KR101774749B1 - Recombinant antigenic protein for diagnosis of canine leptospira IgG,IgM antibody and diagnostic kit by using the same simultaneously - Google Patents
Recombinant antigenic protein for diagnosis of canine leptospira IgG,IgM antibody and diagnostic kit by using the same simultaneously Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 개시에 따르면, 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 개(canine) 렙토스피라 IgG, IgM 항체 동시 진단용 재조합 항원 단백질, 개(canine) 렙토스피라의 재조합 단백질의 제조방법, 개(canine) 렙토스피라의 재조합 단백질을 포함하는 진단키트 및 동시 진단키트를 제공한다.According to the teachings of the present invention, there is provided a method for producing a recombinant protein of canine leptospira, a recombinant protein of canine leptospira, a recombinant antigen protein for simultaneous diagnosis of IgM antibody, a canine leptospira, a canine leptospira IgG recombinant LipL21 and LipL32, And a simultaneous diagnostic kit comprising the recombinant protein.
Description
본 발명은 개에 감염되는 렙토스피라 균에 대한 항-렙토스피라 이뮤노글로불린 M(Immunoglobulin M)과 항-렙토스피라 이뮤노글로불린 G(Immunoglobulin G)를 동시에 진단하기 위한 면역 진단 키트 및 진단 방법, 그리고 이에 이용되는 재조합 항원 단백질에 관한 것이다. The present invention relates to an immunoassay kit and a diagnostic method for simultaneously diagnosing anti-leptospira immunoglobulin M and anti-leptospira immunoglobulin G against leptospira infected with a dog, RTI ID = 0.0 > recombinant < / RTI >
좀 더 구체적으로, 본 발명은 면역크로마토그라피법을 사용하여 렙토스피라균에 자연 감염되거나 백신을 투여하였을 때 생성되는 IgG 및 IgM 항체를 진단하는 동시 진단 키트에 관한 것이다.More particularly, the present invention relates to a simultaneous diagnostic kit for diagnosing IgG and IgM antibodies produced when a natural infection or vaccine is administered to a leptospirosis using immunochromatography.
렙토스피라균은 크게 비병원성인 렙토스피라 바이플레사(Leptospira biflexa)와 병원성인 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interoggans)로 나눠지며 병원성 균인 렙토스피라 인테로간스에 의하여 렙토스피라증(Leptospirosis)이 발생된다. 주로 7월에서 11월 사이에 빈발하는 계절 감염병이며 동물이나 사람에 감염되는 인수 공통 질병이다. 감염된 동물이나 사람의 소변에 있는 렙토스피라균이 전파되어 다른 개체에 감염되어 집단 발생할 수 있는 질병이다. Leptospira is divided into Leptospira biflexa and Leptospira interoggans, which are largely non-pathogenic, and hospitalized adult leptospira interoggans. Leptospirosis is caused by the pathogenic germ, Leptospira, Terogenis. It is a seasonal infectious disease that is frequent between July and November, and it is a common disease that infects animals or people. Leptospirosis in the urine of infected animals or humans is a disease that can be spread by spreading and infecting other individuals and causing masses.
렙토스피라 인테로간스에 감염되어 발생되는 증상으로는 급성 렙토스피라증으로서 무유, 황달, 혈색소뇨증(Haemoglobinuria)이 나타나며 특히 어린 동물에게 뇌수막염, 급성 신부전 등의 증상이 나타난다. 만성 렙토스피라증은 유산, 사산, 불임, 만성 신부전, 만성 간염 등의 증상이 나타난다. 치료시기를 놓치면 합병증을 일으켜 치사율이 20%에 이르는 위험한 질병으로 알려져 있다. Leptospira infection is caused by acute leptospirosis, which is characterized by the absence of milk, jaundice, and hemoglobinuria. Especially in young animals, symptoms such as meningitis and acute kidney failure occur. Chronic leptospirosis presents with symptoms such as abortion, stillbirth, infertility, chronic renal failure, and chronic hepatitis. It is known to be a dangerous disease with a mortality rate of up to 20% by causing complications when missed treatment time.
이러한 렙토스피라증은 인수 공통 질병으로 동물에서 사람으로 감염되거나 사람에서 동물로 감염되기에 반려 동물에 대한 렙토스피라균의 감염 여부는 매우 중요하게 해석될 수 있다.Such leptospirosis may be interpreted very importantly as an infectious disease, since it is a common infectious disease, from animal to human or from human to animal.
렙토스피라균은 약 240여 종류의 병원성 렙토스피라 혈청형이 있으며 주로 개에 감염되는 혈청형으로는 캐니콜라(canicola)이며 포모나(pomona), 그립포티포사(Grippotyphosa), 익테로해모라지에(icterohaemorrhagiae), 어스트라리스(Australis)등이 있다.Leptospira has about 240 kinds of pathogenic leptospirosis serotypes. Among the serotypes that can be infected with dogs are canicola, pomona, Grippotyphosa, icterohaemorrhagiae, And Australis.
개 렙토스피라 항체의 진단은 렙토스피라균을 사용하여 항체 역가를 측정하는 현미경적 응집검사(Microscopic agglutination test)를 표준 진단법으로 사용하고 있다. MAT에 의한 역가가 1:400 이상을 나타내면 1주~여러 해 전에 감염된 항체 양성자로 판정하며, 1:800 이상의 역가를 나타내면 최근이나 현재 감염된 상태로 판정할 수 있다. 하지만 렙토스피라균 보관 및 배양의 문제점이 있으며 각 균주는 타 혈청균과 교차반응이 있지만 같은 혈청균에 대해 역가가 높게 측정되므로 각 혈청군에 대해 각각 검사를 진행해야 하는 문제점이 있다. The diagnosis of leptospira antibodies is made using the microscopic agglutination test (Leptospira spp.), Which measures antibody titer, as a standard diagnostic method. If the activity by MAT is 1: 400 or more, it is judged to be an antibody positive from 1 week to several years ago. If the activity value is 1: 800 or more, it can be determined as recent or presently infected. However, there are problems in the storage and cultivation of leptospira, and each strain has a cross-reaction with other serogroups, but the serogroups have high titers for the same serogroups.
이런 문제점을 해결하기 위해 효소면역 측정법(ELISA), 중합효소 연쇄반응(PCR) 등을 이용한 진단법이 연구되었다. 상기 언급된 면역항체 측정기술은 리더(reader) 및 실험기구 등이 요구되어, 현장에서의 진단법으로는 실행하기가 어려우며 시간 또한 많이 소요된다.To solve these problems, diagnostic methods using enzyme immunoassay (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR) have been studied. The above mentioned immunoassay technique is required to be a reader and an experimental apparatus, and it is difficult to perform by an on-site diagnostic method and takes a lot of time.
본 발명은 면역크로마토그라피법을 사용하여 렙토스피라균에 자연 감염되거나 백신을 투여하였을 때 생성되는 IgG 및 IgM 항체를 진단하는 동시 진단 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a simultaneous diagnostic kit for diagnosing IgG and IgM antibodies produced when a natural infection or vaccine is administered to a leptospirosis using immunochromatography.
본 발명의 일 실시형태는 렙토스피라의 지질단백질인 LipL21-LipL32 재조합 항원 단백질을 제공한다.One embodiment of the present invention provides LipL21-LipL32 recombinant antigen protein, a lipid protein of Leptospira.
본 발명의 다른 실시형태는 상기 렙토스피라의 지질단백질 코딩 서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a recombinant expression vector comprising the lipid protein coding sequence of said Leptospira.
본 발명의 또 다른 실시형태는 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.Yet another embodiment of the present invention provides a host cell transformed with said recombinant expression vector.
본 발명의 다른 실시형태는 상기 숙주세포를 배양한 후 렙토스피라 재조합 LipL21-LipL32 항원 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 렙토스피라의 재조합 항원 단백질의 제조방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a method for preparing a recombinant antigen protein of Leptospira comprising culturing the host cell and obtaining a Leptospira recombinant LipL21-LipL32 antigen protein.
본 발명의 다른 실시형태는 상기 렙토스피라의 재조합 항원 단백질을 포함하는 개 렙토스피라 IgG 항체를 진단할 수 있는 진단 키트를 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a diagnostic kit capable of diagnosing canine leptospira IgG antibody comprising the recombinant antigen protein of Leptospira.
본 발명의 다른 실시형태는 상기 렙토스피라의 재조합 항원 단백질을 포함하는 개 렙토스피라 IgM 항체를 진단할 수 있는 진단 키트를 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a diagnostic kit capable of diagnosing canine leptospira IgM antibody comprising the recombinant antigen protein of Leptospira.
본 발명의 또 다른 실시형태는 상기 렙토스피라의 재조합 항원 단백질을 포함하는 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체를 동시 진단할 수 있는 동시 진단키트를 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a simultaneous diagnostic kit capable of simultaneously diagnosing the leptospira IgM, IgG antibody comprising the recombinant antigen protein of the leptospira.
본 발명의 다른 실시형태는 검체를 분석 스트립의 접적 영역에 일정량 투입하는 단계와 소정의 표지가 구비된 검출시약과 상기 검체 중의 분석물과 결합시켜 복합체를 형성하는 단계, 상기 복합체를 멤브레인에 전개하는 단계 및 상기 멤브레인 상의 소정 영역에 렙토스피라균으로부터 면역반응을 통해 얻어진 항체에 대해 고정상을 갖는 반응부의 외관변화를 관찰하는 단계를 포함하며, 상기 반응부에는 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질이 코팅된 개 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단하는 진단방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention is a method for analyzing a sample, comprising the steps of injecting a specimen into a contact area of an assay strip, combining a detection reagent with a predetermined label and an analyte in the specimen to form a complex, And a step of observing a change in appearance of a reaction part having a fixed phase with respect to an antibody obtained through an immune reaction from a leptospirosis in a predetermined region on the membrane, wherein the reaction part comprises a recombinant LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of Leptospira, The present invention provides a diagnostic method for simultaneously diagnosing IgE antibodies and leptospira IgG coated with an antigen protein.
많은 혈청형에 대해 생성된 항체를 특이적 항원-항체 결합을 할 수 있는 재조합 항원 단백질을 제공하며, 렙토스피라 감염 및 백신에 의한 항체를 진단할 수 있다.Antibodies generated against many serotypes can be provided to recombinant antigen proteins capable of specific antigen-antibody binding, and antibodies to leptospira infection and vaccines can be diagnosed.
