KR101760707B1 - A kit for examining organtransplant rejection using xenogenic albumin - Google Patents
A kit for examining organtransplant rejection using xenogenic albumin Download PDFInfo
- Publication number
- KR101760707B1 KR101760707B1 KR1020160001253A KR20160001253A KR101760707B1 KR 101760707 B1 KR101760707 B1 KR 101760707B1 KR 1020160001253 A KR1020160001253 A KR 1020160001253A KR 20160001253 A KR20160001253 A KR 20160001253A KR 101760707 B1 KR101760707 B1 KR 101760707B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- albumin
- heterologous
- antibody
- kit
- gal
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/76—Assays involving albumins other than in routine use for blocking surfaces or for anchoring haptens during immunisation
- G01N2333/765—Serum albumin, e.g. HSA
Abstract
본 발명은 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 효과적으로 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트, 구체적으로 기존 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응의 원인으로 알려진 당단백질인 gal-α-1,3-gal에 대한 항체에 의한 항원항체반응이 아닌 이종 단백질인 이종 알부민에 대한 항체에 의한 항원항체반응을 측정하여, 보다 효과적으로 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 예측할 수 있는 검사용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a kit for testing organ rejection using heterologous albumin, which effectively measures transplant rejection according to organ transplantation of a heterologous organs, and more particularly, In addition to the antigen-antibody reaction to gal-α-1,3-gal, which is a protein, the antigen-antibody reaction by heterologous albumin was measured. To a test kit.
Description
본 발명은 장기 이식 거부반응 검사용 키트, 구체적으로 이종장기의 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반응을 이종장기의 수여자의 이종 알부민에 대한 항원항체반응 즉, 돼지 알부민에 대한 항원항체반응을 측정함으로써 이종장기의 장기 이식 거부반응 여부를 측정할 수 있는 검사용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a kit for examining rejection of organ transplantation, and more particularly to a kit for rejecting transplantation rejection by heterologous transplantation of a heterologous organs, comprising an antigen-antibody reaction to heterologous albumin of a recipient of heterologous organs, The present invention relates to an assay kit capable of measuring the rejection of organs transplanted with different organs.
다양한 질환에 있어서, 장기이식은 임상적으로 효과적인 치료법으로 받아들여지고 있으나, 장기의 제한적 공급은 임상적 치료에 있어서, 가장 심각한 제한요소로 작용되고 있다. 이러한 측면에서, 이종장기는 차후 부족한 공여장기를 대체할 새로운 신기술로 받아들여지고 있으며, 특히 돼지의 장기는 손쉽게 활용가능하고 개념적으로 거의 제한이 없는 대체제로 받아들여지고 있다. 이 중 돼지의 췌도를 이용한 이종췌도이식은 가장 임상적용이 근접한 연구분야로 확인되고 있다. 그러나, 이종장기를 이용한 장기이식의 임상활용에 있어서, 아직 많은 장벽이 존재하고 있으며, 특히 면역학적 장벽이 존재하고 있다.In various diseases, organ transplantation has been accepted as a clinically effective treatment, but a limited supply of organs has been the most serious limiting factor in clinical treatment. In this respect, heterologous organs are being accepted as new new technologies to replace donor organs that are lacking in the future. In particular, organs of pigs are accepted as substitutes that are readily available and conceptually almost unlimited. Among these, islet pancreas transplantation using pancreatic islets has been confirmed to be the most closely related field of clinical application. However, there are still many barriers in the clinical application of organ transplantation using heterologous organs, especially immunological barriers.
이와 관련하여, 기존에는 1,3-알파갈락토오스 전달효소(α-1,3-galactosyltransferase, α-1,3-gal)에 의해 만들어지는 당단백질인 gal-α-1,3-gal(Gal α-1,3 Gal, α-Gal)에 대한 항체 즉, 항-알파갈 항체(Anti-Gal)는 이종장기 이식 후 인간이 아닌 영장류 실험동물에서의 초급성 거부반응(hyperacute rejection)의 원인이 되는 것으로 보고되고 있다. 그리고, 이는 α-1,3-galactosyltransferase의 합성효소를 유전적으로 결여시킨 돼지의 장기를 이용함으로써 극복할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 상기 항-알파갈 항체(Anti-Gal)는 인간의 다양한 항체 즉, IgM, IgG 및 IgA isotype에서 확인되었다.In this connection, gal-α-1,3-gal (Gal α-1,3-gal), which is a glycoprotein originally produced by 1,3-alpha galactosyltransferase (Anti-Gal), which is the cause of hyperacute rejection in non-human primate experimental animals after heterologous transplantation, . It has been reported that this can be overcome by using a porcine organs lacking genetically engineered α-1,3-galactosyltransferase. The anti-Gal antibody was identified in various human antibodies, IgM, IgG and IgA isotypes.
상기 α-Gal은 영장류 이하의 하등동물에서 확인되는 단백질로, 하등동물의 장기 즉, 이종장기를 이식하는 경우, 영장류에서 거부반응을 일으키는 원인이므로, 상기 α-Gal에 대한 거부반응을 측정하는 것은 장기훼손 여부의 확인 및 상기 α-Gal에 의해 유도되는 다른 면역반응을 모니터링함에 있어서 중요한 판단 근거가 될 수 있는 것으로 보고되고 있다. 그러므로, 상기 α-Gal에 대한 거부반응을 정확하게 측정하는 것은, 이종장기 이식에 있어서 고위험성 환자군에 대한 판단 여부 및 면역억제제 사용과 관련된 기본적인 자료를 제공함에 있어서 매우 중요한 것으로 보고되고 있다.The above-mentioned α-Gal is a protein identified in lower animals of primates or below. When transplanting a long-term animal or a heterologous organ of a lower animal, it causes a rejection reaction in the primate. Therefore, the measurement of the α- It has been reported that it can be an important basis for judging long-term damage or monitoring other immune responses induced by? -Gal. Therefore, accurate measurement of the rejection response to? -Gal has been reported to be very important in providing basic data related to the judgment of the high-risk patient group and the use of immunosuppressive drugs in heterologous organ transplantation.
본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 효과적으로 확인할 수 있는 검사방법 및 검사용 키트에 관한 것이다.It is an object of the present invention to solve the problems of the prior art as described above, and an object of the present invention is to provide an examination method and an examination kit which can effectively confirm a transplant rejection reaction by organ transplantation of a dissimilar organs.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반응을 항-이종알부민 항체반응을 측정하여 확인하는 검사용 키트에 관한 것으로, 상기 검사용 키트는 돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 항원으로 포함하는 것인 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention relates to an assay kit for assaying an anti-heterologous albumin antibody reaction by a transplant rejection reaction by a heterologous antibody according to organ transplantation of a dissimilar organs, The present invention provides a kit for testing organ rejection using heterologous albumin, which measures transplant rejection according to organ transplantation of a heterologous organs, which comprises as an antigen at least one heterologous albumin selected from the group consisting of albumin and bovine albumin.
상기 이종 알부민은 바람직하게는 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민, 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민일 수 있다.The heterologous albumin is preferably pig-derived albumin or bovine-derived albumin, more preferably pig-derived albumin.
상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트에 상기 이종 알부민을 포함하는 항원액 또는 상기 이종 알부민을 포함하는 기판 또는 멤브레인에 코팅된 형태로 제공될 수 있다.The heterologous albumin may be provided in a form coated on a substrate or membrane containing the anti-parental or the heterologous albumin in the kit for testing organ rejection using the heterologous albumin.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 포함한 항원을 포함하고; 상기 이종 알부민에 대한 항원항체반응을 측정할 수 있는; 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention also includes an antigen comprising at least one heterologous albumin selected from the group consisting of pig-derived albumin and bovine albumin; An antibody to the heterologous albumin can be measured; Provided is a kit for testing organ rejection using heterologous albumin, which measures transplant rejection according to organ transplantation.
상기 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트는 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent assay, ELISA)을 수행하기 위한 검사용 키트인 것을 특징으로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트일 수 있다.The kit for testing organ rejection using heterologous albumin is an assay kit for performing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The kit for measuring transplant rejection according to organ transplantation And may be a kit for testing organ rejection using heterologous albumin.
