1:90의 몰비로 혼합하고, 0.01M 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 200㎕ 및 0.01M N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS) 300㎕을 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다(도 1(A)). 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 원심분리(17000rpm, 5분)를 통해 결합하지 않은 양자점을 제거하고, 침전물을 상기 세척완충용액을 가하여 1회 세척한 후, 다시 원심분리하여 상기 세척 완충용액 200㎕에 분산하여 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체를 제조하였다. Specifically, washing buffer (0.1 M Phosphate Buffered Saline containing 8.77 g / L NaCl, pH 8) was added to 50 μl of 0.044 μM amino latex (amine latex, life technology) having a size of about 100 nm and washed once to obtain a hydrophilic compound Were mixed at a molar ratio of 1:90, and 200 μl of 0.01 M 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 0.01 M N- 300 μl of Sulfo-NHS was added thereto, followed by reaction at room temperature for 1 hour (FIG. 1 (A)). After completion of the reaction, the reaction mass was removed by centrifugation (17000 rpm, 5 minutes) to remove unbound quantum dots. The precipitate was washed once with the washing buffer solution, centrifuged again and washed with the washing buffer solution 200 To prepare a complex in which a quantum dot coated with a hydrophilic compound and latex beads were bonded.

상기 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체의 발광파장은 520nm, 580nm, 620nm 또는 640nm를 나타낸다(도 1(B)).
The emission wavelength of the complex in which the quantum dot coated with the hydrophilic compound and the latex bead are bonded shows 520 nm, 580 nm, 620 nm or 640 nm (FIG. 1 (B)).

(2) 링커를 통한 인플루엔자 바이러스 항체와 상기 (2) an influenza virus antibody through a linker and 양자점Qdot -- 라텍스비Latex rain 복합체의 결합을 통한 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 제조 Composition for detection of influenza virus through binding of complex

상기 양자점-라텍스 비드 복합체에서 양자점이 결합되지 않은 라텍스 비드 표면의 아미노기에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 결합하여 라텍스 비드 표면을 카르복실기로 치환하였다. In the quantum dot-latex bead composite, succinic anhydride was bonded to the amino group on the latex bead surface to which the quantum dots were not bonded, thereby replacing the surface of the latex bead with a carboxyl group.

상기 양자점-라텍스 비드 복합체에서 양자점이 결합되지 않은 라텍스 비드의 카르복실기와 H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체 또는 H5N1형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체(1㎎/㎖)를 1:455의 몰비로 혼합하고, 0.01M 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 100㎕ 및 0.01M N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS) 150㎕을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 비특이반응을 제거하기 위해, 0.1%의 BSA, 1%의 자당(sucrose), 1%의 젤라틴(gelatin) 및 0.01%의 카제인(casein)을 포함하는 블로킹용액에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 원심분리(15,000rpm, 5분)를 통해 결합하지 않은 인플루엔자 바이러스 항체를 제거하고, 침전물을 상기 세척완충용액(pH7.4)을 가하여 1회 세척한 후, 다시 원심분리하여 상기 세척완충용액(pH7.4) 500㎕에 분산하여 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제조하였다(도 3 내지 5).
In the quantum dot-latex bead complexes, antibodies against the nucleoside protein (NP) of influenza viruses of H1N1, H5N3, H7N7 or H9N2 type carboxyl groups of latex beads not bound to quantum dots or hemagglutinins of H5N1 influenza virus The antibody (1 mg / ml) against nin (HA) was mixed at a molar ratio of 1: 455 and 100 μl of 0.01 M 1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 150 μl of N-hydroxyl pseudosuimide (Sulfo-NHS) was added and reacted at room temperature for 2 hours. To remove the nonspecific reaction, the reaction was carried out for 30 minutes in a blocking solution containing 0.1% BSA, 1% sucrose, 1% gelatin and 0.01% casein. After the reaction was completed, the influenza virus antibody not bound through the centrifugation (15,000 rpm, 5 minutes) was removed, and the precipitate was washed once with the washing buffer solution (pH 7.4) Centrifuged and dispersed in 500 μl of the washing buffer solution (pH 7.4) to prepare a composition for detecting influenza virus containing the quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex as an active ingredient (FIGS. 3 to 5).

실시예Example 2. 인플루엔자 바이러스 검출용  2. For detection of influenza virus 키트의Of kit 제작 making

상기 실시예 1에서 제조한 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체 복합체 또는 양자점-라텍스 비드-H5N1형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체 복합체가 인플루엔자 바이러스 검출용 키트에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제작하였다. The antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein (NP) prepared in Example 1 or the antibody complex against QD-latex bead-H5N1 influenza virus hemagglutinin (HA) was used for the detection of influenza virus In order to evaluate the effect on the kit, an influenza virus detection kit containing the composition for detecting influenza virus was prepared.