특히, 본 발명의 일 실시형태에 따르면 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 렙토스피라 IgG, IgM 항체 동시 진단용 재조합 항원 단백질을 이용함으로써, 렙토스피라 IgG, IgM 항체를 동시에 신속하며 우수한 검출을 할 수 있다.In particular, according to one embodiment of the present invention, leptospira IgG and IgM antibodies can be rapidly and rapidly detected by using recombinant antigen proteins for simultaneous diagnosis of leptospira IgG and IgM antibodies, which are recombinant LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of leptospirosis .
또한, 종래와 달리 렙토스피라 IgG 항체에 대해서도 우수한 검출 결과를 얻을 수 있다.Also, unlike the conventional method, excellent detection results can be obtained for the leptospira IgG antibody.
도 1은 본 발명에서 사용되는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pET21a-LipL21-His(A), pET21a-LipL32-His(B), pET21a-LipL21/23-His(C)에 대한 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 진단키트의 구성도이다.
도 3은 본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgM 항체 진단키트 스트립의 구성도이다.
도 4는 본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgG 항체 진단키트 스트립의 구성도이다.
도 5는 본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단키트의 검체 적용후의 반응 결과 예를 촬영한 사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단키트 결과에 따른 해석을 보여주는 표이다.
도 7은 본 발명에 사용된 LipL21-His(A), LipL32-His(B), LipL21/23-His(C)의 SDS-PAGE 결과이다.
도 8은 본 발명에 사용된 LipL21-His(A), LipL32-His(B), LipL21/23-His(C)의 ELISA 결과이다.
도 9는 본 발명에 해당되는 서열목록을 나타낸 것임.FIG. 1 is a diagram showing recombinant expression vectors pET21a-LipL21-His (A), pET21a-LipL32-His (B) and pET21a-LipL21 / 23-His (C) containing genes used in the present invention.
2 is a configuration diagram of a diagnostic kit according to the present invention.
FIG. 3 is a block diagram of the kit for analyzing the leptospira IgM antibody according to the present invention.
FIG. 4 is a block diagram of the kit for analyzing the leptospira IgG antibody according to the present invention. FIG.
FIG. 5 is a photograph showing an example of a reaction result after application of a sample of a kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibody according to the present invention.
FIG. 6 is a table showing the analysis according to the result of the kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibodies according to the present invention.
7 shows SDS-PAGE results of LipL21-His (A), LipL32-His (B) and LipL21 / 23-His (C) used in the present invention.
FIG. 8 shows ELISA results of LipL21-His (A), LipL32-His (B) and LipL21 / 23-His (C) used in the present invention.
FIG. 9 shows a sequence listing corresponding to the present invention.
이하, 구체적인 실시형태 및 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 도면에서의 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있으며, 도면상의 동일한 부호로 표시되는 요소는 동일한 요소이다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to specific embodiments and the accompanying drawings. However, the embodiments of the present invention can be modified into various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below. Furthermore, embodiments of the present invention are provided to more fully explain the present invention to those skilled in the art. Accordingly, the shapes and sizes of the elements in the drawings may be exaggerated for clarity of description, and the elements denoted by the same reference numerals in the drawings are the same elements.
그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하고, 여러 층 및 영역을 명확하게 표현하기 위하여 두께를 확대하여 나타내었으며, 동일한 사상의 범위 내의 기능이 동일한 구성요소는 동일한 참조부호를 사용하여 설명한다.It is to be understood that, although the present invention has been described with reference to exemplary embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, Will be described using the symbols.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
Throughout the specification, when an element is referred to as "comprising ", it means that it can include other elements as well, without excluding other elements unless specifically stated otherwise.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 개 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21, LipL32를 포함하는 재조합 항원 단백질인 LipL21/32-His을 사용하여 개 렙토스피라 항체 IgM, IgG에 대한 동시 진단키트에 관한 것이다.According to one embodiment of the present invention, a kit for simultaneous diagnosis of leptospira antibodies IgM and IgG using LipL21 / 32-His, a recombinant antigen protein comprising LipL21 and LipL32, lipid proteins of canine leptospirosis.
본 발명 일 실시형태에 사용된 LipL21의 아미노산 서열은 GeneBank No. DQ173546.1로 등록된 서열을 사용하며 LipL32의 아미노산 서열은 GeneBank No. AY568679.1로 등록된 서열을 사용할 수 있다.The amino acid sequence of LipL21 used in one embodiment of the present invention is GeneBank No. 1. The amino acid sequence of LipL32 is listed in GeneBank No. 1, using the sequence registered as DQ173546.1. A sequence registered as AY568679.1 can be used.
좀 더 구체적으로, 본 발명의 다른 실시형태에 따르면 면역크로마토그래피법을 사용하여 개 렙토스피라 균에 감염되거나 백신접종으로 인하여 초기에 생성되는 IgM과 3~5일 뒤에 생성되는 IgG를 진단하여 감염 여부 및 면역 증강 상태를 진단하는 방법을 제공한다.More specifically, according to another embodiment of the present invention, an immunochromatographic method is used to diagnose IgM which is infected with canine leptospirosis or is initially produced due to vaccination and IgG which is produced 3 to 5 days later, Thereby providing a method for diagnosing an immune enhancement state.
본 발명의 일 실시형태에 사용되는 LipL21/32-His 재조합 항원 단백질을 이용하여 많은 혈청형이 존재하는 렙토스피라 항체에 대한 높은 특이도와 민감도로 렙토스피라균의 감염여부 및 백신투여에 대한 면역증강상태를 진단할 수 있다.Using the LipL21 / 32-His recombinant antigen protein, which is used in one embodiment of the present invention, the high specificity and sensitivity of leptospira antibodies having many serotypes were examined to determine whether leptospirosis was infected and the immune enhancement status for vaccine administration can do.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 실시형태는 렙토스피라 항원 LipL21과 LipL32가 융합된 재조합 형태로서 렙토스피라 특이 항체인 IgM, IgG를 포획하며, 신속하게 면역크로마토그래피법에 의해 검체에서 렙토스피라 IgM, IgG를 특이적으로 검출할 수 있는 분석 스트립을 제공한다.In order to achieve the above object, an embodiment of the present invention is to provide a recombinant form in which Leptospira antigens LipL21 and LipL32 are fused to capture leptospira specific antibodies IgM and IgG, and can be rapidly detected by immunochromatography in a sample using leptospira IgM, IgG Lt; / RTI > can be specifically detected.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 개 렙토스피라 IgG, IgM 항체 동시 진단용 재조합 항원 단백질을 제공한다.According to one embodiment of the present invention, there is provided a recombinant antigen protein for the simultaneous diagnosis of canine leptospira IgG and IgM antibody, which is a recombinant LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of leptospirosis.
상기 LipL21과 LipL32는 렙토스피라 인테로간스(Leptospira Interrogans) 지질 단백질일 수 있다.The LipL21 and LipL32 may be Leptospira interrogans lipid proteins.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질을 사용하여 렙토스피라 IgG, IgM 항체를 동시에 진단하므로, 렙토스피라 IgG, IgM 항체를 동시에 신속하며 우수한 검출을 할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the recombinant antigen protein recombinant with LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of leptospirosis, is used to simultaneously diagnose the leptospira IgG and IgM antibodies. Thus, the leptospira IgG and IgM antibodies can be rapidly and rapidly detected have.
또한, 종래와 달리 렙토스피라 IgG 항체에 대해서도 우수한 검출 결과를 얻을 수 있다.Also, unlike the conventional method, excellent detection results can be obtained for the leptospira IgG antibody.
상기 렙토스피라 IgG, IgM 항체는 개(Canine) 렙토스피라 IgG, IgM 항체일 수 있다.The leptospira IgG and IgM antibodies may be canine leptospira IgG or IgM antibodies.
도 1은 본 발명에서 사용되는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pET21a-LipL21-His(A), pET21a-LipL32-His(B), pET21a-LipL21/23-His(C)에 대한 도식화한 도면이다.FIG. 1 is a diagram showing recombinant expression vectors pET21a-LipL21-His (A), pET21a-LipL32-His (B) and pET21a-LipL21 / 23-His (C) containing genes used in the present invention.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 상기 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질의 코딩 서열을 포함하는 개 렙토스피라 IgG, IgM 항체 동시 진단용 재조합 발현 벡터를 제공한다.According to another embodiment of the present invention, there is provided a recombinant expression vector for simultaneous diagnosis of human leptospira IgG and IgM antibody comprising the coding sequence of the recombinant antigen protein recombinant with LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of the leptospires.
도 1a를 참조하면, 상기 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터는 pET21a-LipL21-His로 명명될 수 있다.Referring to FIG. 1A, the recombinant expression vector comprising the gene of LipL21, which is a lipid protein of the leptospires, can be named pET21a-LipL21-His.
상기 재조합 발현 벡터는 LipL21 그 자체 염기 서열과 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가될 수 있다.The recombinant expression vector may have LipL21 own base sequence and 6 histidine at the C-terminal.
상기 재조합 발현 벡터는 상기와 같은 구조로 인해 렙토스피라 진단에 유용하도록 항원성이 극대화될 수 있으며, C-말단에 6개의 히스티딘이 첨가됨으로써, 재조합 단백질의 정제가 용이할 수 있다.The recombinant expression vector can maximize antigenicity so as to be useful for the diagnosis of leptospira due to the above structure, and 6 histidine at the C-terminal can be added to facilitate the purification of the recombinant protein.
한편, 도 1b를 참조하면, 상기 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL32의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터는 pET21a-LipL32-His로 명명될 수 있다.Meanwhile, referring to FIG. 1B, the recombinant expression vector containing the gene of LipL32, which is a lipid protein of the leptospires, can be named pET21a-LipL32-His.
상기 재조합 발현 벡터는 LipL32 그 자체 염기 서열과 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가될 수 있다.The recombinant expression vector may contain LipL32 itself and six histines at the C-terminus.
상기 재조합 발현 벡터는 상기와 같은 구조로 인해 렙토스피라 진단에 유용하도록 항원성이 극대화될 수 있으며, C-말단에 6개의 히스티딘이 첨가됨으로써, 재조합 단백질의 정제가 용이할 수 있다.The recombinant expression vector can maximize antigenicity so as to be useful for the diagnosis of leptospira due to the above structure, and 6 histidine at the C-terminal can be added to facilitate the purification of the recombinant protein.
