KR101754798B1 - Composition for inducing the differentiation into m2 macrophage comprising mesoporus silica nanopaticles and cytokine contained therein - Google Patents

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Abstract

본 발명의 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 M2 대식세포로의 분화유도용 조성물은, 사이토카인을 생체 내로 전달하여 단핵구, 대식세포 등이 M2 대식세포로 분화하는 것을 유도함으로써, 과도한 면역 반응을 조절하여 효과적인 면역반응이 일어날 수 있도록 한다. The composition for inducing the differentiation into M2 macrophages containing the cytokine-bearing porous silica nanoparticles of the present invention is a composition for inducing the differentiation of monocytes, macrophages and the like into M2 macrophages by transmitting cytokine in vivo, Controlling the immune response allows an effective immune response to occur.

Description

사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 M2 대식세포로의 분화유도용 조성물{COMPOSITION FOR INDUCING THE DIFFERENTIATION INTO M2 MACROPHAGE COMPRISING MESOPORUS SILICA NANOPATICLES AND CYTOKINE CONTAINED THEREIN}Technical Field [0001] The present invention relates to a composition for inducing differentiation into M2 macrophages including cytokine-bearing porous silica nanoparticles. [0002] The present invention relates to a composition for inducing the differentiation into M2 macrophages including porous silica nanoparticles carrying cytokines,

본 발명은 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 M2 대식세포로의 분화유도용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for inducing differentiation into M2 macrophages containing cytokine-bearing porous silica nanoparticles.

선천적 면역 반응은 외부에서 침입하는 병원균으로부터 우리 몸을 가장 먼저 보호하는 1차 방어 작용으로서, 비특이적 면역이라고도 한다. 선천적 면역 반응에는 호중구, 단핵구, 대식세포 등이 관여하며, 선천적 면역 반응은 병원균의 종류나 감염 경험의 유무와 관계없이 병원균 침입, 감염 시 신속하게 반응이 일어난다.
Congenital immune response is the first defense that protects our body from pathogenic bacteria that invade from the outside. It is also called nonspecific immunity. Congenital immune responses include neutrophils, monocytes, and macrophages. Congenital immune responses occur rapidly when pathogens are infected or infected, regardless of the type of pathogens or the experience of infection.

특히, 대식세포는 생체 내 모든 조직에 분포하여 면역을 담당하는 세포로서, 침입한 병원균의 제거, 바이러스에 감염된 자가세포와 암세포의 제거, 및 염증 반응의 유도에 관여한다. 대식세포는 발생과정에서 난황낭(Yolk Sac)이나 태아 간(Fetal Liver)에서 분화한 조직세포 유래 대식세포(tissue-resident macrophage)와, 혈액 내의 단핵구(골수세포에서 분화)가 염증반응이나 병원균 침입 등에 의해 분화한 단핵구 유래 대식세포(Monocyte-derived macrophage)로 구분될 수 있다.
In particular, macrophages are distributed in all tissues in vivo and are responsible for immunity. They are involved in the elimination of invading pathogens, the elimination of virus-infected autologous cells and cancer cells, and the induction of inflammatory responses. Macrophages are the main source of tissue-resident macrophages, differentiated from yolk sac or fetal liver, and monocytes (differentiated from bone marrow cells) in the blood, Derived monocyte-derived macrophages (monocyte-derived macrophages).

조직세포 유래 대식세포 및 단핵구 유래 대식세포는, 사이토카인(cytokine)에 의해 서로 다른 면역 반응에 작용하는 M1 대식세포 및 M2 대식세포로 분화될 수 있다. 사이토카인은 세포 간의 정보전달에 관여하는 단백질로서, 병원균 또는 감염을 인지한 세포로부터의 연쇄적인 면역 반응에 의해 분비되며 helper T 세포(Th세포), B 세포, 대식세포 등의 면역 반응을 전담하는 세포들의 분화 및 증식을 촉진한다. M1 대식세포는 Th1 세포의 사이토카인인 IFN-γ, TNF-α등에 의해 유도되며, Th1 반응 유도, 염증반응 유발, 암 성장 억제 등에 작용한다. M2 대식세포는 Th2 세포의 사이토카인인 IL-4, IL-10 등에 의해 유도되며, Th2 반응 유도, 염증반응 억제, 손상된 조직 복구 등에 작용한다. 이처럼, 골수유래 대식세포 및 단핵구 유래 대식세포는 사이토카인의 종류에 따라 서로 다른 작용을 하는 M1 또는 M2 대식세포로 분화될 수 있다.
Tissue cell-derived macrophages and monocyte-derived macrophages can be differentiated into M1 macrophages and M2 macrophages, which act on different immune responses by cytokines. Cytokine is a protein involved in the transmission of information between cells. It is secreted by a series of immune responses from pathogen or infection-recognized cells and is responsible for immune responses such as helper T cells (Th cells), B cells and macrophages Promotes differentiation and proliferation of cells. M1 macrophages are induced by Th1 cell cytokines such as IFN-γ, TNF-α and the like and act on Th1 response induction, inflammation induction, cancer growth inhibition and the like. M2 macrophages are induced by Th2 cell cytokines such as IL-4, IL-10 and the like, and they act on induction of Th2 response, inhibition of inflammation reaction and repair of damaged tissue. As such, bone marrow-derived macrophages and monocyte-derived macrophages can be differentiated into M1 or M2 macrophages that have different actions depending on the type of cytokine.

단핵구 유래 대식세포가 사이토카인에 의해 분화유도 및 증식되어 활성화되는 데에는 시간이 필요하다. 최근에는, 인체 내에서 과반응(hypersensitive reaction), 아나필락시스(anaphylaxis) 등의 반응을 유발하지 않으면서 단핵구 유래 대식세포의 분화, 증식 및 활성화 시간을 단축시키기 위한 방법으로서, 사이토카인을 생체 내 안정한 상태로 제제화하거나 담체 내에 담지하여 직접 주입하는 방법 등의 연구가 활발히 이루어지고 있다. It takes time for monocyte-derived macrophages to be differentiated and proliferated and activated by cytokines. In recent years, as a method for shortening the differentiation, proliferation and activation time of monocyte-derived macrophages without inducing a hypersensitive reaction, anaphylaxis and the like in the human body, Or a method of directly injecting the drug into a carrier and the like have been actively studied.