본 발명의 검사용 키트의 경우, 통상적으로 이종장기의 항체이식에 의해 발생되는 면역반응과 관련하여, 초급성 거부반응의 원인이 되는 하등동물에서 발현되는 탄수화물 유래 항원인 이종항원 즉, α-Gal을 측정한 기존 검사용 키트와 달리, 이종단백 유래 항원 즉, 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민을 이용하여 항원항체반응을 통해 이종장기의 수혜자 내에서 장기 이식 후 발생할 수 있는 항체반응을 측정함으로써, 보다 정확하게 이종 장기 이식에 따른 거부반응을 효과적으로 예측할 수 있다.In the case of the test kit of the present invention, in connection with the immune response normally caused by antibody transplantation of heterologous organs, a heterogeneous antigen, i.e., α-Gal, which is a carbohydrate-derived antigen expressed in lower animals, , An antibody reaction derived from a heterologous protein, that is, an albumin derived from pigs or a bovine-derived albumin, can be used to measure the antibody reaction that can occur after organ transplantation in a recipient of a heterologous organ through an antigen-antibody reaction It is possible to accurately predict rejection due to precise xenotransplantation.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 췌도 이식 후의 인간외 영장류 동물에서 이종장기이식에 의해 유발되는 Anti-Gal IgG 및 Anti-non-Gal IgG의 항체 생성 여부를 확인을 그래프로, 도 1a 는 Anti-Gal IgG는 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 1b 는 Anti-non-Gal IgG는 1,3 - 알파갈락토오스 전달효소 유전자를 제거한 돼지(1,3 - α - galactosyltransferase gene knockout(GTKO))의 돼지 내피세포(porcine endothelial cell, PEC69)를 이용하여, flow cytometry로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 췌도 이식 후의 인간외 영장류 동물에서 이종장기이식에 의해 유발되는 구체적인 IgG 항체의 종류를 확인하기 위한 것으로, 도 2a는 2-DE gel을 이용하여 웨스턴블롯팅(Western blot)을 수행한 결과를 나타낸 사진이고, 도 2b는 인간외 영장류 동물에서 이종장기 이식 전후에 의해 유발되는 사람 알부민(HA), 돼지 알부민(PA), 소 알부민(BA) 및, HA 접합 α-Gal에 대한 항체 반응성을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2a에서 항원항체 반응이 나타난 항원을 화살표로 표시하였으며, 1은 BA(bovine serum albumin, gi 1351907)을 의미하고, 2는 PA(albumin, partial(Sus scrofa), gi 164318)을 의미하며, 3은 calreticulin precursor(Sus scrofa, gi 291622246)을 의미하고, 4는 poly 4-hydroxylase beta polypeptide(Sus scrofa, gi 358009193)을 의미하며, 5는 cytoskeletal beta actin(partial(Sus scrofa), gi 45269029)을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 췌도 이식 후의 인간외 영장류 동물에서 이종장기이식에 의해 유발되는 돼지 알부민에 대한 항체 유발을 확인하기 위하여, 이식 전후의 인간외 영장류 혈장에서 사람 알부민(HA), 돼지 알부민(PA), 소 알부민(BA) 및, HA 접합 α-Gal에 대한 항체 반응성을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프로, 첫 번째 줄과 두 번째 줄은 그룹 1에 대한 이종장기이식 전후의 각 항체에 대한 ELISA 결과를 나타낸 것이고, 세 번째 줄은 그룹 2에 대한 이종장기이식 전후의 각 항체에 대한 ELISA 결과를 나타낸 것이다. 각각의 그래프에서 흰색 막대 그래프는 장기이식 전을 의미하고, 검은색 막대 그래프는 장기이식 후를 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 췌도 이식 후의 영장류 동물에서 이종장기이식에 의해 돼지 알부민에 대한 항체 유발을 확인하기 위하여, 그룹 2에 대한 이종장기이식 전후의 인간외 영장류 혈장에서 사람 알부민(HA), 돼지 알부민(PA), 소 알부민(BA) 및, HA 접합 α-Gal에 대한 항체 반응성을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이종장기 이식에 의한 사람 알부민(HA), 돼지 알부민(PA), 소 알부민(BA) 및 HA 접합 α-Gal에 대한 IgG 항체반응을 이종장기 이식 후 180일 동안 확인한 각 항체에 대한 ELISA 결과로, 각각의 그래프에서 점선은 이종장기 이식이 실패한 시점을 의미하고, →anti-Gal은 anti-Gal 항체가 이종장기 이식 후 증가하지 않은 것을 의미하며, ↑anti-Gal은 anti-Gal 항체가 이종장기 이식 후 증가한 것을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 2차 이종장기 이식에 의한 사람 알부민(HA), 돼지 알부민(PA), 소 알부민(BA) 및 HA 접합 α-Gal에 대한 IgG 항체반응 정도를 확인한 그래프로, 도 6a는 실험동물(NHP) M4에 대한 결과이고, 도 6b는 실험동물(NHP) M5에 대한 결과이다.1 is a graph showing the generation of antibodies of anti-Gal IgG and anti-non-Gal IgG induced by heterologous transplantation in non-human primate animals after pig transplantation according to an embodiment of the present invention. Anti-Gal-IgG is a graph showing the results obtained by ELISA. Fig. 1B shows anti-non-Gal IgG in the presence of 1,3-alpha-galactosyltransferase gene knockout (GTKO )) Porcine endothelial cell (PEC69), using flow cytometry
FIG. 2 is a graph showing the type of a specific IgG antibody induced by heterologous transplantation in non-human primate animals after transplantation of a porcine pancreatic islet according to an embodiment of the present invention. FIG. (HA), porcine albumin (PA), small albumin (BA), and hyaluronan (HA), which are induced by heterologous transplantation in non-human primate animals, are shown in FIG. 2 FIG. 5 is a graph showing the results of measurement of antibody reactivity against conjugated? -Gal with ELISA. FIG. In FIG. 2A, the antigen exhibiting the antigen-antibody reaction is indicated by an arrow, 1 means BA (bovine serum albumin, gi 1351907), 2 means PA (albumin, partial (Sus scrofa), gi 164318) (Sus scrofa, gi 291622246), 4 means poly 4-hydroxylase beta polypeptide (Sus scrofa, gi 358009193), and 5 means cytoskeletal beta actin (partial scent, Sus scrofa, gi 45269029) do.
FIG. 3 is a graph showing the effect of human albumin (HA) on non-human primate plasma before and after transplantation in order to confirm the induction of antibody against porcine albumin induced by heterologous transplantation in an extrinsic human primate animal after an islet transplantation according to an embodiment of the present invention. (PA), small albumin (BA), and HA-conjugated α-Gal. The first row and the second row show the results of immunohistochemistry , And the third row shows the results of ELISA for each antibody before and after heterozygous transplantation to
FIG. 4 is a graph showing the results of immunohistochemical staining for human albumin (FIG. 4) in non-human primate plasma before and after heterologous transplantation for
FIG. 5 is a graph showing an IgG antibody response to human albumin (HA), porcine albumin (PA), small albumin (BA) and HA conjugated? -Gal by heterologous transplantation according to an embodiment of the present invention. As a result of ELISA for each antibody identified for one day, the dotted line in each graph indicates the time point when the xenotransplantation failed, and the anti-Gal means that the anti-Gal antibody did not increase after the heterologous transplant, -Gal means that the anti-Gal antibody is increased after heterologous transplantation.
FIG. 6 is a graph showing the degree of IgG antibody response to human albumin (HA), porcine albumin (PA), small albumin (BA), and HA-conjugated? -Gal according to the second embodiment of the present invention , Figure 6a is the result for the experimental animal (NHP) M4, and Figure 6b is the result for the experimental animal (NHP) M5.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 이식 거부반응을 효과적으로 확인할 수 있는 검사용 키트 및 검사방법을 제공한다. 상기 검사용 키트 및 검사방법은 이종 항원 즉, 이종 알부민을 이용한 검사용 키트 및 검사방법일 수 있다.In order to accomplish the above object, the present invention provides an inspection kit and an inspection method which can effectively confirm a transplant rejection reaction in organ transplantation. The test kit and the test method may be a test kit using a heterologous antigen, that is, a test kit using heterologous albumin.
상기 검사용 키트는 이종 알부민, 구체적으로 돼지 알부민 또는 소 알부민을 항원으로 이용한 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반응을 효과적으로 확인할 수 있는 검사용 키트일 수 있다.The test kit may be an assay kit for effectively confirming the transplant rejection reaction by heterologous antibody due to organ transplantation using heterologous albumin, specifically, pig albumin or small albumin as an antigen.
구체적으로, 본 발명은 돼지 유래 알부민(Porcine albumin, PA) 및 소 유래 알부민(Bovine albumin, BA)으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민, 바람직하게는 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민, 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민을 항원으로 이용한 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반응을 효과적으로 확인할 수 있는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트일 수 있다. 상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트에 액상 형태의 항원액으로 제공되거나, 기판 또는 멤브레인(membrane)에 코팅된 형태로 제공될 수 있다.More specifically, the present invention relates to a method for producing a recombinant vector comprising at least one heterologous albumin selected from the group consisting of porcine albumin (PA) and bovine albumin (BA), preferably pig-derived albumin or bovine albumin, Can be a kit for examining rejection of organ transplantation using heterologous albumin, which can effectively confirm rejection of transplantation by a heterologous antibody due to organ transplantation using pig-derived albumin as an antigen. The heterologous albumin may be provided as a solution in liquid form in a kit for testing organ rejection using the heterologous albumin, or in a form coated on a substrate or a membrane.