구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를 결합시켜서 비후강검체 시료를 투입할 수 있는 시료 주입부를 구비시켰다. 상기 검체 패드와 일정간격을 두고, 상기 실시예 1에 따른 0.88nM 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 2㎕를 가한 다음 일정 간격을 두고, 검사선(Test line; T)을 설정한 다음, 상기 검사선에 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 2.5㎍을 가하여 고정시켰다. 상기 검사선에 고정한 인플루엔자 바이러스에 대한 항체는 H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 뉴클레오단백질(NP)에 대한 항체 또는 H5N1형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체이다.Specifically, a sample injecting unit is provided, which is capable of injecting a specimen of thickened specimen by bonding a sample pad made of glass fiber, cotton or cellulose to one end of a strip-shaped nitrocellulose membrane. 2 μl of the composition for detecting 0.88 nM influenza virus according to Example 1 was added to the test pads at regular intervals, test lines (T) were set at predetermined intervals, and then the influenza Antibodies against the virus Was added and fixed. The antibody against influenza virus immobilized on the test line is an antibody against a nucleoprotein (NP) of H1N1, H5N3, H7N7 or H9N2 or against hemagglutinin (HA) of H5N1 influenza virus.

상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선(Control line; C)을 설정한 다음, 상기 대조선에 인플루엔자 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차항체(마우스 IgG에 대한 항체) 2㎍을 가하여 고정시켰다.A control line (C) was set at a predetermined interval from the above-mentioned inspecting line, and 2 μg of a secondary antibody (antibody against mouse IgG) against an antibody specifically binding to influenza virus was fixed to the control line .

그 결과로서, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광 검출 키트를 제작하였다.
As a result, a fluorescence detection kit in which a sample pad, a composition for detecting influenza virus, an inspection line and a control line were sequentially aligned was prepared on a nitrocellulose membrane in the form of a strip.

실시예Example 3. 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트 3. An influenza virus detection kit comprising a composition for detecting influenza virus 의of 검출한계 측정 Detection limit measurement

(1) (One) H1N1H1N1 형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 Influenza comprising a composition for detecting influenza virus 바이bye 러스 검출용 키트A kit for detecting a lesion 의of 검출한계 Detection limit

H1N1형 인플루엔자 바이러스를 시료로서 준비하고, 시료희석액(25mM HEPES, 100mM NaCl, 2.5mM MgCl2, 0.1% NP40, pH7.5)을 별도로 준비하였다.Prepare the H1N1 influenza virus as a sample, and the sample dilution buffer (25mM HEPES, 100mM NaCl, 2.5mM MgCl 2, 0.1% NP40, pH7.5) was prepared separately.

상기 실시예 2에서 제작한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 시료 주입부에 H1N1형 인플루엔자 바이러스 시료 75㎕를 가하고, 이어 상기 시료 희석액 75㎕를 가한 다음, 암실에서 5분간 반응시키고, 방출된 형광세기를 측정하였다.75 H of H1N1 influenza virus sample was added to the sample injecting section of the kit for detecting influenza virus prepared in Example 2, and then 75 시 of the diluted sample was added, followed by reaction in a dark room for 5 minutes, and the emitted fluorescence intensity was measured Respectively.

이때, 상기 시료에 포함된 H1N1형 인플루엔자 바이러스의 양은 2.5×102 PFU/㎖, 5.0×102 PFU/㎖, 1.0×103 PFU/㎖, 1.0×104 PFU/㎖ 또는 5.0×104 PFU/㎖이 되도록 설정하였고, 대조군은 바이러스를 처리하지 않은 것을 사용하였다.At this time, the amount of the H1N1 influenza virus contained in the specimen 2.5 × 10 2 PFU / ㎖, 5.0 × 10 2 PFU / ㎖, 1.0 × 10 3 PFU / ㎖, 1.0 × 10 4 PFU / ㎖ or 5.0 × 10 4 PFU / Ml, and the control group, which was not treated with virus, was used.

반응 후의 검출용 키트를 375nm 파장에서 여기시켜 검사선과 대조선의 형광세기를 형광리더기(aGcare TRF, Medisensor)로 측정하였다. 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 양자점의 발광파장은 520nm, 580nm, 620nm 또는 640nm으로 하였다.After the reaction, the detection kit was excited at a wavelength of 375 nm and the fluorescence intensity of the test line and the control line was measured with a fluorescent reader (aGcare TRF, Medisensor). Composition for Detecting Influenza Virus The emission wavelength of the quantum dots was 520 nm, 580 nm, 620 nm, or 640 nm.

