KR101744341B1 - Composition for Measuring of 3,6-L-AHG Transferase Activity, Method for Measuring of 3,6- L-AHG Transferase Activity Using the Same, and Composition for quantitative analysis of 3,6- L-AHG - Google Patents
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Abstract
NADP에서 NADPH로의 환원을 통해 L-AHG 전환효소의 활성을 측정하는, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 전환효소의 활성측정용 조성물 및 이를 이용한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 전환효소의 활성측정 방법을 제공한다. 해조류 바이오매스 등 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 원료의 이용에 유용하게 사용될 수 있는 바 산업적으로 유용하다. Anhydro-L-galactose converting enzyme for measuring the activity of L-AHG converting enzyme through reduction from NADP to NADPH, and a composition for measuring the activity of 3,6-anhydro-L-galactose converting enzyme Lt; / RTI > Anhydrous-L-galactose, such as seaweed biomass, and is industrially useful.
Description
3,6- L-AHG 전환효소의 활성측정용 조성물, 이를 이용한 3,6- L-AHG 전환효소의 활성 측정방법 및 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물에 관한 것이다.
A method for measuring activity of 3,6-L-AHG converting enzyme, a method for measuring activity of 3,6-L-AHG converting enzyme using the same, and a composition for quantitative analysis of 3,6-L-AHG.
전세계적으로 화석 연료의 과다 사용에 따른 자원 고갈 및 환경오염에 대한 우려가 증가함에 따라 안정적이고 지속적으로 에너지를 생산하는 신재생 대체에너지 개념이 화두가 되고 있다. 그러한 대체에너지 개발의 일환으로 바이오매스 자원으로부터 알코올을 생산하는 기술이 주목을 받고 있다. As the global exhaustion of fossil fuels and concerns about environmental pollution increase, the concept of renewable and alternative energy that produces stable and sustainable energy is becoming a hot topic. Techniques for producing alcohol from biomass resources are attracting attention as part of such alternative energy development.
현재 사탕수수 등의 당질계, 옥수수 등의 전분계를 이용한 제 1 세대 알코올이 생산되고 있으나, 이는 식품 및 가축 사료와의 경쟁, 재배 면적의 포화 등 많은 문제에 봉착되어 있다. 이에, 지구상에서 가장 풍부하고 고갈 없이 재생이 가능한 자원으로 대표되는 목질자원 리그노셀룰로오스(lignocelluloses)를 이용한 제 2 세대 알코올이 개발 중에 있다. First-generation alcohols such as sugar cane and sugar starch, such as corn, have been produced. However, this has led to many problems such as competition with food and livestock feed, saturation of cultivation area, and the like. Accordingly, a second-generation alcohol using lignocelluloses, which is the most abundant and reproducible resource on the planet, is under development.
최근에는 해조류(algae)를 이용한 알코올의 개발이 진행 중에 있다. 해조류는 성장속도가 빠르고, 광범위한 지역에서 재배가 용이하며, 이산화탄소 흡수 능력이 높기 때문에 효과적으로 이산화탄소를 고정화할 수 있어서 새로운 에너지 자원으로서 적절한 것으로 기대된다. In recent years, the development of alcohols using algae is underway. Seaweeds are expected to be suitable as new energy sources because they have a high growth rate, are easy to cultivate in a wide area, and can absorb carbon dioxide effectively because of their high ability to absorb carbon dioxide.
또한, 해조류는 리그닌에 비해 치밀하지 않은 조직을 가지므로 제 1 세대, 제 2 세대 알코올에 사용되는 바이오매스에 비해 상대적으로 당화가 용이하며, 생산량도 매우 방대하다는 장점이 있다. 또한, 상대적으로 풍부한 해양자원을 활용할 수 있어 대단한 잠재력을 가지고 있다. In addition, seaweeds are less dense than lignin, so they are easier to saccharify compared to biomass used in first- and second-generation alcohols, and the yield is very large. It also has great potential to utilize relatively abundant marine resources.
해조류 중 하나인 홍조류 바이오매스는 주로 한천(agar)으로 이루어져 있다. 한천은 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-Anhydro-L-galactose, 이하, '3,6-L-AHG'로 약칭함)가 1,3- 결합 또는 1,4- 결합으로 반복되어 있는 복합 다당류이다. 이 중 3,6-L-AHG는 희귀당으로서 통상적인 발효공정에서 사용되지 않으므로 그 이용이 제한되고 있다.
Red algae biomass, one of seaweeds, is mainly composed of agar. Galactose and 3,6-anhydro-L-galactose (abbreviated as '3,6-L-AHG' hereinafter) are 1,3-linkages or 1 , 4-linked repeating polysaccharide. Of these, 3,6-L-AHG is a rare sugar and its use is restricted because it is not used in conventional fermentation processes.