또한, 본 발명은 돼지 유래 알부민(Porcine albumin, PA) 및 소 유래 알부민(Bovine albumin, BA)으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 항원으로 포함하고, 상기 이종 알부민에 대한 항체의 함량을 측정하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 효과적으로 확인할 수 있는 장기 이식 거부반응 검사용 키트에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for measuring the content of an antibody against heterologous albumin, the method comprising: (a) detecting one or more heterologous albumin selected from the group consisting of porcine albumin (PA) and bovine albumin (BA) The present invention relates to a kit for organ transplant rejection test which can effectively confirm a transplant rejection reaction by organ transplantation of a dissimilar organs.
본 발명의 발명자들은 이종항체의 장기이식, 구체적으로 돼지 유래 장기인 돼지 췌도를 영장류, 구체적으로 인간과 가장 유사한 영장류 실험모델 중 하나인 붉은털 원숭이에 장기이식한 경우, 발생되는 거부반응과 관련하여 항원항체 반응에 대해 연구하던 중, 해당 거부반응과 관련된 면역반응은 초급성 거부반응의 원인이 되는 α-Gal에 대한 Anti-Gal의 항체반응뿐만 아니라, 돼지 알부민에 대한 항체(Anti-PA)에 의한 항체반응 및 소 알부민에 대한 항체(Anti-BA)에 의한 항체반응이 동반될 수 있으며, 다양한 실험 조건에서도 이러한 항원항체반응 중, 탄수화물 항원(carbohydrate antigen)인 α-Gal에 대한 Anti-Gal의 항체반응과 단백 으로 구성된 anti-돼지 알부민 항체반응은 구분될 수 있음이 확인되었으며, 이러한 결과로부터 기존 α-Gal에 대한 항체반응의 측정만으로는 이종장기의 이식에 따른 면역반응을 효과적으로 예상할 수 없으며, 이와 별도로 이종 단백질에 대한 항체반응도 측정하는 것이 필요함을 확인하였으며, 이에 따라 대표적인 장기 공여체인 돼지와 관련하여, 돼지알부민 또는 소알부민에 대한 항체반응을 측정함으로써, 보다 정확한 이종장기 이식에 따른 면역반응을 예상할 수 있을 것으로 확인하여, 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have found that organ transplantation of a heterologous antibody, specifically, a porcine-derived organs-derived porcine pancreatic islet is transplanted into a primate, specifically, a rhesus monkey, While studying the antigen-antibody reaction, the immune response related to the rejection reaction is not only the anti-Gal antibody response to α-Gal, which is the cause of the hyperacute rejection, but also the anti-PA antibody against pig albumin (Anti-BA) antibody against the α-Gal, which is a carbohydrate antigen, can be accompanied by the antibody reaction by the anti-Gal antibody and the antibody reaction by the anti-BA Antibody response and anti-swine albumin antibody reaction composed of protein can be distinguished. From these results, only the measurement of antibody response to existing α-Gal It is necessary to measure the antibody response to the heterologous protein separately. Therefore, it has been confirmed that, in relation to the pig, which is a typical organ donor, the antibody against porcine albumin or small albumin The present inventors completed the present invention by confirming that the immune response due to more accurate xenotransplantation can be expected by measuring the antibody reaction.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에 있어서, 개체(subject) 또는 실험동물이란 이종 조직 또는 기관의 이식에 의한 면역반응을 수행할 수 있는 모든 동물이 포함될 수 있는 개념으로 특별히 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 토끼, 마우스 등의 척추동물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 영장류일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 인간을 제외한 영장류일 수 있다.In the present invention, a subject or an experimental animal is not particularly limited to any animal capable of carrying out an immune reaction by transplantation of a heterologous tissue or organ, and preferably is a human, a monkey, a cattle A vertebrate such as a horse, a sheep, a pig, a goat, a camel, a nutrition, a dog, a rabbit, and a mouse, more preferably a primate, and still more preferably a primate excluding a human.
본 발명에 있어서, 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent assay, ELISA)이란 효소면역측정법의 하나이다. 상기 효소면역측정법은 항원 및 항체에 대한 정량적 분석기법을 의미하며, 항원 및 항체 반응의 결과를 효소 및 기질의 반응 결과로 나타는 물질의 변색 정도를 이용하여 측정하는 방법을 의미한다. 페르옥시데이즈, 알칼리-포스포테이즈, 베타-갈락토시데이즈 등의 효소를 화학적으로 항원 또는 항체와 결합시켜, 특이적인 항원항체 반응 후에 효소염색을 시행함으로써, 그 변색정도를 측정하는 방법이다. 상기 효소면역분석법은 효소를 표식자로 이용하여 항원항체반응을 이용한 항원 또는 항체량을 측정하는 방법이다.In the present invention, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is one of enzyme immunoassay methods. The enzyme immunoassay refers to a quantitative analysis technique for an antigen and an antibody, and refers to a method of measuring the result of an antigen and an antibody reaction using the degree of discoloration of the substance as a result of the reaction of the enzyme and the substrate. An enzyme such as peroxidase, alkaline-phosphatase, or beta-galactosidase is chemically bound to an antigen or an antibody to perform enzyme-staining after a specific antigen-antibody reaction, and the degree of discoloration is measured. The enzyme immunoassay is a method of measuring an amount of an antigen or an antibody using an antigen-antibody reaction using an enzyme as a marker.
본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반응을 효과적으로 확인할 수 있는 검사용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to an examination kit which can effectively confirm a transplant rejection reaction by a heterologous antibody due to organ transplantation of a dissimilar organs.
구체적으로, 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반응을 항-이종알부민 항체반응을 측정하여 확인하는 검사용 키트에 관한 것으로, 상기 검사용 키트는 돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민, 바람직하게는 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민, 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민을 항원으로 포함하는 것인 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트에 관한 것이다.In particular, the present invention relates to an assay kit for assaying an anti-heterologous albumin antibody response by a transplant rejection reaction by a heterologous antibody according to organ transplantation of a dissimilar organs, wherein the assay kit comprises a swine- Albumin, preferably a pig-derived albumin or a bovine-derived albumin, more preferably a pig-derived albumin as an antigen. The transplantation rejection response is measured by organ transplantation of a heterologous organs The present invention relates to a kit for testing rejection of organ transplantation using heterologous albumin.
상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트에 상기 이종 알부민을 포함하는 항원액 또는 상기 이종 알부민을 포함하는 기판 또는 멤브레인에 코팅된 형태로 제공될 수 있다.The heterologous albumin may be provided in a form coated on a substrate or membrane containing the anti-parental or the heterologous albumin in the kit for testing organ rejection using the heterologous albumin.
상기 장기 이식 거부반응 검사용 키트는 항원항체결합반응을 측정하는 방법, 바람직하게는 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent assay, ELISA)을 수행하기 위한 검사용 키트일 수 있으며, 이러한 점에서 통상적으로 효소면역분석법에 사용되는 완충액(buffer), 구체적으로 반응액을 희석시키기 위해 사용되는 희석 완충액(dilution buffer) 또는 비특이성 반응을 억제하기 위한 차단 완충액(blocking buffer)과 항원액을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항원액은 항원으로 돼지 유래 알부민(Porcine albumin, PA) 및 소 유래 알부민(Bovine albumin, BA)으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민, 바람직하게는 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민, 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민을 포함한 항원액일 수 있다.The kit for assaying rejection of organ transplantation may be a kit for assaying an antigen-antibody binding reaction, preferably an assay kit for performing an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this regard, A buffer used for immunoassay, a dilution buffer used for diluting the reaction solution, or a blocking buffer for suppressing nonspecific reaction, and an anti-stock solution. In addition, the anti-stock solution may be at least one kind of heterologous albumin selected from the group consisting of porcine albumin (PA) and bovine albumin (BA), preferably pig-derived albumin or bovine albumin as an antigen Preferably, it may be an antifouling liquid containing pig-derived albumin.
또한, 본 발명은 돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 포함한 항원을 포함하고; 상기 이종 알부민에 대한 항원항체반응을 측정할 수 있는; 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트에 관한 것이다.The present invention also encompasses an antigen comprising at least one heterologous albumin selected from the group consisting of pig-derived albumin and bovine-derived albumin; An antibody to the heterologous albumin can be measured; The present invention relates to a kit for testing an organ rejection reaction using a heterologous albumin measuring transplant rejection according to organ transplantation.