도 1c를 참조하면, 상기 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터는 pET21a-LipL21/23-His로 명명될 수 있다.Referring to FIG. 1C, the recombinant expression vector comprising the genes of LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of the leptospires, can be named pET21a-LipL21 / 23-His.
상기 재조합 발현 벡터는 pET21a-LipL21 벡터와 LipL32의 유전자를 결합하여 마련될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.The recombinant expression vector may be prepared by combining pET21a-LipL21 vector and LipL32 gene, but is not limited thereto.
상기 도 1a 내지 도 1c에 도시된 재조합 발현 벡터를 제조하는 상세한 설명은 후술하도록 한다.Detailed description of the production of the recombinant expression vector shown in Figs. 1A to 1C will be given later.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 검체를 분석 스트립의 접적 영역에 일정량 투입하는 단계, 소정의 표지가 구비된 검출시약과 상기 검체 중의 분석물과 결합시켜 복합체를 형성하는 단계, 상기 복합체를 멤브레인에 전개하는 단계 및 상기 멤브레인 상의 소정 영역에 렙토스피라균으로부터 면역반응을 통해 얻어진 항체에 대해 고정상을 갖는 반응부의 외관변화를 관찰하여 개 렙토스피라균의 감염 여부 및 면역 증강 상태를 진단하는 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체를 동시에 진단하는 진단방법을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, there is provided a method for analyzing a sample, comprising the steps of putting a specimen in a contact area of an assay strip with a predetermined amount, forming a complex by binding a detection reagent with a predetermined label to an analyte in the specimen, And an antibody obtained through immunization from a leptospirosis in a predetermined region on the membrane was subjected to observation of changes in appearance of a reaction part having a fixed phase to detect the infection and immune enhancement of canine leptospirosis, At the same time.
상기 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체를 동시에 진단하는 진단방법에 있어서, 상기 반응부에는 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질이 코팅된다.In the diagnostic method for simultaneously diagnosing the leptospira IgM and IgG antibody, the recombinant antigen protein is recombined with LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of leptospirosis.
상기 진단방법은 샌드위치법(sandwich assay) 또는 경쟁법(competition assay)을 포함할 수 있다.The diagnostic method may include a sandwich assay or a competition assay.
상기 검출시약은 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체와 결합하는 금(gold) 접합체일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.The detection reagent may be a gold conjugate binding to leptospira IgG and IgM antibody, but is not limited thereto.
상기 금(gold) 접합체는 상기 렙토스피라 IgG 항체와 결합하는 금(gold) 라벨된 토끼 항-개 IgG 항체와 상기 렙토스피라 IgM 항체와 결합하는 금(gold) 라벨된 산양 항-개 IgM 항체를 원료로 할 수 있다.The gold conjugate is prepared by using a gold-labeled rabbit anti-dog IgG antibody that binds to the leptospira IgG antibody and a gold-labeled goat anti-dog IgM antibody that binds to the leptospira IgM antibody as raw materials .
상기와 같이 금(gold) 접합체가 렙토스피라 IgG 항체와 결합하는 금(gold) 라벨된 토끼 항-개 IgG 항체와 렙토스피라 IgM 항체와 결합하는 금(gold) 라벨된 산양 항-개 IgM 항체를 원료로 하기 때문에, 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단할 수 있다.As described above, a gold-labeled rabbit anti-dog IgG antibody in which a gold conjugate binds to a Leptospira IgG antibody and a gold-labeled goat anti-dog IgM antibody that binds to a Leptospira IgM antibody are used as a raw material Therefore, leptospira IgG and IgM antibody can be diagnosed at the same time.
상기 재조합 항원 단백질 및 금(gold) 접합체에 대한 좀 더 자세한 설명은 후술하도록 한다.A more detailed description of the recombinant antigen protein and gold conjugate will be described later.
도 2는 본 발명에 따른 진단키트의 구성도이다.2 is a configuration diagram of a diagnostic kit according to the present invention.
도 3은 본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgM 항체 진단키트 스트립의 구성도이다.FIG. 3 is a block diagram of the kit for analyzing the leptospira IgM antibody according to the present invention.
도 4는 본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgG 항체 진단키트 스트립의 구성도이다.FIG. 4 is a block diagram of the kit for analyzing the leptospira IgG antibody according to the present invention. FIG.
한편, 본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 상기 진단방법을 구현하기 위한 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단용 진단 키트를 제공한다.According to another embodiment of the present invention, there is provided a diagnostic kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibodies for implementing the diagnostic method.
도 2 내지 도 4를 참조하면, 상기 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단용 진단 키트는 검체를 흡수하는 검체 패드(④)와 검출 결과를 나타내는 멤브레인(⑥) 및 검체 전개액을 흡수하는 흡수 패드(⑨)를 포함하는 분석 스트립과 상기 분석 스트립을 각종 오염물질로부터 보호하며, 검체를 투입하기 위한 검체 투입구(①) 및 상기 멤브레인(⑥)에 대응하며, 반응결과를 관찰하기 위한 결과 표시창(②)을 포함하며, 상기 분석 스트립은 렙토스피라균에 대한 면역반응으로 유래된 IgG 와 IgM 항체에 대해 고정상을 갖는 검사선(⑤)과 정상 동작 여부를 판단하기 위한 대조선(⑦)이 멤브레인 상의 소정 영역에 구비된다.2 to 4, the diagnostic kit for simultaneous diagnosis of leptospirosis IgM and IgG antibodies comprises a sample pad (4) for absorbing a sample, a membrane (6) for detecting the detection result, and an absorption pad ) And an analyzing strip which protects the analyte strip from various contaminants and corresponds to a sample inlet (1) for injecting a sample and the membrane (6), and a result display window (2) for observing the reaction result (5) having a fixed phase against the IgG and IgM antibodies derived from the immunological reaction to the leptospirosis and a control line (7) for judging whether the normal operation is performed are provided in a predetermined region on the membrane .
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 상기 멤브레인(⑥)에 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질을 코팅하여 검사선(⑤)으로 사용한다.According to another embodiment of the present invention, the membrane (⑥) is coated with a recombinant antigen protein, which is a recombinant lipopolysaccharide LipL21 and LipL32, and used as a test line (⑤).
상기와 같이 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질을 검사선(⑤)으로 사용하기 때문에, 종래와 달리 렙토스피라 IgG, IgM 항체를 동시에 신속하며 우수한 검출을 할 수 있고, 렙토스피라 IgG 항체에 대해서도 우수한 검출 결과를 얻을 수 있다.As described above, since the recombinant antigen protein recombinant with LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of leptospirosis, is used as an inspecting line (⑤), leptospira IgG and IgM antibodies can be detected rapidly and at the same time, Excellent detection results can be obtained.
상기 항체 진단방법은 면역 크로마토그래피법인 것을 특징으로 할 수 있으며, 다만 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.The antibody diagnostic method may be an immunochromatography method, but is not limited thereto.
상기 검체 패드(④)의 적어도 일면에는 상기 검체 패드(④)와 중첩되게 렙토스피라 IgG 및 IgM 항체와 결합하는 금 접합체가 처리된 금(gold) 접합체 패드를 더 포함할 수 있다.The gold pad may be further provided on at least one surface of the sample pad (4) with a gold conjugate pad bonded to the sample pad (4) to bind the leptospiral IgG and IgM antibody.
상기 렙토스피라 IgG 항체와 결합하는 금 접합체는 금(gold) 라벨된 토끼 항-개 IgG 항체를 원료로 하며, 상기 렙토스피라 IgM 항체와 결합하는 금 접합체는 금(gold) 라벨된 산양 항-개 IgM 항체를 원료로 할 수 있다.The gold conjugate binding to the leptospira IgG antibody is a gold labeled rabbit anti-dog IgG antibody, and the gold conjugate binding to the leptospira IgM antibody is a gold labeled goat anti-dog IgM antibody. It can be used as raw material.
상기로 인해, 본 발명의 다른 실시형태에 따른 렙토스피라 진단 키트는 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단할 수 있다.Accordingly, the leptospira diagnostic kit according to another embodiment of the present invention can simultaneously diagnose leptospira IgG and IgM antibody.
상기 결과 표시창(②)은 상기 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단한 결과를 보여주는 2개의 창으로 구성될 수 있으나, 그 수에 있어서 반드시 제한되는 것은 아니다.The result display window (2) may consist of two windows showing the result of simultaneously diagnosing the leptospira IgG and the IgM antibody, but the number is not necessarily limited.
상기 검사선(⑤)은 렙토스피라균에 대한 면역반응으로 유래된 IgM, IgG 항체에 대해 고정상을 가질 수 있다.The test line (5) may have a fixed phase against IgM and IgG antibodies derived from an immune response to leptospirosis.
즉, 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질을 코팅하여 상기 검사선(⑤)을 사용하기 때문에, 렙토스피라 IgM, IgG 항체를 갖는 검체가 투입된 후 상기 검사선(⑤)으로 전개될 경우 상기 렙토스피라 IgM, IgG 항체에 대해 고정상을 가질 수 있다.That is, since the test line (5) is used by coating the recombinant antigen protein recombinant with LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of leptospirosis, the sample having the leptospira IgM or IgG antibody is injected into the test line (5) , It may have a fixed phase for the leptospira IgM, IgG antibody.
또한, 상기 검사선(⑤)과 진단 키트의 정상 동작 여부를 판단하기 위한 대조선(⑦)이 멤브레인 상의 소정 영역에 구비된다.In addition, a check line (⑦) for determining whether the inspection line (5) and the diagnostic kit are normally operated is provided in a predetermined area on the membrane.
상기 검체는 바람직하게는 체액으로서 혈액, 혈청, 혈장 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.The sample preferably includes blood, serum, plasma and the like as a body fluid, but is not necessarily limited thereto.
상기 분석 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인(⑥)은 통상의 진단 스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 나이트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체에서 선택되는 1종이 있다.The membrane (6) which can be used for the production of the assay strip may be one which is used as a material of a conventional diagnostic strip. For example, a membrane (1) selected from various synthetic polymers such as nitrocellulose, cellulose, cellulose acetate, There is a paper.
