KR101764389B1 - Liposome-hyaluronic acid complex composition containing epidermal growth factor for subcutaneous or intracutaneous injection - Google Patents

Liposome-hyaluronic acid complex composition containing epidermal growth factor for subcutaneous or intracutaneous injection Download PDF

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Abstract

The present invention relates to an agent capable of continuously releasing an epidermal growth factor at a constant rate over days or weeks while remaining locally in the injection site once injected subcutaneously or intracutaneously, and to a method of preparing the agent. The agent of the present invention comprises a liposome-hyaluronic acid complex as an active ingredient, wherein the liposome-hyaluronic acid complex includes a liposome containing an epidermal growth factor (EGF), and the liposome contains a lipid having an amine group, and is connected to hyaluronic acid. Since the liposome-hyaluronic acid complex of the present invention is formed by a biodegradable liposome, it can be degraded without being accumulated in the body, and has no toxicity, and thus is safe. Particularly, apart from the above advantages that the liposome-hyaluronic acid complex of the present invention provides by comprising an epidermal growth factor as an active ingredient, hyaluronic acid used in forming the complex provides benefits for improving the skin condition such as wrinkles and whitening, and therefore, the liposome-hyaluronic acid complex of the present invention can act as a filler for alleviating wrinkles and is excellently effective for such use.

Description

피하 또는 피내 주사용 상피세포성장인자 함유 리포솜-히야론산 복합체 조성물{Liposome-hyaluronic acid complex composition containing epidermal growth factor for subcutaneous or intracutaneous injection}The present invention relates to a liposome-hyaluronic acid complex composition containing an epidermal growth factor for subcutaneous or intramuscular injection,

본 발명은 상피세포성장인자(EGF)를 효율적으로 전달하기 위한 제제 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 피내 또는 피하 주사된 부위에서 국소적으로 머물면서 EGF를 일정한 속도로 장기간 방출할 수 있는 제제 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a preparation for efficiently delivering epithelial cell growth factor (EGF) and a method for producing the same, which is capable of long-term release of EGF at a constant rate while locally staying in the intradermal or subcutaneous injection site, And a manufacturing method thereof.

상피세포성장인자(epidermal growth factor; EGF)는 종래 유로가스트론(urogastrone)으로 알려진 53개의 아미노산과 3개의 이황화물(disulfide) 결합을 갖는 분자량 6045의 폴리펩타이드로서, 상피세포와 간엽세포를 포함한 각종 세포들에 대해 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산분비 억제 등의 활성이 있어 피부나 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다. Epidermal growth factor (EGF) is a polypeptide of molecular weight 6045 with 53 amino acids and three disulfide bonds, known as urogastrone, and it contains various epitopes and mesenchymal cells It has been known that it has an activity of promoting mitosis, promoting cell growth and inhibiting the secretion of gastric acid, and thus has a therapeutic effect on skin or corneal wound healing or gastric ulcer.

또, 이러한 상피세포성장인자는 피부 표면에 있는 수용체 단백질과 결합하여 새로운 세포 생성을 촉진하기 때문에 이를 장기간 사용하게 되면 피부 탄력과 매끄러움을 유지시키고 주름이나 피부 처짐 현상을 막게 된다. 원래는 피부 속에 존재하던 이러한 상피세포성장인자는 노화에 따라 감소하게 되며, 이를 피부 외부에서 공급해주게 되면 주름, 미백, 탄력개선 등 여러 가지 유익한 효과를 나타낼 수 있다고 알려져 있다. In addition, these epithelial growth factors bind to the receptor protein on the surface of the skin to promote the production of new cells. Therefore, when used for a long time, it maintains skin elasticity and smoothness and prevents wrinkles and skin sagging. These epithelial growth factors originally present in the skin are decreased with aging, and it is known that when they are supplied from the outside of the skin, they can exhibit various beneficial effects such as wrinkles, whitening, and elasticity improvement.

그러나 상피세포성장인자가 세포의 DNA 합성하도록 유도하기 위해서는 8 내지 12시간 정도의 잠복기가 필요한데 반하여 상피세포성장인자의 반감기는 약 1시간 이내로 매우 짧아서 목적하는 효과를 나타내기 어렵고, 상피세포성장인자가 충분한 효과를 나타내기 위해서는 상피세포성장인자의 유효 농도가 지속적으로 유지되어야 한다는 보고가 있다(Franklin et al., J. Lab. Clin. Med., 108:103-108, 1986). 따라서 상피세포성장인자를 서방성(sustained release) 제제로 개발한다면 큰 장점이 될 수 있다. However, in order for the epithelial growth factor to induce the DNA synthesis of the cells, a latency period of about 8 to 12 hours is required, whereas the half-life of the epithelial growth factor is very short within about one hour, There is a report that the effective concentration of epithelial growth factor must be maintained constantly for sufficient effect (Franklin et al. , J. Lab. Clin. Med., 108: 103-108, 1986). Therefore, development of epithelial cell growth factor as a sustained release agent can be a great advantage.

한편, 리포솜 기술을 이용한 서방성 제제를 제조하려는 노력들이 있어 왔다. 예를 들어, 한국 특허출원공개공보 제2014-0086741호에서는 지질 성분으로 솔비탄 불포화지방산 에스터, 포스포리피드 및 특정 성분인 액상 결정 강화제를 사용하여 활성 물질인 GnRH(gonadotropin-releasing hormone) 유도체를 포함하는 액상 결정(liquid crystal)을 제조하는 기술을 공개하고 있다. 서방화의 특성은 결정상의 지질이 생체 내에서 서서히 와해되어 내부에 함유되어 있는 활성 성분이 방출하게 됨으로써 나타난다. 이러한 기술은 결정성의 온도에 대한 민감성 여부에 따라 결정된다는 점에서 그 특징을 두고 있다. 그러나 서방화의 정도가 초반에 급격히 이루어지고, 약물의 방출이 1차 속도 방출 패턴으로 빠르게 진행되어 엄밀한 의미에서 서방화라는 목적을 달성하기에는 부족한 상태이다.On the other hand, efforts have been made to produce sustained release formulations using liposomal technology. For example, in Korean Patent Application Laid-Open Publication No. 2014-0086741, a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) derivative is contained as a lipid component by using a sorbitan unsaturated fatty acid ester, a phospholipid and a liquid crystal enhancing agent, Discloses a technique for producing a liquid crystal that is a liquid crystal material. The characteristic of the sustained release is that the crystalline lipid gradually dissolves in the living body and releases the active ingredient contained therein. This technique is characterized in that it is determined by the sensitivity of the crystallinity to the temperature. However, the extent of the sustained release is rapid at the beginning, and the release of the drug is rapidly progressed to the primary rate release pattern, which is insufficient to achieve the goal of the slow release in the strict sense.

한국 특허출원공개공보 제2014-0086741호 (2014. 7. 8. 공개)Korean Patent Application Laid-Open Publication No. 2014-0086741 (published on July 8, 2014)

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상피세포성장인자(EGF)를 목적하는 농도로 장기간 방출할 수 있으며, 주사된 부위에 투여된 약효 성분이 유지되어 목적하는 부위에서 상피세포성장인자를 방출함으로써 상피세포성장인자의 부작용을 가능한 줄일 수 있는 상피세포성장인자 함유 조성물 및 이러한 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.Therefore, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition which can release the epithelial growth factor (EGF) at a desired concentration for a long period of time, maintains the active ingredient administered to the injected site, A composition containing an epithelial cell growth factor capable of reducing side effects of a cell growth factor as much as possible, and a method for producing such a composition.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상피세포성장인자(EGF)를 함유하고 있는 리포솜이며, 이러한 리포솜은 아민기를 함유한 지질을 포함하고 있고, 리포솜들이 히야론산과 연결되어 있는 리포솜-히야론산 복합체를 유효 성분으로 함유하고 있으며, 피하 또는 피내 주사 부위에서 상기 상피세포성장인자를 지연 방출(sustained release)하는 것을 특징으로 하는 피하 또는 피내 주사용 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention is a liposome containing an epithelial cell growth factor (EGF), wherein the liposome comprises a lipid containing an amine group, and the liposome is linked to hyaluronic acid, Wherein the composition contains an effective ingredient and sustained release of the epithelial growth factor at the subcutaneous or intradermal injection site.

본 발명의 조성물은 상처 치료, 위궤양 치료 등의 목적으로 사용될 수 있으나, 특히 피하 또는 피내 주사하여 주사된 국소 부위에서 이동하지 않고 머물면서 수일 또는 수주 동안의 장기간 동안 상피세포성장인자를 지속적으로 방출할 수 있다는 점에서 미백 용도 또는 주름 개선 용도로 더욱 바람직하다. 특히 복합체를 생성하기 위한 목적으로 사용된 히야론산 또한 피부 재생 효과, 주름 개선 효과 등이 알려져 있어 이러한 주름 개선 용도에 더욱 더 바람직하다.The composition of the present invention can be used for the purpose of wound healing, gastric ulcer treatment, etc., but it can be used for the purpose of continuously releasing the epithelial growth factor for a long period of days or weeks while staying in the localized area injected by subcutaneous or intradermal injection It is more preferable for a whitening purpose or a wrinkle improving purpose. In particular, hyaluronic acid used for the purpose of producing a complex is also more preferable for such wrinkle-improving use because skin regeneration effect and wrinkle-reducing effect are known.