상기 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트는 돼지 유래 알부민(Porcine albumin, PA) 및 소 유래 알부민(Bovine albumin, BA)으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민, 바람직하게는 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민, 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민을 항원으로 이용하여 실험동물의 혈액 등 개체로부터 분리된 샘플에 포함된 이종 알부민에 대한 항체의 함량을 측정하거나, 이종 알부민에 대한 항원항체반응을 측정하여, 실험동물 또는 개체에서 발생될 수 있는 이종 알부민 항체반응에 의한 거부반응을 확인할 수 있으며, 이로부터 기존 Anti-Gal 항체반응에 의한 거부반응의 측정만으로는 확인할 수 없었던 이종장기 이식에 의한 거부반응을 확인할 수 있다는 측면에서 이종장기 이식에 따른 거부반응을 보다 정확하게 예측할 수 있는 특징이 있다.The kit for the organ rejection reaction test using the heterologous albumin is one or more kinds of heterologous albumin selected from the group consisting of porcine albumin (PA) and bovine albumin (BA), preferably pig-derived albumin or The content of the antibody against the heterologous albumin contained in the sample separated from the blood or the like of the animal is measured using the bovine-derived albumin, more preferably the pig-derived albumin as the antigen, or the antigen antibody reaction against the heterologous albumin is measured , It is possible to confirm a rejection reaction by a heterologous albumin antibody reaction which may occur in an experimental animal or an individual. From this, it can be confirmed that rejection by a heterologous organ transplantation, which can not be confirmed only by measurement of rejection reaction by a conventional anti- More precise examples of rejection due to heterologous organ transplantation There are features you can.
상기 이종 알부민에 대한 항체반응에 대한 정량적 확인은 항원항체결합반응을 측정하는 방법, 바람직하게는 효소면역측정법, 더욱 바람직하게는 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent assay, ELISA)일 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 키트는 효소면역분석법을 수행하기 위해 요구되는 추가적인 구성수단, 구체적으로 효소면역측정법 또는 효소면역분석법의 수행과 관련하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 추가할 수 있는 구성수단, 일 예로 이종 알부민에 대한 항체, 일 예로 Anti-non-Gal IgG 등에 대한 2차 항체 등을 더 포함할 수 있다.Quantitative confirmation of the antibody reaction to the heterologous albumin may be a method of measuring the antigen-antibody binding reaction, preferably enzyme immunoassay, more preferably enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this regard, the kits of the present invention may be used in conjunction with additional constituent means required to carry out enzyme immunoassays, in particular with respect to the performance of enzyme immunoassays or enzyme immunoassays, to those skilled in the art to which the present invention pertains For example, an antibody against heterologous albumin, for example, a secondary antibody against anti-non-Gal IgG, and the like.
상기 항원항체결합반응을 측정하는 방법은 상기 효소면역분석법 외에 방사선 면역측정법(radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 면역 블롯팅 분석법 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The method for measuring the antigen-antibody binding reaction may be a radioimmunoassay (RIA), a sandwich assay, an immunoblot assay or the like in addition to the enzyme immunoassay, but is not limited thereto.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail so that those skilled in the art can easily carry out the present invention. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein.
<< 실시예Example . 돼지 췌장 이식에 의해 유발된 . Induced by pig pancreas transplantation 항원항체체반응의Antigen-antibody reaction 확인> Check>
본 발명에서 기존 이종장기 즉, 돼지 췌장의 이식에 의한 거부 반응을 진단하기 위한 시스템의 문제점을 개선하기 위해, 우선적으로 돼지 췌장 이식에 의해 유발되는 영장류 동물에서의 항체 종류를 확인하기 위하여, 비인간성 영장류(non- human primates, NHPS)로 Rh factor를 가진 의학 실험용 원숭이인 붉은털 원숭이(rhesus monkey)에 대해 돼지 췌장 이식(intraportal porcine islet transplantation(PITX)을 수행하고(Kang HJ et al., Transplantation 97 : 999 - 1008(2014)), 투여된 면역억제제의 종류에 따른 항체의 발생 여부를 확인하였다.In order to solve the problem of the system for diagnosing the rejection reaction by the transplantation of the existing heterologous organ, that is, the transplantation of the pancreas in the present invention, in order to confirm the type of the antibody in the primate animal caused by the transplantation of the pancreas first, A rhesus monkey, a medical laboratory monkey with Rh factor with non human primates (NHPS), was subjected to intraportal porcine islet transplantation (PITX) (Kang HJ et al ., Transplantation 97: 999-1008 (2014)), and the occurrence of antibodies was confirmed according to the type of immunosuppressant administered.
간략하게, 돼지의 췌장(porcine islet)은 축소된 성인 돼지(miniature adult pig, 서울대학교, 대한민국)로부터 변형된 리코르디법(Ricordi method)으로 분리하고(Kim HI, et al., Xenotransplantation 16 : 11 - 18(2009), Jin SM et al., Xenotransplantation 18 : 369 - 379(2011)), 돼지 췌장 이식(porcine islet transplantation((PITX)) 전 24시간 동안 10% 돼지 혈청(porcine serum)이 첨가된 Medium 199(Gibco BRL, Life Technologies Ltd., 영국)를 이용하여 37℃에서 부유배양법(free-floating method)으로 배양하였다.Briefly, the porcine islets of the pigs were separated by the modified Ricordi method from a miniature adult pig (Seoul National University, Korea) (Kim HI, et. al ., Xenotransplantation 16: 11-18 (2009), Jin SM et al, Xenotransplantation 18:. 369 - 379 (2011)), pig pancreas transplantation (porcine islet transplantation ((PITX) ) with 10% swine serum (porcine serum) for 24 hours before addition of Medium 199 (Gibco BRL, Life Technologies Ltd , UK) at 37 < 0 > C using the free-floating method.
상기 붉은털 원숭이 30마리에 대해 실험을 수행하였고, 상기 분리된 췌장 클러스터(islet cluster)를 실험동물 1 kg 당 100,000 islet equivalents/kg의 함량으로 면역억제제(immunosuppression, IS) 처리를 수행한 스트렙토조토신 유래 제1형 당뇨병(streptozotocin-induced type 1 diabetes)을 갖는 붉은털 원숭이(rhesus monkey)에 주입하였다.Experiments were carried out on 30 rhesus monkeys, and the separated islet clusters were treated with immunosuppression (IS) treated with 100,000 islet equivalents / kg per kg of experimental animals, (Rhesus monkey) with streptozotocin-induced
상기 붉은털 원숭이에 대한 면역억제제 처리 종류 및 함량(regimen)을 달리하여 실험을 수행하였다. 상기 면역억제제 처리 종류 및 함량에 따라, 하기 표 1과 같이 그룹을 구분하여 실험동물을 구분하였다. 하기 표 1에 기재된 면역억제제와 관련하여, ATG는 anti-thymocyte globulin(Thymoglobulin® Genzyme, Cambridge, USA)를 의미하고, anti-ICAM1는 anti-human intercellular adhesion molecule 1 antibody를 의미하며, MMF는 mycophenolate mofetil를 의미하고, anti-CD154(5C8, National Institutes of Health, Bethesda, USA)는 CD154에 대한 항체를 의미하며, anti-CD40(2C10R4, National Institutes of Health, Bethesda, USA)는 CD40에 대한 항체를 의미하고, sirolimus는 시판되는 면역억제제인 sirolimus(Rapamune® Wyeth, USA)를 의미한다.Experiments were conducted by varying the type and amount of immunosuppressant treatment for the rhesus monkeys. Depending on the type and content of the immunosuppressant treatment, the animals were divided into groups as shown in Table 1 below. In relation to the immunosuppressants described in the following Table 1, ATG means anti-thymocyte globulin (Thymoglobulin ® Genzyme, Cambridge, USA), anti-ICAM1 means anti-human
구체적으로, 그룹 1(group I)의 경우, CD40-CD154 차단제가 아닌 통상적인 면역 억제제 치료만을 투여한 5마리로 구분하였다. 반면에, 그룹 2(group II)는 CD40-CD154 차단제에 기초한 면역 억제제를 투여한 25마리로 구분하였다. 그룹 2-A는 anti-ICAM1, sirolimus 및 anti-CD154를 투여한 10마리로 구분하였고, 그룹 2-B는 ATG, sirolimus 및 anti-CD154를 투여한 7마리로 구분하였으며, 그룹 2-C는 ATG, sirolimus 및 anti-CD40를 투여한 7마리로 구분하였고, 그룹 2-C는 sirolimus 및 anti-CD154를 투여한 1마리로 구분하였다.Specifically, in group I, five were treated with only conventional immunosuppressive therapy, not the CD40-CD154 blocker. On the other hand, group 2 (group II) was divided into 25 animals receiving immunosuppressants based on CD40-CD154 blockers. Group 2-A was divided into 10 animals treated with anti-ICAM1, sirolimus and anti-CD154. Group 2-B was divided into 7 animals treated with ATG, sirolimus and anti-CD154, , sirolimus, and anti-CD40. Group 2-C was divided into two groups: sirolimus and anti-CD154.