한천의 주요 구성성분 중의 하나인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 효과적으로 이용하기 위해서는 3,6-L-AHG의 반응 기작을 매개하는 3,6-L-AHG 전환효소의 활성을 측정하고, 3,6-L-AHG 를 정량할 수 있는 방법이 개발되어야 한다. 또한, D형의 3,6-안하이드로-갈락토오스와 구별하여 L형 만을 구별할 수 있어야 한다. In order to effectively utilize 3,6-anhydro-L-galactose, one of the major constituents of agar, the activity of 3,6-L-AHG converting enzyme mediating the reaction mechanism of 3,6-L-AHG was measured , 3,6-L-AHG should be developed. In addition, it is necessary to distinguish only L-type from D-
이에 3,6-L-AHG 전환효소의 활성을 측정하기 위한 조성물 및 이를 이용한 활성 측정방법을 제공하고자 한다. Accordingly, there is provided a composition for measuring the activity of 3,6-L-AHG converting enzyme and a method of measuring activity using the same.
본 발명의 일 측면에 따르면, 조효소인 NADP+(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 기질인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-L-AHG), 및 버퍼액을 포함하는 3,6-L-AHG 전환효소의 활성측정용 조성물을 제공한다. 여기서, NADP+로부터 NADPH로의 환원을 통해 L-AHG 전환효소의 활성을 측정할 수 있다. According to one aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a pharmaceutical composition comprising a coenzyme NADP + (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), a
또 다른 측면에 따르면, 상술한 조성물을 이용한 3,6-L-AHG 전환효소의 활성 측정방법을 제공한다. According to another aspect, there is provided a method for measuring the activity of 3,6-L-AHG converting enzyme using the composition described above.
일 예에서, 임의의 효소 추출액과 상기 조성물을 반응시키는 단계, 및 상기 반응에 의해 NADPH로 환원되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다. In one example, the method comprises the step of reacting the composition with any enzyme extract and determining whether it is reduced to NADPH by the reaction.
상기 NADPH로 환원되는지 여부는 339~340 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 알 수 있다. Whether the NADPH is reduced can be determined by measuring the absorbance at a wavelength of 339 to 340 nm.
또 다른 측면에 따르면, 3,6-L-AHG의 전환효소를 함유한 활성분획, NADP+, 및 버퍼액을 포함하는 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물을 제공한다. According to another aspect, there is provided a composition for quantitative analysis of 3,6-L-AHG comprising an active fraction containing 3,6-L-AHG converting enzyme, NADP + , and a buffer solution.
상기 정량분석용 조성물을 임의의 시료와 반응시키는 경우 임의의 시료 내 3,6-L-AHG의 함량은 NADPH의 함량에 비례한다. 상기 NADPH의 함량은 339~340 nm에서의 흡광도로 측정할 수 있다. When the composition for quantitative analysis is reacted with an arbitrary sample, the content of 3,6-L-AHG in any sample is proportional to the content of NADPH. The content of NADPH can be measured by absorbance at 339 to 340 nm.
상기 3,6-L-AHG의 함량은 도 1에 도시된 검정곡선(calibration curve)에서 339 nm에서의 흡광도(y축)에 대비하여 정량될 수 있다. The content of 3,6-L-AHG can be quantified relative to the absorbance at 339 nm (y-axis) in the calibration curve shown in Fig.
상기 3,6-L-AHG의 전환효소를 함유한 활성분획은 사카로파구스 데그라단스(Saccharophagus degradans)로부터 유래될 수 있다. The active fraction containing the 3,6-L-AHG converting enzyme can be derived from Saccharophagus degradans .
이러한 활성분획은 예를 들어, 사카로파구스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 조추출액을 얻는 단계, 조추출액에 황산암모늄((NH4)2SO4)을 0-50%의 포화도로 첨가하여 침전시키는 단계, 침전에 의한 상등액에 황산암모늄((NH4)2SO4)을 50-70%의 포화도로 첨가하여 침전시키는 단계, 및 침전에 의한 침전물에 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 분획하는 단계를 통해 얻어질 수 있다. 이에 최종 얻어진 활성분획의 비활성도(Specific activity)는 2.5 ~ 3.0일 수 있다.
This active fraction can be obtained, for example, by obtaining a crude extract of Saccharophagus degradans , adding ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) to the crude extract at a degree of saturation of 0-50% Adding ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) to the supernatant by precipitation at a degree of saturation of 50-70%, and separating the precipitate by precipitation through anion exchange chromatography Can be obtained. The specific activity of the finally obtained active fraction may be 2.5 to 3.0.