일례로, 사이토카인을 타겟으로 하는 항체와 사이토카인의 혼합물, 표적세포를 타겟팅하기 위한 항체 및 사이토카인의 혼합물 등을 면역복합체로 만들어서 주입하는 방법이 알려져 있다. 국제공개번호 제WO/2012/149259호는 면역 반응을 유도하기 위해 사이토카인을 포함하는 나노운반체를 개시하고 있으나, 상기 특허에 개시된 나노운반체는 B-세포를 타겟으로 하는 항원을 포함하는 것으로서 B-세포를 유도해 2차 방어(특이적 면역)에 작용하도록 한다.
For example, a method of injecting a mixture of an antibody and a cytokine targeting a cytokine, an antibody for targeting a target cell, and a mixture of cytokines into an immunocomplex is known. International Publication No. WO / 2012/149259 discloses a nano-carrier comprising a cytokine for inducing an immune response. However, the nano-carriers disclosed in the patent include antigens targeting B- Cells are induced to act on secondary defense (specific immunity).

본 발명자들은 생체적합성이 우수한 다공성 실리카 나노입자에 IL-4, IL-10 등의 사이토카인을 담지시켜 생체 내로 전달함으로써 단핵구 유래 대식세포 등이 M2 대식세포로 효과적으로 분화하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
The present inventors completed the present invention by confirming that monocyte-derived macrophages and the like are effectively differentiated into M2 macrophages by supporting cytokines such as IL-4 and IL-10 on the biocompatible porous silica nanoparticles and delivering them in vivo Respectively.

국제공개번호 제WO/2012/149259호International Publication No. WO / 2012/149259

따라서, 본 발명의 목적은 다공성 실리카 나노입자에 사이토카인을 담지시켜 생체 내로 전달함으로써 과도한 면역 반응 조절에 기여하는, M2 대식세포로의 분화유도용 조성물을 제공하는 것이다.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for inducing differentiation into M2 macrophages, which contributes to regulation of an excessive immune response by carrying cytokines to the porous silica nanoparticles and delivering them in vivo.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 M2 대식세포로의 분화유도용 조성물을 제공한다.
In order to accomplish the above object, the present invention provides a composition for inducing differentiation into M2 macrophages containing cytokine-bearing porous silica nanoparticles.

본 발명의 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 M2 대식세포로의 분화유도용 조성물은, 사이토카인을 생체 내로 전달하여 단핵구, 대식세포 등이 M2 대식세포로 분화하는 것을 유도함으로써, 과도한 면역 반응을 조절하여 효과적인 면역반응이 일어날 수 있도록 한다.
The composition for inducing the differentiation into M2 macrophages containing the cytokine-bearing porous silica nanoparticles of the present invention can induce differentiation of monocytes, macrophages, and the like into M2 macrophages by delivering cytokines in vivo, Controlling the immune response allows an effective immune response to occur.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 골수유래 대식세포에 처리한 후의, Arg-eYFP(Arginase-enhanced yellow fluorescent protein) 발현량 및 M2 대식세포 분화량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 골수유래 대식세포에 처리한 후의, FIZZ1 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 Arg-eYFP 마우스 복강에 주입한 후의, 마우스의 복강 내 대식세포 중 M2 대식세포로 분화한 정도를 나타낸 그래프이다. 1 is a graph showing the relationship between the amount of Arg-eYFP (arginase-enhanced yellow fluorescent protein) expression and the amount of M2 macrophage differentiation after treating the cytoskine-loaded porous silica nanoparticles according to an embodiment of the present invention with bone marrow-derived macrophages Fig.
FIG. 2 is a graph showing the amount of FIZZ1 mRNA expression after treatment of cytokine-loaded porous silica nanoparticles according to an embodiment of the present invention with bone marrow-derived macrophages.
FIG. 3 is a graph showing the degree of differentiation of M2 macrophages into the intraperitoneal macrophages of mice after injecting cytokine-loaded porous silica nanoparticles into the abdominal cavity of Arg-eYFP mice according to an embodiment of the present invention.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는, M2 대식세포로의 분화유도용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for inducing differentiation into M2 macrophages, comprising a porous silica nanoparticle carrying cytokines.

상기 M2 대식세포는 대식세포, 단핵구 등으로부터 분화될 수 있다. The M2 macrophages can be differentiated from macrophages, mononuclear cells, and the like.

상기 사이토카인은 대식세포, 단핵구 등이 M2 대식세포로 분화하는 것을 유도할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-10(IL-10)일 수 있고, 보다 바람직하게는 IL-4일 수 있다.
The cytokine is not particularly limited as long as it can induce the differentiation of macrophages, mononuclear cells, etc. into M2 macrophages, and may be interleukin-4 (IL-4) and interleukin-10 , More preferably IL-4.

상기 다공성 실리카 나노입자는 입자의 직경이 100 내지 300nm, 100 내지 200nm 또는 100 내지 150nm일 수 있다. 상기 다공성 실리카 나노입자의 직경이 상기 범위일 때 분산성이 좋고 반응성이 유지되며 물과 생체 내에서 우수한 생체 적합성을 가지는 장점이 있다.
The porous silica nanoparticles may have a particle diameter of 100 to 300 nm, 100 to 200 nm, or 100 to 150 nm. When the diameter of the porous silica nanoparticles is within the above range, the dispersibility is good, the reactivity is maintained, and the biocompatibility is excellent in water and in vivo.