상기 anti-CD154의 투여와 관련하여, 정맥주사를 통하여, 장기이식 4일전, 장기이식 당일, 장기이식 3일 후 및 7일후 각각 20 mg/kg 함량으로 투여하였고, 이 후, 3개월 동안 매주 1회 투여하였다. 이후, 그룹 2-A의 경우, 투여를 중단하였고, 그룹 2-B는 실험이 끝날 때가지 격주로 투여하였다. 상기 anti-CD40의 투여는 정맥주사를 통하여, 장기이식 4일전, 장기이식 당일, 장기이식 3일 후, 7일 후 및 12일후 각각 30 mg/kg 함량으로 투여하였고, 이 후, 실험이 끝날 때까지 매주 1회 투여하였다. 상기 sirolimus의 투여와 관련하여, 장기이식 9일전부터 매일 3 ㎍/ml 내지 8 ㎍/ml의 범위에서 안정적인 최저 혈중 농도가 유지되는 함량으로 구강으로 투여하였다. 상기 anti-ICAM1 의 투여는 정맥주사를 통하여, 장기이식 9일전, 6일전 및 3일전 각각 8 mg/kg 함량으로 투여하였고, 상기 ATG(anti-thymocyte globulin)의 투여는 정맥주사를 통하여, 장기이식 3일전 및 1일전 5 mg/kg 함량으로 투여하였다. 상기 tacrolimus(Prograf, Astellas Pharma Inc., 일본)의 투여는 경구투여를 통하여, 장기이식 6일전부터 2일에 한번씩 각각 0.1 mg/kg 함량으로 투여하였고, 상기 leflunomide(Arava, 사노비-아벤티스, 독일)의 투여는 경구투여를 통하여, 장기이식 6일전부터 2일에 한번씩 각각 10 mg/kg 함량으로 투여하였다. 상기 mycophenolate mofetil(MMF, Roche Pharmaceuticals, NJ)의 투여는 경구투여를 통하여, 장기이식일부터 실험이 끝날 때까지 2일에 한번씩 각각 25 mg/kg 함량으로 투여하였고, 상기 Alemtuzumab(Bayer Schering Pharma 영국)의 투여는 정맥주사를 통하여, 장기이식일에 2시간 동안 30 mg/kg 함량으로 투여하였다. 상기 Rituximab(Roche Pharmaceuticals, 스위스)는 정맥주사를 통하여, 장기이식 15일전, 8일전 및 1일전 각각 100 mg 함량으로 투여하였고, 상기 Bortezomib(Millennium Pharmaceuticals, MA)의 투여는 정맥주사를 통하여, 장기이식 후 1일, 4일, 8일 및 11일 시점에 각각 0.6 mg/m2(BSA) 함량으로 투여하였고, 상기 BSA(body surface area)는 하기 계산식에 의해 측정하였다.Regarding the administration of the anti-CD154, 20 mg / kg was administered intravenously, 4 days before the organ transplantation, 3 days after the organ transplantation, and 7 days after the organ transplantation. Lt; / RTI > Thereafter, administration of Group 2-A was discontinued, and Group 2-B was administered every other week until the end of the experiment. The anti-CD40 was administered by intravenous injection at a dose of 30 mg / kg after 4 days of organ transplantation, 3 days of organ transplantation, 3 days, 7 days and 12 days after organ transplantation, respectively. , Respectively. Regarding the administration of sirolimus, oral administration was carried out 9 days prior to organs transplantation in such a manner that a stable minimum blood concentration was maintained in the range of 3 μg / ml to 8 μg / ml daily. The anti-ICAM1 was administered by intravenous injection at a dose of 8 mg / kg before 9 days, 6 days and 3 days before organs transplantation, and the administration of anti-thymocyte globulin (ATG) 3 days before and 1 day before 5 mg / kg. Administration of tacrolimus (Prograf, Astellas Pharma Inc., Japan) was orally administered at a dose of 0.1 mg / kg once every two days from 6 days before transplantation, and the leflunomide (Arava, Were administered by oral administration at a dose of 10 mg / kg once every 6 days from organ transplantation to 2 days. The administration of the above mycophenolate mofetil (MMF, Roche Pharmaceuticals, NJ) was performed at 25 mg / kg every two days from the day of organ transplantation to the end of the experiment through oral administration. The Alemtuzumab (Bayer Schering Pharma UK) Was administered via intravenous injection at a dose of 30 mg / kg for 2 hours on an organ transplantation day. Rituximab (Roche Pharmaceuticals, Switzerland) was administered intravenously at a dose of 100 mg, respectively, 15 days, 8 days and 1 day before organs transplantation. The administration of Bortezomib (Millennium Pharmaceuticals, MA) after 1 day, 4 days, 8 days and 11 days were administered to each of 0.6 mg / m 2 (BSA) content at the time, the BSA (body surface area) was determined by the following formula.
[계산식][formula]
BSA(cm2) = body weigh0 .6046(kg) X length0 .1862(from head to anus, cm) X 514BSA (cm 2 ) = body weigh 0 .6046 (kg) X length 0 .1862 (from head to anus, cm) X 514
하기 표 1에서 Anti-Gal은 이종항원인 gal-α-1,3-gal(Gal α 1,3 Gal, α-gal)에 대한 항체를 의미하며, Anti-PA는 항-돼지알부민 항체를 의미하고, Anti-BA는 항-소알부민 항체를 의미하며, 상기 표에 기재된 수치는 실험동물 중 해당 항체가 확인된 개체수를 의미한다.In Table 1 below, Anti-Gal means an antibody to the heterologous gal-α-1,3-gal (
(recipient)Laboratory animal ID
(recipient)
(n=5)Group I
(n = 5)
(n=5)Group 2
(n = 5)
(n=10)Group 2-A
(n = 10)
M21M6, M9, M10, M11, M12, M13, M14, M15, M16,
M21
(n=7)Group 2-B
(n = 7)
(n=7)Group 2-C
(n = 7)
(n=1)Group 2-D
(n = 1)
상기 각 실험동물의 혈액 샘플을 장기이식 전, 장기이식 당일 및 장기이식 후 장기이식이 실패된 것으로 확인될 때까지 1주일에 1회씩 채취하여, EDTA 튜브(EDTA tube)에 보관한 후, 실험에 사용될 때까지 -70℃에서 보관하였다.Blood samples of each of the above-mentioned experimental animals were collected once a week until the organ transplantation was confirmed to be unsuccessful after organ transplantation, organ transplantation and organ transplantation, and stored in an EDTA tube (EDTA tube) And stored at -70 [deg.] C until used.
본 실험에서, 수혜자가 외인성 인슐린(exogenous insulin) 즉, 인슐린의 추가 투여 없이 장기이식 전과 유사한 혈당 정도의 정상 혈당(euglycemia)을 유지하지 못하는 상태일 때, 장기이식 실패(graft failure)로 판명하였다. 또한, 모든 수혜자는 장기이식 실패로 판명된 때에도 인슐린 처지(insulin therapy)를 통해 생존하였다.In this experiment, the recipient was found to have a graft failure when they did not maintain exogenous insulin, that is, euglycemia, which is similar to that of pre-transplantation, without additional administration of insulin. In addition, all beneficiaries survived insulin therapy even when proven to have failed organ transplants.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 그룹 1의 수혜자의 경우, Anti-Gal(100%) 및 Anti-PA(100%)와 관련하여 모두 개체에서 확인되었고, Anti-BA의 경우, 3개체(60%)에서 확인된 반면, 그룹 2의 수혜자의 경우, Anti-Gal과 관련하여 4개의 개체(16%)에서 항체가 확인되었을 뿐, Anti-PA와 Anti-BA에 대해서는 항체가 확인되지 아니하였다.As shown in the above Table 1, in the case of the recipient of
구체적으로, 돼지 췌장 이식 후의 영장류 동물에서 이종장기이식에 의해 유발되는 이종 단백질에 의한 항체 즉, Anti-non-Gal 즉, α-1,3-galactosyltransferase (α-1,3-gal) 유전자가 결여된 돼지 내피세포(α-1,3-galactosyltranse gene knockout(GTKO) porcine endothelial cell)에서의 이종 단백질에 대한 항체를 측정하기 위하여, Anti-Gal과 Anti-non-Gal을 상기 표 1의 M4 실험동물의 샘플을 이용하여 ELISA 및 유동세포계수법(flow cytometry)으로 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, Anti-Gal과 Anti-non-Gal 모두 이종장기이식 이후에 비인간성 영장류 수혜자인 붉은털 원숭이로부터 채취한 혈액 샘플에서 급격한 증가가 확인되었다.Specifically, it lacks an anti-non-Gal antibody, ie, α-1,3-galactosyltransferase (α-1,3-gal) gene by heterologous protein induced by heterologous transplantation in primate animals after transplantation of pancreas pancreas Anti-Gal and anti-non-Gal were measured in the M4 experimental animals of Table 1 above in order to measure antibodies against heterologous proteins in porcine endothelial cells (α-1,3-galactosyltranse gene knockout (GTKO) The results obtained by ELISA and flow cytometry using a sample of the present invention are shown in Fig. As shown in FIG. 1A and FIG. 1B, a rapid increase in blood samples collected from rhesus monkeys, which are recipients of non-human primate, after heterologous transplantation of both Anti-Gal and Anti-non-Gal was confirmed.