본 발명의 조성물은 약학 또는 의학 용도로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 미용 또는 화장학적 목적을 위해서도 사용될 수 있다. The compositions of the present invention may be used for pharmaceutical or medical purposes, as well as for cosmetic or cosmetic purposes.

본 발명에 이용된 기술사상들 중 일부를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 상피세포성장인자가 함유된 리포솜들이 히야론산으로 연결되어 복합체(직경이 약 5-50 μm)를 형성하게 되며, 이러한 복합체를 피하 또는 피내 주사하게 되면 크기, 점도 등의 물리적 특성으로 인해 주사된 국소 부위에 해당 성분들이 머물게 되고 후술하는 바와 같이 바람직한 농도로 오랫동안 상피세포성장인자를 방출하게 된다.Some of the technical ideas used in the present invention are shown in Fig. As shown in FIG. 1, liposomes containing epithelial growth factors are linked to hyaluronic acid to form a complex (diameter of about 5-50 μm). When such a complex is injected subcutaneously or intradermally, Due to their physical properties, the components remain in the injected local site and release the epithelial growth factor for a long time at a desired concentration as described below.

본 명세서에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 기재된 수치 대비 ±10%의 범위를 가질 수 있음을 의미한다. As used herein, the term " about "or" approximately "means having a range of +/- 10%

본 발명에 따른 리포솜은 인지질을 이용하여 제조된다. 예를 들어, 난황 레시틴, 대두 레시틴, 수첨 레시틴 등의 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산(phosphatidic acid) 등이 1종 이상 이용될 수 있다. 리포솜을 구성하는 기본적인 지질로서 인지질은 리포솜 같은 층상 구조(lamellar structure)의 제조에 필수적으로 사용되어 온 물질이며, 이는 입자 형성에 안정화를 부여하는 이중막 또는 다중막을 구성하는 필수적인 역할을 하게 된다.The liposomes according to the present invention are prepared using phospholipids. For example, one or more of lecithin such as egg yolk lecithin, soybean lecithin and hydrogenated lecithin, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerin, phosphatidylinositol, phosphatidic acid and the like may be used. As a basic lipid constituting the liposome, the phospholipid is a substance that has been essentially used for the production of a lamellar structure such as liposomes, which plays an essential role in constituting a bi-layer or a multi-layer which gives stabilization to particle formation.

본 발명에 따른 리포솜은 히야론산과의 결합을 위해 아민기를 함유한 지질을 포함하도록 제조된다. 바람직하게, 이러한 아민기를 함유한 지질로는 1차 아민(primary amine)을 가지는 인지질이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 탄소수 12 내지 20인 포화 지질(예를 들어, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) 및/또는 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질(예를 들어, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) 중에서 선택된 2개의 지질이 포스파티딜에탄올아민의 글리세롤 1 및 2번 위치에 연결된 포스파티딜에탄올아민 및/또는 아미노 PEG-포스파티딜에탄올아민이 사용될 수 있다. 본 발명의 여러 목적상 더욱 바람직하게, 본 발명에서 사용될 수 있는 아민기를 함유한 지질로는 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE) 및/또는 DSPE-PEG 아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-amino(polyethylene glycol))(예를 들어, 바람직하게는 DSPE-PEG(2000) Amine)이 사용될 수 있다. Liposomes according to the present invention are prepared to contain lipids containing amine groups for attachment to hyaluronic acid. Preferably, the lipid containing the amine group may be a phospholipid having a primary amine, preferably a saturated lipid having 12 to 20 carbon atoms (e.g., lauric acid, myristic acid, palmitic acid, wherein two lipids selected from stearic acid, arachidic acid and / or unsaturated lipids having 16 to 20 carbon atoms (e.g., palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) are glycerol 1 and 2 of phosphatidylethanolamine Phosphatidylethanolamine and / or amino PEG-phosphatidylethanolamine, which are linked in position 1, can be used. More preferably for the purposes of the present invention, lipids containing amine groups which may be used in the present invention include dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE) and / or DSPE-PEG amine (1,2-distearoyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine-N-amino (polyethylene glycol) (for example, preferably DSPE-PEG (2000) Amine) may be used.

바람직하게, 본 발명에 따른 리포솜은 콜레스테롤을 함유한다. 리포솜 성분으로 콜레스테롤이 사용되지 않을 경우 리포솜의 안정성이 상대적으로 떨어져 상피세포성장인자의 방출 속도가 빨라지고 방출의 편차가 증가하여 본 발명에서 목적하는 서방화의 효과를 기대하기 어렵다. Preferably, the liposome according to the present invention contains cholesterol. When cholesterol is not used as a liposome component, the stability of the liposome is relatively reduced, and the release rate of the epithelial growth factor is increased and the deviation of the release is increased, so that the effect of the sustained release desired in the present invention is hardly expected.

본 발명의 리포솜은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 중성 지질(들)을 추가로 포함할 수 있다. The liposomes of the present invention may further comprise other neutral lipid (s) within the scope of not impairing the object of the present invention.

본 발명에 이용될 수 있는 중성 지질로는 포스파티딜콜린; 라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine); EPC(egg phosphatidylcholine); 탄소수 12 내지 20인 포화 지질(lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) 및/또는 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질(예를 들어, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) 중에서 선택된 하나 이상이 글리세롤에 연결된 포스파티딜콜린(예를 들어, DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DL(linoleoyl)PC(dilinoleoyl phosphatidylcholine), DL(lauryloyl)PC(dilauryloyl phosphatidylcholine), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoyl phosphatidylcholine), PLPC(1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MPPC(l-myristoyl-2-palmitoyl phosphatidylcholine), PMPC(l-palmitoyl-2-myristoyl phosphatidylcholine), SPPC(l-stearoyi-2-palmitoyl phosphatidylcholine), DBPC(l,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC(1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphochohne), POPC(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine), DOPC(dioleoyl phosphatidylcholine), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine)); PE(phosphatidylethanolamine); 라이소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine); 탄소수 12 내지 20인 포화 지질(lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) 및/또는 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질(예를 들어, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) 중에서 선택된 하나 이상이 글리세롤에 연결된 포스파티딜에탄올아민(예를 들어, DSPE(distearoyl phophatidylethanolamine), DMPE(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), DPPE(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), POPE(palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine), DOPE(dioleyl phosphatidylethanolamine), DSPE(distearoyl phophatidylethanolamine), POPE(palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine), DOPE(dioleyl phosphatidylethanolamine)); PEG-PE(polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine); 탄소수 12 내지 20인 포화 지질(lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) 및/또는 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질(예를 들어, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) 중에서 선택된 하나 이상이 글리세롤에 연결된 알콕시 PEG-PE(예를 들어, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[알콕시(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG)(예를 들어, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](DSPE-mPEG-2000)), MPEG-DSPE(carbonyl methoxypolyethylene glycol-distearoyl phosphatidylethanolamine)(예를 들어, 바람직하게는 DSPE-MPEG-750, DSPE-MPEG-2000 및 DSPE-MPEG-5000), MPEG-DPPE(carbonyl methoxypolyethylene glycol-dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine)(예를 들어, 바람직하게는 DPPE-MPEG-2000 및 DPPE-MPEG-5000), DMPE-MPEG(carbonyl methoxypolyethylene glycol-dimyristoyl phosphatidylethanolamine)(예를 들어, 바람직하게는 DMPE-MPEG-2000 및 DMPE-MPEG-5000); 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. Neutral lipids that may be used in the present invention include phosphatidylcholine; Lysophosphatidylcholine; EPC (egg phosphatidylcholine); Palmitoleic acid, oleic acid, linolenic acid, linolenic acid, palmitic acid, stearic acid, and arachidic acid having 12 to 20 carbon atoms and / or unsaturated lipids having 16 to 20 carbon atoms (e.g., palmitoleic acid, arachidonic acid, phosphatidylcholine linked to glycerol (for example, DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn- glycero-3-phosphocholine) , Dilinoleoyl phosphatidylcholine (DL), DL (dilauryloyl) phosphatidylcholine (DL), dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 2-palmitoyl phosphatidylcholine, 1-palmitoyl-2-myristoyl phosphatidylcholine, 1-stearoyl-2-palmitoyl phosphatidylcholine, DBPC (1,2-diarachidoyl- 3-phosphocholine, DEPC (1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC (palmitoyloleoyl phosphatidylcholine), DOPC ioleoyl phosphatidylcholine), DMPC (dimyristoyl phosphatidylcholine)); Phosphatidylethanolamine (PE); Lysophosphatidylethanolamine; Palmitoleic acid, oleic acid, linolenic acid, linolenic acid, palmitic acid, stearic acid, and arachidic acid having 12 to 20 carbon atoms and / or unsaturated lipids having 16 to 20 carbon atoms (e.g., palmitoleic acid, arachidonic acid, phosphatidylethanolamine (DSPE), dimyristoyl phosphatidylethanolamine (DMPE), dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE), palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine (POPE), dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE), DSPE (distearoyl phophatidylethanolamine), POPE (palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine), DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine)); Polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine (PEG-PE); Palmitoleic acid, oleic acid, linolenic acid, linolenic acid, palmitic acid, stearic acid, and arachidic acid having 12 to 20 carbon atoms and / or unsaturated lipids having 16 to 20 carbon atoms (e.g., palmitoleic acid, arachidonic acid) is an alkoxy PEG-PE linked to glycerol (for example, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- [alkoxy (polyethylene glycol)] (DSPE (E.g., 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- [methoxy (polyethylene glycol) 2000] (DSPE-mPEG-2000) DSPE-MPEG-2000 and DSPE-MPEG-5000), MPEG-DPPE (carbonyl methoxypolyethylene glycol-dipalmitoyl phosphatidylethanolamine) (For example, preferably DPPE-MPEG-2000 and DPPE-MPEG-5000), DMPE-MPEG (carbonyl methoxypolyethylene glycol-d imyristoyl phosphatidylethanolamine (for example, preferably DMPE-MPEG-2000 and DMPE-MPEG-5000); or mixtures thereof.