상기 다공성 실리카 나노입자는 그 기공 크기가 3 내지 40nm, 3 내지 35nm, 3 내지 25nm, 3 내지 20nm, 2.5 내지 40nm, 2.5 내지 35nm, 2.5 내지 25nm 또는 2.5 내지 20nm일 수 있고, 단위질량 당 기공 부피가 0.3 내지 2 cm3/g, 0.5 내지 2 cm3/g, 0.3 내지 1 cm3/g, 0.5 내지 1 cm3/g 또는 1 내지 2 cm3/g일 수 있다. 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공 크기 및 부피가 상기 범위일 때 사이토카인의 활성에 영향을 미치지 않으면서 상기 사이토카인을 나노입자의 기공 내에 잘 담지할 수 있다.
The porous silica nanoparticles may have a pore size of 3 to 40 nm, 3 to 35 nm, 3 to 25 nm, 3 to 20 nm, 2.5 to 40 nm, 2.5 to 35 nm, 2.5 to 25 nm, or 2.5 to 20 nm, 0.3 to 2 cm 3 / g, 0.5 to 2 cm 3 / g, 0.3 to 1 cm 3 / g, 0.5 to 1 cm 3 / g, or 1 to 2 cm 3 / g. When the pore size and volume of the porous silica nanoparticles are within the above ranges, the cytokine can be supported in the pores of the nanoparticles without affecting the activity of the cytokine.

또한, 상기 다공성 실리카 나노입자는 산화철(Iron oxide)을 함유할 수 있다. 상기 다공성 실리카 나노입자가 산화철을 함유하면 생체 내에서 MR 조영(contrast) 효과를 나타낼 수 있다. 상기 산화철은 Fe2O3, Fe3O4 등일 수 있다.
In addition, the porous silica nanoparticles may contain iron oxide. When the porous silica nanoparticles contain iron oxide, they can exhibit an MR contrast effect in vivo. The iron oxide may be Fe 2 O 3 , Fe 3 O 4, or the like.

상기 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자는 다음과 같은 방법에 의해 제조할 수 있다. The above-described cytokine-bearing porous silica nanoparticles can be prepared by the following method.

구체적으로, (1) 유기용매 상에 분산되어 있는 산화철 나노입자를 계면활성제를 이용하여 물에 분산시키는 단계; (2) 물, C1 -10 알코올 및 유기용매로 이루어진 혼합용매 중에서 상기 단계 (1)의 분산액과 테트라에틸 오소실리케이트(TEOS)를 첨가하여 다공성 실리카 나노입자를 제조하는 단계; 및 (3) 물로 이루어진 용매 중에서 사이토카인과 상기 단계 (2)에서 제조된 다공성 실리카 나노입자를 1 내지 3시간, 상온에서 볼텍싱(vortexing)시키는 단계에 의해 제조할 수 있다. Specifically, (1) dispersing iron oxide nanoparticles dispersed in an organic solvent in water using a surfactant; (2) preparing a porous silica nanoparticle by adding the dispersion of step (1) and tetraethyl orthosilicate (TEOS) in a mixed solvent consisting of water, a C 1 -10 alcohol and an organic solvent; And (3) vortexing the cytokine and the porous silica nanoparticles prepared in step (2) in a solvent composed of water for 1 to 3 hours at room temperature.

상기 단계 (2)는 촉매 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 촉매는 염기성 촉매, 바람직하게 암모늄하이드록사이드(NH4OH)일 수 있다.
The step (2) may be carried out in the presence of a catalyst. The catalyst may be a basic catalyst, preferably ammonium hydroxide (NH 4 OH).

상기 산화철 나노입자는 계면활성제에 둘러싸임으로써 물에 안정한 상태로 분산될 수 있다. 그 다음, 상기 나노입자는 물, C1 -10 알코올 및 유기용매로 이루어진 유사 에멀젼(emulsion) 상태의 혼합용매 중에서 TEOS와 수화, 축합 반응하면서 다수의 기공을 갖는 실리카 나노입자를 형성할 수 있다. The iron oxide nanoparticles are surrounded by the surfactant and can be dispersed in a stable state in water. Then, the nanoparticles can be hydrated and condensed with TEOS in a mixed solvent of emulsion state of water, C 1 -10 alcohol and organic solvent to form silica nanoparticles having a plurality of pores.

계면활성제로 둘러싸인 반응물 내부 및 외부에서는 TEOS가 수화, 축합되면서 발열반응이 일어난다. 보다 구체적으로, 발열 반응 시 일부 용매, 예를 들어 유기용매는 실리카 나노입자의 내부 및 외부에서 동시다발적으로 기화됨으로써 사이토카인을 담지하기에 충분한 크기의 기공을 갖는 다공성의 실리카 나노입자가 형성되도록 할 수 있다. 이렇게 제조된 다공성의 실리카 나노입자에 사이토카인이 담지될 수 있다. 상기 사이토카인, 예컨대, IL-4, IL-10 등은 상기 다공성 실리카 나노입자와 물 등의 용매 중에서 볼텍싱(vortexing)됨으로써 상기 나노입자에 담지될 수 있다. 볼텍싱은 상온에서 약 1 내지 3시간동안 수행될 수 있다. 사이토카인의 담지 효율을 높이기 위해, 볼텍싱 공정 수행 전, 다공성 실리카 나노입자를 물 등의 용매 중에서 소니케이션(sonication)을 더 수행한 후 사이토카인을 첨가하여 볼텍싱시킬 수 있다.
In the inside and outside of the reaction product surrounded by the surfactant, an exothermic reaction occurs while TEOS is hydrated and condensed. More specifically, during the exothermic reaction, some solvents, such as organic solvents, are simultaneously vaporized in and out of the silica nanoparticles to form porous silica nanoparticles having pores of sufficient size to carry the cytokine can do. The thus prepared porous silica nanoparticles can be loaded with cytokines. The cytokines such as IL-4, IL-10 and the like can be carried on the nanoparticles by vortexing the porous silica nanoparticles in a solvent such as water. Vortexing can be carried out at room temperature for about 1 to 3 hours. In order to increase the loading efficiency of the cytokine, the porous silica nanoparticles may be subjected to sonication in a solvent such as water before the vortexing process, followed by vortexing by adding cytokines.