도 1은 3,6-L-AHG의 함량(x축) 대비 NADPH의 함량(y축)을 나타낸 검정곡선(calibration curve)이다(x축: 3,6- L-AHG의 상대적 농도, y축: 339nm 에서의 흡광도);
도 2는 사카로파구스 데그라단스로부터 3,6-L-AHG의 전환효소를 함유한 활성분획을 얻는 과정의 모식도이다;
도 3은 실험예 1의 사카로파구스 데그라단스 조추출액의 분리정제 단계별 효소활성 측정 그래프이다(x축: 시간(min), y축: 339nm 에서의 흡광도).1 is a calibration curve showing the content (y-axis) of NADPH relative to the content of 3,6-L-AHG (x axis) (x axis: relative concentration of 3,6-L- AHG, y axis : Absorbance at 339 nm);
FIG. 2 is a schematic diagram of a process for obtaining an active fraction containing 3,6-L-AHG converting enzyme from Saccharophagus de Grondans;
3 is a graph showing the enzyme activity measurement (x-axis: time (min), y-axis: absorbance at 339 nm) of the saccharophagus de Grassan crude extract of Experimental Example 1.
이하, 본 발명의 이점들과 특징들 및 이를 수행하는 방법들이 하기 실시예들에 대한 상세한 설명 및 첨부된 도면들을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 여기서 언급한 실시예들로만 한정되어 구성되는 것은 아니다. Hereinafter, advantages and features of the present invention and methods of performing the same will be more readily understood by reference to the following detailed description of the embodiments and the accompanying drawings. However, it should be understood that the present invention may be embodied in many other specific forms without departing from the spirit or scope of the invention.
또한, 본 발명의 명세서 및 청구항에 사용된 성분, 반응 조건 등의 수치를 나타내는 모든 숫자는 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상반된 언급이 없다면, 본 발명의 명세서 및 첨부된 청구항에 나타난 수적인 파라미터는 본 발명의 목적하는 바에 따라 달라질 수 있는 근사값이다. It is also to be understood that all numbers expressing numerical values of the components, reaction conditions, etc. used in the specification and claims of the present invention can be modified. Accordingly, unless indicated to the contrary, the numerical parameters set forth in the specification and the appended claims are approximations that may vary depending on the purview of the present invention.
본 발명에서 사용된 용어는 별도의 언급이 없다면 하기와 같은 의미를 갖는다. 또한, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서에서 별도의 언급이 없다면 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. The terms used in the present invention have the following meanings unless otherwise specified. Also, all technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by one of ordinary skill in the art, unless otherwise stated herein.
용어 '효소의 활성'은 일반적으로 반응기작에서 효소의 촉매능력을 의미하고, 본 명세서에서 '전환효소의 활성' 은 조효소인 NADP+로부터 NADPH로의 환원을 통해 확인할 수 있다. The term " enzyme activity " generally refers to the catalytic ability of the enzyme in the reaction mechanism. In the present specification, the 'conversion enzyme activity' can be confirmed by reduction of the coenzyme NADP + to NADPH.
용어 '조효소(Coenzyme)'는 주효소에 결합되어 있는 비단백질 성분으로, 효소반응 과정에서 그 화학구조가 변하면서 원자나 전자 등의 기능기를 반응기질에 전달하는 방식으로 효소반응을 보조하는 인자를 말하며, '보효소' 또는 '보조효소'라고도 한다. 조효소의 예로는 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드(NAD), NADH, 니코틴아미드아데닌 디뉴클레오티드인산(NADP), NADPH, 아데노신삼인산(ATP), 포스포아데닐산황산(PAPS), 우리딘이인산(UDP), 시티딘이인산(CDP), 구아노신삼인산(GTP), 이노신삼인산(ITP), 조효소 A(CoA) 등을 들 수 있다. 다만, 본 발명의 예에 따른 L-AHG 전환효소의 활성 측정용 조성물 및 L-AHG의 정량용 조성물에는 NADP가 유효한 조효소로서 포함된다. The term 'coenzyme' is a non-protein component that is bound to the main enzyme, and its chemical structure is changed during the enzymatic reaction process, and the function such as the atom or electron is transferred to the reaction substrate. It is also called coenzyme or coenzyme. Examples of the coenzyme include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), NADH, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), NADPH, adenosine triphosphate (ATP), phosphoadenylsulfuric acid (PAPS) (CDP), guanosine triphosphate (GTP), inosine triphosphate (ITP), coenzyme A (CoA), and the like. However, the composition for measuring the activity of an L-AHG converting enzyme according to the present invention and the composition for quantifying L-AHG include NADP as an effective coenzyme.
용어 '기질'은 효소의 작용을 받는 물질을 총칭하고, 효소의 작용을 받아 그 화학구조가 변화하는 화합물을 포함한다.
The term " substrate " is a generic term for a substance that is subjected to an action of an enzyme, and includes a compound whose chemical structure changes under the action of an enzyme.
3,6-L-AHG 전환효소의 활성측정용 조성물Composition for measuring activity of 3,6-L-AHG converting enzyme
본 발명의 일 측면에 따르면, 3,6-L-AHG 전환효소의 활성을 측정하는데 사용될 수 있는 활성측정용 조성물을 제공한다. According to one aspect of the present invention, there is provided a composition for measuring activity, which can be used to measure the activity of 3,6-L-AHG converting enzyme.
상기 조성물은 조효소인 NADP+, 기질인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-L-AHG), 및 버퍼액을 포함한다. 본 발명자들이 확인한 바에 따르면, 임의의 효소 추출액 내에 L-AHG 전환효소의 활성이 있는 경우 조효소인 NADP+가 NADPH로 전환되면서, 반응 기질인 L-AHG의 전환반응이 매개된다. 따라서, NADP+로부터 NADPH로의 환원을 통해 L-AHG 전환효소의 활성을 측정할 수 있다. The composition comprises a coenzyme NADP + , a
여기서, 임의의 효소 추출액은 3,6-L-AHG 전환효소의 활성을 측정하고자 하는 효소 추출액을 의미한다. Here, an arbitrary enzyme extract means an enzyme extract to measure the activity of 3,6-L-AHG converting enzyme.
상기 기질인 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-L-AHG)는 우뭇가사리 등 다수의 홍조류에 존재하는 한천(Agar)의 구성성분이므로 홍조류로부터 수득될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다. The substrate, 3,6-anhydro-L-galactose (3,6-L-AHG), can be obtained from red algae because it is a component of agar present in many red algae such as mugwort. However, the present invention is not limited thereto.
상기 조효소인 NADP+는 NAD의 인산화형으로서 339~340 nm에서 흡수극대 파장을 갖는다. The coenzyme NADP + is a phosphorylated form of NAD and has an absorption maximum wavelength at 339 to 340 nm.
상기 버퍼액은 일반적으로 효소의 활성이 가장 활발할 수 있는 최적 조건을 유지하도록 하기 위한 것이다. 또한, NADP+로부터 NADPH로의 환원이 비가역적으로 일어나는 것을 유지한다. 버퍼액의 예로는 Tris-HCl (pH 8.0)을 들 수 있다. The buffer solution is generally intended to maintain an optimal condition in which the activity of the enzyme is most active. It also maintains irreversible reduction of NADP + to NADPH. An example of a buffer solution is Tris-HCl (pH 8.0).
상기 활성측정용 조성물을 이용하면, 3,6-L-AHG 전환효소의 활성을 효과적으로 측정할 수 있다. 이에, 상기 활성측정용 조성물은 임의의 효소 추출액 내에 L-AHG 전환효소의 활성이 존재하는지 여부를 확인하고자 하는 경우에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 활성측정용 조성물을 효소 추출액에 첨가한 후 NADP+로부터 NADPH로의 환원이 발생했는지 여부를 통해 확인할 수 있다. Using the composition for activity measurement, the activity of 3,6-L-AHG converting enzyme can be effectively measured. Thus, the composition for activity measurement can be used when it is desired to determine whether the activity of L-AHG converting enzyme is present in any enzyme extract. For example, the composition for activity measurement may be added to the enzyme extract to determine whether reduction from NADP + to NADPH has occurred.
NADPH로의 환원을 관찰하는 방법은 특별히 제한되지 않으며 예를 들어, 분광학적 방법에 의해 339~340 nm의 파장에서 흡광도를 측정할 수 있다. 이 경우 상기 조성물에는 NADP+ 이외의 339~340 nm에서 흡수파장을 갖는 조효소(예를 들어, NADH) 등이 포함되지 않아야 한다.
The method of observing the reduction to NADPH is not particularly limited, and for example, the absorbance at a wavelength of 339 to 340 nm can be measured by a spectroscopic method. In this case, the composition should not contain a coenzyme (for example, NADH) having an absorption wavelength at 339 to 340 nm other than NADP + .
3,6-L-AHG 전환효소의 활성 측정방법Method for measuring activity of 3,6-L-AHG converting enzyme
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상술한 3,6-L-AHG 전환효소의 활성측정용 조성물을 이용한 3,6-L-AHG 전환효소의 활성 측정방법을 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for measuring the activity of 3,6-L-AHG converting enzyme using the composition for measuring activity of 3,6-L-AHG converting enzyme described above.
일 예에서, 측정방법은 임의의 효소 추출액과 상술한 3,6-L-AHG 전환효소의 활성측정용 조성물을 반응시키는 단계, 및 상기 반응에 의해 NADPH로 환원되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다. In one example, the measurement method includes the step of reacting any enzyme extract with the composition for measuring the activity of the 3,6-L-AHG converting enzyme described above, and determining whether or not it is reduced to NADPH by the reaction .
상기 NADPH로 환원되는지 여부는 339~340 nm에서의 흡광도를 측정할 수 있다. 여기서, NADPH로 환원되었다는 것은 3,6-L-AHG가 전환되었음을 의미하고, 따라서 3,6-L-AHG 전환효소의 활성이 있는 것으로 판단할 수 있다. Whether the NADPH is reduced or not can be determined by measuring the absorbance at 339 to 340 nm. Here, the reduction to NADPH means that 3,6-L-AHG is converted, and thus it can be judged that 3,6-L-AHG converting enzyme is active.
상기에서 단위시간 당 NADPH의 함량을 측정하는 경우 효소의 활성을 반응속도로서 측정할 수 있을 것이다.
In the above, when the content of NADPH per unit time is measured, the activity of the enzyme can be measured as a reaction rate.
3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물Composition for Quantitative Analysis of 3,6-L-AHG
현재 3,6-L-AHG의 분석은 정성적으로는 박막크로마토그래피와 분광분석법이 이용되고, 기타 액체크로마토그래피 등을 사용하여 정량분석하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 표준화된 방법은 존재하지 않으며 상기 방법들은 광학이성질체인 D형의 3,6-AHG를 구분하지 못한다는 문제점을 가지고 있다.At present, the analysis of 3,6-L-AHG is qualitatively performed using thin film chromatography and spectroscopic analysis, and it is known that quantitative analysis using other liquid chromatography or the like is known. However, there is no standardized method and these methods have the problem that they can not distinguish the D-
이에, 3,6-L-AHG 를 효과적으로 정량 할 수 있고, L형의 3,6-L-AHG 를 구별할 수 있는 정량분석용 조성물을 제공하고자 한다. Accordingly, a composition for quantitative analysis capable of effectively quantifying 3,6-L-AHG and distinguishing L-
일 예에서, 상기 정량분석용 조성물은 3,6-L-AHG의 전환효소를 함유한 활성분획, NADP+, 및 버퍼액을 포함한다. In one example, the composition for quantitative analysis comprises an active fraction containing 3,6-L-AHG converting enzyme, NADP + , and a buffer solution.
임의의 시료 내에 3,6-L-AHG 가 존재하는 경우, 3,6-L-AHG 전환효소에 의해 3,6-L-AHG 가 전환되고, 이 과정에서 NADP+가 NADPH로 환원된다. 이 때, 시료 내 3,6-L-AHG의 함량 변화율은 NADP의 함량 변화율에 비례한다. 즉, 하나의 NADP+가 NADPH로 전환되면서 3,6-L-AHG 하나를 전환시킨다. When 3,6-L-AHG is present in any sample, 3,6-L-AHG is converted by 3,6-L-AHG converting enzyme, and NADP + is reduced to NADPH in this process. At this time, the content change rate of 3,6-L-AHG in the sample is proportional to the content change rate of NADP. That is, one NADP + is converted to NADPH and converts one of 3,6-L-AHG.
여기서, 임의의 시료는 3,6-L-AHG의 존재 및 정량을 확인하고자 하는 대상 시료를 의미한다. Here, an arbitrary sample refers to a sample to be tested for the presence and quantification of 3,6-L-AHG.
따라서, 시료 내의 3,6-L-AHG를 정량 하고자 하는 경우, 본 발명의 예에 따른 정량분석용 조성물을 첨가하여 반응시킨 후 NADPH의 함량을 측정하면 된다. 상기 NADPH의 함량은 339~340 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 알 수 있다. Therefore, when 3,6-L-AHG in the sample is to be quantified, the content of NADPH may be measured after reacting with the composition for quantitative analysis according to the example of the present invention. The content of NADPH can be determined by measuring the absorbance at a wavelength of 339 to 340 nm.
이와 관련하여 도 1은 3,6-L-AHG의 함량(x축) 대비 NADPH의 함량(y축)을 나타낸 검정곡선(calibration curve)이다. 여기서, 339 nm에서의 흡광도(y축)가 NADPH의 함량을 의미한다. 따라서, 상기 3,6-L-AHG의 함량은 도 1에 도시된 검정곡선에서 339 nm에서의 흡광도(y축)에 대비하여 정량될 수 있다. 예를 들어, 임의의 시료에 상기 정량분석용 조성물을 반응시키면 3,6-L-AHG의 전환효소에 의해 시료 내 3,6-L-AHG의 함량 변화에 비례하여 NADPH가 생성된다. 이에, NADPH의 함량을 339 nm파장에서의 흡광도를 측정하여 구할 수 있다. 측정된 흡광도 값을 도 1의 y축 좌표에 대입하면 그에 대응하는 x축의 3,6-L-AHG의 함량이 구해질 수 있을 것이다. In this connection, FIG. 1 is a calibration curve showing the content (y-axis) of NADPH relative to the content of 3,6-L-AHG (x axis). Here, the absorbance at 339 nm (y-axis) means the content of NADPH. Thus, the content of 3,6-L-AHG can be quantified relative to the absorbance at 339 nm (y-axis) in the calibration curve shown in FIG. For example, when the composition for quantitative analysis is reacted with an arbitrary sample, NADPH is produced in proportion to the content of 3,6-L-AHG in the sample by the conversion enzyme of 3,6-L-AHG. Thus, the content of NADPH can be determined by measuring the absorbance at a wavelength of 339 nm. When the measured absorbance value is substituted into the y-axis coordinate in FIG. 1, the content of 3,6-L-AHG in the corresponding x-axis will be obtained.
상기 3,6-L-AHG의 전환효소를 함유한 활성분획은 특별히 제한되지 않으며, 3,6-L-AHG를 대사에 이용하는 다양한 균주로부터 얻어질 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명자들은 사카로파구스 데그라단스(Saccharophagus degradans)의 활성분획에 3,6-L-AHG의 전환효소가 존재함을 확인하였다. The active fraction containing the 3,6-L-AHG converting enzyme is not particularly limited and may be obtained from various strains using 3,6-L-AHG for metabolism. For example, the present inventors have confirmed the presence of 3,6-L-AHG converting enzyme in the active fraction of Saccharophagus degradans .
상기 사카로파구스 데그라단스(Saccharophagus degradans)의 활성분획을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않으며 공지의 효소 분획방법에 따라 수행될 수 있다. The method for obtaining the active fraction of Saccharophagus degradans is not particularly limited and may be carried out according to a known enzyme fractionation method.
예를 들어, 황산암모늄 분획법(염석), 유기용매침전법, pH처리법, 막분획법 등의 조분획; 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 또는 여과 크로마토그래피, 등의 크로마토그래피법, 및 SDS-PAGE법, 등전점 전기영동법, 이차원 전기영동법 등의 전기영동법 등을 들 수 있고, 이들 분획방법은 2종 이상 복합적으로 이용될 수 있다. For example, crude fraction such as ammonium sulfate fractionation (salting out), organic solvent precipitation, pH treatment, membrane fractionation and the like; Chromatography such as affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel or filtration chromatography, and electrophoresis such as SDS-PAGE, isoelectric point electrophoresis, and two-dimensional electrophoresis. More than two species can be used in combination.
도 2에는 사카로파구스 데그라단스로부터 3,6-L-AHG의 전환효소를 함유한 활성분획을 얻는 방법이 예시적으로 도시되어 있다. 도 2를 참조하면, 상기 활성분획은 사카로파구스 데그라단스 조추출액을 얻는 단계(S1), 조추출액에 황산암모늄((NH4)2SO4)을 0-50%의 포화도로 첨가하여 침전시키는 단계(S2), 침전에 의한 상등액에 황산암모늄((NH4)2SO4)을 50-70%의 포화도로 첨가하여 침전시키는 단계(S3), 및 침전에 의한 침전물에 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 분획하는 단계(S4)로 얻어질 수 있다. FIG. 2 exemplarily shows a method of obtaining an active fraction containing 3,6-L-AHG converting enzyme from Saccharophagus de Grondans. 2, the active fractions to afford a de gras par Goose thiooxidans crude extract was saccharide (S1), ammonium sulfate ((NH 4) 2 SO 4 ) the crude extract was added to the saturation of 0-50% in the supernatant by the step (S2), precipitated with ammonium sulfate precipitation ((NH 4) 2 SO 4 ) a step (S3) to precipitate by addition of a saturation degree of 50-70%, and anion exchange chromatography to precipitate by precipitation Photography (S4). ≪ / RTI >
이러한 방법으로 얻어진 활성분획은 비활성도(Specific activity)가 2.5 ~ 3.0일 수 있다. 효소의 활성을 나타내는 비활성도는 단백질 밀리그램 당 단위수(Unit)로 표현된다.
The active fraction obtained by this method may have a specific activity of 2.5 to 3.0. The degree of activity, which indicates the activity of the enzyme, is expressed in units per milligram of protein.
이하, 본 발명의 제조예 및 실험예에 따라 본 발명을 상술한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Preparation Examples and Experimental Examples of the present invention.
[제조예 1] 사카로파구스 데그라단스 조추출액[Manufacturing Example 1] Saccharophagus de Grassan crude extract
단일 콜로니로부터 배양한 10 ml의 사카로파구스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40 (이하 'sde')를 0.2% 한천이 포함된 1L의 최소배지에 넣고 30℃에서 24시간 동안 배양하여 4000rpm으로 30분간 원심분리하여 5g의 생균체를 확보하였다. 10 ml of Saccharophagus degradans 2-40 (hereinafter, referred to as 'sde') cultured from a single colony was added to a minimal medium of 1 L containing 0.2% agar, followed by culturing at 30 ° C for 24 hours, For 30 minutes to obtain 5 g of live cells.
생균체는 초음파 파쇄기(Sonifier 450, Branson, USA)를 사용하여 파쇄한 후, 4℃에서 15000rpm으로 1시간동안 원심분리하여 0.45㎛ 여과지(Sartorius stedim biotech, Germany)를 사용하여 여과하여 조추출액을 얻었다.
The cells were disrupted by using an ultrasonic wave crusher (Sonifier 450, Branson, USA), centrifuged at 15000 rpm for 1 hour at 4 ° C, and filtered using 0.45 μm filter paper (Sartorius stedim biotech, Germany) .
[제조예 1] 사카로파구스 데그라단스 조추출액의 분리정제[Preparation Example 1] Separation purification of saccharophagus degustan crude extract
제조예 1에서 얻은 조추출액을 황산암모늄((NH4)2SO4) 분획법을 사용하여 0-50% 포화도로 활성분획하였다. 그런 다음, 침전에 의한 상등액에 황산암모늄((NH4)2SO4)을 50-70%의 포화도로 활성분획하였다. 50-70%의 활성분획을 HiTrap™ Q 컬럼(GE healthcare, USA)을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피방법으로 다시 활성분획하였다. 최종 분획한 단백질의 활성은 표 1와 같다.
The crude extract solution obtained in Preparation Example 1 using an ammonium sulfate ((NH 4) 2 SO 4 ) Fractionation was active fractions in 0-50% saturation. Then, ammonium sulfate ((NH 4) 2 SO 4 ) the supernatant was precipitated by the active fraction by 50-70% saturation. 50-70% of the active fractions were again active fractions by anion exchange chromatography using a HiTrap (TM) Q column (GE healthcare, USA). The activity of the final fractionated protein is shown in Table 1.
[표 1] 사카로파구스 데그라단스 2-40조추출액으로부터의 분리정제[Table 1] Saccharophagus degustadens 2-40 Separation from extracts Purification
[실시예 1] 3,6-L-AHG 전환효소의 활성측정용 조성물의 제조[Example 1] Preparation of composition for measuring activity of 3,6-L-AHG converting enzyme
5mM의 NADP+, 20 ㎍ 의 3,6-L-AHG, 및 20mM의 Tris-HCl(pH 8.0) 버퍼액을 혼합하여 100 ㅅl의 활성측정용 조성물을 제조한다.
100 μl of the active composition for measurement is prepared by mixing 5 mM NADP + , 20 μg of 3,6-L-AHG, and 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer solution.
[실험예 1] 사카로파구스 데그라단스 조추출액의 분리정제 단계별 효소활성 측정[Experimental Example 1] Separation and purification of saccharophagus degustan crude extract
사카로파구스 데그라단스 조추출액의 분리정제 단계별로 3,6-L-AHG의 전환효소의 활성을 측정한다. 이를 위해 실시예 1에 따라 제조된 활성측정용 조성물에 제조예 1에 따른 조추출액, 제조예 2에서 50-70%(NH4)2SO4 처리 후의 활성분획, 및 음이온교환 크로마토그래피 후의 활성분획을 각각 10 ㎕씩 첨가한다. 그런 다음, NADPH의 함량을 측정하기 위해, 339nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 스펙트로포토미터(microplate spectrophotometer, Bio-Tek Instruments, Inc.)를 사용하여 End-point UV법에 따라 시간대 별로 측정하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. Separation of Saccharophagus degustacean Extract The activity of 3,6-L-AHG converting enzyme is measured by the purification step. To this end, the crude extract according to Preparation Example 1, the active fraction after 50-70% (NH 4 ) 2 SO 4 treatment in Preparation Example 2, and the active fraction after anion exchange chromatography 10 μl each. Then, in order to measure the content of NADPH, the absorbance at 339 nm was measured by a microplate spectrophotometer (Bio-Tek Instruments, Inc.) according to the end-point UV method at the time of day, Is shown in Fig.
도 3을 참조하면, 조추출액, 황산암모늄 처리 후의 활성분획, 및 음이온교환 크로마토그래피 처리한 후의 활성분획 모두에서 NADPH 환원이 이루어졌음을 확인할 수 있다.
Referring to Figure 3, it can be seen that NADPH reduction was achieved in both the crude extract, the ammonium sulfate treated active fraction, and the active fraction after anion exchange chromatography.
[비교실험예 1][Comparative Experimental Example 1]
실시예 1에서, 조효소로서 NADP+ 대신에 NAD+, NADH, NADPH 를 각각 첨가한다. 각각의 조성물에 대해 실시예 1에 따라 제조된 활성측정용 조성물에 제조예 2에서 최종 수득한 활성분획 10 ㎕ 첨가한다. 그런 다음, NADPH의 환원을 339nm에서의 흡광도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. In Example 1, NAD + , NADH, and NADPH were added, respectively, instead of NADP + as a coenzyme. For each composition, 10 μl of the active fraction obtained in Production Example 2 is added to the active measuring composition prepared according to Example 1. Then, the absorbance at 339 nm of NADPH reduction was measured, and the results are shown in Table 2 below.
표 2를 참조하면, NADP+를 제외한 조효소에 대해서는 3,6-L-AHG의 전환효소의 활성이 없음을 알 수 있다.
Referring to Table 2, it can be seen that the conversion enzyme of 3,6-L-AHG is not active for the coenzyme except for NADP + .
[표 2] 흡광도(ΔA339)에 의한 효소활성에 대한 조효소의 효과 [Table 2] Effect of coenzyme on enzyme activity by absorbance (? A 339 )
[실시예 2] 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물 [Example 2] Composition for quantitative analysis of 3,6-L-AHG
제조예 2에서 얻은 최종 활성분획 7.5 ㎕, 0.1 mM의 NADP+, 및 50mM의 Tris-HCl(pH 8.0)를 혼합하여 100 ㎕의 정량분석용 조성물을 제조한다.
7.5 μl of the final active fraction obtained in Production Example 2, 0.1 mM of NADP + , and 50 mM of Tris-HCl (pH 8.0) were mixed to prepare 100 μl of a composition for quantitative analysis.
[실험예 2][Experimental Example 2]
실시예 2에서 얻은 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물에 3,6-L-AHG를 상대적 농도(Relative concentration)로서 1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05 의 희석배율(dilution factor) 로 첨가한다. 50분 동안 반응을 수행한 후 마이크로플레이트 스펙트로포토미터(Bio-Tek Instruments, Inc.)를 사용하여 End-point UV법에 따라 339nm에서의 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 3,6-L-AHG was added to the composition for quantitative analysis of 3,6-L-AHG obtained in Example 2 as a relative concentration at a dilution factor of 1, 0.5, 0.25, 0.1, and 0.05 . After the reaction was performed for 50 minutes, the absorbance at 339 nm was measured by End-point UV method using a microplate spectrophotometer (Bio-Tek Instruments, Inc.), and the results are shown in FIG.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.Those skilled in the art will appreciate that various modifications, additions and substitutions are possible, without departing from the scope and spirit of the invention as disclosed in the accompanying claims.
Claims (10)
상기 반응에 의해 NADPH로 환원되는지 여부를 측정하는 단계;를 포함하는 효소 추출액 중의 3,6-L-AHG 전환효소의 활성 측정방법. Reacting an arbitrary enzyme extract with a composition for measuring activity of the 3,6-L-AHG converting enzyme according to claim 1; And
Measuring the activity of the 3,6-L-AHG converting enzyme in the enzyme extract comprising measuring whether or not it is reduced to NADPH by the reaction.
상기 NADPH로 환원되는지 여부는 339~340 nm 파장에서 흡광도를 측정하는, 측정방법. 3. The method of claim 2,
Wherein the absorbance of the NADPH is measured at a wavelength of 339 to 340 nm.
임의의 시료 내 3,6-L-AHG의 함량은 상기 NADP+로부터 환원된 NADPH의 함량에 비례하는, 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물. 5. The method of claim 4,
A composition for quantitative analysis of 3,6-L-AHG wherein the content of 3,6-L-AHG in any sample is proportional to the content of NADPH reduced from the NADP + .
상기 NADPH의 함량은 339~340 nm 파장에서의 흡광도로 측정하는, 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물.6. The method of claim 5,
The composition for quantitative analysis of 3,6-L-AHG wherein the content of NADPH is measured by absorbance at a wavelength of 339 to 340 nm.
상기 3,6-L-AHG는 하기 식 1의 검정곡선(calibration curve)에서 339 nm파장에서의 흡광도(y축)에 대비하여 정량되는, 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물.
[식 1]
y=0.0743x + 0.0314
상기 식에서 x는 3,6-L-AHG이고, y는 339 nm파장에서의 흡광도이다.The method according to claim 6,
Wherein the 3,6-L-AHG is quantified relative to the absorbance (y-axis) at a wavelength of 339 nm in a calibration curve of formula 1 below.
[Formula 1]
y = 0.0743x + 0.0314
Where x is 3,6-L-AHG and y is the absorbance at a wavelength of 339 nm.
상기 3,6-L-AHG의 전환효소를 함유한 활성분획은 사카로파구스 데그라단스(Saccharophagus degradans)로부터 유래한, 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물. 5. The method of claim 4,
The active fraction containing the 3,6-L-AHG converting enzyme is derived from Saccharophagus degradans , and is a composition for quantitative analysis of 3,6-L-AHG.
사카로파구스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 조추출액을 얻는 단계;
조추출액에 황산암모늄((NH4)2SO4)을 0-50%의 포화도로 첨가하여 침전시키는 단계;
침전에 의한 상등액에 황산암모늄((NH4)2SO4)을 50-70%의 포화도로 첨가하여 침전시키는 단계; 및
침전에 의한 침전물에 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 분획하는 단계; 를 통해 얻어지는, 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물.9. The method of claim 8,
Obtaining a crude extract of Saccharophagus degradans ;
Adding ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) to the crude extract at a degree of saturation of 0 to 50% to precipitate;
Adding ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) to the supernatant by precipitation at a degree of saturation of 50-70%; And
Fractionating the precipitate by precipitation through anion exchange chromatography; Wherein the composition comprises 3,6-L-AHG.
상기 최종 얻어진 활성분획의 비활성도(Specific activity)는 2.5 ~ 3.0인, 3,6-L-AHG의 정량분석용 조성물.
10. The method of claim 9,
A composition for quantitative analysis of 3,6-L-AHG wherein the final activity fraction has a specific activity of 2.5 to 3.0.
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