도 6은 발광파장이 580nm, 620nm 또는 640nm인 양자점을 각 이용한 라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하여 H1N1형 인플루엔자 바이러스 함량에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프로서, 상세하게는 대조선(C)과 검사선(T)의 형광세기 값을 대조선(C)의 형광세기 값을 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸다. FIG. 6 is a graph showing changes in fluorescence intensity according to H1N1 influenza virus content using a kit for detecting influenza virus containing an antibody complex against latex bead-influenza virus nucleoprotein using quantum dots having an emission wavelength of 580 nm, 620 nm or 640 nm Specifically, the graph shows the change in the value calculated by dividing the fluorescent intensity value of the reference line C and the fluorescent intensity value of the reference line C by the fluorescent intensity value of the inspection line T. Specifically,

이를 통하여 발광파장이 580nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 H1N1형 인플루엔자 바이러스에 대한 검출한계는 약 9.3×102 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다. The detection limit for the H1N1 influenza virus of the influenza virus detection kit containing the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 580 nm is about 9.3 × 10 2 PFU / ml Able to know.

또한, 발광파장이 620nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 H1N1형 인플루엔자 바이러스에 대한 검출한계는 약 5.1×102 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.In addition, the detection limit for the H1N1 influenza virus of the influenza virus detection kit containing the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 620 nm is about 5.1 × 10 2 PFU / ml Able to know.

또한, 발광파장이 640nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 H1N1형 인플루엔자 바이러스에 대한 검출한계는 약 5.2×102 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.In addition, the detection limit for the H1N1 influenza virus of the influenza virus detection kit containing the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 640 nm is about 5.2 × 10 2 PFU / ml Able to know.

도 7은 발광파장이 520nm 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 H1N1형 인플루엔자 바이러스에 대한 검출여부를 UV상에서 확인한 것으로, 이를 통하여 발광파장이 520nm 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 H1N1형 인플루엔자 바이러스 검출한계는 약 5.0×104 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.
FIG. 7 shows UV detection of the detection of H1N1 influenza virus in a kit for detecting influenza virus containing an antibody complex against a 520 nm quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein, wherein the emission wavelength is 520 nm The detection limit of the H1N1 influenza virus of the kit for detecting influenza virus containing the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein is found to be about 5.0 × 10 4 PFU / ml.

(2) (2) H5N3형H5N3 type 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트 A kit for detecting influenza virus comprising a composition for detecting influenza virus 의of 검출한계 Detection limit

상기 실시예 2에서 제작한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하고, H5N3형 인플루엔자 바이러스를 시료로서 준비하였다.Using the kit for detecting influenza virus prepared in Example 2, H5N3 influenza virus was prepared as a sample.

상기 시료에 포함된 H5N3형 인플루엔자 바이러스의 양은 1.0×100 PFU/㎖, 2.5×100 PFU/㎖, 5.0×100 PFU/㎖, 1.0×101 PFU/㎖ 또는 5.0×101 PFU/㎖이 되도록 설정하다. 이를 제외하고는 상기 실시예 3의 (1)과 동일한 방법을 수행하여 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 검출한도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 바이러스를 처리하지 않은 것을 사용하였다.The amount of the H5N3 influenza virus contained in the specimen 1.0 × 10 0 PFU / ㎖, 2.5 × 10 0 PFU / ㎖, 5.0 × 10 0 PFU / ㎖, 1.0 × 10 1 PFU / ㎖ or 5.0 × 10 1 PFU / ㎖ To be set. The detection limit of the kit for detecting influenza virus was measured by the same method as (1) of Example 3 except for this. At this time, as the control group, those not treated with virus were used.

반응 후의 검출용 키트를 375nm 파장에서 여기시켜 검사선과 대조선의 형광세기를 형광리더기(aGcare TRF, Medisensor)로 측정하였다. 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 양자점의 발광파장은 520nm, 580nm, 620nm 또는 640nm으로 하였다.After the reaction, the detection kit was excited at a wavelength of 375 nm and the fluorescence intensity of the test line and the control line was measured with a fluorescent reader (aGcare TRF, Medisensor). Composition for Detecting Influenza Virus The emission wavelength of the quantum dots was 520 nm, 580 nm, 620 nm, or 640 nm.

도 8은 발광파장이 580nm, 620nm 또는 640nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하여 H5N3형 인플루엔자 바이러스 함량에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프로서, 상세하게는 대조선(C)과 검사선(T)의 형광세기 값을 대조선(C)의 형광세기 값을 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸다.8 shows changes in fluorescence intensity according to the H5N3 influenza virus content using a kit for detecting influenza virus including an antibody complex against quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein having an emission wavelength of 580 nm, 620 nm or 640 nm As a graph, in particular, the fluorescence intensity values of the reference line C and the inspection line T are represented by the fluorescence intensity values of the reference line C divided.