상기 계면활성제로는 세틸트리메틸암모늄브로마이드, 옥틸트리메틸암모늄브로마이드 또는 도데실트리메틸암모늄브로마이드인 알킬트리메틸암모늄염; 및 알칼리염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 알킬트리메틸암모늄염 등을 사용할 수 있다.
Examples of the surfactant include alkyltrimethylammonium salts such as cetyltrimethylammonium bromide, octyltrimethylammonium bromide or dodecyltrimethylammonium bromide; And alkali salts, and alkyltrimethylammonium salts and the like can be preferably used.

상기 유기용매로는 헥산, 에틸 아세테이트, 디에틸 에테르 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 에틸 아세테이트 등을 사용할 수 있다.
The organic solvent may be selected from the group consisting of hexane, ethyl acetate, diethyl ether and the like, preferably ethyl acetate.

상기 C1 -10 알코올은 상기 단계 (2)의 용매의 총 중량에 대하여 1 내지 5 중량%, 1 내지 4 중량%, 1 내지 3중량%, 2 내지 4중량% 또는 3 내지 5중량%로 포함될 수 있다. The C 1 -10 alcohol is contained in an amount of 1 to 5 wt%, 1 to 4 wt%, 1 to 3 wt%, 2 to 4 wt%, or 3 to 5 wt% based on the total weight of the solvent of the step (2) .

상기 유기용매는 상기 단계 (2)의 용매의 총 중량에 대하여 5 내지 20중량%, 5 내지 15중량%, 8 내지 15중량%, 8 내지 15중량%, 10 내지 20중량%, 10 내지 15중량% 또는 15 내지 20중량%로 포함될 수 있다.
The organic solvent is used in an amount of 5 to 20% by weight, 5 to 15% by weight, 8 to 15% by weight, 8 to 15% by weight, 10 to 20% by weight, 10 to 15% by weight, % Or 15 to 20% by weight.

상기 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 M2 대식세포로의 분화유도용 조성물은 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 피하 투여 등의 방법으로 투여될 수 있다.
The composition for inducing differentiation into M2 macrophages containing the cytokine-bearing porous silica nanoparticles may be administered by intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, or the like.

상기 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자는 골수유래 대식세포, 단핵구 유래 대식세포 등이 M2 대식세포로 분화되는 것을 유도할 수 있다(도 1 내지 3 참조).
The cytosine-loaded porous silica nanoparticles can induce the differentiation of bone marrow-derived macrophages, monocyte-derived macrophages, and the like into M2 macrophages (see FIGS. 1 to 3).

상술한 바와 같은 사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 M2 대식세포로의 분화유도용 조성물은 사이토카인을 생체 내로 전달하여 골수유래 대식세포, 단핵구 유래 대식세포 등이 M2 대식세포로 분화하는 것을 유도함으로써, 선천적 면역 반응이 보다 빠르고 효과적으로 일어날 수 있도록 한다.
The composition for inducing differentiation into M2 macrophages containing the above-described cytokine-bearing porous silica nanoparticles is a composition for inducing the differentiation of M2 macrophages into macrophages and monocyte-derived macrophages by delivering cytokines in vivo By inducing the innate immune response to occur more quickly and effectively.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, the following examples are intended to be illustrative of the present invention, but the present invention is not limited thereto.

[[ 실시예Example ]]

제조예Manufacturing example 1. 사이토카인이  1. cytokines 담지된Supported 다공성 실리카 나노입자의 제조 Preparation of porous silica nanoparticles

1-1. 다공성 실리카 나노입자의 제조1-1. Preparation of porous silica nanoparticles

0.5ml의 클로로포름에 분산되어 있는 Fe3O4 나노입자를 헥사데실트리메틸암모늄 브롬화물(CTAB)(0.1g)이 녹아 있는 증류수 5mL에 첨가하여 30분간 교반해 분산시켰다. 이후, 반응기를 가열시켜 온도를 60℃로 올리고 10분간 더 교반하여 클로로포름을 증발시켰다. 그 다음, 반응기의 교반을 유지하면서 증류수 95mL, 메탄올 5mL, 암모늄하이드록사이드 용액(30%) 3mL 및 에틸아세테이트 20mL을 첨가해 교반시켰다. 그 후, 반응기의 교반을 계속 유지하면서 상온에서 테트라에틸오소실리케이트(TEOS) 0.5mL를 첨가하고 12시간 동안 반응을 유지시켰다. The Fe 3 O 4 nanoparticles dispersed in 0.5 ml of chloroform were added to 5 ml of distilled water containing 0.1 g of hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), and the mixture was stirred and dispersed for 30 minutes. Thereafter, the reactor was heated, the temperature was raised to 60 ° C, and the mixture was further stirred for 10 minutes to evaporate the chloroform. Then, 95 mL of distilled water, 5 mL of methanol, 3 mL of ammonium hydroxide solution (30%) and 20 mL of ethyl acetate were added while stirring the reactor, and the mixture was stirred. Thereafter, 0.5 mL of tetraethylorthosilicate (TEOS) was added at room temperature while the stirring of the reactor was maintained, and the reaction was maintained for 12 hours.

상기 결과물을 11,000rpm으로 원심분리하여 상층액(미반응 물질, 불순물)을 제거하였다. 이후, pH 1.4, 60℃의 조건에서 에탄올을 이용하여 3시간동안 반응(계면활성제 제거 및 기공 주형 추출)시켜 다공성 실리카 나노입자를 수득하였다. 상기 수득된 다공성 실리카 나노입자를 에탄올에 분산시켜 25℃에서 보관하였다.
The resultant was centrifuged at 11,000 rpm to remove the supernatant (unreacted material, impurities). Thereafter, the reaction was carried out for 3 hours using ethanol at pH 1.4 and 60 ° C (surfactant removal and pore-casting extraction) to obtain porous silica nanoparticles. The obtained porous silica nanoparticles were dispersed in ethanol and stored at 25 캜.