면역크로마토그래피법으로 렙토스피라 IgM, IgG 항체를 진단하기 위해서는 나이트로셀룰로오스 멤브레인(⑥)에 렙토스피라 항체를 검출할 수 있는 LipL21-LipL32 재조합 항원 단백질을 정해진 위치에 흡착시키고 금입자에 IgM과 IgG를 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 접합시켜 패드에 흡착시키고 건조시킨다. In order to diagnose leptospira IgM and IgG antibodies by immunochromatography, a LipL21-LipL32 recombinant antigen protein capable of detecting leptospire antibodies in the nitrocellulose membrane (⑥) is adsorbed at a predetermined position and IgM and IgG are selectively An antibody capable of binding is conjugated, adsorbed on the pad, and dried.
도 3 및 도 4를 참조하면, 본 발명의 다른 실시형태에 따른 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단 키트는 건조된 금(gold) 접합체 패드와 검체를 적용하는 검체 패드(④)를 중첩하여 나이트로셀룰로오스 멤브레인(⑥) 위에 덮고 반대편 위치에 흡수 패드(⑨)를 포함한다.3 and 4, a kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibodies according to another embodiment of the present invention comprises a dried gold-conjugate pad and a sample pad (4) to which a sample is applied, It covers the membrane (6) and contains the absorption pad (9) at the opposite position.
검출시약은 검사하고자 하는 표식물질(analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해주는 표지 시약(labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분이 구비된다. The detection reagent may be a labeled reagent, an auxiliary specific binding member, and / or a component of a signal generating system that enables the presence of the analyte to be examined to be visually or otherwise identified from outside through a device. do.
대조시약에 포함될 수 있는 표지 시약은 위 검출시약과 동일한 것을 사용할 수 있다. The labeling reagent that can be included in the control reagent can be the same as the above detection reagent.
보조적 특이결합부재의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 예를 들면, 아비딘, 바이오틴, FITC, 항 FITC 항체, 마우스 면역 글로불린, 항 마우스 면역 글로불린 항체에서 선택될 수 있다.Examples of the auxiliary specific binding member include, but are not limited to, avidin, biotin, FITC, anti-FITC antibody, mouse immunoglobulin, anti-mouse immunoglobulin antibody.
이러한 표지의 예는 촉매, 효소(포스퍼타제, 퍼옥시다제), 효소기질(니트로블루테트라졸리움, 3,5' 5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5브로모4클로로3인돌일포스페이트), 화학발광 효소기질(디옥세탄), 형광화합물(플로우레세인, 피코빌리프로틴, 로다민), 화학발광화합물, 금속졸, 비금속졸, 탄소졸, 염료졸, 미립자 라텍스, 칼라인디케이터, 리포좀에 포함된 색 재료 등이 있다.Examples of such labels are catalysts, enzymes (phosphatase, peroxidase), enzyme substrates (nitro blue tetrazolium, 3,5 ', 5,5'-tetranitrobenzidine, 4-
본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단용 진단 키트는 분석 스트립을 검체 투입구(①)와 결과 표시창(②)이 표시된 플라스틱 콤보 디바이스(이하 면역 분석장치)에 삽입하여 제조할 수 있다. The diagnostic kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibodies according to the present invention can be prepared by inserting an assay strip into a plastic combo device (hereinafter referred to as an immunoassay device) having a sample injection port (1) and a result display window (2).
본 발명의 다른 실시형태인 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단용 진단 키트를 이용한 진단 과정을 좀 더 자세히 설명하도록 하겠다.The diagnostic process using the diagnostic kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibodies, which is another embodiment of the present invention, will be described in more detail.
검체 투입구(①)에 개로부터 얻은 혈액(전혈, 혈청, 혈장)을 10 ul (1 drop) 넣고 검체 전개 용액을 추가적으로 80 ul (2 drops) 적하하며 검체 중에 존재하는 렙토스피라 특이적 IgM, IgG 항체가 금 입자에 부착된 각각의 항체와 반응을 하면서 나이트로셀룰로오스 멤브레인(⑥) 위를 모세관 현상에 의해서 전개된다. Add 10 μl (1 drop) of blood (whole blood, serum, plasma) obtained from the dog to the sample inlet (1) and add 80 μl (2 drops) of the sample eluting solution. It is developed by capillary action on nitrocellulose membrane (⑥) while reacting with each antibody attached to gold particles.
멤브레인(⑥)의 검사선(⑤)에 렙토스피라 항체를 검출할 수 있는 LipL21/32 재조합 항원 단백질을 일정한 위치에 흡착시킨다. The LipL21 / 32 recombinant antigen protein capable of detecting the leptospire antibody is adsorbed at a predetermined position on the inspection line (⑤) of the membrane (⑥).
렙토스피라균에 유래된 IgM, IgG 항체가 존재하는 경우에는 골드입자에 접합된 항체에 대해 반응한 렙토스피라균에 대한 항체가 결합하여 복합체를 형성하고 그 복합체가 검사선을 지나면서 검사선에 위치한 LipL21/32 재조합 항원 단백질과 결합을 하여 해당 위치에 금입자 색에 의한 보라색(혹은 붉은색) 밴드를 형성한다.In the presence of IgM and IgG antibodies derived from leptospirosis, antibodies against leptospira reacted with antibodies bound to gold particles to form a complex, and the complex was observed to pass through the test line and the LipL21 / 32 recombinant antigen protein to form a purple (or red) band by the gold particle color at the corresponding position.
도 3 및 도 4를 참조하면, 대조선(⑦) 위치에는 항-닭 IgY를 흡착시켜 닭 IgY가 결합된 금입자가 검체 중에 렙토스피라균에 대한 항체 존재 여부에 관계없이 항상 반응하여 보라색(혹은 붉은색) 밴드를 나타내게 한다. 3 and 4, the gold particle to which chicken IgY is bound by adsorbing anti-chicken IgY at the position of the control line (7) always reacts in the sample regardless of the presence or absence of an antibody against leptospirosis, ) Band.
반응하지 않는 내용물은 흡수 패드(⑨)에 스며들어 검사창의 멤브레인은 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있다. The unreacted contents penetrate into the absorption pad (9), and the membrane of the test window appears as a clear white color, and the formed band can be easily read.
도 5는 본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단키트의 검체 적용후의 반응 결과 예를 촬영한 사진이다.FIG. 5 is a photograph showing an example of a reaction result after application of a sample of a kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibody according to the present invention.
도 6은 본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단키트 결과에 따른 해석을 보여주는 표이다.FIG. 6 is a table showing the analysis according to the result of the kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibodies according to the present invention.
도 5 및 도 6을 참조하면, 검체 중에 렙토스피라균에 대한 항체가 존재하지 않으면 양쪽 스트립의 대조선 부위에만 보라색 또는 붉은색 밴드가 형성됨을 알 수 있다. Referring to FIGS. 5 and 6, it can be seen that a purple or red color band is formed only on the control line region of both strips when no antibody against Leptospira is present in the sample.
이하 실시 예를 통해 본 발명에 따르는 원료, 분석 스트립 및 그 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the raw material, the analysis strip, and the method for producing the same according to the present invention will be described in more detail by way of examples.
다만 이들 실시 예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시 예에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
It is to be understood, however, that these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art.
실시예 1. 재조합 렙토스피라 항원의 준비Example 1 Preparation of Recombinant Leptospira Antigen
A. 렙토스피라 항원 발현 벡터의 제조
A. Preparation of Leptospira antigen expression vector
(i) 합성 LipL21 유전자의 제조(i) Production of synthetic LipL21 gene
렙토스피라 Lai의 게놈(genome) DNA를 주형으로 하고, LipL21 유전자를 코딩하여 그 자체의 염기서열을 함유한 핵산 서열(GeneBank No. DQ173546.1) 말단에 상보적인 염기서열을 포함하도록 프라이머 서열(표 1 A, B: 각각 제한 효소 EcoR I과 Sal I(stop codon 미포함), 인식부위를 포함하고 있음)을 제작하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)를 통해 그 자체의 염기서열을 함유한 LipL21을 코딩하는 유전자를 증폭하였다.The primer sequences (Table 1) were prepared so that the genome DNA of Leptospira Lai was used as a template and the LipL21 gene was coded to include a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence (GeneBank No. DQ173546.1) A and B, which contain restriction enzymes EcoR I and Sal I (stop codon not included) and recognition site, respectively, were prepared, and a gene encoding LipL21 containing its own nucleotide sequence through PCR (Polymerase Chain Reaction) Respectively.
이때, PCR은 최종 부피가 50 ul가 되도록 10 pmol 프라이머, 2 mM dNTP 혼합물, 50 ng의 plasmids DNA, 5 ul의 10 X PCR 완충용액(Intron, Korea), 2.5 unit의 Tag(Intron, Korea) DNA 폴리머라제를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 5 분간 변성, 55℃에서 30 초간 재결합을 하고 72℃에서 1분간 신장 과정을 40회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10 분간 확장한 다음 반응을 종료하였다.The PCR was carried out using 10 pmol primer, 2 mM dNTP mixture, 50 ng of plasmid DNA, 5 uL of 10 X PCR buffer (Intron, Korea) and 2.5 units of Tag (Intron, Korea) DNA The mixture was denatured at 94 ° C for 5 minutes, recombined at 55 ° C for 30 seconds, and then stretched at 72 ° C for 1 minute for 40 times. Followed by extension at 72 [deg.] C for 10 minutes and the reaction was terminated.
증폭된 PCR 산물은 TAE 완충용액에 1% 아가로오즈 젤(Agarose gel)을 만들어 전기 영동 한 후, 젤 추출 키트(Thermo, Scientific GeneJET gel extraction and DNA cleanup micro kit)를 이용하여 증폭된 DNA를 분리하였다. The amplified PCR product was electrophoresed with 1% agarose gel in TAE buffer, and the amplified DNA was isolated using a gel extraction kit (Thermo, Scientific Gene JET gel extraction and DNA cleanup micro kit) Respectively.
증폭된 DNA를 유전자 클로닝 벡터에 삽입 하기 위하여 증폭된 DNA의 양쪽 끝에 A-Tailing을 수행하였다. A-Tailing was performed on both ends of the amplified DNA to insert the amplified DNA into the gene cloning vector.
이때, 최종 부피가 20ul가 되도록 DNA 15 ul, 5X완충용액(Intron, Korea), 2 mM dNTP 혼합물을 혼합한 다음 72℃에서 15분간 반응시켰다. At this time, 15 μl of DNA, 5 × buffer solution (Intron, Korea) and 2 mM dNTP mixture were mixed so that the final volume was 20 μl, followed by reaction at 72 ° C. for 15 minutes.