이를 통하여 발광파장이 580nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트이용한 H5N3형 인플루엔자 바이러스의 검출한계는 약 3.1×100 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다. The detection limit of the H5N3 influenza virus using the kit for detecting influenza virus including the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 580 nm was about 3.1 × 10 0 PFU / ml .

또한, 발광파장이 620nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 이용한 H5N3형 인플루엔자 바이러스의 검출한계는 약 2.4×100 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.In addition, the detection limit of the H5N3 influenza virus using the kit for detecting influenza virus including the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 620 nm is about 2.4 × 10 0 PFU / ml Able to know.

또한, 발광파장이 640nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트을 이용한 H5N3형 인플루엔자 바이러스 검출한계는 약 4.4×100 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.In addition, the detection limit of H5N3 influenza virus using the kit for detecting influenza virus including the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 640 nm is about 4.4 × 10 0 PFU / ml have.

도 9은 발광파장이 520nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트을 이용하여 H5N3형 인플루엔자 바이러스 검출여부를 UV상에서 확인한 것으로, 이를 통하여 발광파장이 520nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 H5N3형 인플루엔자 바이러스에 대한 검출한계는 약 5.0×102 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다. FIG. 9 shows the detection of H5N3 influenza virus by UV using a kit for detecting influenza virus containing an antibody complex against a quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 520 nm, The detection limit for the H5N3 influenza virus of the influenza virus detection kit containing the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein is about 5.0 × 10 2 PFU / ml.

(3) (3) H7N7형H7N7 type 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트 A kit for detecting influenza virus comprising a composition for detecting influenza virus 의of 검출한계 Detection limit

상기 실시예 2에서 제작한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하고, H7N7형 인플루엔자 바이러스를 시료로서 준비하였다.Using the kit for detecting influenza virus prepared in Example 2, H7N7 influenza virus was prepared as a sample.

상기 시료에 포함된 H7N7형 인플루엔자 바이러스의 양은 2.5×10-1 PFU/㎖, 5.0×10-1 PFU/㎖, 1.0×100 PFU/㎖, 5.0×101 PFU/㎖ 또는 1.0×101 PFU/㎖이 되도록 설정하다. 이를 제외하고는 상기 실시예 3의 (1)과 동일한 방법을 수행하여 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 검출한도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 바이러스를 처리하지 않은 것을 사용하였다.The amount of H7N7 influenza virus contained in the sample was 2.5 × 10 -1 PFU / ml, 5.0 × 10 -1 PFU / ml, 1.0 × 10 0 PFU / ml, 5.0 × 10 1 PFU / ml or 1.0 × 10 1 PFU / Ml. The detection limit of the kit for detecting influenza virus was measured by the same method as (1) of Example 3 except for this. At this time, as the control group, those not treated with virus were used.

반응 후의 검출용 키트를 375nm 파장에서 여기시켜 검사선과 대조선의 형광세기를 형광리더기(aGcare TRF, Medisensor)로 측정하였다. 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 양자점의 발광파장은 520nm, 580nm, 620nm 또는 640nm으로 하였다.After the reaction, the detection kit was excited at a wavelength of 375 nm and the fluorescence intensity of the test line and the control line was measured with a fluorescent reader (aGcare TRF, Medisensor). Composition for Detecting Influenza Virus The emission wavelength of the quantum dots was 520 nm, 580 nm, 620 nm, or 640 nm.

도 10은 발광파장이 580nm, 620nm 또는 640nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하여 H7N7형 인플루엔자 바이러스 함량에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프로서, 상세하게는 대조선(C)과 검사선(T)의 형광세기 값을 대조선(C)의 형광세기 값을 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸다. 10 shows the change in fluorescence intensity according to the H7N7 influenza virus content using a kit for detecting influenza virus comprising an antibody complex against a quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein having an emission wavelength of 580 nm, 620 nm or 640 nm As a graph, in particular, the fluorescence intensity values of the reference line C and the inspection line T are represented by the fluorescence intensity values of the reference line C divided.

이를 통하여 발광파장이 580nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 이용한 H7N7형 인플루엔자 바이러스 검출한계는 약 6.0×10-1 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다. The detection limit of the H7N7 influenza virus using the kit for detecting influenza virus including the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 580 nm was about 6.0 × 10 -1 PFU / ml Able to know.

또한, 발광파장이 620nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 이용한 H7N7형 인플루엔자 바이러스 검출한계는 약 5.0×10-1 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.In addition, the detection limit of H7N7 influenza virus using the kit for detecting influenza virus including an antibody complex against a quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 620 nm is about 5.0 × 10 -1 PFU / ml Able to know.

또한, 발광파장이 640nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 이용한 H7N7형 인플루엔자 바이러스 검출한계는 약 7.0×10-1 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.In addition, the detection limit of H7N7 influenza virus using an influenza virus detection kit containing an antibody complex against a quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 640 nm is about 7.0 x 10 < -1 > PFU / Able to know.

도 11은 발광파장이 520nm 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하여 H7N7형 인플루엔자 바이러스 검출여부를 UV상에서 확인한 것으로, 이를 통하여 H7N7형 인플루엔자 바이러스 검출한계가 약 5.0×101 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.
FIG. 11 shows the detection of H7N7 influenza virus detection on the UV using a kit for detecting influenza virus containing an antibody complex against a 520-nm quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein. The H7N7 influenza virus It can be seen that the detection limit is about 5.0 × 10 1 PFU / ml.

(4) (4) H9N2형H9N2 type 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 검출한계 The detection limit of an influenza virus detection kit containing a composition for influenza virus detection

상기 실시예 2에서 제작한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하고, H9N2형 인플루엔자 바이러스를 시료로서 준비하였다.Using the kit for detecting influenza virus prepared in Example 2, H9N2 influenza virus was prepared as a sample.

상기 시료에 포함된 H9N2형 인플루엔자 바이러스의 양은 2.5×10-2 PFU/㎖, 5.0×10-2 PFU/㎖, 1.0×10-1 PFU/㎖, 5.0×10-1 PFU/㎖ 또는 1.0×100 PFU/㎖이 되도록 설정하다. 이를 제외하고는 상기 실시예 3의 (1)과 동일한 방법을 수행하여 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 검출한도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 바이러스를 처리하지 않은 것을 사용하였다.The amount of H9N2 influenza virus contained in the sample was 2.5 × 10 -2 PFU / ml, 5.0 × 10 -2 PFU / ml, 1.0 × 10 -1 PFU / ml, 5.0 × 10 -1 PFU / 0 PFU / ml. The detection limit of the kit for detecting influenza virus was measured by the same method as (1) of Example 3 except for this. At this time, as the control group, those not treated with virus were used.

반응 후의 검출용 키트를 375nm 파장에서 여기시켜 검사선과 대조선의 형광세기를 형광리더기(aGcare TRF, Medisensor)로 측정하였다. 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 양자점의 발광파장은 520nm, 580nm, 620nm 또는 640nm으로 하였다.After the reaction, the detection kit was excited at a wavelength of 375 nm and the fluorescence intensity of the test line and the control line was measured with a fluorescent reader (aGcare TRF, Medisensor). Composition for Detecting Influenza Virus The emission wavelength of the quantum dots was 520 nm, 580 nm, 620 nm, or 640 nm.

도 12는 발광파장이 580nm, 620nm 또는 640nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하여 H9N2형 인플루엔자 바이러스 함량에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프로서, 상세하게는 대조선(C)과 검사선(T)의 형광세기 값을 대조선(C)의 형광세기 값을 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸다. 12 shows the change in fluorescence intensity according to the H9N2 influenza virus content using a kit for detecting influenza virus containing an antibody complex against a quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 580 nm, 620 nm or 640 nm As a graph, in particular, the fluorescence intensity values of the reference line C and the inspection line T are represented by the fluorescence intensity values of the reference line C divided.

이를 통하여 발광파장이 580nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 이용하여 H9N2형 인플루엔자 바이러스의 검출한계가 약 2.6×10-1 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다. The detection limit of the H9N2 influenza virus was about 2.6 x 10 < -1 > PFU / ml using the kit for detecting influenza virus including the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein having an emission wavelength of 580 nm .

또한, 발광파장이 620nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 이용하여 H9N2형 인플루엔자 바이러스 검출한계가 약 1.0×10-1 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.Further, the detection limit of H9N2 influenza virus was about 1.0 x 10 < -1 > PFU / ml using a kit for detecting influenza virus containing an antibody complex against a quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 620 nm .

또한, 발광파장이 640nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 이용하여 H9N2형 인플루엔자 바이러스 검출한계가 약 6.0×10-2 PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.Further, the detection limit of H9N2 influenza virus was about 6.0 × 10 -2 PFU / ml using a kit for detecting influenza virus containing an antibody complex against a quantum dot-latex bead-influenza virus nucleotide protein having an emission wavelength of 640 nm .

도 13은 발광파장이 520nm 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하여 H9N2형 인플루엔자 바이러스 검출여부를 UV상에서 확인한 것으로, 이를 통하여 발광파장이 520nm인 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 뉴클레오단백질에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 UV상 검출한계는 약 1.0×101PFU/㎖을 나타냄을 알 수 있다.
13 shows the detection of H9N2 influenza virus by UV detection using a kit for detecting influenza virus containing an antibody complex against a 520 nm quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein, wherein the emission wavelength is 520 nm The detection limit of the UV phase of the kit for detecting influenza virus containing the antibody complex against the quantum dot-latex bead-influenza virus nucleoprotein is about 1.0 × 10 1 PFU / ml.