1-2. 인터루킨-4(IL-4)가 1-2. Interleukin-4 (IL-4) 담지된Supported 다공성 실리카 나노입자의 제조 Preparation of porous silica nanoparticles

상기 제조예 1-1에서 제조된 다공성 실리카 나노입자에 다음과 같은 방법으로 IL-4를 담지시켰다.The porous silica nanoparticles prepared in Preparation Example 1-1 were loaded with IL-4 in the following manner.

구체적으로, 에탄올에 분산되어 보관된 다공성 실리카 나노입자 1mg에 에탄올 70%가 되도록 증류수를 첨가하였다. 그 다음, 11,000rpm으로 상온에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 남은 여액에 증류수 1ml를 첨가하여 재분산시켰다. 상기 원심분리부터 재분산까지의 과정을 3회 더 수행하였다. 이 때, 3회째에는 증류수의 양을 100ul로 달리하여 첨가하였다. 이후, 소니케이션을 수행한 다음, IL-4(IL-4의 함량은 하기 실험예마다 차이가 있음)를 첨가하고 2시간 동안 상온에서 볼텍싱(vortexing)시켰다. 이후, 11,000rpm으로 상온에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하고 남은 여액에 증류수 200ul을 첨가하여 재분산시켰다. 상기 원심분리부터 재분산까지의 과정을 한 번 더 수행한 후, 다시 11,000rpm으로 상온에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 남은 여액(IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자 포함)을 수득하였다. 수득한 여액은 물 또는 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)에 재분산시켰다. In vivo 실험에서는 DPBS에 재분산시킨 것을 사용하였으며, In vitro 실험에서는 물에 재분산시킨 것을 사용하였다.
Specifically, distilled water was added to 1 mg of the porous silica nanoparticles dispersed and stored in ethanol so as to be 70% ethanol. Then, it was centrifuged at 11,000 rpm for 5 minutes at room temperature, and the supernatant was removed. The remaining filtrate was redissolved by adding 1 ml of distilled water. The procedure from centrifugation to redispersion was performed three more times. At this time, in the third run, the amount of distilled water was changed to 100 ul. After the sonication, IL-4 (the content of IL-4 differs from each of the following experimental examples) was added and vortexed at room temperature for 2 hours. Thereafter, the mixture was centrifuged at 11,000 rpm for 5 minutes at room temperature, and the supernatant was removed. To the remaining filtrate, 200 ul of distilled water was added and redispersed. The procedure from the centrifugation to the redispersion was performed once more and then centrifuged again at 11,000 rpm for 5 minutes at room temperature to remove the supernatant to obtain the remaining filtrate (including the porous silica nanoparticles carrying IL-4) Respectively. The obtained filtrate was redispersed in water or Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS). For in vivo experiments, redispersed in DPBS was used. In vitro experiments were used for redispersed in water.

실험예Experimental Example 1.  One. ArgArg -- eYFPeYFP (( ArginaseArginase -- enhanced yellow fluorescent proteinenhanced yellow fluorescent protein ) 마우스에서의 ) In mice M2M2 대식세포로의 분화 여부 확인- Whether the cells are differentiated into macrophages - in vitroin vitro

사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자에 의해 대식세포가 M2 대식세포로 분화하는지 여부를 알아보기 위해, Arg-eYFP 마우스의 골수세포로부터 얻은 골수유래 대식세포(Bone marrow-derived macrophage: BMDM)을 사용하여 다음과 같은 시험을 수행하였다. 이때, Arg-eYFP 마우스는 The Jackson laboratory에서 구입한 것을 사용하였다. 상기 Arg-eYFP 마우스는 M2 대식세포의 reporter 마우스로서, M2 대식세포의 marker로 이용되는 Arg 유전자에 eYFP 유전자를 재조합시킨 마우스이다. Bone marrow-derived macrophages (BMDM) obtained from bone marrow cells of Arg-eYFP mice were used to determine whether macrophages were differentiated into M2 macrophages by cytosine-loaded porous silica nanoparticles The following tests were carried out. At this time, Arg-eYFP mouse purchased from The Jackson laboratory was used. The Arg-eYFP mouse is a reporter mouse of M2 macrophage, which is a mouse in which the Arg gene used as a marker of M2 macrophages is recombined with eYFP gene.