다만, 본 발명의 목적상 중성 지질로 디아스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-hosphocholine; DSPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine; DPPC), DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine), PLPC(1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PE(phosphatidylethanolamine), EPC(egg phosphatidylcholine) DLPC(dilauryloyl phosphatidylcboline), DMPC(dimyristoyl phosphatidylcholine), MPPC(l-myristoyl-2-palmitoyl phosphatidylcholine), PMPC(l-palmitoyl-2-myristoyl phosphatidylcholine), SPPC(l-stearoyi-2-palmitoyl phosphatidylcholine), DBPC(l,2-diarachidoyl-snglycero-3-phosphocholine), DEPC(1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphochohne), POPC(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine), DSPE(lysophosphatidylcholine), 또는 이들의 혼합물이 바람직하다.For the purpose of the present invention, however, it is preferred to use neutral lipids such as 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine ; DPPC), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (dimyristoyl phosphatidylcholine), PLPC (1-palmitoyl-2-linoleoyl- 2-palmitoyl phosphatidylcholine (MPPC), 1-palmitoyl-2-myristoyl phosphatidylcholine (PMPC), SPPC (1-stearoyl- palmitoyl phosphatidylcholine, DBPC, 1,2-diacachidoyl-snglycero-3-phosphocholine, DEPC (1,2-dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC (palmitoyloleoyl phosphatidylcholine), DSPE (lysophosphatidylcholine) Mixtures are preferred.

본 발명의 리포솜은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 양이온성 지질 및/또는 음이온성 지질을 추가적으로 포함할 수 있다. The liposomes of the present invention may additionally contain other cationic lipids and / or anionic lipids within the scope not to impair the object of the present invention.

상기 양이온성 지질로 사용되는 것은 디알킬디메틸암모늄, 디오레오일포스파티딜에탄올아민, 디오레오일디알킬트리메틸암모늄프로판 또는 디오레오일디알킬디메틸암모늄프로판을 포함하나, 이외에 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 다른 다양한 양이온성 지질이 사용될 수 있다. The cationic lipids include dialkyldimethylammonium, dioleoylphosphatidylethanolamine, dioleoyldialkyltrimethylammoniumpropane or dioleoyldialkyldimethylammoniumpropane, but may also include a variety of other well-known in the art Cationic lipids can be used.

상기 음이온성 지질에는 디미리스틸글리세로포스페이트, 디팔미토일글리세로포스페이트 디미리스틸글리세로포스페이트, 디스테로일글리세로포스페이트, 디스테로일글리세로포스포글리세롤, 디팔미토일글리세로포스포라글리세롤, 디미리스틸글리세로포스포세린, 디팔미토일글리세로포스포세린 또는 디스테로일글리세로포스포세린을 포함하나, 이외에 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 다른 다양한 음이온성 지질이 사용될 수 있다. Examples of the anionic lipid include dimyristyl glycerophosphate, dipalmitoyl glycerophosphate dimyristyl glycerophosphate, distearoyl glycerophosphate, distearoyl glycerophosphoglycerol, dipalmitoyl glycerophosphoryl glycerol, Di-myristyl glycerophosphorin, dipalmitoyl glycerophosphorus or distearoyl glycerophosphorus, but also various other anionic lipids well known in the art to which the present invention belongs.

바람직하게, 본 발명은 상피세포성장인자(EGF)를 함유하고 있는 단일층(unilamellar) 리포솜이며, 이러한 리포솜은 아민기를 함유한 지질, 콜레스테롤 및 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)을 포함하고 있고, 리포솜들이 히야론산과 연결되어 있는 리포솜-히야론산 복합체를 유효 성분으로 함유하고 있으며, 피하 또는 피내 주사 부위에서 상기 상피세포성장인자를 지연 방출(sustained release)하는 것을 특징으로 하는 피하 또는 피내 주사용 조성물을 제공한다. 이러한 조성물에 있어, 보다 바람직하게, 상기 리포솜은 DSPE-mPEG(예를 들어, 보다 바람직하게는 DSPE-mPEG(2000))을 추가적으로 포함하고 있고, 상기 아민기를 함유한 지질은 DSPE-PEG 아민(예를 들어, 보다 바람직하게는 DSPE-PEG(2000) 아민)이다. Preferably, the present invention is a unilamellar liposome containing an epithelial growth factor (EGF), wherein the liposome comprises lipid containing amine groups, cholesterol and distearoylphosphatidylcholine (DSPC) Wherein the composition comprises a liposome-hyaluronic acid complex which is linked to hyaluronic acid as an active ingredient and sustained release of the epithelial growth factor at the subcutaneous or intradermal injection site. to provide. In such a composition, more preferably, the liposome additionally comprises DSPE-mPEG (e.g., more preferably DSPE-mPEG (2000)) and the lipid containing amine groups is DSPE-PEG amine , More preferably DSPE-PEG (2000) amine).

예를 들어, 상기 DSPC 대신 용융점이 상대적은 낮은 DPPC와 같은 중성 지질을 사용한 리포솜의 경우 체온 근처에서 상피세포성장인자의 방출이 촉진됨으로써 본 발명에서 목적하는 서방성 달성을 위해서는 다른 부가적인 수단을 가하거나 상피세포성장인자의 함량을 낮게 조절해야 한다는 단점이 생길 수 있다. For example, in the case of liposomes using neutral lipids such as DPPC, which have a relatively low melting point in place of the DSPCs, the release of epithelial growth factors is promoted in the vicinity of the body temperature, so that additional means are required to achieve the desired sustained- Or the content of epithelial growth factor should be controlled to a low level.

또, 보다 바람직한 본 발명의 구현 예에 포함되는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[알콕시(폴리에틸렌글리콜)](DSPE-PEG)(예를 들어, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](DSPE-mPEG-2000)]는 리소폼 간의 뭉침 현상을 방지하는 등 리포솜의 안정성 개선에 도움이 되며, 또한 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)](ammonium salt)(예를 들어, DSPE-mPEG-2000amine)은 히야론산과의 결합을 위한 아민기를 제공한다. 히야론산과의 복합체를 형성하지 않으면 피하 또는 피내 주사 후 히야론산과 리포솜이 분리되어 체내에서 이동하므로 적용부위에서 서방화의 목적을 달성할 수 없다. PEG 고분자는 단일층 리포솜의 안정화에 도움이 된다. Also preferred are 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- [alkoxy (polyethylene glycol)] (DSPE-PEG) 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- [Methoxy (polyethylene glycol) 2000] (DSPE-mPEG-2000)] prevents the aggregation of lysoforms, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (ammonium polyethylene glycol) (ammonium salt) (for example, DSPE-mPEG-2000amine) When a conjugate of hyaluronic acid is not formed, hyaluronic acid and liposome are separated from each other after subcutaneous or intradermal injection, and therefore they can not be achieved in the application site. This helps stabilize the single layer liposomes.

본 발명에 따른 상기 단일층(unilamellar) 리포솜은 DSPC, DSPE-mPEG-2000, DSPE-mPEG-2000 아민 및 콜레스테롤로 형성될 경우 그 중량비가 20~40 : 3~7 : 3~7 : 7~13 (DSPC : DSPE-mPEG-2000 : DSPE-mPEG-2000 : 콜레스테롤)인 것이 본 발명의 목적상 보다 바람직하다.The unilamellar liposome according to the present invention has a weight ratio of 20 to 40: 3 to 7: 3 to 7: 7 to 13, when formed with DSPC, DSPE-mPEG-2000, DSPE-mPEG-2000 amine and cholesterol. (DSPC: DSPE-mPEG-2000: DSPE-mPEG-2000: cholesterol) is more preferable for the purpose of the present invention.

바람직하게, 본 발명은 상피세포성장인자(EGF)를 함유하고 있는 다중비히클(multivesicular) 리포솜이며, 이러한 리포솜은 아민기를 함유한 지질, 콜레스테롤, 디팔미토일포스파티딜글리세린 및 디오레오일포스파티딜콜린을 포함하고 있고, 리포솜들이 히야론산과 연결되어 있는 리포솜-히야론산 복합체를 유효 성분으로 함유하고 있으며, 피하 또는 피내 주사 부위에서 상기 상피세포성장인자를 지연 방출(sustained release)하는 것을 특징으로 하는 피하 또는 피내(intracutaneous) 주사용 조성물을 제공한다. 이러한 조성물에 있어, 보다 바람직하게, 상기 리포솜은 트리글리세라이드를 추가적으로 포함하고 있고, 상기 아민기를 함유한 지질은 디팔미토일포스파티딜에탄올아민이다.Preferably, the present invention is a multivesicular liposome containing epithelial growth factor (EGF), which liposome contains lipids containing an amine group, cholesterol, dipalmitoyl phosphatidylglycerin and diorouylphosphatidylcholine A liposome-hyaluronic acid complex in which liposomes are linked to hyaluronic acid as an active ingredient, and sustained release of the epithelial growth factor at the subcutaneous or intradermal injection site. ) ≪ / RTI > In such a composition, more preferably, the liposome further comprises triglyceride, and the lipid containing the amine group is dipalmitoyl phosphatidylethanolamine.

이러한 리포솜-히야론산 복합체에 있어, 히야론산과 결합할 수 있는 아민기가 있는 지질인 DPPE가 없는 경우 입자를 형성 또는 유지시키기 어렵고 결과적으로 상피세포성장인자의 국소적 서방 방출을 달성하기 어렵다. In such a liposome-hyaluronic acid complex, in the absence of DPPE, which is a lipid having an amine group capable of binding to hyaluronic acid, it is difficult to form or maintain particles, and consequently, it is difficult to achieve local sustained release of epithelial growth factor.

또한, 본 발명에 따른 다중비히클(multivesicular) 리포솜에 포함되는 트리글리세라이드는 리포솜이 매우 단단히 안정화되어 약물의 방출이 너무 느려지는 단점을 개선하기 위하여 추가될 수 있으며, 이러한 트리글리세라이드는 탄소수 12 내지 20인 포화 지질(예를 들어, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) 및/또는 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질(예를 들어, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid) 중에서 선택된 3개의 지방산이 연결되어 있다. 바람직하게, 본 발명에서 사용된 트리글리세라이드는 이중결합이 포함된 불포화 지방산을 포함하며, 보다 바람직하게 지방산 분자 사슬에 이중 결합이 2개 이상 또는 3개 이상인 다불포화 지방산을 포함하고, 더욱더 바람직하게는 분자 사슬에 이중결합이 3개 이상인 다불포화 지방산을 포함한다. 상기 다불포화 지방산으로는 올레산(ω-9), 감마리놀레산(ω-6), 및 알파리놀렌산(ω-3)을 예로 들 수 있으나 특별히 여기에 한정되는 것은 아니다. 모노 및 디리놀레일(mono- or dilinoleyl), 모노 및 디올레일(mono- and dioleyl), 모노 및 디팔미톨레일(mono- and dipalmitoleyl), 모노 및 디미리스톨레일(mono- and dimyristoleyl) 등의 불포화 지방산 에스터 또한 사용될 수 있으며, 포화 지방산 에스터와 불포화 지방산 에스터가 함께 존재하는 형태일 수 있다. 상기 분자사슬 내 불포화 이중결합이 1개인 모노불포화지방산의 함량이 높거나 다불포화 지방산(예를 들어, 이중결합이 3개인 리놀렌산(ω-3))이 50 중량% 이하인 불포화오일의 경우에는 초기 방출은 어느 정도 제어가 가능하지만 서방출 효과가 미미하다.In addition, the triglyceride contained in the multivesicular liposome according to the present invention may be added to improve the disadvantage that the liposome is very tightly stabilized and the release of the drug is too slow, and this triglyceride has 12 to 20 carbon atoms (For example, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, and the like) having a carbon number of 1 to 20 and a saturated lipid (e.g., lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid) acid) are connected to each other. Preferably, the triglyceride used in the present invention comprises an unsaturated fatty acid containing a double bond, more preferably a polyunsaturated fatty acid having two or more double bonds in the fatty acid molecular chain, or more preferably three or more, And polyunsaturated fatty acids having three or more double bonds in the molecular chain. Examples of the polyunsaturated fatty acids include oleic acid (? -9), gamma linoleic acid (? -6), and alpha linolenic acid (? -3), but are not limited thereto. Mono- and di- < Desc / Clms Page number 3 > dimyristoleyl, mono- and di-linoleoyl, mono- and dioleyl, mono- and dipalmitoleyl, Unsaturated fatty acid esters may also be used, and may be in the form of a saturated fatty acid ester and an unsaturated fatty acid ester together. In the case of an unsaturated oil having a high content of monounsaturated fatty acids having one unsaturated double bond in the molecular chain or a polyunsaturated fatty acid (for example, linolenic acid (ω-3) having three double bonds) of 50 wt% Can be controlled to a certain extent, but the emission effect is insignificant.

본 발명에 따른 상기 다중비히클(multivesicular) 리포솜은 DPPG, DPPE, DOPC, 트리글리세라이드, 및 콜레스테롤로 형성될 경우 그 중량비가 38~46 : 25~35 : 17~25 : 19~27 : 11~19 (DPPG : DPPE : DOPC : 트리글리세라이드 : 콜레스테롤)인 것이 본 발명의 목적상 보다 바람직하다.When the multivesicular liposome according to the present invention is formed of DPPG, DPPE, DOPC, triglyceride, and cholesterol, the weight ratio of the multivesicular liposome is 38 to 46:25 to 35:17 to 25:19 to 27:11 to 19 DPPG: DPPE: DOPC: triglyceride: cholesterol) is more preferable for the purpose of the present invention.

본 발명의 리포솜은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 여러 가지 보조제를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 또한 리포솜의 제조에 있어 유화안정보조제로 폴리올을 포함할 수 있으며, 이러한 폴리올로는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자이리톨, 솔비톨 등이 사용될 수 있고, 이러한 폴리올로는 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜등이 더욱 바람직하다. 본 발명은 또한 리포솜 제조에 세라마이드를 추가로 이용할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 리포솜에 올리고당을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 올리고당으로 푸코이단, 글루코사민, 팩틴질, 헤파린등이 사용될 수 있으며, 푸코이단이 가장 바람직하다.The liposome of the present invention may additionally contain various adjuvants to the extent that the object of the present invention is not impaired. For example, the present invention may also include a polyol as an emulsion stabilizing aid in the production of liposomes, such as propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, methylpropanediol, isoprene Glycol, pentylene glycol, erythritol, xylitol, sorbitol and the like can be used, and as such polyols, glycerin, butylene glycol, propylene glycol and the like are more preferable. The present invention can further utilize ceramides for the production of liposomes. The present invention may further comprise an oligosaccharide in the liposome of the present invention. Such oligosaccharides may be fucoidan, glucosamine, lactose, heparin or the like, and fucoidan is most preferable.

본 발명의 리포솜-히야론산 복합체를 만들기 위해 사용되는 히야론산 고분자는 분자량이 증가할수록 리포솜과의 결합을 할 수 있는 카르복실기를 많이 함유하고 있고 주사제의 적절한 점도 유지에 도움이 된다. 본 발명의 목적상 이러한 히야론산의 분자량은 중량평균 분자량이 약 10만 내지 100만인 것이 바람직하며, 중량평균 분자량이 약 30만 내지 50만인 것이 더욱 바람직하다. 바람직한 분자량을 가진 히야론산이 사용될 경우 주사 후 리포솜의 이동을 방지하여 적용 부위가 3일 이상 동일한 위치에 있을 수 있게 하는 역할을 할 수 있을 것이며 적절한 점도유지로 주사하기에 편리하다.The hyaluronic acid polymer used to make the liposome-hyaluronic acid complex of the present invention contains a large number of carboxyl groups capable of bonding with the liposomes as the molecular weight increases, and helps maintain proper viscosity of the injection. For the purposes of the present invention, the molecular weight of such a hylaronic acid preferably has a weight average molecular weight of about 100,000 to 1,000,000, and more preferably has a weight average molecular weight of about 300,000 to 500,000. When hyaluronic acid having a desirable molecular weight is used, it is possible to prevent the migration of the liposome after injection and to allow the application site to be in the same position for more than three days.

본 발명의 상피세포성장인자 함유 리포솜-히야론산 복합체에 있어, 복합체는 본 발명의 목적상 (특히 피하 또는 피내 주사 후 주사 부위에 고정한다는 목적상) 직경이 약 1-50 μm인 것이 바람직하다. 작은 주사바늘을 사용이 가능하고 주사 후 통증이 적다는 측면도 고려하면 클러스터 입경은 10-50 μm인 것이 더욱 바람직하다. 다만, 10 μm 보다 적을 경우 입자의 체내에서 이행될 가능성이 증가한다.In the epithelial growth factor containing liposome-hyaluronic acid complex of the present invention, it is preferred that the complex has a diameter of about 1-50 μm for the purposes of the present invention (especially for the purpose of fixing to the injection site after subcutaneous or intradermal injection). It is more preferable that the particle diameter of the cluster is 10-50 μm considering the aspect that small needles can be used and the pain after injection is small. However, if it is less than 10 μm, the likelihood of particle migration increases.

본 발명에 있어 리포솜과 복합체의 입경은 전기영동 광산란 분광광도기(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer)를 이용해 측정된 값으로, 입도 분포에서 누적 체적이 50 부피%에 해당하는 입자의 직경인 평균 입경(D50)을 의미한다. In the present invention, the particle size of the liposome and the complex was measured using an electrophoretic light scattering spectrophotometer, and the average particle diameter (D 50) , which is the diameter of particles corresponding to a cumulative volume of 50 vol% in the particle size distribution ).

본 발명은 또한 (a) 아민기를 함유한 지질을 이용하여 상피세포성장인자(EGF)를 함유하는 리포솜을 제조하는 단계, 및 (b) 상기 (a)단계에서 제조된 리포솜과 히야론산 고분자의 반응을 통해 리포솜-히야론산 복합체를 형성하는 단계를 추가적으로 포함하는, 주름 개선 용도로 적합한 상피세포성장인자 함유 리포솜-히야론산 복합체의 제조 방법을 제공한다. 보다 바람직하게, 이러한 제조 방법에 있어 상기 리포솜은 디스테아로일포스파티딜콜린, DSPE-mPEG(2000), DSPE-PEG(2000) 아민 및 콜레스테롤을 포함하는 단일층(unilamellar) 리포솜이거나, 또는 디팔미토일포스파티딜글리세린, 디팔미토일포스파티딜아민, 디오레오일포스파티딜콜린, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤을 포함하는 다중비히클(multivesicular) 리포솜이며, 이러한 리포솜-히야론산 복합체는 사용된 성분들의 특성, 상피세포성장인자의 방출 특성 등에 기초할 때 주름 개선 용도로 더욱 적합하다. The present invention also provides a method for preparing a liposome comprising the steps of: (a) preparing a liposome containing an epithelial growth factor (EGF) using lipids containing an amine group; and (b) reacting the liposome and the hyaluronic acid polymer Wherein the liposome-hyaluronic acid complex is a liposome-hyaluronic acid complex. More preferably, in such a preparation, the liposome is a unilamellar liposome comprising dystearoylphosphatidylcholine, DSPE-mPEG (2000), DSPE-PEG (2000) amine and cholesterol, or dipalmitoylphosphatidyl Is a multivesicular liposome including glycerin, dipalmitoylphosphatidylamine, diureoylphosphatidylcholine, triglyceride and cholesterol. These liposome-hylauronic acid complexes are based on the properties of the components used, the release characteristics of epithelial growth factors, etc. It is more suitable for improving wrinkles.

본 발명의 리포솜은 곧은 통로 또는 굴곡 통로를 가진 필터를 통해 압출하거나, 호모게나이저를 이용하여 균질화함으로써 축소된 균일한 크기분포를 가지도록 할 수 있으며, 제조된 용액을 탈수법 또는 동결건조법으로 건조시킬 수 있다.The liposomes of the present invention can be extruded through a filter having a straight passage or a curved passage or can be homogenized using a homogenizer to have a reduced size distribution and the prepared solution is dried by a dehydration method or a freeze drying method .

본 발명의 제조방법에 있어 상피세포성장인자의 리포솜 내 로딩은 본 발명이 속한 분야에서 통상적으로 알려진 여러 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 열 민감성의 리포솜을 제조하면서 상피세포성장인자를 통상적인 수화방법으로 로딩할 수 있다. 이외에 본 발명이 속한 분야에서 통상적으로 알려진 pH gradient loading 방법과 ammonium ion loading 방법을 이용하여 유효 성분을 봉입시킬 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 카르복실기가 2개 이상 있는 약산 및 탄산수소암모늄(ammonium bicarbonate)을 리포솜 내에 먼저 봉입하고 복합체를 형성시킨 다음 상피세포성장인자를 수용액에 넣으면 리포솜 표면에 삼투압이 발생하여 유효 성분이 리포솜 내로 들어가게 되고 이후에 유기산과 수소 결합하여 분자가 큰 가교체를 형성하여 다시 밖으로 나오지 못하여 로딩이 증가하는 '리모트 로딩' 방식을 이용할 수 있다. 약산은 50-500 mmol, 바람직하게는 200-300 mmol에서 유효 성분의 봉입효율을 가장 높일 수 있다. 상기 카르복실기가 2개 이상 있는 약산으로는, 예를 들어, 말레익, 퓨마릭, 석시닉, 타르타릭, 시트릭 산, 또는 이들의 혼합물을 이용할 수 있으나, 보다 바람직하게, 상기 약산으로는 구연산(citric acid)이 이용된다.In the production method of the present invention, the liposome loading of the epithelial growth factor can be performed by various methods commonly known in the art. For example, epithelial growth factors can be loaded by conventional hydration methods while producing heat sensitive liposomes. In addition, the pH gradient loading method and the ammonium ion loading method commonly known in the field of the present invention can be used to enclose an active ingredient. Specifically, for example, when a weak acid having two or more carboxyl groups and ammonium bicarbonate are first encapsulated in a liposome to form a complex, and then an epithelial growth factor is added to an aqueous solution, osmotic pressure is generated on the surface of the liposome, A 'remote loading' method can be used in which the liposomes enter into the liposome and then hydrogen bonds with the organic acid to form a large cross-linked molecule and can not go out again, thereby increasing the loading. The efficiency of encapsulating the active ingredient can be maximized at a weak acid of 50-500 mmol, preferably 200-300 mmol. As the weak acid having two or more carboxyl groups, for example, maleic acid, fumaric acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, or a mixture thereof may be used. More preferably, citric acid is used.

히야론산을 이용한 리포솜-히야론산 복합체의 제조는 본 발명이 속한 분야에서 알려진 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 본 발명의 목적상 바람직하게는, Carbodiimide 커플링 반응을 이용할 수 있다. 예를 들어, 히야론산과 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)(또는 DCC(dicyclohexylcarbodiimide))와 NHS(N-hydroxysuccinimide esters)을 혼합하여 카복시기를 활성화시킨 다음 아민기를 함유한 리포솜을 첨가하여 상온에서 2시간 이상 반응을 유도하여 히야론산과 리포솜이 결합된 복합체를 얻을 수 있다.The preparation of the liposome-hylauronic acid complex using hyaluronic acid can be carried out by a conventional method known in the art. For the purpose of the present invention, a carbodiimide coupling reaction can be preferably used. For example, the carboxy group is activated by mixing hyaluronic acid and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (or DCC (dicyclohexylcarbodiimide)) and NHS (N-hydroxysuccinimide esters) And the reaction is induced at room temperature for 2 hours or more to obtain a complex in which hyaluronic acid and liposome are combined.

본 발명에 따른 약학, 미용학적 또는 화장학적 조성물은 앞서 언급한 리포솜-히야론산 복합체 이외에, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사용 생리식염수, 등장화제, pH조절제, 안정화제, 계면활성제 등을 추가로 포함할 수 있다. The pharmaceutical, cosmetic or cosmetic composition according to the present invention may further comprise, in addition to the aforementioned liposome-hyaluronic acid complex, a pharmaceutically acceptable additive to the extent that the object of the present invention is not impaired. For example, it may further include a physiological saline solution for injection, an isotonizing agent, a pH adjusting agent, a stabilizer, a surfactant, and the like.

본 발명의 상피세포성장인자 함유 리포솜-히야론산 복합체는 상처 치료, 주름 개선, 미백 등이 필요한 부위에 국소적으로 투여되어 투여된 부위에서 장기간 머무르면서 수일 또는 수주 동안 상피세포성장인자를 일정한 속도로 방출함으로써 그 치료 또는 개선 효과를 극대화할 수 있다. 본 발명의 리포솜-히야론산 복합체는 생분해성의 리포솜으로 제조되어 몸에 축적되지 않고 분해될 수 있으며, 독성이 없어 안전하다. 특히, 본 발명의 리포솜-히야론산 복합체는 유효 성분으로 상피세포성장인자를 포함하여 위와 같은 장점을 가질 뿐만 아니라, 복합체 제조를 위해 사용된 히야론산 또한 주름, 미백 등의 피부 상태 개선에 도움이 되고 주름 개선용 필러 역할을 할 수 있어 이러한 용도로 그 효과가 매우 뛰어나다.The liposome-hyaluronic acid complex containing the epithelial growth factor of the present invention may be administered locally to a site where wound healing, wrinkle improvement, whitening, etc. are required to be locally administered, and the epithelial growth factor may be released at a constant rate for a few days or several weeks So that the treatment or improvement effect can be maximized. The liposome-hyaluronic acid complex of the present invention is made of biodegradable liposome and can be decomposed without accumulating in the body, and is safe because it is not toxic. In particular, the liposome-hyaluronic acid complex of the present invention not only has the above-mentioned advantages including an epithelial growth factor as an effective ingredient, but also helps improve the skin condition such as wrinkles and whitening, It can serve as a filler for improving wrinkles, and thus the effect is very excellent for such a use.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 본 발명에 따른, 히야론산과 리포솜이 결합된 리포솜-히야론산 복합체 필러의 구성을 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 리포솜의 형태 변화를 관찰하기 위한, 실시예 1-2 및 2-1의 Cryo-TEM 사진 측정 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 리포솜-히야론산 결합체 필러의 형태 변화를 측정하기 위한 실험 결과인, 실시예 3-2-1의 광학현미경 관찰 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1-2, 실시예 2-1, 실시예 3-1-2 및 실시예 3-2-1의 리포솜 또는 리포솜-히야론산 복합체로부터 시간에 따라 방출되는 EGF의 누적 방출량을 측정한 그래프 결과이다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The accompanying drawings, which are incorporated in and constitute a part of the specification, illustrate exemplary embodiments of the invention and, together with the description of the invention, It should not be construed as limited.
1 is a schematic view showing the constitution of a liposome-hyaluronic acid complex filler in which hyaluronic acid and liposome are combined according to the present invention.
FIG. 2 shows the results of Cryo-TEM photographs of Examples 1-2 and 2-1 for observing morphological changes of the liposome according to the present invention.
FIG. 3 is an optical microscope photograph of Example 3-2-1, which is an experimental result for measuring the morphological change of the liposome-hyaluronic acid conjugate filler according to the present invention.
4 shows the cumulative accumulation of EGF released from liposomes or liposome-hyaluronic acid complexes of Examples 1-2, 2-1, 3-1-2, and 3-2-1 of the present invention over time This is the result of the measurement of the emission amount.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail to facilitate understanding of the present invention. However, the embodiments according to the present invention can be modified into various other forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following embodiments. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art to which the present invention belongs.

실시예 1: EGF 함유 유니라멜라 리포솜(Unilamellar liposomes; ULL) 제조Example 1: Preparation of EGF-containing Unilamellar liposomes (ULL)

리포솜을 제조하기 위하여, 지질 성분인 1) 콜레스테롤, 2) 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC) 또는 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidyl choline, DSPC), 3) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](DSPE-mPEG-2000)], 및 4) 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)(DSPE-PEG-2000amine)을 다양한 비율의 질량비로 사용하였다. 각 지질을 클로로포름에 용해시킨 후, 회전 증발기를 사용하여 40℃에서 감압하여 둥근 플라스크 벽면에 얇은 지질 막을 형성시켰다.1) cholesterol, 2) dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) or distearoyl phosphatidyl choline (DSPC), 3) 1,2-distearoyl-phosphatidylcholine glycero-3-phosphoethanolamine- [methoxy (polyethylene glycol) 2000] (DSPE-mPEG-2000) and 4) 1,2-distearoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine- N- [ (polyethylene glycol) -2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG-2000amine) was used in various ratios of the mass ratios. Each lipid was dissolved in chloroform, and then a thin lipid membrane was formed on the wall of the round flask by reducing pressure at 40 ° C using a rotary evaporator.

지질 막에 300 mM citric acid을 가하고 여기에 ammonium bicarbonate를 서서히 넣으면서 pH 4의 완충액으로 제조하였다. 제조된 리포솜은 크기를 조절하기 위하여 가압압출기로 각각 200 nm, 100 nm 및 80 nm의 폴리카보네이트 분리막(Whatman, USA)을 이용하여 4-5회 이상씩 가압 압출하였다. 리포솜 내부에 봉입되지 않은 citric acid는 Sephadex G-50 columns (20 mM HEPES buffer pH 7)을 이용하여 제거하였다. 제조되어진 리포솜에 EGF를 약물 : 지질비율이 1 : 10 (w/w)이 되도록 첨가하여 24℃에서 20시간 pH gradient loading 방법과 ammonium ion loading 방법을 이용하여 EGF이 봉입된 리포솜을 제조하였다. 리포솜 내부에 봉입되지 않은 EGF은 Sephadex G-50 columns을 이용하여 제거하였다.300 mM citric acid was added to the lipid membrane and ammonium bicarbonate was slowly added thereto to prepare a buffer solution of pH 4. The liposomes were extruded by pressure extruder more than 4-5 times using 200 nm, 100 nm and 80 nm polycarbonate membrane (Whatman, USA) to adjust the size. Citric acid, which was not encapsulated in the liposomes, was removed using Sephadex G-50 columns (20 mM HEPES buffer, pH 7). EGF was added to the prepared liposome at a drug: lipid ratio of 1:10 (w / w), and lipid encapsulated with EGF was prepared by pH gradient loading method and ammonium ion loading method at 24 ° C for 20 hours. EGF not encapsulated in the liposome was removed using Sephadex G-50 columns.

리포솜의 모폴로지를 측정하기 위하여 Cryo-TEM (Tecnai G2 Spirit, FEI Company, Hillsboro, OR, USA) 장비를 이용하였다. 5μl 용액을 채취 후 구리 그리드의 탄소필름에 시료 로딩시킨 다음, 액화 질소로 급속 냉각 후 측정하였다. 본 이미지는 CCD camera (Proscan GmbH, Scheuring, Germany)로 기록하였으며, Analysis software (Soft Imaging System, GmbH, Munster, Germany)를 사용하였다.Cryo-TEM (Tecnai G2 Spirit, FEI Company, Hillsboro, OR, USA) was used to measure the liposome morphology. A 5 μl solution was sampled and loaded onto a carbon film of a copper grid and then rapidly cooled with liquefied nitrogen. This image was recorded with CCD camera (Proscan GmbH, Scheuring, Germany) and analyzed software (Soft Imaging System, GmbH, Munster, Germany) was used.

하기 표 1은 실시예 1의 인지질 배합조건(중량비, w/w)를 나타낸다.Table 1 below shows the phospholipid mixing conditions (weight ratio, w / w) of Example 1.

DPPCDPPC DSPCDSPC DSPE-mPEG-2000DSPE-mPEG-2000 DSPE-PEG-2000amineDSPE-PEG-2000amine 콜레스테롤cholesterol 실시예1-1Example 1-1 3030 55 55 1010 실시예1-2Examples 1-2 3030 55 55 1010 실시예1-3Example 1-3 3030 00 1010 1010 실시예1-4Examples 1-4 3030 1010 00 1010 실시예1-5Examples 1-5 3030 55 55 00

실시예 2: EGF 함유 멀티베시클 리포솜(Multivesicular liposomes; MVL) 제조Example 2: Preparation of Multivesicular Liposomes (MVL) containing EGF

리포솜을 제조하기 위하여, 지질 성분인 1) 콜레스테롤, 2) 디팔미토일포스파티딜글리세린(dipalmitoyl phosphatidylglycerine, DPPG), 3) DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 4) 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, DPPE), 및 5) 트리글리세라이드를 다양한 비율의 질량비로 사용하였다. 1) cholesterol, 2) dipalmitoyl phosphatidylglycerine (DPPG), 3) DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 4) Dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE), and 5) triglyceride were used in various ratios of the mass ratios.

지질은 클로로포름에 용해시켰다. 300 mM citric acid에 2 mmol의 EGF를 용해시킨후 pH 4의 완충액으로 제조하였다. 지질 용액을 약물 완충액에 서서히 혼합하면서 강하게 1시간 이상 교반하여 입자 크기가 약 1 μm 이하가 되게 강한 교반을 하여 1차 에멜젼을 제조하였다. 이 용액은 안전성이 낮으므로 최대한 빠른 시간에 미리 준비한 생리식염수 용액에 서서히 혼합하면서 강한 교반을 하여 입자 크기가 약 20 μm의 2차 유화액를 제조하였다. 상온에서 서서히 지질에 포함된 클로로포름을 감압 하에서 제거하면 최종 EGF 함유 멀티베시클 리포솜을 제조하였다.Lipids were dissolved in chloroform. After dissolving 2 mmol of EGF in 300 mM citric acid, the solution was buffered to pH 4. The lipid solution was agitated for 1 hour or more while gradually mixing with the drug buffer solution, and strong agitation was performed so that the particle size was less than about 1 占 퐉 to prepare a first-order melt. Since this solution is low in safety, it is stirred vigorously in a physiological saline solution prepared as soon as possible to produce a secondary emulsion having a particle size of about 20 μm. The chloroform contained in the lipids was gradually removed at room temperature under reduced pressure to prepare the final EGF-containing multimeric liposomes.

리포솜 내부에 봉입되지 않은 EGF와 citric acid는 Sephadex G-50 columns (20 mM HEPES buffer pH 7)을 이용하여 제거하였다. 시료의 약물 함량은 하기 실험예 2와 같은 방법으로 형광 광도계를 이용하여 로딩 양을 측정하였다.EGF and citric acid not encapsulated in liposomes were removed using Sephadex G-50 columns (20 mM HEPES buffer, pH 7). The drug content of the sample was measured by a fluorescence photometer in the same manner as in Experimental Example 2 below.

리포솜의 모폴로지는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 평가하였다.The liposome morphology was evaluated in the same manner as in Example 1 above.

하기 표 2은 실시예 2의 인지질 배합조건(중량비, w/w)를 나타낸다. Table 2 below shows the phospholipid mixing conditions (weight ratio, w / w) of Example 2.

DPPGDPPG DPPEDPPE DOPCDOPC 트리글리세라이드Triglyceride 콜레스테롤cholesterol 실시예2-1Example 2-1 4242 3030 2121 2323 1515 실시예2-2Example 2-2 4242 00 2121 2323 1515 실시예2-3Example 2-3 4242 3030 2121 00 1515 실시예2-4Examples 2-4 4242 3030 00 2323 1515 실시예2-5Example 2-5 4242 3030 2121 2323 00

상기 표 2에서 트리글리세라이드로는 1,2,3-trioctanoylglycerol인 Tricaprylin을 이용하였다.Tricaprylin, 1,2,3-trioctanoylglycerol, was used as the triglyceride in Table 2 above.

실시예 3: 실시예 1과 2의 EGF 함유 리포솜과 히야론산 고분자 반응을 통한 서방형 히야론산 필러 제조Example 3: Production of sustained-release hyaluronic acid filler by reaction of EGF-containing liposome with hyaluronic acid polymer in Examples 1 and 2

0.5 중량% 히야론산 고분자(중량평균 MW 350,000) 1ml를 1% EDC와 1% NHS 수용액에 첨가하여 카르복시 기의 활성화를 유도하였다. EGF 함유 리포솜과 히야론산 반응 용액은 상온에서 2시간 이상 서서히 교반하면서 반응을 유도하였다. 반응이 종료된 후 미반응물의 제거를 위하여 4000 rpm 이상에서 원심 분리하여 상층액을 버리고 침전물을 생리식염수로 재분산시켰다. 이와 같은 조작을 3회 이상 반복하였다.1 ml of 0.5% by weight hyaluronic acid polymer (weight average MW 350,000) was added to 1% EDC and 1% NHS aqueous solution to induce activation of carboxyl groups. The EGF-containing liposome and hyaluronic acid reaction solution were reacted slowly at room temperature for 2 hours or more. After the reaction was completed, the supernatant was discarded by centrifugation at 4000 rpm or higher to remove unreacted materials, and the precipitate was redispersed in physiological saline. This operation was repeated three times or more.

시험예 1: 제조된 리포솜의 입자크기와 표면 전하 측정Test Example 1: Measurement of particle size and surface charge of the prepared liposome

각각 실시예에서 제조한 EGF 함유 리포솜의 입자크기 및 표면 전하를 전기영동 광산란 분광광도기(ELS-Z, Otuska, 일본)를 이용하여 측정하였다. 측정결과는 하기 표 3에 나타내었다.The particle size and surface charge of the EGF-containing liposome prepared in each Example were measured using an electrophoresis light scattering spectrometer (ELS-Z, Otuska, Japan). The measurement results are shown in Table 3 below.

시험예 2: 리포솜-히야론산 필러으로부터 약물의 방출 특성Test Example 2: Release characteristics of drug from liposome-hyaluronic acid filler

리포솜으로부터 EGF의 방출 특성을 확인하기 위하여 시간에 따라 방출되는 EGF의 농도를 형광 광도계를 사용하여 측정하였다. EGF의 미량 방출 농도를 측정하기 위하여 EGF에 FITC를 무게비로 2:1로 첨가하여 상온에서 2시간 서서히 교반하면서 반응시켰다. 반응이 완료된 EGF-FITC는 3500 MWCO 투석막을 이용하여 미반응 FITC를 제거 정제하고 동결건조하여 반응물을 얻었다. 방출 실험용 시료는 EGF-FITC를 사용하여 리포솜을 제조하였다. 흡수파장 488 nm와 형광 검출 파장 520 nm에서 검량선을 작성하여 방출된 시료의 함량을 측정하였다. 시료 200 mg을 PBS 완충액 10ml가 있는 바이알에 넣고 시간에 따라 0.5 ml씩 채취하여 형광 광도계를 이용하여 방출된 EGF의 농도를 측정하였다. 방출농도는 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.To determine the release characteristics of EGF from liposomes, the concentration of EGF released over time was measured using a fluorescence photometer. In order to measure the trace amount of EGF, EGF was added at a ratio of 2: 1 by weight of FITC and reacted with stirring at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, unreacted FITC was removed and purified by using a 3500 MWCO dialysis membrane and lyophilized to obtain a reaction product. Liposomes were prepared using EGF-FITC as a sample for the release experiment. A calibration curve was prepared at an absorption wavelength of 488 nm and a fluorescence detection wavelength of 520 nm to determine the content of the released sample. 200 mg of the sample was put into a vial containing 10 ml of PBS buffer, and 0.5 ml of each sample was taken with time, and the concentration of released EGF was measured using a fluorescence photometer. The emission concentration was calculated according to the following equation (1).

Figure 112016029362755-pat00001
Figure 112016029362755-pat00001

상기 수학식 2에서, F t 는 각 조건에서 리포솜의 형광강도이고, F i 는 약물의 방출이 일어나지 않은 범위(4)에서의 형광강도이며, F f 는 클로로포름 : 메탄올 (8:2)(부피비)로 리포솜을 처리하여 측정한 EGF의 형광강도이다.In Equation 2, F t is the fluorescence intensity of the liposome in each condition, F i is the fluorescence intensity at that the release of the drug occurs range (4), F f is chloroform: methanol (8: 2) (volume ratio ) ≪ / RTI > of the EGF.

시험예 3: 형성된 복합체의 고정성 평가Test Example 3: Evaluation of the stability of the formed composite

실시예 3-1-2, 3-1-4, 3-2-1 및 및 3-2-2를 마우스에 0.1 ml 피하 주사하고, 1일 후 주사부위를 적출하여 적출된 부위에 EGF의 함량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 함께 나타내었다(* 표시됨). The mice were injected subcutaneously with 0.1 ml of each of Examples 3-1-2, 3-1-4, 3-2-1 and 3-2-2, and the injection site was removed one day later, and the content of EGF Were measured. The results are shown together in Table 3 (* indicated).

표 3의 결과에 나타나는 바와 같이, 본 발명에서 목적하는 적당한 입자 크기를 갖는 실시예 3-1-2 및 3-2-1의 리포솜-히야론산 복합체의 경우 투여된 부위에서 EGF가 이동 없이 유지됨을 알 수 있었다. 반면에 크기가 너무 작은 실시예 3-1-4 및 3-2-2의 경우 피부의 체액 등에 의하여 유실되어 EGF가 실질적으로 관찰되지 않았다.As shown in the results of Table 3, in the case of the liposome-hyaluronic acid complexes of Examples 3-1-2 and 3-2-1 having suitable particle sizes desired in the present invention, Could know. On the other hand, in Examples 3-1-4 and 3-2-2 in which the size was too small, EGF was not substantially observed due to loss of body fluids and the like.

각 실시예들의 평가 결과를 하기 표 3에 종합하여 나타내었다.The evaluation results of the respective examples are summarized in Table 3 below.

입자크기(μm)Particle Size (μm) 표면전하(mV)Surface charge (mV) EGF농도
(mg/ml)EGF concentration
(mg / ml) 방출속도
(mg/day)Release rate
(mg / day) 실시예3-1-1Example 3-1-1 1717 -11-11 4.64.6 4.14.1 실시예3-1-2Example 3-1-2 1111 -12-12 6.7/5.5*6.7 / 5.5 * 1.41.4 실시예3-1-3Example 3-1-3 침전Sedimentation -- -- -- 실시예3-1-4Example 3-1-4 0.160.16 -16-16 4.2/0*4.2 / 0 * NDND 실시예3-1-5Example 3-1-5 1717 -19-19 6.16.1 5.25.2 실시예3-2-1Example 3-2-1 34.334.3 -25-25 5.8/4.6*5.8 / 4.6 * 1.21.2 실시예3-2-2Example 3-2-2 4.34.3 -19-19 3.4/0*3.4 / 0 * NDND 실시예3-2-3Example 3-2-3 35.835.8 -21-21 4.74.7 0.10.1 실시예3-2-4Example 3-2-4 침전Sedimentation -- -- -- 실시예3-2-5Example 3-2-5 침전Sedimentation -- -- --

* ; 마우스 피부 주사 1일 후 피부 내의 EGF-FITC 함량 변화*; Changes in EGF-FITC content in skin 1 day after mouse skin injection

실시예 3에서 제조한 리포솜-히야론산 필러의 물리적 특성을 확인한 결과, 실시예 3-1-1에 나타낸 바와 같이 DPPC를 사용한 경우 체온 근처에서 DPPC의 용융점이 낮아(보통 32℃) 약물의 방출이 매우 빠르게 진행됨을 알 수 있었다.The physical properties of the liposome-hyaluronic acid filler prepared in Example 3 were examined. As shown in Example 3-1-1, when the DPPC was used, the melting point of the DPPC was low (usually 32 ° C) It was found that it progressed very quickly.

실시예 3-1-3의 경우 DSPE-mPEG-2000를 사용하지 않을 경우 리포솜의 안정성이 낮아 리포솜 간의 뭉침 현장이 발생해 제조에 문제점이 있었다.In the case of Example 3-1-3, when DSPE-mPEG-2000 was not used, the stability of the liposome was low and there was a problem in production due to the occurrence of lumpsurface between liposomes.

실시예 3-1-4의 경우 DSPE-mPEG-2000amine을 사용하지 않으면 리포솜과 히야론산 간의 반응이 되지 않아 마이크로 단위의 입자를 형성하기 어려운 단점이 있다. 즉, 주사 후 히야론산과 리포솜이 분리되어 체내에서 이동하므로 적용부위에서 서방화의 목적을 달성할 수 없었다.In case of Example 3-1-4, there is a disadvantage that it is difficult to form micro-unit particles because the reaction between liposome and hyaluronic acid is not performed unless DSPE-mPEG-2000amine is used. That is, since the hyaluronic acid and the liposome were separated after the injection and moved in the body, the purpose of the sustained release at the application site could not be achieved.

실시예 3-1-5의 경우 실시예 3-1-1의 경우와 마찬가지로 불안정하였다. 즉, 리포솜 성분으로 콜레스테롤이 없으면 리포솜이 불안정하여 약물이 방출 속도가 빨라서 서방화의 효과를 기대하기 어려웠다.In the case of Example 3-1-5, it was unstable as in the case of Example 3-1-1. In other words, if cholesterol is not present as a liposome component, the liposome becomes unstable and the release rate of the drug is high, so it is difficult to expect the effect of the sustained release.

실시예 3-1-2의 경우는 적절한 약물 방출 속도를 나타내었으며, 리포솜의 형성이 잘되었고, 입자크기나 표면전하도 안정화되었다.In the case of Example 3-1-2, the appropriate drug release rate was shown, and the liposome was well formed and the particle size and surface charge were stabilized.

실시예 3-2-1의 경우는 약물의 농도와 방출 속도가 적절하였고, 입자 크기가 주사하기에 적절한 50마이크로 이하를 유지하여 사용하는데 적절하였다.In the case of Example 3-2-1, the concentration and the release rate of the drug were appropriate, and the particle size was suitable to be maintained at 50 microns or less suitable for injection.

반면에, 실시예 3-2-2의 경우는 히야론산과의 결합을 할 수 있는 아민기가 있는 지질인 DPPE가 없어 입자 형성이 안되어 방출 속도를 측정할 수 없었다.On the other hand, in the case of Example 3-2-2, since DPPE, which is a lipid having an amine group capable of bonding with hyaluronic acid, was not formed, the release rate could not be measured.

실시예 3-2-3의 경우는 트리글리세라이드가 없어 리포솜이 매우 단단히 안정화되어 약물의 방출이 너무 느려 서방출로 사용하기에 문제가 있었다.In the case of Example 3-2-3, since there was no triglyceride, the liposome was stabilized very firmly, and the release of the drug was too slow, and there was a problem in using it for release.

실시예 3-2-4의 경우와 실시예 3-2-5의 경우는 제조과정에서 침전이 발생하여 리포솜-히야론산 필러를 제조할 수 없었다.In the case of Examples 3-2-4 and 3-2-5, precipitation occurred in the manufacturing process and the liposome-hyaluronic acid filler could not be produced.

도 2에 리포솜의 형태 변화를 측정하기 위한 실험 결과인 실시예 1-2 및 실시예 2-1의 Cryo-TEM 사진을 나타내었다. 도 2에 나타나는 바와 같이 실시예 1-2는 unilamellar liposome임을 확인할 수 있었으며, 실시예 2-1의 경우 multivesicular liposome임을 확인할 수 있었다.FIG. 2 shows Cryo-TEM photographs of Examples 1-2 and 2-1 as experimental results for measuring the morphological change of the liposome. As shown in FIG. 2, Example 1-2 was confirmed to be unilamellar liposome, and Example 2-1 was confirmed to be multivesicular liposome.

도 3에 리포솜-히야론산 필러의 형태 변화를 측정하기 위한 실험 결과인, 실시예 3-2-1의 광학현미경 관찰 사진을 나타내었다. Fig. 3 shows an optical microscope photograph of Example 3-2-1, which is an experimental result for measuring the morphological change of the liposome-hyaluronic acid filler.

도 4에 실시예 1-2 및 실시예 2-1 각각과 히야론산 결합 후 제조되는 실시예 3-1-2 및 실시예 3-2-1의 리포솜-히야론산 복합체를 이용한 EGF 방출 정도를 평가한 결과를 나타내었다. 도 4에 나타나는 바와 같이, 본 발명에 따른 리포솜들을 히야론산과 반응시킴으로써 EGF 방출 속도를 조절할 수 있었다.Fig. 4 shows the results of evaluating the degree of EGF release using the liposome-hyaluronic acid complexes of Examples 1-2 and 2-1 and Example 3-1-2 and Example 3-2-1 prepared after binding of hyaluronic acid, respectively Respectively. As shown in FIG. 4, the release rate of EGF could be controlled by reacting liposomes according to the present invention with hyaluronic acid.

Claims (10)

상피세포성장인자(EGF)를 함유하고 있는 리포솜이며, 이러한 리포솜은 아민기를 함유한 지질로 탄소수 12 내지 20인 포화 지질 및 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질 중에서 선택된 2개의 지질이 포스파티딜에탄올아민의 글리세롤 1 및 2번 위치에 연결된 아미노 폴리에틸렌글리콜(PEG)-포스파티딜에탄올아민을 포함하고 있고, 리포솜들이 히야론산과 연결되어 있는 리포솜-히야론산 복합체를 유효 성분으로 함유하고 있으며,
상기 리포솜-하야론산 복합체는 직경이 10-50 μm이고,
피하 또는 피하 주사 부위에서 상기 상피세포성장인자를 지연 방출(sustained release)하는 것을 특징으로 하는 피하 또는 피내 주사용 조성물.Wherein the liposome is lipid containing an amine group, wherein two lipids selected from saturated lipids having 12 to 20 carbon atoms and unsaturated lipids having 16 to 20 carbon atoms are glycerol 1 of phosphatidylethanolamine And an aminopolyethylene glycol (PEG) -phosphatidylethanolamine connected to the 2-position, wherein the liposome contains a liposome-hyaluronic acid complex in which the liposomes are linked to hyaluronic acid as an active ingredient,
The liposome-heparonic acid complex has a diameter of 10-50 μm,
Subcutaneously or subcutaneously injecting said epithelial growth factor into said subcutaneous or subcutaneous injection site. 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 아민기를 함유한 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG(2000) 아민)인 것을 특징으로 하는 피하 또는 피내 주사용 조성물.2. The method of claim 1, wherein the lipid containing the amine group is selected from the group consisting of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) 2000) amine). ≪ / RTI > 제1항에 있어서, 상기 리포솜은 단일층(unilamellar) 리포솜이며, 리포솜은 디스테아로일포스파티딜콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](DSPE-mPEG-2000)), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG(2000) 아민) 및 콜레스테롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 피하 또는 피내 주사용 조성물.The method of claim 1, wherein the liposome is a unilamellar liposome and the liposome is selected from the group consisting of distearoylphosphatidylcholine, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- [methoxy Polyethylene glycol) 2000 (DSPE-mPEG-2000), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) -2000] (2000) amine) and cholesterol. ≪ / RTI > 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 히야론산의 중량평균 분자량은 100,000 내지 1,000,000인 것을 특징으로 하는 피하 또는 피내 주사용 조성물. The subcutaneous or intradermic composition according to claim 1, wherein the weight average molecular weight of the hyaluronic acid is 100,000 to 1,000,000. (a) 아민기를 함유한 지질로 탄소수 12 내지 20인 포화 지질 및 탄소수 16 내지 20인 불포화 지질 중에서 선택된 2개의 지질이 포스파티딜에탄올아민의 글리세롤 1 및 2번 위치에 연결된 아미노 폴리에틸렌글리콜(PEG)-포스파티딜에탄올아민을 이용하여 상피세포성장인자(EGF)를 함유하는 리포솜을 제조하는 단계, 및
(b) 상기 (a)단계에서 제조된 리포솜과 히야론산 고분자의 반응을 통해 리포솜-히야론산 복합체를 형성하는 단계를 추가적으로 포함하며,
상기 리포솜-하야론산 복합체는 직경이 10-50 μm인 것을 특징으로 하는
피하 또는 피내 주사에 적합한, 상피세포성장인자 함유 리포솜-히야론산 복합체의 제조 방법.(a) a lipid containing an amine group, wherein two lipids selected from saturated lipids having 12 to 20 carbon atoms and unsaturated lipids having 16 to 20 carbon atoms are combined with glycerol 1 of phosphatidylethanolamine and aminopolyethylene glycol (PEG) -phosphatidyl Preparing a liposome containing epithelial growth factor (EGF) using ethanolamine, and
(b) forming a liposome-hylaonic acid complex by reacting the liposome prepared in the step (a) with the hyaluronic acid polymer,
The liposome-heparonic acid complex has a diameter of 10-50 [mu] m
A method for producing an epithelial cell growth factor-containing liposome-hyaluronic acid complex suitable for subcutaneous or intradermal injection. 삭제delete 제8항에 있어서, 상기 리포솜은 디스테아로일포스파티딜콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000](DSPE-mPEG-2000)), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG(2000) 아민) 및 콜레스테롤을 포함하는 단일층(unilamellar) 리포솜인 것을 특징으로 하는 상피세포성장인자 함유 리포솜-히야론산 복합체의 제조 방법.9. The liposome according to claim 8, wherein the liposome is selected from the group consisting of distearoylphosphatidylcholine, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine - [methoxy (polyethylene glycol) 2000] (Polyethylene glycol) -2000] (DSPE-PEG (2000) amine) and cholesterol, as well as cholesterol. Wherein the liposome is an unilamellar liposome. ≪ RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI >
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KR102324076B1 (en) 2021-05-25 2021-11-08 김현아 Composition for improving skin wrinkles and elasticity through induction of elastin and collagen

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