(5) (5) H5N1형H5N1 type 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자  Influenza comprising a composition for detecting influenza virus 바이bye 러스 HA 항원 검출용 키트의 검출한계Detection limit of kit for detecting HA HA antigen

상기 실시예 2에서 제작한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하고, H5N1형 인플루엔자 바이러스 HA 항원을 시료로서 준비하였다.Using the kit for detecting influenza virus prepared in Example 2, H5N1 influenza virus HA antigen was prepared as a sample.

상기 시료에 포함된 H5N1형 인플루엔자 바이러스의 HA 항원 함량은 1.25×10-2 ㎍/㎖, 2.5×10-2 ㎍/㎖, 5.0×10-2 ㎍/㎖, 5.0×10-1 ㎍/㎖ 또는 2.0×102 ㎍/㎖이 되도록 설정하였다. 이를 제외하고는 상기 실시예 3의 (1)과 동일한 방법을 수행하여 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 검출한도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 항원을 처리하지 않은 것을 사용하였다.The HA antigen content of the H5N1 influenza virus contained in the sample was 1.25 × 10 -2 μg / ml, 2.5 × 10 -2 μg / ml, 5.0 × 10 -2 μg / ml, 5.0 × 10 -1 μg / ml or 2.0 x 10 < 2 > g / ml. The detection limit of the kit for detecting influenza virus was measured by the same method as (1) of Example 3 except for this. At this time, as the control group, those not treated with the antigen were used.

도 14는 발광파장이 620nm인 양자점을 이용한 양자점-라텍스 비드-H5N1형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체 복합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하여 H5N1형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 함량에 따른 형광세기의 변화를 나타내는 그래프로서, 상세하게는 대조선(C)과 검사선(T)의 형광세기 값을 대조선(C)의 형광세기 값을 나누어 산출한 값의 변화를 나타낸다. 이를 통하여 H5N1형 인플루엔자 바이러스 HA 항원 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 검출한계는 약 5.0×10-2 ㎍/㎖을 나타냄을 알 수 있다.
14 is a graph showing the effect of the H5N1 influenza virus hemagglutinin (H5N1) influenza virus hemagglutinin (H5N1) influenza virus using a kit for detecting influenza virus containing an antibody complex against a quantum dot-latex bead-H5N1 influenza virus hemagglutinin (HA) using a quantum dot having an emission wavelength of 620 nm (C) and the inspection line (T) by the fluorescence intensity value of the control line (C). The graph shows the change of the fluorescence intensity according to the content of HA . Thus, the detection limit of the influenza virus detection kit containing the composition for detecting H5N1 influenza virus HA antigen is about 5.0 × 10 -2 ㎍ / ml.

실시예Example 4. 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 민감도 및 특이도 확인 4. Identification of Sensitivity and Specificity of Influenza Virus Detection Kit Containing Composition for Detecting Influenza Virus

인플루엔자 바이러스 중 H1N1형에 감염된 사람의 비후강 검체를 상기 실시예 2에서 제작한 형광 H1N1형 인플푸엔자 바이러스 검출용 키트에 적용하여, 검출반응을 수행하였고, 검출 민감성을 확인하였다.A hypertrophic specimen of a human infected with the H1N1 strain of the influenza virus was applied to the kit for the detection of the fluorescent H1N1 influenza virus prepared in Example 2, and the detection reaction was carried out to confirm the detection sensitivity.

H1N1형 인플루엔자 바이러스를 대신하여 H1N1형 인플루엔자 바이러스에 감염된 환자의 비후강 검체를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 3의 방법을 이용하여 H1N1형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 대조선(C)과 검사선(T)에서 방출된 형광세기를 측정하였다. 이때 대조군은 정상인의 비후강 검체를 사용하였다.A kit for the detection of influenza virus comprising a composition for detecting H1N1 influenza virus using the method of Example 3, except that a hyperplastic specimen of a patient infected with H1N1 influenza virus was used instead of the H1N1 influenza virus Fluorescence intensity emitted from the control line (C) and the test line (T) was measured. At this time, the control group was a normal human hypertrophic specimen.

임상 양성 검체에 대한 민감도 시험:Sensitivity test for clinically positive specimens:

RT-PCR을 통하여 H1N1형 바이러스 감염 양성으로 판정된 9개의 검체에 대해 상기 H1N1형 인플루엔자 바이러스 HA항원 검출용 키트는 9개 검체에 대해 양성의 결과를 보였다(도 15).The 9 H1N1 influenza virus antigen detection kits were positive for 9 specimens determined to be positive for H1N1 virus infection by RT-PCR (Fig. 15).