A-Tailing된 DNA를 유전자 클로닝 벡터인 pLUG-TA(Intron, Korea)에 삽입 하였다. A-Tailed DNA was inserted into the gene cloning vector pLUG-TA (Intron, Korea).
결과적인 벡터를 pLUG-LipL21이라 명명하였다.The resulting vector was named pLUG-LipL21.
이를 유전자 대장균의 재조합 발현 벡터인 pET-21(a)+(Novagen, USA)의 T7 프로모터에 작동 가능하게 결합시키기 위하여, 먼저 pET-21(a)+를 EcoRI과 SalI으로 절단하고 pLUG-LipL21을 EcoRI과 SalI으로 절단 하여 젤 추출 키트(Thermo, Scientific GeneJET gel extraction and DNA cleanup micro kit)를 이용하여 분리하였다.
PET-21 (a) + was digested with EcoRI and SalI, and pLUG-LipL21 was added to the TET promoter of pET-21 (a) + (Novagen, USA) And digested with EcoRI and SalI and separated using a gel extraction kit (Thermo, Scientific Gene JET gel extraction and DNA cleanup micro kit).
상기 EcoRI과 SalI으로 처리한 pET-21(a)+과 EcoRI과 SalI으로 처리하여 얻어진 LipL21를 T4 DNA 리가아제(ligase)로 결합시켰다. The pET-21 (a) + treated with EcoRI and SalI and the LipL21 obtained by treating with EcoRI and SalI were ligated with T4 DNA ligase.
이때, 생성된 재조합 발현 벡터를 pET21a-LipL21라 명명하였고 (도 1a), 이 발현 벡터에서는 LipL21 그 자체 염기 서열과 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가 되었다.
At this time, the recombinant expression vector thus generated was named pET21a-LipL21 (Fig. 1A). In this expression vector, 6 histidine was added to the base sequence of LipL21 and C-terminal thereof.
(ii) 합성 LipL32 유전자의 제조(ii) Production of synthetic LipL32 gene
렙토스피라 Lai의 게놈(genome) DNA를 주형으로 하고, LipL32 유전자를 코딩하여 그 자체의 염기서열을 함유한 핵산 서열(GeneBank No. AY568679.1) 말단에 상보적인 염기서열을 포함하도록 프라이머 서열([표 1] C, D: 각각 제한 효소 SalI과 NotI(stop codon 미포함), 인식부위를 포함하고 있음)을 제작하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)를 통해 그 자체의 염기서열을 함유한 LipL32를 코딩하는 유전자를 증폭하였다.(GeneBank No. AY568679.1) containing the nucleotide sequence of the LipL32 gene and a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence (GeneBank No. AY568679.1) containing the nucleotide sequence of the LipL32 gene and the primer sequence 1] C, D: containing restriction enzymes SalI and NotI (stop codon not included), recognition site), and a gene encoding LipL32 containing its own nucleotide sequence through PCR (Polymerase Chain Reaction) Respectively.
이때, PCR은 최종 부피가 50 ul가 되도록 10 pmol 프라이머, 2 mM dNTP 혼합물, 50 ng의 plasmids DNA, 5 ul의 10 X PCR 완충용액(Intron, Korea), 2.5 unit의 Tag(Intron, Korea) DNA 폴리머라제를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 5 분간 변성, 55℃에서 30 초간 재결합을 하고 72℃에서 1분간 신장 과정을 40회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10 분간 확장한 다음 반응을 종료하였다.The PCR was carried out using 10 pmol primer, 2 mM dNTP mixture, 50 ng of plasmid DNA, 5 uL of 10 X PCR buffer (Intron, Korea) and 2.5 units of Tag (Intron, Korea) DNA The mixture was denatured at 94 ° C for 5 minutes, recombined at 55 ° C for 30 seconds, and then stretched at 72 ° C for 1 minute for 40 times. Followed by extension at 72 [deg.] C for 10 minutes and the reaction was terminated.
증폭된 PCR 산물은 TAE 완충용액에 1% 아가로오즈 젤(Agarose gel)을 만들어 전기 영동 한 후, 젤 추출 키트(Thermo, Scientific GeneJET gel extraction and DNA cleanup micro kit)를 이용하여 증폭된 DNA를 분리하였다. The amplified PCR product was electrophoresed with 1% agarose gel in TAE buffer, and the amplified DNA was isolated using a gel extraction kit (Thermo, Scientific Gene JET gel extraction and DNA cleanup micro kit) Respectively.
증폭된 DNA를 유전자 클로닝 벡터에 삽입 하기 위하여 증폭된 DNA의 양쪽 끝에 A-Tailing을 수행하였다. A-Tailing was performed on both ends of the amplified DNA to insert the amplified DNA into the gene cloning vector.
이때, 최종 부피가 20ul가 되도록 DNA 15 ul, 5X완충용액(Intron, Korea), 2 mM dNTP 혼합물을 혼합한 다음 72℃에서 15분간 반응시켰다. At this time, 15 μl of DNA, 5 × buffer solution (Intron, Korea) and 2 mM dNTP mixture were mixed so that the final volume was 20 μl, followed by reaction at 72 ° C. for 15 minutes.
A-Tailing된 DNA를 유전자 클로닝 벡터인 pLUG-TA(Intron, Korea)에 삽입 하였다. A-Tailed DNA was inserted into the gene cloning vector pLUG-TA (Intron, Korea).
결과적인 벡터를 pLUG-LipL32라 명명하였다.The resulting vector was designated pLUG-LipL32.
이를 유전자 대장균의 재조합 발현 벡터인 pET-21(a)+(Novagen, USA)의 T7 프로모터에 작동 가능하게 결합시키기 위하여, 먼저 pET-21(a)+를 SalI과 NotI으로 절단하고 pLUG-LipL32를 SalI과 NotI으로 절단하여 젤 추출 키트(Thermo, Scientific GeneJET gel extraction and DNA cleanup micro kit)를 이용하여 분리하였다.
PET-21 (a) + was first digested with SalI and NotI, and pLUG-LipL32 was ligated to the T7 promoter of the recombinant expression vector pET-21 (a) + (Novagen, USA) SalI and NotI, and then separated using a gel extraction kit (Thermo, Scientific Gene JET gel extraction and DNA cleanup micro kit).
상기 SalI과 NotI으로 처리한 pET-21(a)+과 SalI과 NotI으로 처리하여 얻어진 LipL32를 T4 DNA 리가아제(ligase)로 결합시켰다. PET-21 (a) + treated with SalI and NotI and LipL32 obtained by treating with SalI and NotI were ligated with T4 DNA ligase.
이때, 생성된 재조합 발현 벡터를 pET21a-LipL32라 명명하였고 (도 1b), 이 발현 벡터에서는 LipL32 그 자체 염기 서열과 C-말단에는 6개의 히스티딘이 첨가 되었다.
At this time, the recombinant expression vector thus generated was named pET21a-LipL32 (Fig. 1B). In this expression vector, 6 histidine was added to the base sequence of LipL32 and C-terminal thereof.
(iii) 합성 LipL21/32 유전자의 제조(iii) Production of synthetic LipL21 / 32 gene
상기 예 1에서 명명한 pET21a-LipL21을 SalI과 NotI으로 절단하고 젤 추출 키트를 이용하여 pET21a-LipL21를 분리하였으며, 상기 예 2에서 명명한 pLUG-LipL32을 SalI과 NotI으로 절단하고 젤 추출 키트를 이용하여 LipL32를 분리하였다. The pET21a-LipL21 named in Example 1 was digested with SalI and NotI, and pET21a-LipL21 was isolated using a gel extraction kit. The pLUG-LipL32 named in Example 2 was digested with SalI and NotI, To isolate LipL32.
분리시킨 pET21a-LipL21 벡터와 LipL32를 T4 리가아제(ligase)로 결합 시켰다. 이때 생성된 재조합 발현 벡터를 pET21a-LipL21/32라 명명하였다 (도 1c).
The isolated pET21a-LipL21 vector and LipL32 were ligated with T4 ligase. The resulting recombinant expression vector was named pET21a-LipL21 / 32 (Fig. 1C).
B. 렙토스피라 항원 플라스미드를 갖는 대장균 균주의 성장 및 발현 유도
B. Growth and expression of Escherichia coli strains harboring the Leptospira antigen plasmid
각 대장균 클론의 종균들을 100 ug/ml의 엠피실린이 첨가된 50 ml 살균 LB에서 37℃의 진탕 배양기(shaking orbital incubator)에 밤새 배양하였다. 50 ml의 접종물을 종균으로부터 100 ug/ml의 엠피실린이 첨가된 0.5 리터의 무균 LB를 함유한 플라스크로 옮겨서, 이들이 중-대수 증식할 때까지 37℃로 배양하고, 0.5 mM IPTG(isopropylthiogalactoside)로 20℃에서 밤새 배양하여 유도하였다. 상기 유도기 후에, 세포들을 원심분리기에서 펠렛화하여 수거하였다. 펠렛화된 세포들은 다음 단계까지 -70℃에서 보관하였다.
Each Escherichia coli strain was inoculated overnight in a shaking orbital incubator at 37 ° C in 50 ml sterile LB supplemented with 100 ug / ml of ampicillin. 50 ml of the inoculum was transferred from the seeds to a flask containing 0.5 liter of aseptic LB to which 100 ug / ml of ampicillin had been added, and they were cultured at 37 캜 until medium-logarithmic growth, and 0.5 mM IPTG (isopropylthiogalactoside) Lt; RTI ID = 0.0 > 20 C < / RTI > overnight. After the induction period, cells were harvested by pelleting in a centrifuge. The pelleted cells were stored at -70 < 0 > C until the next step.
C. 렙토스피라 항원의 제조
C. Preparation of Leptospira antigens
실시예 B로부터 얻어진 결빙 세포들을 PolyHistidine-Tagged 단백질 정제 표준절차에 따라 제조하였다. 각각의 표준절차는 다음과 같다.The icing cells obtained from Example B were prepared according to the standard procedure of PolyHistidine-Tagged Protein Purification. Each standard procedure is as follows.
LipL21-His, LipL32-His, LipL21/32-His 단백질들은 Lysis-Equilibration/Wash buffer (LEW, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM Imidazole, pH 8.0)를 첨가하여 재부유하고, 상기세포들을 초음파처리(Ultrasonication)에 의해 분쇄되었다. LipL21-His and LipL21 / 32-His proteins were resuspended by adding Lysis-Equilibration / Wash buffer (LEW, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 1 mM Imidazole, pH 8.0) Lt; RTI ID = 0.0 > (Ultrasonication). ≪ / RTI >
세포-용해질의 원심분리(10,000 rpm, 30 분)를 통해 수용성 용해질을 제조하였으며 0.45 um의 주입필터(Syringe filter, Sartorius)로 여과시켰다. The aqueous lysate was prepared by centrifugation of the cell-lysate (10,000 rpm, 30 min) and filtered with a 0.45 μm syringe filter (Sartorius).
니켈 친화력 크로마토그래피로 항원 단백질을 정제하였고, 수용성 세포 용해질은 LEW로 각각의 컬럼을 세척한 후에, LipL21-His, LipL32-His, LipL21-LipL32-His 재조합 단백질들을 각각 Elution buffer (20 mM NaH2PO4, 250 mM Imidazole, pH 8.0)의 버퍼용액으로 용출하였다. 상기 용출 단편은 도 7에 도시된 바와 같이, 12% SDS-PAGE에서 분석하였다. 용출된 재조합 단백질들은 0.2 um 필터를 통과시켜 냉장 보관하였다.
LipL21-His, LipL21-His, and LipL21-LipL32-His recombinant proteins were eluted with an elution buffer (20 mM NaH2PO4, 250 mM Imidazole, pH 8.0) buffer solution. The eluted fractions were analyzed on 12% SDS-PAGE as shown in FIG. The eluted recombinant proteins were passed through a 0.2 μm filter and refrigerated.
실시예 2. 재조합 렙토스피라 융합 단백질의 항원성 비교Example 2. Antigenicity comparison of recombinant leptospira fusion protein
A. 재조합 렙토스피라 단백질의 직접 효소면역 측정법(direct ELISA)을 통한 선별
A. Selection of Recombinant Leptospira Proteins by Direct ELISA
상기 LipL21-His, LipL32-His, LipL21/32-His의 재조합 항원의 항원성 분석을 위해 정제된 항원은 각각 coating buffer(KOMA BIOTECH INC, KO331021)에 1 ug/ml 농도로 희석하여 well 당 200 ul씩 첨가 하고 4℃에서 overnight incubation 하여 코팅시킨다. For the antigen analysis of the recombinant antigen of LipL21-His, LipL32-His and LipL21 / 32-His, purified antigens were diluted to 1 ug / ml in coating buffer (KOMA BIOTECH INC, KO331021) And incubated overnight at 4 ° C.
코팅된 플레이트는 washing solution (PBST, KOMA BIOTECH INC, K0331041, K0331051)을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 Blocking solution (1% BSA/PBS, KOMA BIOTECH INC, K0331032)을 well 당 250 ul씩 첨가 후 상온에서 1 시간 동안 반응하여 blocking 을 수행하였다. The coated plate was washed 5 times with washing solution (PBST, KOMA BIOTECH INC, K0331041, K0331051) and added with blocking solution (1% BSA / PBS, KOMA BIOTECH INC, K0331032) For 1 hour.
Blocking 된 plate는 다시 washing solution을 이용하여 5 회 반복하여 세척하고 1:50으로 희석된 렙토스피라 항체 양성 검체로 각 혈청형 캐니콜라(canicola), 코펜하게니(copenhageni), 포모나(Pomona), 그립포티포사(grippotyposa)를 well 당 200 ul씩 첨가 후 상온에서 1 시간 동안 반응하였다.The blocked plate was washed again with washing solution 5 times and washed with 1:50 diluted leptospira antibody-positive specimen in each serotype canicola, copenhageni, Pomona, Grippotyposa was added at 200 μl per well and reacted at room temperature for 1 hour.
시료의 반응이 완료된 plate는 washing solution을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 anti-Canine IgG HRP(1:5,000, Antibody Incorporated, USA)를 well 당 200 ul 씩 첨가 후 상온에서 1 시간 동안 반응하고 washing 과정을 거친 후 TMB Substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060)로 발색반응을 유도하고 stop solution (2M, H2SO4)으로 반응을 정지한 후 ELISA reader 450 nm 파장 흡광도로 측정하여 분석하였다.
After the reaction was completed, the plate was washed 5 times with washing solution and 200 μl of anti-Canine IgG HRP (1: 5,000, Antibody Incorporated, USA) was added to each well. , And the reaction was terminated by stop solution (2M, H2SO4) using a TMB substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060). The reaction was stopped and analyzed with an ELISA reader 450 nm wavelength absorbance.
도 7은 본 발명에 사용된 LipL21-His(A), LipL32-His(B), LipL21/23-His(C)의 SDS-PAGE 결과이다.7 shows SDS-PAGE results of LipL21-His (A), LipL32-His (B) and LipL21 / 23-His (C) used in the present invention.
도 8은 본 발명에 사용된 LipL21-His(A), LipL32-His(B), LipL21/23-His(C)의 ELISA 결과이다.
FIG. 8 shows ELISA results of LipL21-His (A), LipL32-His (B) and LipL21 / 23-His (C) used in the present invention.
본 발명의 실시예 1.A의 3개의 재조합 항원은 실시예 2.A의 결과를 확인한 결과가 도 7에 도시되어 있으며, LipL21-His는 코펜하게니(copenhageni), 캐니콜라(canicola)에서 항원성이 뛰어났으며 LipL32-His는 포모나(Pomona), 그립포티포사(grippotyphosa)에서 항원성이 뛰어남을 확인하였으며 LipL21/32-His는 실험에 사용된 혈청형에 대해서 모두 항원성이 뛰어난 것을 확인하였다. The three recombinant antigens of Example 1.A of the present invention are shown in Fig. 7 as a result of confirming the results of Example 2.A, and LipL21-His is an antigen in copenhageni, canicola, And LipL32-His was found to be excellent in antigenicity in Pomona and grippotyphosa, and LipL21 / 32-His was found to be highly antigenic in all of the serotypes used in the experiment .
이와 같은 반응성을 나타내는 재조합 LipL21/32-His 단백질을 이용하여 본 발명에 따르는 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단 키트의 제작에 사용하였다.
The recombinant LipL21 / 32-His protein exhibiting such reactivity was used to prepare a kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG according to the present invention.
실시예 3. 렙토스피라 IgM, IgG 동시 진단 스트립 및 진단 키트의 제조Example 3 Preparation of Simultaneous Diagnostic Strips and Diagnostic Kits for Leptospira IgM and IgG
A. 렙토스피라 항원이 코팅된 막(membrane)의 준비
A. Preparation of Membranes Coated with Leptospira Antigens
상기 재조합 LipL21/32-His 항원 단백질을 2 mg/ml 농도로 맞추어 검사선으로 사용하였고, 대조군은 염소 항-닭 이뮤노글로불린 Y (Goat anti-chicken IgY)를 사용하였다. The recombinant LipL21 / 32-His antigen protein was used as a test line at a concentration of 2 mg / ml, and a goat anti-chicken immunoglobulin Y was used as a control.
상기 검사선의 재조합 항원 및 대조선의 용액은 디스펜싱 기구(KINAMETICS, USA)를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 코팅하였다. The solution of the recombinant antigen and the control line of the test line was coated on a nitrocellulose membrane using a dispensing instrument (KINAMETICS, USA).
낮은 습도의 실험실에서 밤새 건조하거나 적어도 5시간 이상 팬에서 건조시켰다. 상기 제조된 막의 플레이트는 건조제와 함께 밀봉된 컨테이너 또는 낮은 습도의 실험실에서 보관하였다.
Dry in a low humidity laboratory overnight or in a fan for at least 5 hours. The plates of the prepared membrane were stored in a container sealed with a desiccant or in a laboratory of low humidity.
B. 산양 항-개 IgM 항체 금 (Gold) 접합체 제조
B. Manufacture of goat anti-dog IgM antibody gold (gold) conjugate
산양 항-개 IgM 항체(AbD Serotec, AA130)를 최종 농도가 12 ug/ml이 되도록 교반하면서 금 용액에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. The goat anti-dog IgM antibody (AbD Serotec, AA130) was added dropwise to the gold solution with stirring to a final concentration of 12 ug / ml, and the solution was again stirred for 15 minutes.
그 후, 금 입자 부유물에 10% BSA 용액을 첨가하였다. Then, 10% BSA solution was added to the gold particle suspension.
다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 원심분리하여, 결합되지 않은 재조합 단백질을 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액(펠렛)에, 펠렛 용량의 3배의 1% BSA가 첨가된 5 mM 보레이트(Sodium Tetraborate, pH 7.2)을 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유하였다. After stirring for another 15 minutes, the bound gold solution was centrifuged, and the supernatant was discarded to remove unbound recombinant protein. To the bound gold solution (pellet) was added 3
상기 부유물을 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH 7.2)에 스펙트로포토메터 530 nm에서 흡광도가 10±1이 되게 조정하여 제조하였다.
The suspension was centrifuged again and the final pellet was prepared by adjusting the absorbance at 530 nm in 5 mM borate (Sodium Tetraborate, pH 7.2) to which 1% BSA had been added at 530 nm.
C. 토끼 항-개 IgG 항체 금 (Gold) 접합체 제조
C. Preparation of rabbit anti-dog IgG antibody Gold (Gold) conjugate
토끼 항-개 IgG 항체(ICL, RGFC-40A)를 최종 농도가 10 ug/ml이 되도록 교반하면서 금 용액에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. The rabbit anti-dog IgG antibody (ICL, RGFC-40A) was added dropwise to the gold solution with stirring to a final concentration of 10 ug / ml, and the solution was again stirred for 15 minutes.
그 후, 금 입자 부유물에 10% BSA 용액을 첨가하였다. Then, 10% BSA solution was added to the gold particle suspension.
다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 원심분리하여, 결합되지 않은 재조합 단백질을 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액(펠렛)에, 펠렛 용량의 3배의 1% BSA가 첨가된 5 mM 소디움 테트라보레이트(Sodium Tetraborate, pH 7.2)을 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유하였다. After stirring for another 15 minutes, the bound gold solution was centrifuged, and the supernatant was discarded to remove unbound recombinant protein. To the bound gold solution (pellet) was added 3
상기 부유물을 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 테트라보레이트 (Sodium Tetraborate, pH 7.2)에 스펙트로포토메터 530 nm에서 흡광도가 10±1이 되게 조정하여 제조하였다.
The suspension was centrifuged again and the final pellet was prepared by adjusting the absorbance at 530 nm in 5 mM sodium tetraborate (pH 7.2) to which 1% BSA had been added at 530 nm.
D. 닭 IgY 항체 금 (Gold) 접합체 제조
D. Chicken IgY Antibody Gold Assembly
닭 IgY 항체(Fitzerald, 70-B9093RA00-A0)를 최종 농도가 20 ug/ml이 되도록 교반하면서 금 용액에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. The chicken IgY antibody (Fitzerald, 70-B9093RA00-A0) was added dropwise to the gold solution while stirring to a final concentration of 20 ug / ml, and the solution was stirred again for 15 minutes.
그 후, 금 입자 부유물에 10% BSA 용액을 첨가하였다. Then, 10% BSA solution was added to the gold particle suspension.
다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 원심분리하여, 결합되지 않은 재조합 단백질을 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액(펠렛)에, 펠렛 용량의 3배의 1% BSA가 첨가된 5 mM 소디움 테트라보레이트(Sodium Tetraborate, pH 7.2)을 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유하였다. After stirring for another 15 minutes, the bound gold solution was centrifuged, and the supernatant was discarded to remove unbound recombinant protein. To the bound gold solution (pellet) was added 3
상기 부유물을 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 테트라보레이트 (Sodium Tetraborate, pH 7.2)에 스펙트로포토메터 530 nm에서 흡광도가 10±1이 되게 조정하여 제조하였다.
The suspension was centrifuged again and the final pellet was prepared by adjusting the absorbance at 530 nm in 5 mM sodium tetraborate (pH 7.2) to which 1% BSA had been added at 530 nm.
E. 금 접합체 패드의 준비
E. Preparation of gold conjugate pad
상기 B, C, D에서 제조된 금 접합체는 5% 트레할로스(Trehalose)를 첨가하여 다음과 같이 제조하였다. 렙토스피라 IgM 항체 진단 스트립(strip)을 위해 0.5 X 20 cm 유리섬유에 토끼 항-개 IgM-금 접합체가 최종농도 3 O.D(Optical Density)와 닭 IgY-금 접합체가 최종농도 1 O.D(Optical Density)가 되도록 제조한다.The gold conjugates prepared in B, C and D were prepared by adding 5% trehalose as follows. For a strip of leptospira IgM antibody, a final concentration of 3 OD (OD) and a chicken IgY-gold conjugate of
렙토스피라 IgG 항체 진단 스트립(Strip)을 위해 0.5 X 20 cm 유리섬유에 산양 항-개 IgG-금 접합체가 최종농도 3 O.D(Optical Density)와 닭 IgY-금 접합체가 최종농도 1 O.D(Optical Density)가 되도록 제조한다.
The
F. 흡수 패드 및 검체 패드 제조
F. Manufacture of Absorption Pads and Sample Pads
흡수 패드 및 검체 패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다.
The absorbing pad and the sample pad were prepared by drying so that the reaction solution could be absorbed well.
G. 디바이스 조립
G. Device assembly
상기에서 제조된 각각의 멤브레인, 패드들을, 오른쪽부터 검체 패드, 금 접합체 패드(골드 패드), 니트로셀룰로오스 멤브레인, 마지막으로 흡수 패드를 각각 중첩되게 결합하고 면역분석장치(디바이스)에 크기에 맞는 스트립 크기로 절단하였다. Each of the membranes and pads prepared above was superimposed on the sample pad, the gold pad (gold pad), the nitrocellulose membrane, and finally the absorbent pad in the overlapping manner from the right side, and the size .
이렇게 절단된 스트립을 최종적으로 동시 진단용 면역분석장치의 하판에 각각 넣고 상판을 덮어 동시 진단용 키트를 제조하였다.
The cut strips were finally placed on the bottom plate of the immunoassay analyzer for simultaneous diagnosis, and the top plate was covered to prepare a simultaneous diagnosis kit.
H. 제품 구성
H. Composition of products
상기에서 설명된 동시 진단용 면역분석장치와 검체 전개액을 최종제품으로 구성되도록 하였다. 검체 전개액의 조성은 1XPBS, 0.8% tween20 및 0.1% NaN3 일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
The above-described simultaneous diagnosis immunoassay apparatus and specimen expansion liquid were constituted as final products. The composition of the sample solution is developed 1XPBS, 0.8% tween20 and 0.1% NaN 3 days, but can, but are not necessarily limited thereto.
실시예 4. 본 발명에 따르는 재조합 LipL21/32-His 항원 단백질을 사용한 개 렙토스피라 IgG, IgM 동시 진단 스트립의 효능 시험Example 4: Efficacy test of co-diagnosed strips of leptospira IgG and IgM using the recombinant LipL21 / 32-His antigen protein according to the present invention
A. 상기 실시예 3에 의해 제조된 개 렙토스피라 IgG, IgM 동시 진단 키트를 이용하여 일본, 인도, 브라질, 벨기에 등 해외 동물 병원으로부터 제공받은 개 렙토스피라 항체 양성 시료와 음성 시료를 대상으로 진단하였다.
A. The dogs were diagnosed with dog leptospira antibody positive and negative samples provided from foreign animal hospitals such as Japan, India, Brazil and Belgium using the dog leptospira IgG and IgM simultaneous diagnostic kit manufactured in Example 3 above.
양성검체는 표준진단법인 현미경적 응집검사(Microscopic agglutination test)로 검사된 개 렙토스피라 항체 양성 검체 68개와 음성 검체 112개를 사용하였다.
The positive specimens used were 68 positive specimens from dogs and 112 negative specimens tested by microscopic agglutination test.
본 발명에 따르는 개 렙토스피라 IgM, IgG 동시 진단 키트와 현미경적 응집검사(Microscopic agglutination test)의 진단법을 가지고 각각 검사하여 그 결과를 표 2에 나타냈다. The results are shown in Table 2, and the results are shown in Table 2. The results are shown in Table 2. [Table 2] < EMI ID = 18.1 > < tb >
각 검사방법에 따른 검출된 시료의 수를 측정하여 개 렙토스피라 IgM, IgG 동시 진단키트의 상대 민감도(relative sensitivity) 및 상대 특이도(relative specificity)를 표 3 및 표 4에 나타내었으며 현미경적 응집검사에 의한 검출 수와 대비하여 상대 민감도 및 상대 특이도를 표 3 및 표 4에 나타냈다. The relative sensitivity and relative specificity of the Leptospira IgM and IgG co-detection kit are shown in Tables 3 and 4 by measuring the number of detected samples according to each test method. Microscopic cohesion test The relative sensitivity and the relative specificity are shown in Tables 3 and 4. < tb > < TABLE >
그 결과 실시예 3의 개 렙토스피라 IgG, IgM 동시 진단키트 중 IgM에 대해서는 표준진단법인 현미경적 응집검사법 대비 100%의 상대 민감도 및 100%의 상대 특이도를 보여주었으며 IgG에 대해서는 표준진단법인 현미경적 응집검사법 대비 98 %의 상대 민감도 및 100 %의 상대 특이도를 보여주었다. As a result, the relative sensitivity and 100% relative specificity of IgM of the dogs were 100% and 100%, respectively, compared with the standard diagnostic method, Microscopic coagulation test, and the microscopic coagulation The relative sensitivity of the test was 98% and the relative specificity of the test was 100%.
따라서, 종래 현미경적 응집검사법은 면역크로마토그라피법 대비 약 100배의 높은 민감도를 보유하고 있다는 점을 감안할 때 본 발명에 따른 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단키트는 우수한 결과를 보였음을 알 수 있었다.Therefore, considering that the conventional microscopic coagulation assay has a sensitivity about 100 times higher than that of immunochromatography, it was found that the kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibody according to the present invention showed excellent results.
즉, 본 발명의 개시에 따르면, 렙토스피라의 지질단백질인 LipL21-LipL32을 재조합하여 마련된 재조합 항원 단백질을 이용하여 제작된 개 렙토스피라 IgM, IgG 항체 동시 진단키트로 상기 렙토스피라증을 진단하므로, 종래와 달리 렙토스피라 IgG 항체에 대해서도 우수한 검출 결과를 나타냄을 알 수 있다.
That is, according to the disclosure of the present invention, leptospirosis is diagnosed by a kit for simultaneous diagnosis of leptospira IgM and IgG antibody prepared using the recombinant antigen protein prepared by recombining LipL21-LipL32, which is a lipoprotein lipoprotein, But also excellent detection results for antibodies.
(MAT)Microscopic Coagulation Test
(MAT)
상기 표에서 "-"는 해당 항목의 렙토스피라 항체를 보유하고 있지 않음을 의미하며, 1+, 2+ 및 3+는 해당항목의 렙토스피라 항체를 보유하고 있음을 의미함과 동시에 표적물질의 양에 따른 양성 신호의 강도 정도를 의미한다. 즉 숫자가 높을수록 더욱 강한 신호를 보이고 따라서 표적물질의 양이 많이 존재하는 것을 의미한다.
In the above table, "-" means that the subject has no leptospira antibody, while 1+, 2+ and 3+ means that the subject has the leptospira antibody and the amount of the target substance This means the strength of the positive signal. That is, the higher the number, the stronger the signal and therefore the greater the amount of target material.
IgM 진단키트The
IgM Diagnostic Kit
IgG 진단키트The
IgG Diagnostic Kit
본 발명은 상술한 실시 형태 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니며, 첨부된 청구범위에 의해 한정하고자 한다. 따라서, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.
The present invention is not limited by the above-described embodiments and the accompanying drawings, but is intended to be limited only by the appended claims. It will be apparent to those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. something to do.
①: 검체 투입구 ②: 결과 표시창
③: 제품 문자 표시구 ④: 검체패드
⑤: 검사선 ⑥: 멤브레인
⑦: 대조선 ⑧: 문자 표시 스티커
⑨: 흡수 패드 ⑩: 제1 스트립 지지부
⑪: 제2 스트립 지지부①: Sample inlet ②: Result display window
③: Product letter mark ④: Sample pad
⑤: Inspection line ⑥: Membrane
⑦: Contrast line ⑧: Character display sticker
⑨: Absorption pad ⑩: First strip support
⑪: a second strip support
Claims (23)
A recombinant expression vector for the simultaneous diagnosis of pET21a-LipL21 / 32 canine leptospira IgG and IgM antibodies, including the coding sequence of a recombinant antigen protein recombinant with LipL21 and LipL32, the lipid proteins of leptospirosis.
상기 재조합 발현 벡터는 pET21a-LipL21 벡터와 LipL32를 결합하여 마련된 개(canine) 렙토스피라 IgG, IgM 항체 동시 진단용 재조합 발현 벡터.
The method of claim 3,
The recombinant expression vector is a recombinant expression vector for simultaneous diagnosis of canine leptospira IgG and IgM antibody prepared by combining pET21a-LipL21 vector with LipL32.
상기 재조합 항원 단백질의 코딩 서열은 LipL21 염기 서열과 LipL32 염기 서열을 포함하는 개(canine) 렙토스피라 IgG, IgM 항체 동시 진단용 재조합 발현 벡터.
The method of claim 3,
The coding sequence of the recombinant antigen protein is a recombinant expression vector for simultaneous diagnosis of canine leptospira IgG and IgM antibodies comprising the LipL21 base sequence and the LipL32 base sequence.
A host cell transformed with the recombinant expression vector of claim 3.
Culturing the host cell of claim 7, and then obtaining a recombinant LipL21-LipL32 recombinant antigen protein of canine leptospira.
상기 분석 스트립을 각종 오염물질로부터 보호하며, 검체를 투입하기 위한 검체 투입구; 및
상기 멤브레인에 대응하며, 반응결과를 관찰하기 위한 결과 표시창;을 포함하며,
상기 분석 스트립은 렙토스피라균에 대한 면역반응으로 유래된 IgG 또는 IgM 항체에 대해 고정상을 갖는 검사선과 정상 동작 여부를 판단하기 위한 대조선이 멤브레인 상의 소정 영역에 구비되며, 상기 멤브레인에 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질의 코딩 서열을 포함하며, pET21a-LipL21/32 인 재조합 발현 벡터를 코팅하여 검사선으로 사용한 개(canine) 렙토스피라 IgG 또는 IgM 항체를 진단할 수 있는 진단키트.
An analysis strip including a sample pad for absorbing the sample, a membrane for indicating the detection result, and an absorption pad for absorbing the sample developing solution;
A sample inlet for protecting the assay strip from various contaminants and injecting a sample; And
And a result display window corresponding to the membrane and for observing the reaction result,
The test strip is provided with a test line having a fixed phase against an IgG or IgM antibody derived from an immune reaction to a Leptospira bacterium and a test line for judging whether the test strip is normal or normal operation is provided in a predetermined region on the membrane, and LipL21 And a recombinant expression vector comprising pET21a-LipL21 / 32, which contains the coding sequence of a recombinant antigen protein recombinant with LipL32, and which can diagnose canine leptospira IgG or IgM antibody using the test line.
상기 항체 진단방법은 면역 크로마토그래피법인 것을 특징으로 하는 개(canine) 렙토스피라 IgG 또는 IgM 항체를 진단할 수 있는 진단키트.
10. The method of claim 9,
A diagnostic kit capable of diagnosing canine leptospira IgG or IgM antibody, characterized in that said antibody diagnostic method is an immunochromatography method.
상기 검체 패드의 적어도 일면에는 상기 검체 패드와 중첩되게 렙토스피라 IgG 또는 IgM 항체와 결합하는 금 접합체가 처리된 금(gold) 접합체 패드를 더 포함하는 개(canine) 렙토스피라 IgG 또는 IgM 항체를 진단할 수 있는 진단키트.
10. The method of claim 9,
Wherein the test pad is capable of diagnosing a canine leptospira IgG or IgM antibody further comprising at least one surface of the test pad on which a gold conjugate pad treated with a gold conjugate binding to the leptospira IgG or IgM antibody is overlapped with the test pad Diagnostic Kit.
상기 렙토스피라 IgG 항체와 결합하는 금 접합체는 금(gold) 라벨된 토끼 항-개 IgG 항체를 원료로 한 개(canine) 렙토스피라 IgG 또는 IgM 항체를 진단할 수 있는 진단키트.
13. The method of claim 12,
The gold conjugate binding to the leptospira IgG antibody is a diagnostic kit capable of diagnosing a canine leptospira IgG or IgM antibody using a gold labeled rabbit anti-dog IgG antibody as a raw material.
상기 렙토스피라 IgM 항체와 결합하는 금 접합체는 금(gold) 라벨된 산양 항-개 IgM 항체를 원료로 한 개(canine) 렙토스피라 IgG 또는 IgM 항체를 진단할 수 있는 진단키트.
13. The method of claim 12,
The gold conjugate binding to the leptospira IgM antibody is a diagnostic kit capable of diagnosing a canine leptospira IgG or IgM antibody using a gold labeled goat anti-dog IgM antibody as a raw material.
상기 분석 스트립을 각종 오염물질로부터 보호하며, 검체를 투입하기 위한 검체 투입구; 및
상기 멤브레인에 대응하며, 반응결과를 관찰하기 위한 결과 표시창;을 포함하며,
상기 분석 스트립은 렙토스피라균에 대한 면역반응으로 유래된 IgG 와 IgM 항체에 대해 고정상을 갖는 검사선과 정상 동작 여부를 판단하기 위한 대조선이 멤브레인 상의 소정 영역에 구비되며, 상기 멤브레인에 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질의 코딩 서열을 포함하며, pET21a-LipL21/32 인 재조합 발현 벡터를 고정하여 검사선으로 사용한 개(canine) 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단할 수 있는 진단키트.
An analysis strip including a sample pad for absorbing the sample, a membrane for indicating the detection result, and an absorption pad for absorbing the sample developing solution;
A sample inlet for protecting the assay strip from various contaminants and injecting a sample; And
And a result display window corresponding to the membrane and for observing the reaction result,
In the assay strip, a test line having a fixed phase against IgG and IgM antibodies derived from an immune response to leptospirosis and a test line for judging normal operation are provided in a predetermined region on the membrane, and lipid proteins of LipL21 And LipL32 recombinant antigen protein, and a recombinant expression vector pET21a-LipL21 / 32 is immobilized and used as an inspecting line to diagnose canine leptospira IgG and IgM antibody at the same time.
상기 항체 진단방법은 면역 크로마토그래피법인 것을 특징으로 하는 개(canine) 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단할 수 있는 진단키트.
16. The method of claim 15,
Wherein the antibody diagnostic method is an immunochromatography method. The kit can diagnose canine leptospira IgG and IgM antibody at the same time.
상기 검체 패드의 적어도 일면에는 상기 검체 패드와 중첩되게 렙토스피라 IgG 및 IgM 항체와 결합하는 금 접합체가 처리된 금(gold) 접합체 패드를 더 포함하는 개(canine) 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단할 수 있는 진단키트.
16. The method of claim 15,
The present invention also provides a method for diagnosing canine leptospirosis IgG and IgM antibodies, which further comprises a gold conjugate pad treated with a gold conjugate that binds to the leptospira IgG and IgM antibody so as to overlap with the sample pad on at least one side of the sample pad The diagnostic kit.
상기 렙토스피라 IgG 항체와 결합하는 금 접합체는 금(gold) 라벨된 토끼 항-개 IgG 항체를 원료로 하며, 상기 렙토스피라 IgM 항체와 결합하는 금 접합체는 금(gold) 라벨된 산양 항-개 IgM 항체를 원료로 하는 개(canine) 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단할 수 있는 진단키트.
19. The method of claim 18,
The gold conjugate binding to the leptospira IgG antibody is a gold labeled rabbit anti-dog IgG antibody, and the gold conjugate binding to the leptospira IgM antibody is a gold labeled goat anti-dog IgM antibody. A diagnostic kit capable of simultaneously diagnosing canine leptospirosis IgG and IgM antibodies.
상기 결과 표시창은 상기 개(canine) 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단한 결과를 보여주는 2개의 창으로 구성된 개(canine) 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단할 수 있는 진단키트.
16. The method of claim 15,
The result display window is a diagnostic kit capable of simultaneously diagnosing canine leptospira IgG and IgM antibody having two windows showing the result of simultaneous diagnosis of the canine leptospira IgG and IgM antibody.
소정의 표지가 구비된 검출시약과 상기 검체 중의 분석물과 결합시켜 복합체를 형성하는 단계;
상기 복합체를 멤브레인에 전개하는 단계; 및
상기 멤브레인 상의 소정 영역에 렙토스피라균으로부터 면역반응을 통해 얻어진 항체에 대해 고정상을 갖는 반응부의 외관변화를 관찰하는 단계;를 포함하며,
상기 반응부에는 렙토스피라의 지질 단백질인 LipL21과 LipL32를 재조합한 재조합 항원 단백질의 코딩 서열을 포함하며, pET21a-LipL21/32 인 재조합 발현 벡터가 코팅된 개(canine) 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단하는 진단방법.
Injecting a predetermined amount of the specimen into the contact area of the assay strip;
Binding to a detection reagent having a predetermined label and an analyte in the specimen to form a complex;
Developing the complex on a membrane; And
Observing a change in appearance of a reaction part having a fixed phase with respect to an antibody obtained through an immune reaction from a leptospirosis in a predetermined region on the membrane,
The reaction part includes a coding sequence of a recombinant antigen protein recombinant with LipL21 and LipL32, which are lipid proteins of leptospirosis, and simultaneously diagnoses a canine leptospira IgG and IgM antibody coated with a recombinant expression vector pET21a-LipL21 / 32 Diagnostic method.
상기 검출시약은 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체와 결합하는 금 접합체인 개(canine) 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단하는 진단방법.
22. The method of claim 21,
The detection reagent simultaneously diagnoses leptospira IgG and IgM antibody, which is a gold conjugate that binds to leptospira IgG and IgM antibody.
상기 금 접합체는 상기 렙토스피라 IgG 항체와 결합하는 금(gold) 라벨된 토끼 항-개 IgG 항체와 상기 렙토스피라 IgM 항체와 결합하는 금(gold) 라벨된 산양 항-개 IgM 항체를 원료로 하는 개(canine) 렙토스피라 IgG 와 IgM 항체를 동시에 진단하는 진단방법.23. The method of claim 22,
The gold conjugate contains a gold labeled rabbit anti-dog IgG antibody that binds to the leptospira IgG antibody and a gold labeled goat anti-dog IgM antibody that binds to the leptospira IgM antibody. Diagnostic method for simultaneous diagnosis of leptospira IgG and IgM antibody.
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