상기 Anti-Gal 항체(anti-Gal IgG)를 매주 확인하기 위한 ELISA는 100 μL의 Gal-HA(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-human albumin, 5 ㎍/ml, GlycoTech)를 이용해 각 well을 코팅한 후, PBS로 희석한 5% human albumin(HA, Green Cross CORP, 대한민국) 용액으로로 차단시킨 후, 1% HA가 포함된 PBS를 이용하여 1:100으로 희석시킨 수혜자 즉, 원숭이의 혈액 샘플(Recipient monkey plasma)을 주입하고, 37℃에서 30분 동안 반응시키는 방법으로 수행하였다. 항체는 anti-human IgG(Sigma-Aldrich)를 이용하였고, 음성 대조군으로는 1% HA가 포함된 PBS 용액을 이용하였다. Each well was coated with 100 μL of Gal-HA (Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-human albumin, 5 μg / ml, GlycoTech) for the weekly confirmation of the anti-Gal antibody (anti-Gal IgG) After blocking with 5% human albumin (HA, Green Cross CORP, Korea) solution diluted with PBS, the recipient diluted 1: 100 with PBS containing 1% HA, ie, blood sample of monkey plasma was injected and reacted at 37 캜 for 30 minutes. Anti-human IgG (Sigma-Aldrich) was used as the antibody and PBS solution containing 1% HA was used as the negative control.
또한, 상기 유동세포계수법은 Anti-nol-Gal 항체(Anti-non-Gal) 반응을 측정하기 위해 사용하였다. 상기 실험은 GTKO 내피세포(PEC6)의 단일세포 희석액(Single-cell suspension, 105/tube)과 1% HA와 30 mM EDTA가 포함된 PBS로 1:10 희석된 원숭이의 혈액 샘플(Recipient monkey plasma) 50 μL를 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, human IgG에 대한 특이적인 즉, IgM이나 IgA와 반응하지 않는 항체인 토끼 항체의 F(ab)2와 결합된 FITC(FITC-conjugated F(ab)2 fragments of a rabbit immunoglobulin specific for human IgG)와 반응시켜 항체와 반응한 세포를 확인하였다. 해당 세포의 측정은 FACS(FACSaliubr flow cytometer, BD Biosciences, 캐나다)를 이용하였다. 항체 결합 정도는 형광 정도(mean fluorescence intensity, MFI)로 확인하였다.In addition, the flow cell count method was used to measure anti-nol-Gal antibody (Anti-non-Gal) reaction. The experiment was carried out using a single-cell suspension (10 5 / tube) of GTKO endothelial cells (PEC6) and a blood sample of monkeys diluted 1:10 with PBS containing 1% HA and 30 mM EDTA (FITC-conjugated F (ab)) conjugated with F (ab) 2 of a rabbit antibody that is specific for human IgG, ie, does not react with IgM or IgA, 2 fragments of a rabbit immunoglobulin specific for human IgG). The cells were measured by FACS (FACSaliubr flow cytometer, BD Biosciences, Canada). The degree of antibody binding was confirmed by mean fluorescence intensity (MFI).
상기 결과로부터, 급격하게 증가가 유발된 anti-non-Gal 항체의 항원을 규명하기 위하여, 이종장기 이식 전후의 상기 표 1의 M4 실험동물의 샘플을 이용하여 웨스턴블롯팅을 수행하였다. From the above results, Western blotting was performed using a sample of the M4 laboratory animal of Table 1 before and after xenogeneic organ transplantation in order to identify antigens of anti-non-Gal antibodies that were abruptly increased.
상기 실험은 GTKO 내피세포(PEC6)로부터 DUALXtract total membrane protein extraction kit(Dualsystems biotech AG, Switzerland)을 이용하여 추출한 단백질 150 ㎍을 7 cm immobilized pH gradient(IPG) strips에서 rehydration sample buffer(Bio-Rad Laboratories, USA)을 이용하여 20℃에서 12시간 동안 재수화하였다. 이후, 2DE gel에서 분리를 수행하였다. 우선, Isoelectric focusing은 2-DE system(PROTEAN®IEF Cell, Bio-Rad Laboratories, USA)을 이용하여, 50 V에서 4시간 수직, 250 V에서 20분 수직, 2,000 V에서 40분 수평, 4,000 V에서 2시간 수평의 조건으로 수행하였다. 상기 Isoelectric focusing을 수행한, IPG strip을 평형화시킨 후, 10 % SDS-PAGE(Bio-Rad Laboratories)에서 2-DE 과정을 수행하였다.This experiment was carried out using 150 μg of protein extracted from GTKO endothelial cells (PEC6) using a DUALXtract total membrane protein extraction kit (Dualsystems biotech AG, Switzerland) in 7 cm immobilized pH gradient strips (Bio-Rad Laboratories, USA) at 20 ° C for 12 hours. Separation was then performed on 2DE gels. Isoelectric focusing was performed using a 2-DE system (PROTEAN ® IEF Cell, Bio-Rad Laboratories, USA) for 4 hours at 50 V, 20 minutes at 250 V, 40 minutes at 2,000 V, 2 hours horizontally. The IPG strip, which was subjected to the isoelectric focusing, was equilibrated and subjected to a 2-DE process on 10% SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories).
상기 2DE 과정을 수행한 후, Coomassie brilliant blue(Coomassie brilliant blue G-250(Bio-Rad Laboratories, USA))를 이용하여 염색하고, 상기 표 1의 M4 실험동물의 이종장기 이식 전후의 혈액샘플을 이용하여 1% HA와 AmershamTM ECL prime western blotting detection reagent(GE Healthcare, USA)를 이용하여, 웨스턴블롯팅을 수행한 후, 단백질을 확인하는 방법으로 수행하였다. 상기 면역염색 결과 후 단백질 확인은 트립신을 이용하여 단백질을 분리한 후, MALDI-TOF/TOF 질량분석법(mass spectrometry)으로 질량을 측정하여 방법으로 수행하였다. 상기 측정결과를 도 2a에 나타내었다.After the 2 DE procedure was performed, the cells were stained using Coomassie brilliant blue (Coomassie brilliant blue G-250 (Bio-Rad Laboratories, USA)) and blood samples were taken before and after the dissemination of M4 laboratory animals , Followed by Western blotting using 1% HA and Amersham (TM) ECL prime western blotting detection reagent (GE Healthcare, USA), followed by confirmation of the protein. As a result of immunohistochemical staining, the protein was identified using trypsin, followed by mass spectrometry using MALDI-TOF / TOF mass spectrometry. The measurement results are shown in Fig.
상기 도 2a에 나타낸 바와 같이, 상기 도 2a의 1번 단백질은 69,248, 2번 단백질은 71,348, 3번 단백질은 48,429, 4번 단백질은 56,763, 5번 단백질은 40,194로 분자량이 측정되었고, MASCOT 분석(MASCOT analysis, MASCOT 2.3.01) 결과, 각각, 1번 단백질은 BA, 2번 단백질은 PA, 3번 단백질은 calreticulin 전구체, 4번 단백질은 porcine poly 4-hydroxylase beta polypeptide, 5번 단백질은 porcine cytoskeletal beta actin으로 확인되었다.As shown in FIG. 2A, the molecular weight of the first protein of FIG. 2A was 69,248, the second protein 71,348, the third protein 48,429, the fourth protein 56,763 and the fifth protein 40,194, and MASCOT analysis MASCOT analysis, MASCOT 2.3.01) showed that the first protein was BA, the second protein was PA, the third protein was calreticulin precursor, the fourth protein was porcine poly 4-hydroxylase beta polypeptide and the fifth protein was porcine cytoskeletal beta actin.
상기 측정 결과, anti-non-Gal 항체 반응의 원인이 된 항원으로, BA, porcine poly 4-hydroxylase beta polypeptide 및 porcine cytoskeletal beta actin로 예상되었다.As a result, the antigens responsible for the anti-non-Gal antibody reaction were expected to be BA, porcine poly 4-hydroxylase beta polypeptide and porcine cytoskeletal beta actin.
상기 결과와 관련하여, 장기이식 자체에 의해 어떤 항체가 증가되는지 여부를 명확하게 하기 위하여, 이종장기이식 전후의 M4 실험동물의 혈액 샘플에 대해, 사람 알부민(HA), 돼지 알부민(PA), 소 알부민(BA) 및, HA 접합 α-Gal(HA-conjugated Gal, Gal-HA)를 각각 포함하는 항원액을 이용하여 상기와 같은 실험을 수행하였고, 항체 결합 정도를 ELISA로 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 2b에 나타내었다.In relation to the above results, in order to clarify which antibody is increased by the organ transplantation itself, blood samples of M4 laboratory animals before and after xenotransplantation were subjected to immunohistochemistry using human albumin (HA), porcine albumin (PA) The above experiment was carried out using an anti-stock solution containing albumin (BA) and HA-conjugated Gal (Gal-HA), respectively, and the degree of antibody binding was analyzed by ELISA. The results of the analysis are shown in FIG. 2B.