구체적으로, Arg-eYFP 마우스의 대퇴부뼈와 정강이뼈를 분리한 후 70% 에탄올에 적셔서 소독하였다. 그 다음, 5ml의 Dulbecco's Modified Eagle Medium media(DMEM media: 10% Heat inactivate FBS, HEPES (10mM), L-Glu(2mM), Pen/Strep)가 들어있는 Mortar(막자사발)에 각각 양 끝을 자른 대퇴부뼈와 정강이뼈를 함께 넣어주고, Pestle(막자)를 이용해 파쇄하였다. 상기 뼈들의 파쇄물(BMDM 함유)이 포함된 media를 70um size의 Mesh로 필터링하여 새 튜브로 옮겼다. 필터링된 파쇄물을 다시 Mortar에 넣고 5ml의 DMEM media를 첨가하여 파쇄하고 필터링하였으며, 상기 과정을 1회 더 반복하여 BMDM이 포함된 media를 얻었다. 그 다음, 상기 BMDM이 포함된 media을 5분간 ACK lysis buffer로 처리하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 골수세포를 Macrophage growth media(30% L-929 sup, Heat inactivated FBS (up to 10%), HEPES (10mM), L-Glu (2mM), Pen/Strep)에 1x106 cell/ml이 되도록 분산시켜 10ml/페트리 접시가 되도록 하였다. 그 후, 37℃, 5% CO2의 조건에서 16시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 48시간 경과 후, 상기 Macrophage growth media 5ml를 페트리 접시에 첨가하고, 48시간 더 배양하였다. 그 다음, 상기 페트리 접시의 상층 media를 제거하여 접시에 세포만 붙어있도록 한 후, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)을 20ml, 26G needle의 주사기로 분사하여 접시에 붙어있는 세포가 떨어지도록 하였다. DPBS의 분사력에 의해 떨어져나간 BMDM과, DPBS의 혼합물을 새로운 튜브에 옮기고, 원심분리하여 세포를 spin-down시킨 후 DPBS를 제거하고 DMEM media에 재분산시켰다. 상기 분산액을 24-웰 플레이트에 3x105cell/웰로 시딩(seeding)한 후, 37℃, 5% CO2의 조건에서 16시간동안 인큐베이터에서 배양하여 BMDM을 얻었다. Specifically, the femoral bone and the shin bone of the Arg-eYFP mouse were separated and sterilized by soaking in 70% ethanol. Next, cut into both ends of a Mortar (Mussel's bowl) containing 5 ml of Dulbecco's Modified Eagle Medium media (DMEM medium: 10% heat inactivated FBS, HEPES (10 mM), L-Glu (2 mM), Pen / Strep) The thigh bone and the shin bone were put together and disintegrated using Pestle. The media containing the BMDM-containing fragments of the bones was filtered with a mesh size of 70 um and transferred to a new tube. The filtered lysate was again put into Mortar, and 5 ml of DMEM media was added to disrupt it and then filtered. The above procedure was repeated one more time to obtain BMDM-containing media. Then, the media containing BMDM was treated with ACK lysis buffer for 5 minutes to remove red blood cells. In the bone marrow cells with red blood cells are removed Macrophage growth media (30% L- 929 sup, Heat inactivated FBS (up to 10%), HEPES (10mM), L-Glu (2mM), Pen / Strep) 1x10 6 cell / ml To give a 10 ml / Petri dish. Then, the cells were cultured in an incubator at 37 캜 and 5% CO 2 for 16 hours. After 48 hours, 5 ml of the macrophage growth media was added to the Petri dish and further cultured for 48 hours. Then, the upper layer media of the Petri dish was removed, and the cells were attached to the dish. Then, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) was sprayed with 20 ml of a 26G needle syringe to allow cells attached to the dish to fall off. The mixture of BMDM and DPBS separated by the injection force of DPBS was transferred to a new tube, centrifuged to spin-down the cells, and DPBS was removed and redispersed in DMEM media. The dispersion was seeded on a 24-well plate at 3 × 10 5 cells / well, and then cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 for 16 hours to obtain BMDM.

그 다음, 200ul 볼륨이 되도록 수용액 상태의 IL-4(0.5, 5 및 50 ng/웰)와 IL-4(0.5, 5 및 50 ng/웰)가 담지된 다공성 실리카 나노입자)를 BMDM에 각각 처리하였다. IL-4 단독, IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자가 각각 처리된 BMDM 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양한 후, 유세포분석기(LSRFortessa, BD Biosciences사)를 이용하여 Arg-eYFP level을 분석하였다. 그 결과를 도 1의 a 및 b에 나타내었다. 이때, SSC값은 세포의 granulity를 나타내는 척도로 세포가 granule 등의 과립을 가지고 있는 정도에 따라 값이 달라진다.
Then, the BMDM was treated with IL-4 (0.5, 5 and 50 ng / well) and aqueous IL-4 (0.5, 5 and 50 ng / well) Respectively. BMDM cells treated with IL-4 alone and IL-4-loaded porous silica nanoparticles were cultured for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 , and then analyzed using a flow cytometer (LSRFortessa, BD Biosciences) And the level of Arg-eYFP was analyzed. The results are shown in Figs. 1 (a) and 1 (b). In this case, the SSC value is a measure of the granulity of the cell, and the value varies depending on the degree of granule of the cell.

도 1의 a에서 보는 바와 같이, 수용액 상태의 IL-4(수용성 IL-4) 및 IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자가 처리된 경우, 처리량이 증가함에 따라 Arg-eYFP 신호 및 M2 대식세포량이 증가하는 것을 알 수 있다. 나아가, IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자가 수용성 IL-4에 비하여 SSC 값이 증가한 것으로 보아 IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자가 BMDM에 탐식되었음을 알 수 있다. 또한, 도 1의 b에서 보는 바와 같이, 수용성 IL-4 및 IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자가 처리된 경우, 처리량이 증가함에 따라 각각 M2 대식세포 분화량이 증가한 것을 알 수 있다. As shown in FIG. 1 (a), when treated with aqueous IL-4 (soluble IL-4) and IL-4-loaded porous silica nanoparticles, the amount of Arg-eYFP signal and M2 macrophages It can be seen that the amount increases. Furthermore, it was found that the porous silica nanoparticles loaded with IL-4 had an increased SSC value compared to the water-soluble IL-4, indicating that the porous silica nanoparticles loaded with IL-4 were fumed into BMDM. Further, as shown in FIG. 1 (b), when the water-soluble IL-4 and IL-4-loaded porous silica nanoparticles were treated, the amount of M2 macrophage differentiation increased with increasing throughput.

따라서, IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자에 의해 BMDM이 M2 대식세포로 분화됨을 알 수 있다.
Therefore, it can be seen that BMDM is differentiated into M2 macrophages by IL-4-loaded porous silica nanoparticles.

실험예Experimental Example 2.  2. M2M2 대식세포로의 분화 여부-  Whether to differentiate into macrophages - FIZZ1FIZZ1 mRNAmRNA 발현량- Expression level - in vitroin vitro

사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자에 의해 BMDM이 M2 대식세포로 분화되는지 여부를 알아보기 위해, 다음과 같은 방법으로 FIZZ1 mRNA(M2 대식세포 표지자; Journal of Leukocyte Biology 2002 71:597, BMC Immunology 2002 3:7)의 발현량을 측정하였다.In order to examine whether BMDM is differentiated into M2 macrophages by the porous silica nanoparticles carrying cytokines, FIZZ1 mRNA (M2 macrophage marker; Journal of Leukocyte Biology 2002 71: 597, BMC Immunology 2002 3: 7).

구체적으로, 상기 시험예 1에서 얻은 골수유래 대식세포에, 200ul의 수용액 상태(수용성)의 IL-4(0.5, 5 및 50 ng/웰)와 IL-4(0.5, 5 및 50 ng/웰)가 담지된 다공성 실리카 나노입자를 각각 처리하였다. IL-4 또는 IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자가 처리된 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 24시간 배양 후 500ul Tri reagent(Ambion 사)을 이용하여 균질화시키고, 볼텍싱(vortexing)시킨 후 15분 동안 상온에서 배양하였다. 그 다음, 100ul의 클로로포름을 첨가하고 볼텍싱시킨 후 15분간 상온에서 더 배양하였다. 그 다음, 4℃, 13,200rpm으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 분리하였다. 상층액 200ul을 취한 후, 200ul의 이소프로판올을 첨가하고 볼텍싱시킨 후, 얼음에서 15분간 배양하였다. 그 다음, 4℃, 13,200rpm으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 75% 에탄올 1ml을 첨가한 후, 상온에서 5분간 배양하고, 4℃, 13,200rpm으로 7분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 펠렛(pellet)이 투명해지도록 건조시킨 후, 20ul의 DEPC 버퍼에 녹여, RNA를 분리하였다. Specifically, IL-4 (0.5, 5 and 50 ng / well) and IL-4 (0.5, 5 and 50 ng / well) of 200 ul aqueous solution state (water-soluble) were added to the bone marrow-derived macrophages obtained in Test Example 1, The porous silica nanoparticles were each treated. Cells treated with IL-4 or IL-4-supported porous silica nanoparticles were cultured for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 . After 24 hours of incubation, the cells were homogenized using 500 ul Tri reagent (Ambion), vortexed, and cultured at room temperature for 15 minutes. Then, 100ul of chloroform was added and vortexed, followed by further incubation at room temperature for 15 minutes. Then, centrifugation was carried out at 4 ° C and 13,200 rpm for 15 minutes, and the supernatant was separated. After 200 ul of the supernatant was added, 200 ul of isopropanol was added and vortexed, followed by incubation on ice for 15 minutes. After centrifugation at 13,200 rpm for 15 minutes, the supernatant was removed and 1 ml of 75% ethanol was added. The mixture was incubated at room temperature for 5 minutes, centrifuged at 13,200 rpm for 7 minutes at 4 ° C, The solution was removed, the pellet was dried to be transparent, and then dissolved in 20 ul of DEPC buffer to separate the RNA.

분리된 RNA 8ul를 취하여 RQ1 DNase kit(Promega사)의 DNase(DNase 1ul, buffer 1ul)를 37℃에서 30분간 처리한 후, RQ1 DNase kit(Promega사)의 stop solution(20mM EGTA 1ul)을 넣어 70℃에서 15분간 반응시켜 DNase를 불활성화시켰다. 그 다음, Oligo dT(100pmole)과 dNTP를 넣어준 후 65℃에서 5분간 배양한 후 얼음에서 5분간 더 배양하였다. 그 후, 역전사 효소(superior script III, Enzynomics사)와 reaction buffer, RNase inhibitor 및 0.5uM의 DTT를 넣고 50℃에서 1시간 동안 역전사(RT) 반응시켰다. 그 다음, 70℃에서 15분간 반응시켜 효소를 불활성화시켜 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 hTaq polymerase(solgent사), Evagreen 형광 dye(Biotium사) 및 FIZZ1 primer를 이용하여 Real-time PCR을 수행하여 FIZZ1 mRNA level을 정량화하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
DNase (1 μl of DNase, 1 μl of buffer) was treated with RQ1 DNase kit (Promega) for 30 minutes at 37 ° C, followed by stop solution (20 μM EGTA) of RQ1 DNase kit (Promega) For 15 min to inactivate the DNase. Then, Oligo dT (100 pmoles) and dNTP were added, followed by incubation at 65 ° C for 5 minutes, followed by further incubation on ice for 5 minutes. Afterwards, reverse transcriptase (superior script III, Enzynomics), reaction buffer, RNase inhibitor and 0.5 uM of DTT were added and reacted at 50 ° C for 1 hr. Next, cDNA was synthesized by inactivating the enzyme by reacting at 70 ° C for 15 minutes, and the synthesized cDNA was subjected to real-time PCR using hTaq polymerase (solgent), Evagreen fluorescent dye (Biotium) and FIZZ1 primer To quantify FIZZ1 mRNA levels. The results are shown in Fig.

도 2에서 보는 바와 같이, IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자가 처리된 경우, FIZZ1 mRNA의 발현량이 증가한 것으로 보아, BMDM이 M2 대식세포로 분화되었음을 알 수 있다.
As shown in FIG. 2, when the IL-4-loaded porous silica nanoparticles were treated, the amount of FIZZ1 mRNA expression was increased, suggesting that BMDM was differentiated into M2 macrophages.

실험예Experimental Example 3.  3. M2M2 대식세포로의 분화 여부 확인 -  Whether the cells are differentiated into macrophages - In In vivovivo

사이토카인이 담지된 다공성 실리카 나노입자에 의해 M2 대식세포로의 분화가 유도되는지 여부를 알아보기 위해, 다음과 같은 시험을 수행하였다. In order to examine whether the differentiation of M2 macrophages into mesangial cells was induced by the cytosine-impregnated porous silica nanoparticles, the following test was carried out.

구체적으로, Arg-eYFP 마우스에 수용액 상태(수용성)의 500ng의 IL-4 또는 500ng의 IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자(500ug)를 복강내 주사하였다. 48시간 경과 후 상기 각각의 마우스에 동일한 종류(수용성 500ng의 IL-4 또는 500ng의 IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자, 500ug)를 한번 더 주사하였다. 24시간 뒤에 마우스를 죽인 후, 복막이 드러나게 배 가죽을 제거한 다음, 8ml의 PBS를 넣었다. PBS 주입 후 복강을 가볍게 마사지하고, 10분 뒤 복강에서 PBS를 분리하였다. 분리된 PBS를 2.4G2 sup으로 30분간 블록킹하고, F4/80 및 CD11b 항체와 30분 동안 반응시킨 후, FACS 버퍼(2% Bovine serum, PBS)를 이용하여 2회 워싱하였다. 그 다음, 300ul의 FACS 버퍼에 분산시키고, 유세포분석기(LSRFortessa, BD Biosciences사)로 유세포 분석하였다. 그 결과를 도 3의 a 내지 d에 나타내었다. Specifically, Arg-eYFP mice were intraperitoneally injected with 500ng of IL-4 or 500ng of IL-4-loaded porous silica nanoparticles (500ug) in aqueous solution (aqueous). Forty-eight hours later, each of the mice was injected with the same type (500 ng of water-soluble IL-4 or 500 ng of IL-4 supported porous silica nanoparticles, 500 ug) once more. Twenty-four hours later, the mouse was killed, and the abdominal skin was removed to reveal the peritoneum, and then 8 ml of PBS was added. After PBS injection, the abdominal cavity was lightly massaged, and PBS was separated from the abdominal cavity 10 minutes later. Separated PBS was blocked with 2.4G2 sup for 30 minutes, reacted with F4 / 80 and CD11b antibodies for 30 minutes, and then washed twice with FACS buffer (2% Bovine serum, PBS). It was then dispersed in 300 ul of FACS buffer and analyzed by flow cytometry with a flow cytometer (LSRFortessa, BD Biosciences). The results are shown in Figs. 3 (a) to 3 (d).

도 3의 a 내지 d의 그래프는 왼쪽으로부터 DAPI 염색된 세포의 DAPI signal을 나타낸 그래프, 상기 DAPI염색된 세포들 중 세포가 뭉친 것을 제외하고 한 종류의 세포들로부터 관찰된 신호를 선별하여 FSC-H 및 FSC-A 신호로 나타낸 그래프, 상기 신호들로부터 대식세포 marker로 사용되는 CD11b 및 F4/80의 population을 나타낸 그래프 및 상기 population으로부터 Arg-eYFP의 level을 산출하여 나타낸 그래프이다. 또한, 도 3의 a 및 b는 도 3의 c 및 d의 대조군으로서, 도 3의 a는 Isotype으로 F4/80의 신호가 진짜인지 가짜인지 구분하기 위한 대조군이고, 도 3의 b는 다공성 실리카 나노입자에 의해서 M2 대식세포로 유도되는 것인지 IL-4에 의한 것인지 확인하기 위한 대조군이다.
The graphs a to d in FIG. 3 are graphs showing DAPI signals of DAPI-stained cells from the left. The signals observed from one kind of cells except for the aggregation of cells among the DAPI-stained cells were selected as FSC-H And the FSC-A signal, a graph showing the population of CD11b and F4 / 80 used as macrophage markers from the signals, and a graph showing the level of Arg-eYFP from the population. 3 is a control group for discriminating whether the signal of F4 / 80 is genuine or fake, and Fig. 3 (b) is a graph showing the results of the comparison between the porous silica nano- It is a control group to determine whether it is induced by M2 macrophages or IL-4 by the particles.

도 3의 a 내지 d에서 보는 바와 같이, 다공성 실리카 나노입자만을 주입한 경우에는 M2 대식세포가 유도되지 않았다. 나아가, 수용성 IL-4 및 IL-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자가 처리된 경우에는 대식세포에서 Arg-eYFP signal이 증가한 것으로 보아, 대식세포가 M2 대식세포로 분화되었음을 알 수 있다.As shown in FIGS. 3A to 3D, M2 macrophages were not induced when only the porous silica nanoparticles were injected. Furthermore, when treated with water-soluble IL-4 and IL-4-loaded porous silica nanoparticles, the Arg-eYFP signal was increased in macrophages, indicating that macrophages were differentiated into M2 macrophages.

Claims (7)

인터루킨-4가 담지된 다공성 실리카 나노입자를 포함하는 M2 대식세포로의 분화유도용 조성물에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자는 그 직경이 100 내지 300nm이고, 기공 크기가 3 내지 40nm이며, 상기 다공성 실리카 나노입자의 단위질량 당 기공 부피가 0.3 내지 2cm3/g인, M2 대식세포로의 분화유도용 조성물.
Wherein the porous silica nanoparticles have a diameter of 100 to 300 nm and a pore size of 3 to 40 nm, the porous silica nanoparticles having a diameter of 100 to 300 nm, the porous silica nanoparticles having a diameter of 100 to 300 nm, Wherein the pore volume per unit mass of the nanoparticles is 0.3 to 2 cm < 3 > / g.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 M2 대식세포가 대식세포 또는 단핵구로부터 분화되는 것인, M2 대식세포로의 분화유도용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein said M2 macrophages are differentiated from macrophages or monocytes.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 다공성 실리카 나노입자가 산화철(Iron oxide)를 함유하는, M2 대식세포로의 분화유도용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the porous silica nanoparticles contain iron oxide.
KR1020160096384A 2016-07-28 2016-07-28 Composition for inducing the differentiation into m2 macrophage comprising mesoporus silica nanopaticles and cytokine contained therein KR101754798B1 (en)

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