KR101740034B1 - 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 산화환원 시약 조성물, 및 상기시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 베타-히드록시부틸레이트 검출을 산화환원반응의 시약 조성물, 및 상기 시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.

Description

베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 산화환원 시약 조성물, 및 상기시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서{Reagent composition of Redox reaction for detecting beta-hydroxybutyrate and electrochemical biosensor including the reagent composition}
본 발명은 베타-히드록시부틸레이트 검출을 산화환원반응의 시약 조성물, 및 상기 시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.
당뇨관리에 있어 혈당의 주기적인 측정은 매우 중요하다. 최근 정확성과 정밀도가 향상된 자가혈당 측정장치의 사용이 증가하고 있어 개인이 쉽고 빠르게 혈당 관리가 가능하다.　 이와 더불어, 최근 제 1형 당뇨병 환자와 고혈당을 가지는 당뇨병 환자들은 주기적으로 혈당을 측정함과 동시에 혈중 케톤체(ketone body)를 측정하여 당뇨병성 케톤산증(Diabetic Ketoacidosis)을 예방하도록 권장하고 있다.
당뇨병성 케톤산증은 인슐린에 대한 저항이나 인슐린 부재로 인해 발생한다. 인슐린이 적으면 포도당이 세포 내로 들어갈 수 없어 혈중에 축적된다.　 그 결과 세포는 포도당을 공급받지 못하여 에너지원으로 지방을 사용하게 된다.　 지방대사는 지방산과 글리세롤을 만드는데, 글리세롤은 세포에 약간의 에너지를 공급하지만 지방산은 케톤산으로 대사되어 결과적으로 산독증을 일으킨다.　 산독증은 세포 안에서 혈관 내로 칼륨 이동을 증가시키게 되고, 이뇨작용에 의하여 과칼륨뇨증을 초래하여 전신의 칼륨 고갈상태를 초래한다.
지방을 연소하는 과정에서 생성되는 케톤체는 베타-히드록시부티르산(β-hydroxybutyrate), 아세토아세트산(acetoacetate) 및 아세톤(acetone)이 있는데, 종래 케톤체를 측정하는 방식은 뇨의 아세토아세트산(acetoacetate)의 양을 측정하는 방식이 사용되고 있다.　 그러나 뇨의 아세토아세트산은 시간이 경과할수록 그 농도가 변하게 되어 샘플 채취 후, 측정 시기에 따라 다른 결과 값을 나타낼 수 있는 단점을 가진다.
혈액 중 케톤산증의 주요 원인인 베타-히드록시부티르산 또는 베타-히드록시부틸레이트를 측정하는 경우에는 검사시점의 몸상태를 그대로 반영하기 때문에 자가 모니터링을 통해 몸상태를 확인하는데 매우 유용하다. 하지만 케톤체는 대부분의 사람들이 체내에 소량 존재하기 때문에 저농도의 케톤 측정이 가능하도록 센서의 민감도가 높아야 하고, 케톤체 측정은 대체로 1형 당뇨환자나 고혈당 환자 등의 몸에 이상이 있는 환자가 사용하기 때문에 이러한 환자들의 혈액내 혈구용적률이 정상범위를 벗어나서 존재하는 경우가 많다.
따라서 바이오센서의 제작에 있어서 대표적인 내인성 방해작용을 하는 혈구용적률 차이에 의해 발생하는 정량의 부정확성을 개선하여 정확한 측정이 가능하고, 혈액에서 케톤체를 보다 쉽고 빠르게 현장에서 측정하기 위한 휴대용 바이오센서의 필요성이 증가하고 있다.
본 발명은 미량의 베타-히드록시부틸레이트를 측정 가능하도록 민감도를 개선하고, 케톤 바디 측정에서 대표적 내인성 방해 요소인 혈구용적률 차이에 의한 측정 오차를 개선하여 의료현장에서 쉽고 빠르게 베타-히드록시부틸레이트 측정 가능한, 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 산화환원반응의 시약 조성물, 및 상기 시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공하고자 한다.
본 발명은 히드록시부틸레이트 탈수소효소 및 디아포레이즈를 포함하는 효소 성분과, 조효소 및 전자전달매개체로 루테늄 착물을 포함하는 화합물 성분을 포함하는 베타-히드록시부틸레이트의 정량용 산화환원반응 시약 조성물 및 상기 시약 조성물을 작동전극에 적용한 전기화학적 바이오센서, 예를 들면 스트립에 관한 것이다.
본 발명의 시약 조성물은 케톤 바디, 히드록시부틸레이트(hydroxybutyrate) 또는 히드록시부틸산(hydroxybutyric acid)의 정량에 사용될 수 있다.
본 발명의 일예는 히드록시부틸레이트 탈수소효소 및 디아포레이즈를 포함하는 효소 성분과, 조효소 및 전자전달매개체로 루테늄 착물을 포함하는 화합물 성분을 포함하는 베타-히드록시부틸레이트의 정량용 산화환원반응 시약 조성물로서, 상기 시약 조성물은 시료내 베타-히드록시부틸레이트 농도 0~10mmol/L범위에서 r2이 0.95 이상인, 베타-히드록시부틸레이트의 정량용 산화환원반응 시약 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 시약 조성물은 베타-히드록시부틸레이트 농도 0~10mmol/L범위에서 우수한 선형성을 가지며, 이에 따라 베타-히드록시부틸레이트 농도가 높은 범위에서도 정확도를 담보할 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는, 상기 시약 조성물이 적용된 베타-히드록시부틸레이트의 측정용 바이오센서는 바탕 전류값 0.2uA 이하, 예를 들면 0.001 내지 0.2uA 범위인 것이다.
상기 시약 조성물의 효소성분은 1,000 내지 10,000 유니트(UNIT)를 포함할 수 있다. 또한 상기 시약 조성물에 포함된 효소인 히드록시부틸레이트 탈수소효소 및 디아포레이즈의 혼합 유니트 비율은 히드록시부틸레이트 탈수소효소 1,000 유니트를 기준으로 디아포레이즈 100 내지 990 유니트일 수 있으며, 바람직하게는 디아포레이즈는 100 내지 500 유니트일 수 있다. 본원 발명은 히드록시부틸레이트 탈수소효소 및 디아포레이즈를 적정 혼합비로 사용하므로서, 전기화학적 바이오센서의 안정성 및 민감도를 개선할 수 있다.
본 발명에 따른 시약 조성물은 상기 히드록시부틸레이트 탈수소효소 1,000 유니트을 기준으로, 루테늄 착물 40 내지 60 중량부로 포함할 수 있으며, 추가로 계면활성제, 수용성 고분자, 당화합물 및 FMN 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 루테늄 착물, 조효소, 계면활성제, 수용성 고분자, 당화합물 및 FMN를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 시약 조성물의 일예는, 상기 히드록시부틸레이트 탈수소효소 1,000 유니트을 기준으로, 루테늄 착물 40 내지 60 중량부, 조효소 10 내지 100 중량부, 계면활성제 1 내지 10 중량부, 수용성 고분자 0.1 내지 100 중량부, 당화합물 1 내지 100 중량부 및 FMN 0.1 내지 10 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 시약 조성물을 사용하여 전기화학적 반응 신호를 증폭시킬 수 있으며 산화환원효소 및 조효소와의 높은 반응 안정성을 가지는 베타히드록시부틸레이트 측정용 전기화학적 바이오센서용 산화환원 반응 시약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 산화환원용 시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것으로서, 산화환원효소, 디아포레이즈, 조효소 및 전자전달매개체를 포함하되, 전자전달매개체인 금속함유 착물로 헥사아민루세늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3)를 사용하여, 전자의 전달이 용이하고 바탕신호가 작고 산화환원 안정성이 우수하며 측정정확도가 우수한 전기화학적 바이오센서를 제공한다.
본 발명에 따른 산화환원반응 시약 조성물에 있어서, 산화환원효소는 측정하고자 하는 다양한 대사물질과 반응하여 환원되고, 다시 환원된 효소와 조효소가 반응하여 환원된 조효소를 생성하고, 환원된 조효소와 디아포레이즈가 반응하여 환원된 디아포레이즈를 생성하는데, 환원된 디아포레이즈와 전자전달매개체가 반응하여 발생하는 전기신호 크기에 의해 대사물질을 정량하게 된다.
본 발명은 베타-히드록시부틸레이트를 정량하는 바이오센서를 실시예로 설명하지만, 정량하고자 하는 대사물질에 상응하는 특정효소에 알맞은 전자전달매개체를 도입함으로써 다양한 대사물질, 예를 들면 글루코스, 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 과산화수소, 알코올, 아미노산, 글루타메이트 등과 같은 유기물 또는 무기물도 정량할 수 있다.　
따라서, 본 발명은 시약조성물에 포함되는 산환환원효소의 종류를 측정하고자 하는 대사물질에 따라 달리함으로써, 다양한 대사물질의 정량에 이용될 수 있다.
산화환원효소는 조효소(cofactor) 및 디아포레이즈와 함께 사용되는데, 산환환원효소는 대사물질로부터 수소를 뺏어와 대사물질을 산화시키는 탈수소화 기능을 수행하며, 조효소는 다시 환원된 산화환원효소로부터 수소를 뺏어와 환원된 산화환원효소를 산화시키는 탈수소화 기능을 수행한다. 그리고 디아포레이즈는 다시 환원된 조효소로부터 수소를 뺏어와 환원된 조효소를 산화시키는 탈수소화 기능을 수행한다. 조효소로는 NAD(nicotinamide adenine dinucleotide), NADP(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)을 사용할 수 있고, 디아포레이즈는 NADH dehydrogenase(dihydronicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase), NADPH dehydrogenase(dihydronicotinamide adenine dinucleotide phosphate dehydrogenase)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 시약 조성물에서, 전자전달매개체는 대사물질로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 최종적으로 보관중인 디아포레이즈와 산화환원 반응하여 환원되게 되며, 이렇게 형성된 환원상태의 전자전달매개체는 산화 전위가 인가된 전극표면에서 전류를 발생시키는 역할을 수행한다.
전자전달매개체에서, 금속함유 착물로는 루테늄 착물(ruthenium complex) 을 사용할 수 있다.　 여기서 루테늄 착물로는 Ru(NH3)6Cl3, [Ru(2,2',2''-terpyridine)(1,10-phenanthroline)(OH2)]2+,trans-[Ru(2,2'bipyridine)2(OH2)(OH)]2+, [(2,2'-bipyridine)2(OH)RuORu(OH)(2,2◎py)2]4+ 및 [Ru(4,4'-bipyridine)(NH3)5]2+ 등을 사용할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 루테늄 착물로 헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3)를 사용하는데, 헥사아민루테늄클로라이드는 수용액에서 산화 상태가 안정하며 가역적이고, 환원된 전자전달매개체의 산화가 pH에 민감하지 않으며, 전기화학적 방해물질인 아세트아미노펜(acetaminophene), 아스코빅산(ascorbic acid), 빌리루빈(Bilirubin), 도파민(Dopamine), 요산(Uric acid), 겐티신산(gentisic acid) 등과 거의 반응하지 않는 특성이 있다.
본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약 조성물은 산화환원효소 1,000 Unit를 기준으로 디아포레이즈 100~990Unit, 산화환원효소 1,000 Unit를 기준으로 조효소 10~100 중량부, 금속함유 착물 10~90 중량부를 함유하는 것이 바람직하다.　예를 들면, 디아포레이즈와 금속함유 착물을 상기 범위보다 적게 사용시 고농도의 베타-히드록시부틸레이트를 측정할 때 측정신호가 낮게 나타날 수 있고, 디아포레이즈와 금속함유 착물을 과량 사용시 시약 조성물이 모두 녹지 않고 부유물이 생기거나, 제작 완료된 스트립의 반응 챔버에 샘플이 주입 되었을 때 시약이 빨리 녹지 않는 문제가 있을 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 시약 조성물의 화합물 성분은 추가로 계면활성제, 수용성 고분자, 당화합물 및 FMN 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X-100(Triton X-100), 소듐도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트(perfluorooctane sulfonate), 소듐스테아레이트(sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 적절하게 수행하도록 하기 위하여, 상기 계면활성제를 산화환원효소 1000Unit 기준으로 1 내지 10 중량부의 양으로 함유할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 시약조성물의 고분자 지지체로서 산화환원효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 수행한다.　 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리플루오로설포네이트(perfluoro sulfonate), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 하이드록시에틸셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리아미드(polyamide) 등을 사용할 수 있다.　 본 발명에 따른 시약 조성물은, 산화환원효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 충분하고 적절하게 발휘하도록 하기 위하여, 본 발명에 따른 시약 조성물은 산화환원효소 1000 유니트 기준으로 수용성 고분자 0.1-100 중량부를 함유할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 지지체 및 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역학을 효과적으로 수행하기 위하여 중량평균분자량이 2,500 내지 3,000,000 정도, 예컨대, 5,000 내지 1,000,000 정도일 수 있다.
한편, 첨가제 중 당화합물은 효소의 안정화를 돕는 역할을 수행한다.　 당화합물로는 글루코오즈, 수크로오즈, 락토오즈, 프룩토오즈, 솔비톨, 라피노오즈, 트레할로오즈(Trehalose) 등을 사용할 수 있다.　 본 발명에 따른 시약 조성물은 산화환원효소 1000Unit 기준으로 당화합물은 1-100 중량부를 함유하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 시약 조성물이 포함된 전기화학적 바이오센서를 제공한다. 이러한 전기화학적 바이오센서(종종 "스트립"으로 칭함)에는 모세관 구조의 시료셀에 효소와 전자전달매개체 및 각종 안정제와 분산제를 포함하는 시약이 코팅되어 있는 한 쌍의 전극(작동전극과 보조전극)이 배치되어 있다.
사용자의 혈액이 상기 전기화학적 바이오센서의 시료셀에 채워지고 휴대용 측정장치에 장착되면, 작동전극으로 일정전압이 인가되고 거기에서 얻어지는 전류가 측정되며, 프로그램된 알고리즘에 따라 계산된 분석대상물질의 농도 값이 수 초에서 수 분 사이에 상기 휴대용 측정장치의 화면에 나타난다.
일 구현예에서, 전기화학적 바이오센서에 있어서 작동전극 및 보조전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다(도 2 참조).
또 다른 구현예에서, 전기화학적 바이오센서에 있어서, 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 것을 특징으로 하는 대면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다 (도 3 참조).
상기 바이오센서에 있어서 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 형태는 특별한 제한이 없으며, 구체적으로 작동전극 표면에 코팅된 형태로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서는, 예컨대 대한민국 특허공개 제10-2004-0105429호, 대한민국 특허공개 제10-2006-0089464호, 대한민국 특허등록 제0854389호, 대한민국 특허공개 제10-2008-0080841호, 대한민국 특허공개 제10-2008-0084030호, 대한민국 특허공개 제10-2008-0088028호 등에 공지된 방법을 통해 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 평면형 또는 대면형 전기화학적 바이오센서를 도 2 및 도 3를 참조하여 설명한다.
먼저, 본 발명에 따른 평면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 한 평면상에 구비되는 것으로, 도 2을 참고로 보다 구체적으로 살펴보면 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부(10)를 구비한 상판(11)과, 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하며 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판(9)과, 하기 작동 전극(2)에 코팅되는 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물(8)와, 하기 작동전극(2)과 보조전극(3)의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판(7)과, 작동전극(2)과 보조전극(3)이 프린팅 형성되는 하판(1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다.
다음으로, 도 3를 참고로 본 발명에 따른 대면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 서로 다른 평면상에 대면하도록 구비되는 것으로, 도 3를 참고로 보다 구체적으로 살펴보면 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부(10)를 구비하는 상판(11)과, 상판(11)에 프린트되는 보조전극(3)과, 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상판(11)과 하기 하판(1)을 접착하는 역할을 하고 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판(9)과, 하기 작동전극(2)에 코팅되는 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물(8)과, 하기 작동전극(2)과 보조전극(3)의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판(7)과, 보조전극(3)과 하기 보조전극의 리드(4)를 연결하는 회로연결접지(5)와, 하판(1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다.　 여기서 작동전극(2), 보조전극의 리드(4) 및 혈액이 들어오는 속도를 측정하기 위한 유동감지전극(6)는 하판(1)에 프린팅되어 형성된다.
본 발명에 따른 바이오센서, 예를 들면 스트립은, 스트립의 시료 주입부에 혈구를 걸러줄 수 있는 혈구 거름 구조물을 추가로 포함하여, 전극 표면에서 혈구의 양을 균일하게 유지하여 혈구의 용적률 차이에 의한 신호 영향을 최소화할 수 있다. 상기 혈구 거름 구조물의 예로는, 다공성 필름, 다공성 종이 또는 망사 구조물일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소 및 디아포레이즈, 조효소(NAD(P), nicotinamideadeninedinucleotide(phosphate))와 전자전달매개체로는 금속함유 착물인 헥사아민루세늄클로라이드를 포함하는, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 측정 시스템은 바탕신호가 작고, 일정하게 유지되는 특성을 가진다.
그리고 신호 분석 기술을 적용하여 혈구 용적률 차이에 의한 신호차이를 보정하여 정확성을 개선할 수 있다. 따라서 당뇨병성 케톤산증의 주요 케톤체인 혈액 내 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 전기화학적 바이오센서 측정 시스템의 제조에 유용할 수 있다.
본 발명의 일예에서는, 상기 산화환원용 시약 조성물을 적용한 전기화학적 바이오센서를 이용한 베타-히드록시부틸레이트의 정량방법에 관한 것이다.
구체적인 일예에서, 본 발명은 시료 주입부, 작동전극 및 보조전극을 구비하고, 본 발명에 따른 시약 조성물이 상기 작동전극 위에 포함된 베타-히드록시부틸레이트의 정량을 위한 전기화학적 바이오센서의 시료 주입부에 액상 시료를 주입하고,
베타-히드록시부틸레이트의 산화환원 반응을 개시하고 전자전달 반응을 진행시킬 수 있도록 상기 작동전극에 일정직류 전압을 인가하여 감응전류를 얻고,
상기 얻어진 감응전류를 이용하여 혈액내 베타-히드록시부틸레이트의 농도를 얻는 단계를 포함하는, 액상 시료내 베타-히드록시부틸레이트를 정량하는 방법에 관한 것이다.
상기 바이오센서에 액상 시료가 주입되었을 때 교류 또는 직류 전압을 조합하여 신호를 보내고, 바이오센서의 작동전극과 보조전극 사이에서 일어나는 산화환원 신호를 수집하고 조합하여 혈구의 용적률 차이에 의한 신호 영향을 최소화하는 방법이다.
상기 상기 감응전류를 얻고, 상기 얻어진 감응전류를 이용하여 혈액내 베타-히드록시부틸레이트의 농도를 얻는 단계는,
상기 베타-히드록시부틸레이트의 산화환원 반응을 개시하고 전자전달 반응을 진행시킬 수 있도록 상기 작동전극에 일정직류 전압을 인가하여 적어도 일 시점 이상의 특징점에서 제 1 감응전류를 얻는 단계와,
상기 일정직류 전압을 인가후 Λ모양의 계단화된 사다리형 섭동전압을 인가하여 적어도 2 시점 이상에서 제 2 감응전류를 얻는 단계와,
상기 제 1 감응전류 또는 상기 제 2 감응전류로부터 미리 정해진 피쳐(feature)를 계산하는 단계와,
상기 액상 시료 내 적어도 1 이상의 방해물질의 영향이 최소가 되게 적어도 1 이상의 피쳐(feature)함수로 구성된 검정식을 사용하여 상기 베타-히드록시부틸레이트의 농도를 계산하여 수행할 수 있다.
상기 Λ모양의 계단화된 사다리형 섭동전압의 특징은 각 계단의 높이(Vstep), 각 계단의 인가시간(tstep), 전체 변화 범위에서의 중간전압과 일정전압과의 차이(Vcenter), 중간전압과 봉우리 전압 값과의 차이(Vpeak), 전체 계단화된 사다리형파의 봉우리 전압 값과 인접한 다음 계단화된 사다리형파의 봉우리 전압 값과의 시간차(tcycle)로 이루어질 수 있다.
상기 계단화된 사다리형 전압은 하나의 계단의 높이(Vstep)가 0.5 내지 20 mV이고, 상기 하나의 계단의 지속시간(tstep)이 0.001 내지 0.1 초 이며, 상기 계단화된 사다리형 전압의 중심전압과 상기 일정직류 전압과의 차이 (Vcenter)가 -150 내지 150 mV 이며, 상기 계단화된 사다리형 전압의 중심전압과 봉우리 또는 골 전압과의 차이 (Vpeak) 가 5 내지 150 mV이며, 상기 계단화된 사다리형 전압의 주기 또는 하나의 봉우리와 인접한 다른 하나의 봉우리 사이의 시간 간격 (tcycle)이 0.01 내지 1 초 범위 내의 값일 수 있다.
상기 제 2 감응전류는 제 1 감응전류를 얻은 후 0.1 내지 1 초이내에 얻어지는 것일 수 있다.
상기 일정직류 전압과 상기 Λ모양의 계단화된 사다리형 섭동전압은 마이크로컨트롤러에 연동하는 동일한 디지털-아날로그컨버터 회로를 통해서 상기 작동전극에 인가되도록 구성될 수 있다.
상기 일정직류 전압은 0 - 800 mV의 범위의 전압으로, 1초 이상 1분 이내의 시간 동안 지속적으로 또는 간헐적으로 인가되고, 상기 제 1 감응전류는 상기 일정직류 전압이 인가되는 동안 1회 또는 수회 측정할 수 있다.
상기 피쳐 함수는 상기 일정직류 전류에서 얻은 감응전류값을 사용하는 함수, 상기 계단화된 사다리형 전압에서 얻은 감응전류값을 사용하는 함수, 상기 피쳐 함수는 측정장치에서 측정한 온도값을 사용하는 함수, 측정된 감응전류값을 사칙연산, 지수, 로그, 삼각함수 등의 수학적 함수로 표현하여 얻을 수 있는 함수일 수 있다.
상기 검정식은,
Figure 112015070402384-pat00001
,
Figure 112015070402384-pat00002
,
Figure 112015070402384-pat00003
중 하나이며
여기서 i는 제 1감응전류 및 제 2감응전류에서 얻을 수 있는 1 이상의 전류값이고, T는 독립적으로 측정한 온도값일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 휴대용 측정장치는, 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 물질에 따른 효소 및 전자전달매체를 포함한 시약조성물이 코팅된 대면형 전기화학적 바이오센서가 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 휴대용 측정장치는, 작동전극 및 보조전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 작동전극 위에 물질에 따른 효소 및 전자전달매체를 포함한 시약조성물이 코팅된 평면형 전기화학적 바이오센서가 적용될 수 있다.
도 10 내지 도 13를 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법 및 측정장치에 대하여 상세히 설명한다.
도 10과 도 11은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 사용된 Λ-계단화된 사다리형 섭동전압 (Λ-stepladder-type perturbation potential)과 이에 대응하여 얻어지는 감응전류를 나타내는 그래프이고, 도 13은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 사용된 Λ-계단화된 사다리형 섭동전압의 구조를 설명하기 위한 그래프이며, 도 13은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 의한 검정식이 저장된 측정장치의 전후방 사시도이다.
도 10에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료내 분석대상물질의 농도측정방법에 있어서, 계단화된 사다리형 섭동전압은 일정전압(VDC)이 인가된 후에 연이어 인가된다. 이에 따라 감응전류가 측정된다.
도 12에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료내 분석대상물질의 농도측정방법에 사용된 섭동전압은 계단화된 사다리형파로 구성되며, 섭동전압의 특징은 각 계단의 높이(Vstep), 각 계단의 인가시간(tstep), 전체 변화 범위에서의 중간전압과 일정전압과의 차이(Vcenter), 중간전압과 봉우리 전압 값과의 차이(Vpeak), 전체 계단화된 사다리형파의 봉우리 전압 값과 인접한 다음 계단화된 사다리형파의 봉우리 전압 값과의 시간차(tcycle)로 이루어져 있으며, 다음의 표 1에 나타낸 범위를 갖는다.
계단화된 사다리형파의 범위를 나타내는 표 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐이며, 응용에 따라 다양하게 변형할 수 있다.
항목 최저값 적정값 최고값
Vstep 0.5 mV 1 ~ 10 mV 20 mV
tstep 0.001 sec 0.01 ~ 0.05 sec 0.1 sec
VDC 50 mV 150 ~ 300 mV 800 mV
Vcenter -150 mV -100 ~ 100 mV 150 mV
Vpeak 5 mV 12 ~ 60 mV 150 mV
tcycle 0.01 sec 0.05 ~ 0.2 sec 1 sec
본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료내 분석대상물질의 농도측정방법에 있어서, 상기 분석대상물질의 농도 결정을 위해 사용되는 전류값들은 제 1 또는 2 감응전류의 한 계단 또는 복수의 계단에서 얻을 수 있는 점들이다.
도 13에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료내 분석대상물질의 농도측정장치(100)는 기존의 전기화학적 바이오센서, 즉 스트립(10)의 한 쌍의 작동전극과 보조전극의 구조를 그대로 유지하면서, 전위를 변화시키는 섭동전압을 인가함으로써, 수초 이내, 바람직하게는 0.1 내지 1초 이내에 보정을 위한 추가 신호를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 베타-히드록시부틸레이트 측정 시스템은 다음과 같은 다양한 효과를 가진다.
첫째, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서는 바탕신호가 작고, 산화환원 안정성이 우수하며 낮은 농도의 베타-히드록시부틸레이트도 정확히 측정할 수 있는 우수한 성능의 전기화학적 바이오센서를 제작할 수 있다.
둘째, 본 발명에 따른 신호분석기술을 적용한 전기화학적 바이오센서는 헤마토크릿 용적율 차이에 의한 신호차이를 보정하여 검출 정확도를 향상시킨 전기화학적 바이오센서를 제작할 수 있다.
셋째, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 베타-히드록시부틸레이트 측정 시스템은 현장에서 샘플의 특별한 가공 없이 짧은 시간내에 베타-히드록시부틸레이트를 정량할 수 있는 전기화학적 바이오센서용 측정 시스템을 제작할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 전기화학적 바이오센서의 외형을 나타낸 도면이다.
도 2은 본 발명의 실시예에 따른 평면형 전기화학적 바이오센서의 분해 사시도이다.
도 3는 본 발명의 실시예에 따른 대면형 전기화학적 바이오센서의 분해 사시도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따른 평면형 전기화학적 바이오센서로 다양한 농도의 베타-히드록시부틸레이트 시료를 측정한 전류의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 비교예 4에 따른 평면형 바이오센서를 50도 오븐에 보관하여 가속시킨 후 오븐 보관시간 경과에 따라서 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 신호의 변화를 측정한 그래프이다.
도 6는 비교예 3에 따른 평면형 바이오센서를 50도 오븐에 보관하여 가속시킨 후 오븐 보관시간 경과에 따라서 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우 나타나는 전류 변화의 측정값을 나타내는 그래프이다.
도 7는 본 발명에 따른 실시예 2의 평면형 바이오센서를 이용한 베타-히드록시부틸레이트 농도와 헤마토크릿을 달리한 시료를 적용하였을 경우 나타나는 전류 변화의 측정값을 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예 2에 따른 평면형 바이오센서를 베타-히드록시부틸레이트 농도와 헤마토크릿을 달리한 시료를 적용하여 신호를 측정하고, 측정된 신호를 신호 처리 기술을 사용하지 않았을 경우 나타나는 신호의 변화를 측정한 그래프이다.
도 9는 실시예 2에 따른 평면형 바이오센서를 베타-히드록시부틸레이트 농도와 헤마토크릿을 달리한 시료를 적용하여 신호를 측정하고, 측정된 신호를 신호 처리 기술을 사용한 경우 나타나는 신호의 변화를 측정한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 사용된 Λ-계단화된 사다리형 섭동전압 (Λ-stepladder-type perturbation potential)을 나타내는 그래프.
도 11는 도 10에서 인가한 전압에 대응하여 얻어지는 감응전류를 나타내는 그래프.
도 12는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 사용된 Λ-계단화된 사다리형 섭동전압의 구조를 설명하기 위한 그래프.
도 13은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 의한 검정식이 저장된 측정장치의 전후방 사시도.
도 14는 본 발명의 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 있어서, 대시간전류법에 따른 케톤체 측정값과 기준장비 측정값 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 15은 본 발명의 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 있어서, 대시간전류법에 따른 케톤체 측정값의 평균값에 대한 적혈구용적률의 영향을 나타내는 그래프(1.0 mmol/L보다 작은 농도에 대해서는 100을 곱한 절대오차로 표시하고, 그 이상의 농도에 대해서는 상대오차(%)로 표시함)이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.　 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<비교예 1> 산화환원반응 시약 조성물
산화환원효소로 히드록시부틸레이트 탈수소효소(hydroxy butyrate dehydrogenase) 200 Unit에 대하여, 디아포레이즈(dihydronicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase) 200Unit, 그 외 나머지 시약을 총합 100중량부에 대하여 조효소로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide) 30 중량부와, 금속함유 착물로 포타시움페리시아나이드(K3Fe(CN)6) 36.2 중량부와, 수용성 고분자 5.9 중량부, 당화합물로 트리할로오즈(Trehalose) 14.7 중량부와, 플라빈모노뉴클레오티드 4.4 중량부, 계면활성제(상품명: Triton X-100) 8.8 중량부를 포스페이트(phosphate) 완충액(pH7.4, 0.1M 농도의 1ml)에 용해하여, K3Fe(CN)6 금속착물을 포함하는 산화환원반응용 시약 조성물2을 제조하였다.
<비교예 2> 산화환원반응 시약 조성물
히드록시부틸레이트 탈수소효소 200 Unit에 대하여, 디아포레이즈 200Unit, 그 외 나머지 시약 조성물을 합한 100중량부에 대하여, 조효소로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide) 30 중량부와, 금속함유 착물로 헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3) 36.2 중량부와, 수용성 고분자 5.9 중량부, 당화합물로 트리할로오즈(Trehalose) 14.7 중량부와, 플라빈모노뉴클레오티드 4.4 중량부, 계면활성제(상품명: Triton X-100) 8.8 중량부를 포스페이트(phosphate) 완충액(pH7.4, 0.1M 농도의 1ml)에 녹여서 Ru(NH3)6Cl3를 포함하는 산화환원반응용 시약 조성물을 제조하였다.
<실시예 1> 산화환원반응 시약 조성물
산화환원효소로 히드록시부틸레이트 탈수소효소(hydroxy butyrate dehydrogenase) 1000 Unit에 대하여, 디아포레이즈(dihydronicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase) 300Unit, 그 외 나머지 시약을 총합 100중량부에 대하여 조효소로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide) 29.8 중량부와, 금속함유 착물로 헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3) 51.1 중량부와, 수용성 고분자 3.3 중량부, 당화합물로 트리할로오즈(Trehalose) 8.3 중량부와, 플라빈모노뉴클레오티드 2.5 중량부, 계면활성제(상품명: Triton X-100) 5.0 중량부를 포스페이트(phosphate) 완충액(pH7.4, 0.1M 농도의 1ml)에 녹여서 Ru(NH3)6Cl3를 포함하는 산화환원반응용 시약 조성물을 제조하였다.
성분 실시예 1 비교예 1 비교예 2
산화환원효소 1000 Unit 200 Unit 200 Unit
디아포레이즈 300 Unit 200 Unit 200 Unit
금속착물 51.1 중량부 36.2 중량부 36.2 중량부
조효소 29.8 중량부 30.0 중량부 30.0 중량부
계면활성제 5.0 중량부 8.8 중량부 8.8 중량부
수용성고분자 3.3 중량부 5.9 중량부 5.9 중량부
당화합물 8.3 중량부 14.7 중량부 14.7 중량부
FMN 2.5 중량부 4.4 중량부 4.4 중량부
효소제외 성분의 합계(중량부) 100 100 100
<실시예 2> 평면형 바이오센서의 제조
실시예 1에 따른 시약조성물을 포함하는 평면형 바이오센서를 제조하였다. 본 발명에 따른 평면형 바이오센서의 일예로서 도 2에 도시되어 있는 것과 같이 평균값 0.5㎕ 시료도입부를 가진 평면형 바이오센서를 제조하였다.　
폴리에스터로 만든 하판 플라스틱(1)에 탄소그래파이트를 스크린 프린트하여 만든 작동전극(2)과 보조전극(3), 유동감지전극(6)를 형성한다.　 절연체(7)로써 작동전극과 보조전극의 면적을 규정하는 절연체를 형성한다.　
작동전극에 실시예 1에서 제조한 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물1(8)을 코팅한다.　 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 75㎛ 두께의 끼움판(9)을 배치하는데, 끼움판(9)은 양면에 접착제가 코팅되어 있어서 상판(11)과 하판(1)을 접착시키는 역할을 한다.　 통기구(10)는 혈액이 센서안으로 스며들도록 하기 위한 공기배출구이며, 상판(11)은 하판과 동일한 폴리에스터로 제조된다.
<실시예 3> 대면형 바이오센서의 제조
본 발명에 따른 대면형 바이오센서의 일예로서 도 3에 도시되어 있는 것과 같이 평균값 0.5㎕ 시료도입부를 가진 대면형 바이오센서를 제조하였다.　 폴리에스터로 만든 하판 플라스틱(1)에 탄소그래파이트를 스크린 프린트하여 작동전극(2), 보조전극(3), 보조전극 리드(4) 및 유동감지전극(6)을 형성한다.　 유동감지전극(6)은 혈액이 들어오는 속도를 측정하기 위한 점도측정전극이다.　 보조전극(3)과 보조전극 리드(4)를 연결하기 위한 회로연결접지(5)를 은과 염화은(Ag/AgCl)으로 형성하고, 절연물질로 작동전극(2)의 면적을 규정하는 절연체를 형성한다.　
작동전극에 실시예 1에서 제조한 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물1(8)을 코팅한다.　 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 75㎛ 두께의 끼움판(9)을 배치는데, 끼움판(9)은 양면에 접착제가 코팅되어 있어서 상판(11)과 하판(1)을 접착시키는 역할을 한다.　 통기구(10)는 혈액이 센서안으로 스며들도록 하기 위한 공기배출구이며, 상판(11)은 하판과 동일한 폴리에스터로 제조된다.
<비교예 3> 평면형 바이오센서의 제조
실시예 2의 작동전극에 코팅되는 실시예 1의 시약 조성물 대신에, K3Fe(CN)6 금속착물을 포함하는 비교예 1의 시약 조성물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 실시하여, 비교예 3의 평면형 바이오센서를 제조하였다.
<비교예 4> 평면형 바이오센서의 제조
실시예 2의 작동전극에 코팅되는 실시예 1의 시약 조성물 대신에. (Ru(NH3)6Cl3) 금속착물을 포함하는 비교예 2의 시약 조성물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 실시하여, 비교예 4의 평면형 바이오센서를 제조하였다.
<실험예 1> 평면형 바이오센서의 표준용액에 대한 전류측정
비교예 3 및 비교예 4의 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 용액에 대한 전류측정을 수행하였다.　
베타-히드록시부틸레이트 용액은 베타-히드록시부틸레이트를 무게를 측정하여 적당량을 MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic) buffer에 녹여서 맞추고 베타-히드록시부틸레이트 측정기(제조사:Randox, 모델명:Randox monaco)를 사용해서 정량하여 여러 가지의 베타-히드록시부틸레이트 농도를 가지도록 제조한 용액을 말한다.
비교예 4의 바이오센서는 베타-히드록시부틸레이트 용액이 작동전극과 보조전극을 동시에 덮는 순간 작동전극에 4초간 200 mV를 걸어주고, 4초간 대기한 후 2초 동안 200mV를 걸어준 뒤 전류를 측정하였다. 모든 측정은 각 농도당 10회씩 측정하였고, 비교예 3의 바이오센서는 베타-히드록시부틸레이트 용액이 작동전극과 보조전극을 동시에 덮는 순간 작동전극에 4초간 350 mV를 걸어주고, 4초간 대기한 후 2초 동안 350mV를 걸어준 뒤 전류를 측정하였다. 모든 측정은 각 농도당 10회씩 측정하였고, 그 평균값을 도 4에 나타내었다. 도 4는 비교예 3 및 비교예 4에 따른 평면형 바이오센서를 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 신호의 변화를 측정한 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소 및 디아포레이즈와 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드을 포함하는 비교예 4의 평면형 바이오센서는 약 0.043 μA의 매우 낮은 바탕신호를 나타내었고, 베타-히드록시부틸레이트 농도 0~4.1mmol/L 구간에서 좋은 선형성을 나타냄을 알 수 있었다. 그리고 센서의 LOB를 확인해본 결과 0.008mmol/L 이하를 유지됨을 알 수 있었다.
도 4에서, 효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소 및 디아포레이즈와 전자전달매개체로 포타시움페리시아나이드를 포함하는 비교예 3의 평면형 바이오센서는 약 0.450 μA로 비교예 4로 제작한 센서에 대비해서 높은 바탕신호를 나타내었고, 결국 LOB(limit of blank)가 0.194mmol/L로 상승하는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> 고온보관후 평면형 바이오센서의 안정성 시험
비교예 3와 비교예 4의 평면형 바이오센서를 50도 오븐에 보관하여 가속시킨 후 오븐 보관시간에 경과에 따라서 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하여, 베타-히드록시부틸레이트 용액에 대한 전류측정을 수행하였다.　
도 5와 도 6는 비교예 3 및 비교예 4에 따른 평면형 바이오센서를 50도 오븐에 보관하여 가속시킨 후 오븐 보관시간 경과에 따라서 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 신호의 변화를 측정한 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소 및 디아포레이즈와 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드을 포함하는 비교예 4의 평면형 바이오센서는 50℃ 오븐 가속 경과가 진행되어도 바탕신호가 일정하게 유지되는 것을 알 수 있었다. 그리고 스트립의 50℃ 오븐 가속 경과 시간에 따른 LOB의 변화를 확인해본 결과 0.013mmol/L 이하를 유지됨을 알 수 있었다.
하지만, 도 6에 나타난 바와 같이 효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소 및 디아포레이즈와 전자전달매개체로 포타시움페리시아나이드를 포함하는 비교예 3의 평면형 바이오센서는 50도 오븐 가속 경과가 진행 될수록 바탕신호가 0일차 0.450 μA에서 1일차 0.518 μA, 2일차 0.670 μA로 점진적으로 증가하는 문제가 확인되었다. 이러한 바탕신호의 상승은 낮은 농도의 베타-히드록시부틸레이트 정량에 있어서 정확성을 감소시키는 원인으로 작용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서의 스트립 제작에 있어서 효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소 및 디아포레이즈와 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드를 포함하는 시약조성물을 적용한 바이오센서(비교예 4)가 효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소 및 디아포레이즈와 전자전달매개체로 포타시움페리시아나이드를 포함하는 시약조성물을 적용한 바이오센서(비교예 3)보다 바탕신호와 LOB가 작고, 안정된 신호를 유지하므로, 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 전기화학적 바이오센서에 유용하다.
<실험예 3> 표준용액에 대한 전류측정
실시예 2와 비교예 4에서 제조한 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 용액에 대한 전류측정을 수행하였다. 여기서, 베타-히드록시부틸레이트 용액은 베타-히드록시부틸레이트를 무게를 측정하여 적당량을 MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic) buffer에 녹여서 맞추고 베타-히드록시부틸레이트 측정기(제조사:Randox, 모델명:Randox monaco)를 사용해서 정량하여 여러 가지의 베타-히드록시부틸레이트 농도를 가지도록 제조한 용액을 말한다.
실시예 2과 비교예 4에서 제작한 센서는 베타-히드록시부틸레이트 용액이 작동전극과 보조전극을 동시에 덮는 순간 작동전극에 4초간 200 mV를 걸어주고, 4초간 대기한 후 2초 동안 200mV를 걸어준 뒤 전류를 측정하였다. 모든 측정은 각 농도당 10회씩 측정하였다. 모든 측정은 각 농도당 10회씩 측정하였고, 그 평균값을 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이 효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소 및 디아포레이즈와 조효소로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드의 첨가 비율이 조정된 것을 포함하는 실시예 2의 평면형 바이오센서는 비교예 4와 거의 유사한 바탕신호를 나타내면서 베타-히드록시부틸레이트 농도 0~10mmol/L범위에서 직선성을 유지하는 것을 확인 할 수 있었다.
본 실험예에서 실시예 2의 실험결과와, 실험예 1에서 비교예 3 및 4의 실험결과를 하기 표 3에 정리하였다. 하기 표 3에서 LOB 및 LOD를 구하는 계산식은 각각 다음과 같다.
LOB = 1.96*SD바탕신호/slope
LOD = LOB + 1.645*SD저농도샘플
항목 실시예 2 비교예 3 비교예 4
Slope( 0~10mmol/L) 0.629uA/mmol/L 0.228uA/mmol/L 0.382uA/mmol/L
r2 0.9997 0.9378 0.9412
바탕신호 0.033uA 0.450uA 0.043uA
LOB (limit of blank) 0.010mmol/L 0.194mmol/L 0.008mmol/L
LOD (limit of Detection) 0.013mmol/L 0.526mmol/L 0.014mmol/L
따라서, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 측정 시스템의 스트립 제작에 있어서 효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소 및 디아포레이즈와 조효소로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드를 포함하는 시약조성물의 비율조절을 통해 제작한 바이오센서는 바탕신호가 낮고, 베타-히드록시부틸레이트에 대해 0~10mmol/L까지 직선성을 유지하기 때문에 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 전기화학적 바이오센서용 측정 시스템의 제조에 유용하다.
<실험예 4> 혈구 용적률 변화에 의한 표준용액에 대한 신호측정
실시예 2에서 제조한 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 표준용액에 대한 신호를 측정하였고, 측정된 신호를 신호 처리 기술을 사용했을 때와 신호 처리 기술을 사용하지 않았을 때 혈구 용적률 변화에 의한 정확도를 비교 하였다. 여기서, 베타-히드록시부틸레이트 표준용액은 정맥에서 추출한 혈액을 여러 종류의 헤마토크릿 %로 만들고, 베타-히드록시부틸레이트 측정기(제조사:Randox, 모델명:Randox monaco)를 사용해서 정량하여 3종류의 베타-히드록시부틸레이트 농도를 가지도록 제조한 용액을 말한다.
베타-히드록시부틸레이트 표준용액이 작동전극과 보조전극을 동시에 덮는 순간 작동전극에 4초간 200 mV를 걸어주고, 4초간 대기한 후 2초 동안 200mV를 걸어주고 0.5초 동안 삼각파를 걸어준 뒤 전류를 측정하였다. 모든 측정은 각 농도, 헤마토크릿 종류당 10회씩 측정하였고, 그 평균값을 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8와 도 9는 실시예 2에 따른 평면형 바이오센서를 베타-히드록시부틸레이트 농도와 헤마토크릿을 달리한 시료를 적용하여 신호를 측정하고, 측정된 신호를 신호 처리 기술을 사용하지 않았을 경우(도 8)와 신호 처리 기술을 사용했을 경우(도 9)를 나타나는 신호의 변화를 측정한 그래프이다.
도 8에 나타난 바와 같이 측정된 신호를 신호 처리 기술을 사용하지 않았을 경우 베타-히드록시부틸레이트 0.5mmol/L는 헤마토크릿 10~70%에 대해서 ±0.3mmol/L 이내로 모두 만족하고, 헤마토크릿 0%에서 ±0.3mmol/L를 벗어나는 결과를 나타내었다. 베타-히드록시부틸레이트 1.5 mmol/L과 3.0mmol/L는 헤마토크릿 42~50%에 대해서 ±20% 이내로 만족하였고, 헤마토크릿 42~50%를 초과하면 ±20% 벗어나는 결과를 나타내었다.
하지만, 도 9에 나타난 바와 같이 측정된 신호를 신호 처리 기술을 사용하여 보정하게 되면 베타-히드록시부틸레이트 0.5mmol/L는 헤마토크릿 0~70%에 대해서 ±0.3mmol/L 이내로 모두 만족하고, 베타-히드록시부틸레이트 1.5mmol/L와 3.0mmol/L도 헤마토크릿 0~70%에 대해서 ±20% 이내로 모두 만족하는 결과를 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 측정 시스템에 있어서 측정된 신호를 신호 처리 기술을 적용하여 보정하게 되면 혈구의 용적율(헤마토크릿 %) 차이에 의한 신호차이를 보정하여 혈구의 용적율(헤마토크릿 %) 차이에 의한 방해 작용의 최소화를 통해 베타-히드록시부틸레이트 측정의 정확도를 향상시킬 수 있었고, 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 전기화학적 바이오센서용 측정 시스템의 제조에 유용하다.
따라서, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 측정 시스템에 있어서 측정된 신호를 신호 처리 기술을 적용하여 보정하게 되면 혈구의 용적율(헤마토크릿 %) 차이에 의한 신호차이를 보정하여 혈구의 용적율(헤마토크릿 %) 차이에 의한 방해 작용의 최소화를 통해 베타-히드록시부틸레이트 측정의 정확도를 향상시킬 수 있었고, 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 전기화학적 바이오센서용 측정 시스템의 제조에 유용하다.
<실험예 5> 케톤체 측정을 위한 검정식의 예
본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생체시료내 분석대상물질의 농도측정방법에 있어서, 전기화학적 바이오센서의 시료셀은 스크린인쇄된 2개의 탄소 전극으로 이루어져 있는 일회용 스트립이며, 전극에 케톤체 탈수소화 효소 및 전자전달매개체 (1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate, ruthenium hexamine chloride)이 도포되어 있는 경우, 23 ℃에서 일정 전압 인가하여 감응전류를 얻어 케톤체의 농도를 계산하는 경우이다.
적혈구용적률에 의한 편차를 확인하기 위한 혈액 실험은 실시한다. 혈액은 20, 30, 42, 50, 60, 70% 적혈구용적률을 갖는 시료를 준비한다.
각 적혈구용적률 값에 대하여 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4.2, 5 mmol/L의 케톤체 농도값에 가까운 값이 되도록 준비하고, 실제 각 시료의 혈당값은 기준장비(RX Monaco, Randox)로 측정하여 결정한다.
한편, 측정장치는 앞의 실시예에서 사용된 혈당 측정장치와 동일한 구조의 측정장치에서 일정전압에 대한 감응전류를 기록한다.
사용한 인가전압의 형태는 혈액유입부터 4초까지 200 mV를 스트립내의 두 전극 사이에 인가하고, 다음 4초 동안은 0 mV를 인가하며, 이후 2초 동안 다시 200 mV를 인가한다.
10초에서의 전류값을 각 시료에 대해 기록한다.
케톤체 측정 계산식은 42% 적혈구용적률의 시료를 기준으로 작성한다.
케톤체 측정 계산식은 다음과 같다.
Ketone Body = slope * it=10sec (10 초에서의 전류값) + intercept
실험 데이터에 대해 slope과 intercept를 최소자승법으로 계산하여, 검정식을 구한다.
이러한 케톤체 측정 검정식을 사용하여, 모든 적혈구용적률 시료에 대해 계산한 결과는 도 14 및 도 15에 나타낸다.
도 14은 본 발명의 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 있어서, 대시간전류법에 따른 케톤체 측정값과 기준장비 측정값 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이고, 도 15는 본 발명의 실시예에 따른 생체시료 내 분석대상물질의 농도측정방법에 있어서, 대시간전류법에 따른 케톤체 측정값의 평균값에 대한 적혈구용적률의 영향을 나타내는 그래프(1.0 mmol/L보다 작은 농도에 대해서는 100을 곱한 절대오차로 표시하고, 그 이상의 농도에 대해서는 상대오차(%)로 표시함)이다.
도 14 및 도 15에 도시된 바와 같이, 대시간전류법에 따른 케톤체 측정값의 평균값은 적혈구용적률이 증가할수록 기울기가 감소하는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 15에 도시된 바와 같이, 대시간전류법에 따른 케톤체 측정값의 적혈구용적률에 대한 경향성은 42%를 기준으로 양끝으로 갈수록 편차가 증가하는 것을 알 수 있다.

Claims (25)

  1. 히드록시부틸레이트 탈수소효소 및 디아포레이즈를 포함하는 효소 성분과, 조효소, 전자전달매개체로 루테늄 착물 및 FMN을 포함하는 화합물 성분을 포함하는 베타-히드록시부틸레이트의 정량용 산화환원반응 시약 조성물로서,
    상기 시약 조성물의 효소성분은 1,000 내지 10,000 유니트(UNIT)를 포함하고, 상기 히드록시부틸레이트 탈수소효소 1,000 유니트를 기준으로 디아포레이즈 100 내지 990 유니트 및 루테늄 착물 40 내지 60 중량부로 포함하며,
    상기 시약 조성물은 시료내 베타-히드록시부틸레이트 농도 0~10 mmol/L범위에서 r2이 0.95 이상이고,
    상기 시약 조성물이 적용된 베타-히드록시부틸레이트의 측정용 바이오센서는 바탕 전류값 0.2μA 이하인, 베타-히드록시부틸레이트의 정량용 산화환원반응 시약 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 시약 조성물이 시약 조성물이 적용된 베타-히드록시부틸레이트의 측정용 바이오센서는 바탕 전류값 0.001 내지 0.2uA 이하인 것인, 시약 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 시약 조성물의 효소성분중 히드록시부틸레이트 탈수소효소 및 디아포레이즈의 혼합 유니트 비율은 히드록시부틸레이트 탈수소효소 1,000 유니트를 기준으로 디아포레이즈 100 내지 500 유니트인 시약 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 시약 조성물의 화합물 성분은 추가로 계면활성제, 수용성 고분자 및 당화합물으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 시약 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 시약 조성물의 화합물 성분은 루테늄 착물, 조효소, 계면활성제, 수용성 고분자, 당화합물 및 FMN를 포함하는 것인 시약 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 히드록시부틸레이트 탈수소효소 1,000 유니트을 기준으로, 조효소 10 내지 100 중량부, 계면활성제 1 내지 10 중량부, 수용성 고분자 0.1 내지 100 중량부, 당화합물 1 내지 100 중량부 및 FMN 0.1 내지 10 중량부를 포함하는 것인 시약 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 루테늄 착물은 헥사아민루테늄클로라이드인 시약 조성물.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 조효소는 NAD+ 또는 NADP+ 이고,
    상기 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100), 소듐도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트(perfluorooctane sulfonate), 및 소듐스테아레이트(sodium stearate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
    상기 수용성 고분자는 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트(perfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈 (carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate), 및 폴리아미드(polyamide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
    상기 당화합물은 당화합물로는 글루코오즈, 수크로오즈, 락토오즈, 프룩토오즈, 솔비톨, 라피노오즈, 및 트레할로오즈(Trehalose)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인, 시약 조성물.
  12. 제1항, 제3항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 시약 조성물을 포함하는 베타-히드록시부틸레이트의 정량을 위한 전기화학적 바이오센서.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 바이오센서는, 작동전극 및 보조전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 작동전극 위에 상기 시약 조성물이 포함된 것을 특징으로 하는 평면형 바이오센서.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 바이오센서는, 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 상기 시약 조성물이 포함된 것을 특징으로 하는 대면형 바이오센서.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 바이오센서는, 상기 바이오센서의 시료 주입부에 혈구를 걸러줄 수 있는 거름 구조물을 추가로 포함하는 것인 바이오센서.
  16. 제15 항에 있어서, 상기 거름 구조물은 다공성 필름, 다공성 종이 또는 망사 구조물인 바이오센서.
  17. 시료 주입부, 작동전극 및 보조전극을 구비하고, 제1항, 제3항, 제5항, 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 시약 조성물이 상기 작동전극 위에 포함된 베타-히드록시부틸레이트의 정량을 위한 전기화학적 바이오센서의 시료 주입부에 액상 시료를 주입하고,
    베타-히드록시부틸레이트의 산화환원 반응을 개시하고 전자전달 반응을 진행시킬 수 있도록 상기 작동전극에 일정직류 전압을 인가하여 감응전류를 얻고,
    상기 얻어진 감응전류를 이용하여 혈액내 베타-히드록시부틸레이트의 농도를 얻는 단계를 포함하는, 액상 시료내 베타-히드록시부틸레이트를 정량하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 바이오센서에 액상 시료가 주입되었을 때 교류 또는 직류 전압을 조합하여 신호를 보내고, 바이오센서의 작동전극과 보조전극 사이에서 일어나는 산화환원 신호를 수집하고 조합하여 혈구의 용적률 차이에 의한 신호 영향을 최소화하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 감응전류를 얻고, 상기 얻어진 감응전류를 이용하여 혈액내 베타-히드록시부틸레이트의 농도를 얻는 단계는,
    상기 베타-히드록시부틸레이트의 산화환원 반응을 개시하고 전자전달 반응을 진행시킬 수 있도록 상기 작동전극에 일정직류 전압을 인가하여 적어도 일 시점 이상의 특징점에서 제 1 감응전류를 얻는 단계와,
    상기 일정직류 전압을 인가 후 Λ모양의 계단화된 사다리형 섭동전압을 인가하여 적어도 2 시점 이상에서 제 2 감응전류를 얻는 단계와,
    상기 제 1 감응전류 또는 상기 제 2 감응전류로부터 미리 정해진 피쳐(feature)를 계산하는 단계와,
    상기 액상 시료 내 적어도 1 이상의 방해물질의 영향이 최소가 되게 적어도 1 이상의 피쳐(feature)함수로 구성된 검정식을 사용하여 상기 베타-히드록시부틸레이트의 농도를 계산하여 수행하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 Λ모양의 계단화된 사다리형 섭동전압의 특징은 각 계단의 높이(Vstep), 각 계단의 인가시간(tstep), 전체 변화 범위에서의 중간전압과 일정전압과의 차이(Vcenter), 중간전압과 봉우리 전압 값과의 차이(Vpeak), 전체 계단화된 사다리형파의 봉우리 전압 값과 인접한 다음 계단화된 사다리형파의 봉우리 전압 값과의 시간차(tcycle)로 이루어지는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 계단화된 사다리형 전압은 하나의 계단의 높이(Vstep)가 0.5 내지 20 mV이고, 상기 하나의 계단의 지속시간(tstep)이 0.001 내지 0.1 초 이며, 상기 계단화된 사다리형 전압의 중심전압과 상기 일정직류 전압과의 차이 (Vcenter)가 -150 내지 150 mV 이며, 상기 계단화된 사다리형 전압의 중심전압과 봉우리 또는 골 전압과의 차이 (Vpeak) 가 5 내지 150 mV이며, 상기 계단화된 사다리형 전압의 주기 또는 하나의 봉우리와 인접한 다른 하나의 봉우리 사이의 시간 간격 (tcycle)이 0.01 내지 1 초 범위 내의 값인 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 상기 제 2 감응전류는 제 1 감응전류를 얻은 후 0.1 내지 1 초이내에 얻어지는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 상기 일정직류 전압과 상기 Λ모양의 계단화된 사다리형 섭동전압은 마이크로컨트롤러에 연동하는 동일한 디지털-아날로그컨버터 회로를 통해서 상기 작동전극에 인가되도록 구성되는 방법.
  24. 제 19 항에 있어서, 상기 일정직류 전압은 0 - 800 mV의 범위의 전압으로, 1초 이상 1분 이내의 시간 동안 지속적으로 또는 간헐적으로 인가되고, 상기 제 1 감응전류는 상기 일정직류 전압이 인가되는 동안 1회 또는 수회 측정하는 방법.
  25. 제 19 항에 있어서, 상기 피쳐 함수는 상기 일정직류 전압에서 얻은 감응전류값을 사용하는 함수, 상기 계단화된 사다리형 전압에서 얻은 감응전류값을 사용하는 함수, 상기 피쳐 함수는 측정장치에서 측정한 온도값을 사용하는 함수, 측정된 감응전류값을 사칙연산, 지수, 로그, 삼각함수 등의 수학적 함수로 표현하여 얻을 수 있는 함수인 방법.
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