상기 이종장기이식에 의한 이종반응 항체(Xenoreactive antibodies)의 반응정도는 다음과 같은 방법으로 측정하였다(Choi HJ, Kim MK, Lee HJ, et al. Investigative ophthalmology & visual science 52:6643 - 6650(2011)).The degree of the reaction of Xenoreactive antibodies by the above-mentioned heterologous transplantation was measured by the following method (Choi HJ, Kim MK, Lee HJ, et. al . Investigative ophthalmology & visual science 52: 6643-6650 (2011)).
구체적으로, 각각의 well에 HA, PA, BA 및 HA 접합 α-Gal(Gal-HA, 5 ㎍/mL; GlycoTech, USA) 포함 항원액 100 μL를 각각 첨가하여 도포하고, 하루 저녁 동안 보관한 후, 항원액을 버리고, PBS로 희석한 5% HA 차단 완충액을 100 μL씩 첨가한 다음, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, 반응액을 버리고, 0.05% Tween 20이 첨가된 세척 완충액으로 5회 세척한 후, 1% HA를 첨가한 PBS로 희석시킨 실험동물의 혈액 샘플 100 μL을 각 웰에 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, peroxidase-conjugated anti-human IgG(Sigma-Aldrich, USA)를 이용하여 항원항체 반응 후, 발색반응을 진행하고, 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도에 대한 수치와 1% HA를 첨가한 PBS 샘플(음성대조군) 흡광도를 뺀 결과를 도 2b에 나타내었다.Specifically, 100 μL of the stock solution containing HA, PA, BA and HA conjugated α-Gal (Gal-HA, 5 μg / mL; GlycoTech, USA) was added to each well, , Discarded the stock solution, added 100 μL of 5% HA blocking buffer diluted with PBS, and reacted at 37 ° C for 30 minutes. Thereafter, the reaction solution was discarded and washed five times with wash buffer containing 0.05% Tween 20. Then, 100 μL of a blood sample of an experimental animal diluted with 1% HA-added PBS was added to each well, Lt; / RTI > for 30 minutes. After the antigen-antibody reaction using peroxidase-conjugated anti-human IgG (Sigma-Aldrich, USA), the color reaction was performed and the absorbance was measured. The result of subtracting the measured absorbance value and the absorbance of PBS sample (negative control group) containing 1% HA was shown in FIG. 2B.
상기 도 2b에 나타낸 바와 같이, 이종장기이식 후에는 HA에서 항체반응이 거의 증가되지 않는 것에 비하여, BA, PA 및 Gal-HA의 경우에는 현저하게 반응성이 증가되는 것이 확인되었다.As shown in FIG. 2B, it was confirmed that the reactivity of BA, PA and Gal-HA was significantly increased in comparison with the case where the antibody reaction was not substantially increased in HA after heterologous transplantation.
상기 이종항원 항체반응이 면역억제제에 따라 어떻게 영향을 받는지 확인하기 위하여, 일반적인 면역억제제와 CD40와 CD154에 의한 항원항체반응의 차단제(CD40-CD154 blockade)를 사용하였을 경우 이종항원항체반응의 억제에 대해 실험을 수행하였다. 상기 실험은 상기 표 1의 실험동물 중에서 그룹 1 및 그룹 2-A에 대해 수행하였다. 상기 실험결과를 상기 표 1 및 도 3에 나타내었다.To investigate how the heterologous antigenic antibody response is affected by immunosuppressive agents, the use of a general immunosuppressive agent and a CD40-CD154 blockade of antigen-antibody reaction by CD40 and CD154, Experiments were performed. The experiments were performed on
상기 표 1 및 도 3에 나타낸 바와 같이, CD40-CD154 blockade를 위한 면역억제제가 투여되지 않은 그룹 1의 실험동물에서, anti-PA IgG에 대한 항체반응이 100% 유도된 반면, 상기 표 1 및 도 3과 도 4에 나타낸 바와 같이, 그룹 2의 실험동물에서는 anti-PA IgG에 대한 항체반응이 확인되지 않았다. 또한, anti-BA IgG의 경우, CD40-CD154 blockade를 위한 면역억제제가 투여되지 않은 그룹 1의 실험동물의 60%에서 항체반응이 유도된 반면, 그룹 2의 경우, 항체반응이 확인되지 않았다.As shown in Table 1 and FIG. 3, in the
한편, anti-Gal IgG의 경우, 그룹 1의 실험동물에서는 모두 확인이 되었고, 장기이식 후 1달이 경과된 시점에서 그룹 2의 실험동물에서도 25마리중 4마리 즉, 16%에서 확인되었다. 또한, anti-Gal IgG의 정도가 그룹 2의 4개의 개체(0.29 ± 0.15)의 면역반응에 비하여 그룹 1(1.66 ± 0.49)이 현저히 높은 것으로 확인되었다(P=0.0275, t test). On the other hand, in the case of anti-Gal IgG, all of the test animals in
상기 결과로부터, CD40-CD154 blockade를 위한 면역억제제와 sirolimus는 장기이식 후, anti-PA와 anti-BA에 대한 면역반응을 완벽히 차단하는 반면, anti-Gal에 대한 면역반응은 부분적으로 차단하는 것으로 확인되었다.These results indicate that the immunosuppressant and sirolimus for the CD40-CD154 blockade completely block the immune response against anti-PA and anti-BA after organ transplantation, while partially blocking the immune response against anti-Gal .
또한, anti-Gal에 대한 면역반응과 달리 anti-PA와 anti-BA에 대한 면역반응은 항원에 대한 접촉 후 천천히 진행되는 경향이 있으므로, 6개월 동안 면역반응을 관찰하였다. 확인결과, 그룹 1의 경우, 모두 장기이식에 실패한 것으로 확인되었으나, 그룹 2의 경우, 장기이식 성공여부가 각각 상이하게 나타난 것으로 확인되었다. 특히, 그룹 2의 C 및 D의 경우, 항체반응은 효과적으로 억제되었음에도 불구하고, 장기이식은 실패한 것으로 확인되었다. 장기이식 후, 그룹 2의 A의 9 개체와 그룹 2의 B의 6개체가 인슐린의 외부 주입 없이 1개월 이상 생존하여, 장기이식에 성공한 것으로 확인되었다.In addition, unlike the immune response to anti-Gal, the immune response to anti-PA and anti-BA tended to proceed slowly after contact with the antigen, so the immune response was observed for 6 months. As a result, it was confirmed that all the organ transplantation failed in
도 5에 나타난 바와 같이 이식 후 180일까지 추적 관찰하였을 때, 상기 실험동물에 적용한 면역억제제의 처방에 따라 나타난 상이한 결과로, Anti-BA 및 Anti-PA에 대한 항체반응은 anti-CD154 및 sirolimus에 의해 효과적으로 억제되는 반면, Anti-Gal에 대한 항체반응은 제한적으로 억제되는 것으로 확인되었다. As shown in FIG. 5, the anti-BA and anti-PA antibody responses to anti-CD154 and sirolimus were significantly different from those of anti-CD154 and sirolimus , While the antibody response to Anti-Gal was restricted to a limited extent.
또한, 상기 이종항원 항체반응에 의해 장기이식이 실패된 그룹 1의 실험동물에 대해서, 6개월 후에, M4 및 M5 실험동물에 대해서, 돼지 췌도 이식 즉, 2차 장기이식을 다시 수행하였다. 2차 이종장기 이식에 앞서서, 상기 개체에 대해 그룹 2-A와 같이, anti-ICAM1, anti-CD154 및 sirolimus의 면역억제제를 투여하였다. 상기 면역억제제 투여 이전에 측정한 결과, 1차 이종장기 이식 보다 HA, BA, PA 및 Gal-HA에 대한 항원항체반응이 더 높은 것으로 확인되었다. 2차 이종장기 이식 전 및 후 실험동물로부터 혈액을 채취하여, 혈액 샘플에서의 HA, BA, PA 및 Gal-HA에 대한 항원항체반응을 수행한 결과를 도 6에 나타내었다.In addition, for
상기 도 6에 나타낸 바와 같이, Anti-Gal에 대한 항체반응은 오히려 낮아진 반면, Anti-BA 및 Anti-PA에 대한 항체반응은 급격히 높아지거나, 높은 상태를 유지하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터, Anti-Gal에 대한 항체반응과 Anti-BA 및 Anti-PA에 대한 항체반응은 상이한 경로에 의해 조절되는 것으로 예상되었으며, 상기 Anti-PA에 의한 반응과 Anti-BA에 의한 반응은 연관성이 있는 것으로 확인되었다As shown in FIG. 6, the antibody reaction against Anti-Gal was lowered, while the antibody reaction against Anti-BA and Anti-PA was rapidly increased or maintained high. From these results, it was expected that the antibody reaction to Anti-Gal and the antibody reaction to Anti-BA and anti-PA would be regulated by different pathways, and the reaction by Anti-PA and Anti-BA was related .