하기 계산식(1)로부터 본 발명의 키트의 민감도가 100%임을 알 수 있었다.From the following equation (1), it can be seen that the sensitivity of the kit of the present invention is 100%.

식(1) 민감도(%)=(양성 결과의 검체 수/검사에서 사용된 양성 검체수)×100 (1) Sensitivity (%) = (number of positive samples / number of positive samples used) × 100

따라서, 본 발명의 키트의 민감도(%)=양성 9 검체/9 양성 검체수×100 = 100%이다.Therefore, the sensitivity (%) of the kit of the present invention = 9 positive samples / 9 positive samples × 100 = 100%.

임상 음성 검체에 대한 특이도 시험:Specificity test for clinical negative specimens:

RT-PCR을 통하여 H1N1형 바이러스 감염 음성으로 판정된 16개의 검체에 대해 상기 H1N1형 인플루엔자 바이러스 HA항원 검출용 키트는 16개 검체에 대해 음성의 결과를 보였다(도 15).The 16 H1N1-type influenza virus antigen detection kits were negative for 16 specimens determined to be negative for H1N1 virus infection by RT-PCR (Fig. 15).

하기 계산식(2)로부터 본 발명의 키트의 특이도가 100%임을 알 수 있었다.From the following equation (2), it can be seen that the specificity of the kit of the present invention is 100%.

식(2) 특이도(%)=(음성 결과의 검체 수/검사에서 사용된 음성 검체수)×100 (2) Specificity (%) = (number of samples with negative result / number of negative samples used in test) × 100

따라서, 본 발명의 키트의 특이도(%)=음성 16 검체/16 음성 검체수×100 = 100%이다.Therefore, the specificity (%) of the kit of the present invention = 16 samples of negative / 16 samples of negative / 100 = 100%.

Claims (17)

라텍스 비드에 친수성 화합물이 코팅된 양자점이 결합되고, 상기 라텍스 비드 표면에 인플루엔자 바이러스 항체가 결합된 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.A latex bead-influenza virus antibody complex in which latex beads are bound with quantum dots coated with a hydrophilic compound and an influenza virus antibody is bound to the surface of the latex beads, as an active ingredient. 제1항에 있어서, 상기 라텍스 비드 및 친수성 화합물이 코팅된 양자점은 1:50~1,000의 몰비로 결합된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.The composition for detecting influenza virus according to claim 1, wherein the latex beads and the quantum dots coated with the hydrophilic compound are bound in a molar ratio of 1:50 to 1,000. 제1항에 있어서, 상기 라텍스 비드 및 인플루엔자 바이러스 항체는 1:50~500의 몰비로 결합된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.The composition for detecting influenza virus according to claim 1, wherein the latex beads and the influenza virus antibody are bound at a molar ratio of 1:50 to 500. 제1항에 있어서, 상기 라텍스 비드의 직경은 10~2,000nm인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.The composition for detecting influenza virus according to claim 1, wherein the latex bead has a diameter of 10 to 2,000 nm. 제1항에 있어서, 상기 친수성 화합물이 코팅된 양자점의 직경은 1~30nm이고, 발광파장은 450~700nm인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.The composition for detecting influenza virus according to claim 1, wherein the quantum dots coated with the hydrophilic compound have a diameter of 1 to 30 nm and an emission wavelength of 450 to 700 nm. 제2항에 있어서, 상기 라텍스 비드와 친수성 화합물이 코팅된 양자점의 결합은 라텍스 비드 표면에 있는 아미노기와 양자점에 포함된 카르복실기 사이의 아마이드 결합인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.The composition for detecting influenza virus according to claim 2, wherein the binding of the latex bead and the quantum dot coated with the hydrophilic compound is an amide bond between the amino group on the surface of the latex bead and the carboxyl group contained in the quantum dot. 제3항에 있어서, 상기 라텍스 비드와 인플루엔자 바이러스 항체의 결합은 라텍스 비드 표면에 있는 카르복실기와 인플루엔자 바이러스 항체에 포함된 아미노기 사이의 아마이드 결합인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.The composition for detecting influenza virus according to claim 3, wherein the binding between the latex bead and the influenza virus antibody is an amide bond between a carboxyl group on the latex bead surface and an amino group contained in an influenza virus antibody. 제1항에 있어서, 상기 양자점은 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴설파이드(CdS), 카드뮴텔로리움(CdTe), 징크텔로리움(ZnTe), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크설파이드(ZnS), 징크옥사이드(ZnO), 인듐 인화물(InP), 인듐 비화물(InAs), 머큐리텔로리움(HgTe) 및 머큐리셀레나이드(HgSe) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.The method of claim 1, wherein the quantum dots include at least one of CdSe, CdS, CdTe, ZnTe, ZnSe, ZnS, , Zinc oxide (ZnO), indium phosphide (InP), indium paraffin (InAs), mercuritolium (HgTe) and mercury selenide (HgSe). 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 항체는 H1N1형, H5N3형, H7N7형, H9N2형 또는 H5N1형 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.The composition for detecting influenza virus according to claim 1, wherein the influenza virus antibody is an antibody specifically recognizing influenza viruses of H1N1, H5N3, H7N7, H9N2 or H5N1. 제1항에 있어서, 상기 친수성 화합물은 시스테아민(cysteamine), 머캅토숙신산(mercaptosuccinic acid), 머캅토프로피온산(mercaptopropionic acid), 글루타티온(glutathion), 시스테인(cysteine) 및 티올-함유 실란 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.The method of claim 1, wherein the hydrophilic compound is selected from the group consisting of cysteamine, mercaptosuccinic acid, mercaptopropionic acid, glutathione, cysteine, and thiol- Wherein the composition is for the detection of influenza virus. (a) 양자점(quantum dots; QDs)의 표면을 친수성 화합물로 코팅하는 단계;
(b) 상기 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드를 아마이드 결합반응을 통해 결합시키는 단계;
(c) 상기 양자점이 결합된 라텍스 비드의 표면에 존재하는 아미노기와 숙신산무수물(succinic anhydride)을 반응시켜 상기 라텍스 비드 표면을 카르복실기로 치환하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 치환된 라텍스 비드 표면의 카르복실기와 인플루엔자 바이러스 항체에 포함된 아미노기를 아마이드 결합반응을 통해 결합시킨 후, 원심분리하여 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 수득하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물의 제조방법.(a) coating the surface of quantum dots (QDs) with a hydrophilic compound;
(b) bonding the hydrophilic compound-coated quantum dot and the latex bead through an amide bonding reaction;
(c) reacting a succinic anhydride with an amino group present on the surface of the latex bead to which the quantum dots are bound to replace the surface of the latex bead with a carboxyl group; And
(d) binding the carboxyl group on the surface of the latex beads substituted in step (c) with the amino group contained in the influenza virus antibody through an amide bond reaction and then centrifuging to obtain a quantum dot-latex bead-influenza virus antibody complex ≪ / RTI >; and a method for the detection of influenza virus. 제11항에 있어서, 상기 단계 (b) 및 (d)의 아마이드 결합반응은 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS)의 존재하에 수행되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물의 제조방법.12. The method of claim 11, wherein the amide coupling reaction of steps (b) and (d) is carried out by reacting 1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Sulfo-NHS). ≪ / RTI > 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.A kit for detecting influenza virus comprising the composition for detecting influenza virus according to any one of claims 1 to 10. 제13항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로 부터 일정 간격 이격된 지점에 위치하는 시료 내의 인플루엔자 바이러스 항원과 결합하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원의 결합부; 상기 결합부로부터 일정간격이 이격된 위치에 상기 인플루엔자 바이러스의 특이적 항체가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 테스트 스트립 형태의 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.14. The influenza virus detection kit according to claim 13, wherein the influenza virus detection kit comprises: a sample injection unit for injecting a sample; A binding portion of an influenza virus antigen comprising a composition for detecting an influenza virus that binds to an influenza virus antigen in a sample located at a position spaced apart from the sample injecting portion by a predetermined distance; A test line in which the specific antibody of the influenza virus is immobilized at a position spaced apart from the binding portion at a predetermined interval; And a control line on which an anti-mouse IgG is immobilized are sequentially provided on the test strip-type influenza virus detection kit. 제14항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 항원의 결합부는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 0.2×10-6~1.0×10-5nmole의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.15. The method of claim 14 wherein the influenza virus antigen binding portion of an influenza virus for detecting compositions 0.2 × 10 -6 ~ 1.0 × 10 -5 for influenza virus detection kit comprising an amount of nmole. 제14항에 있어서, 상기 시료는 사람 또는 동물의 비후강 또는 분변인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.15. The kit for detecting influenza virus according to claim 14, wherein the sample is a thickening or feces of a person or an animal. 제14항의 인플루엔자 바이러스 검출용 키트에 인플루엔자 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 형광빛 띠가 나타나면, 인플루엔자 바이러스 감염을 양성으로 판정하고, 대조선에만 형광빛 띠가 나타나면, 인플루엔자 바이러스 감염을 음성으로 판정하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출 방법.A sample suspected of containing an influenza virus is put into a kit for detecting influenza virus according to claim 14, and when a fluorescent light band appears on the test line and the test strip of the test strip, it is judged that the influenza virus infection is positive and only a fluorescent light band And if so, determining that the influenza virus infection is negative.
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