상기에서 확인된 결과로부터, Anti-Gal 뿐만 아니라, PA를 포함한 비영장류 동물 유래 알부민과 같은 이종단백 모두 이종장기에 의한 거부반응의 원인이 되는 것으로 확인되었으며, 이러한 결과로부터 단순히 α-Gal에 대한 면억억제뿐만 아니라, 이종 알부민 즉, 이종 단백에 대한 면억억제와 관련된 방법도 제안되어야, 효과적인 장기이식에 의한 거부반응의 억제 전략이 수립될 수 있는 것으로 확인되었다.From the above results, it was confirmed that all of the heterologous proteins, such as albumin derived from non-primate animals including PA, as well as Anti-Gal are responsible for rejection by heterologous organs. From these results, In addition to suppression, a method related to the suppression of heterologous albumin, ie, phagocytosis of heterologous proteins, has also been proposed, and it has been confirmed that an effective strategy of inhibiting rejection by organ transplantation can be established.
상기 결과로부터, 이종장기 이식에 있어서, 초급성 거부반응의 원인이 되는 이종항원인 α-gal과 관련된 거부반응뿐만 아니라, 이종 단백이 항원이 되는 면역반응도 이종장기의 이식의 성공여부를 결정하는 요인이 됨이 확인되었고, 따라서, 장기이식과 관련하여, 이종 알부민에 대한 면역반응을 확인함으로써, 이종장기를 공급받는 수여자 즉, 환자의 장기이식 가능성을 보다 정확하고 면밀하게 예측할 수 있을 것으로 확인되었다.From the above results, it can be concluded that, in the heterologous organ transplantation, not only the rejection reaction related to the heterozygous causative agent α-gal, which is the cause of the hyperacute rejection reaction but also the immune response to the heterologous protein as an antigen, Thus, by confirming the immune response to heterologous albumin in relation to organ transplantation, it has been confirmed that the possibility of organ transplantation, that is, the recipient of a heterologous organ, can be more accurately and closely predicted.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, Of the right.
Claims (7)
상기 검사용 키트는 돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 항원으로 포함하는 것인 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트.The present invention relates to an examination kit for confirming an anti-heterologous albumin antibody response by a heterologous organs transplant rejection by a heterologous antibody,
Wherein the test kit comprises one or more kinds of heterologous albumin selected from the group consisting of pig-derived albumin and bovine-derived albumin as an antigen, the transplant rejection reaction using heterologous albumin measuring transplant rejection according to organ transplantation Inspection kit.
상기 이종 알부민은 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민인 것을 특징으로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트.The method according to claim 1,
Wherein the heterologous albumin is pig-derived albumin or bovine-derived albumin, wherein the heterologous organs are transplanted and the transplant rejection reaction is measured.
상기 이종 알부민은 돼지 유래 알부민인 것을 특징으로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트.3. The method of claim 2,
Wherein the heterologous albumin is pig-derived albumin, and wherein the heterologous albumin is a pig derived albumin.
상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민을 포함하는 항원액인 것을 특징으로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트.The method according to claim 1,
Wherein the heterologous albumin is an anti-parental solution containing the heterologous albumin, wherein the heterologous albumin is a stock solution containing the heterologous albumin.
상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민을 포함하는 기판 또는 멤브레인에 코팅된 것을 특징으로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트.The method according to claim 1,
Wherein the heterologous albumin is coated on a substrate or membrane containing the heterologous albumin, wherein the heterologous albumin is coated on a substrate or a membrane.
상기 이종 알부민에 대한 항원항체반응을 측정할 수 있는;
이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트.An antigen comprising at least one heterologous albumin selected from the group consisting of pig-derived albumin and bovine-derived albumin;
An antibody to the heterologous albumin can be measured;
A kit for testing organ rejection using heterologous albumin, which measures transplant rejection following organ transplantation in a heterologous organ.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2016/001889 WO2017119542A1 (en) | 2015-01-05 | 2016-02-26 | Kit for examining organ transplant rejection by using xenogenic albumin |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150000901 | 2015-01-05 | ||
| KR20150000901 | 2015-01-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160084323A KR20160084323A (en) | 2016-07-13 |
| KR101760707B1 true KR101760707B1 (en) | 2017-07-24 |
Family
ID=56505658
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160001253A KR101760707B1 (en) | 2015-01-05 | 2016-01-05 | A kit for examining organtransplant rejection using xenogenic albumin |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101760707B1 (en) |
| WO (1) | WO2017119542A1 (en) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9318612D0 (en) | 1993-09-08 | 1993-10-27 | Sandoz Ltd | An assay |
| KR20020090087A (en) | 2001-05-25 | 2002-11-30 | 장태순 | Method for Inhibiting Injuries of Liver cells, Method for solving alcohol-hangover Method and Food Composition for Treating Hepatoma cell and Kit for Treating Hepatoma |
| CA2490009A1 (en) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Dyax Corporation | Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor |
| KR100987547B1 (en) | 2006-06-01 | 2010-10-12 | 가톨릭대학교 산학협력단 | A composition and a kit for detecting early apoptosis in frozen umbilical cord blood and a method therefor |
| AR088455A1 (en) * | 2011-10-13 | 2014-06-11 | Bristol Myers Squibb Co | ANTIBODIES THAT ANTAGONIZE CD40L |
-
2016
- 2016-01-05 KR KR1020160001253A patent/KR101760707B1/en active IP Right Grant
- 2016-02-26 WO PCT/KR2016/001889 patent/WO2017119542A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Transplantation, Vol. 91(3), pp. 287-292 (2011) |
| Xenotransplantation, Vol. 18, pp. 215-228 (2011) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160084323A (en) | 2016-07-13 |
| WO2017119542A1 (en) | 2017-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220133887A1 (en) | Anti-cd40 antibodies and uses thereof | |
| ES2947826T3 (en) | Human functional corneal endothelial cell and application thereof | |
| JP5898496B2 (en) | Antibodies against IL-6 and uses thereof | |
| JP2020169198A (en) | Therapeutic methods and compositions | |
| EP3101131A1 (en) | Anti-transthyretin humanized antibody | |
| Takada et al. | Randomized, multicenter trial comparing tacrolimus plus mycophenolate mofetil to tacrolimus plus steroids in hepatitis C virus–positive recipients of living donor liver transplantation | |
| CN108610414B (en) | IgG epitope and application thereof as target spot | |
| KR101555030B1 (en) | A kit for examining organtransplant rejection | |
| CN103687871A (en) | Means and methods for diagnosing and treating multiple sclerosis | |
| JP2022528000A (en) | How to Reduce Large Granular Lymphocytes and Natural Killer Cell Levels | |
| KR101760707B1 (en) | A kit for examining organtransplant rejection using xenogenic albumin | |
| TWI821227B (en) | Biomarkers of methotrexate-induced immune tolerance | |
| KR20210070303A (en) | Anti-human CD45RC antibodies and uses thereof | |
| NZ714716A (en) | Method for preparing deep-frozen vegetables pieces | |
| CN106963780B (en) | Application of peripheral blood mononuclear cell activation inhibitor in preparation of medicine for treating acute liver failure | |
| Motyka et al. | Antibody-mediated rejection in a blood group A-transgenic mouse model of ABO-incompatible heart transplantation | |
| US8043852B2 (en) | Monoclonal antibody specific to dentin-derived heparan sulfate | |
| EP2986639B1 (en) | Composition with reduced immunogenicity | |
| Nathanson et al. | Long-term survival after post-transplant lymphoproliferative disease in children | |
| US20240084029A1 (en) | Use of immunomodulatory antibodies to treat fibrotic diseases | |
| Mineura et al. | Fibrotic progression from acute cellular rejection is dependent on secondary lymphoid organs in a mouse model of chronic lung allograft dysfunction | |
| CN102949719A (en) | Application of intravenous immunoglobulins (IVIg) in inhibiting cholera toxin and galectin from being combined into ganglioside GM1 | |
| US20230073248A1 (en) | Compositions and methods for inducing immune tolerance in transplantation recipients | |
| US20240132618A1 (en) | Anti-cd38 antibodies for use in the treatment of antibody-mediated transplant rejection | |
| KR101825807B1 (en) | Biomarker composition of phosphatidylcholine in blood for non-invasive in vitro diagnosis of acute transplant rejection in living donor liver transplantation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |