KR101733063B1

KR101733063B1 - 신규 히알루론산 분해효소 발현 박테리아 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101733063B1
Application number: KR1020150065508A
Authority: KR
Inventors: 민정준; 박승환; 홍영진; 최현일
Original assignee: 전남대학교 산학협력단
Priority date: 2015-05-11
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2017-05-08
Also published as: KR20160132668A

Abstract

본 발명은 암의 효율적인 치료를 위해 히알루론산 분해효소(HAase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자컨스트럭트로 형질전환되어 상기 히알루론산 분해효소를 발현하는 약독화 박테리아 균주를 유효성분으로 함유하는 암치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

신규 히알루론산 분해효소 발현 박테리아 및 그의 용도{Novel bacteria expressing hyaluroniase and use thereof}

본 발명은 박테리아 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신규 히알루론산 분해효소 발현 박테리아 및 그의 용도에 관한 것이다.

세부외 기질(extracelluar matrix, ECM)는 콜라겐, 탄성섬유, 프로테오글리칸, 부착성 당단백질과 히알루론산(hyaluronan, HA)과 같은 다섯종류의 거대분자로 구성되어 있고, 이들 구성성분들은 서로 다른 기능을 위해 다른 비율로 혼합될 수 있는데, ECM은 세포와 세포간 상호작용의 기계적 지지체, 성장인자의 관리자, 및 세포이동의 경로의 기능을 갖는다. 그들 중의 하나인 HA는 프로테오글리칸의 주요한 성분일뿐 아니라, 유리 비분지 글리코아미노글리칸(free unbranched glycoaminoglycan)으로 2,000-25,000개의 반복되는 이당류, N-아세틸 글루코사민, 글루쿠론산으로 구성되어 있으며, 분자량은 10²에서 10⁴kDa 정도이다(Ahrens et al., J. Invest. Dermatol., 116: 93-101, 2001; Bono et al., Mol. Biol. Cell, 12: 891-900, 2001; Termeer et al., J. Exp. Med. 195: 99-111, 2002; Turley et al., Journal of biological chemistry 277(7): 4589-4592, 2002). HA는 인체에서 막삽입 단백질(integral plasma membrane protein)인 세 종류의 HA 합성효소(HAS1-1)에 의해 생산되며, 세포표면의 수용체에 결합하거나, 상기 HA 합성효소에 부착함으로써 세포표면에서 머무를 수 있다. HA와 그 수용체와의 상호작용은 세포내 신호전달을 개시하고 조직항상성과 세포운동의 근간을 형성한다(도 1). 주요 수용체인 CD44는 세포응집, 증식, 이동, 신생혈관생성(angiogenesis) 등을 조절한다(Bourguignon et al., Mol. Cell. Biol., 12: 4464-4471, 1992; Lesley et al., Adv. Immunol., 54: 271-335, 1993; Lokeshwar et al., J. Biol. Chem., 271(39): 23853-23864, 1996).

본 발명자들에 의한 선행기술인 한국등록특허 제1421575호에는 치료용 약독화 살모넬라 균주에 의한 진단 또는 치료용 단백질의 전달 효율을 증가시키기 위해, ara 오페론 및 ppGpp 생산 유전자가 모두 불활성화된 약독화 살모넬라 속 균주 및 그의 용도가 개시된 바 있다. 또한, PCT 공개특허공보 WO2012/174480A에는 페길화된 재조합 인간 히알루론산 분해효소(rHuPH20)를 채용한 연속적인 피하 인슐린 주입 방법(CSII)이 개시된 바 있는데, 특히 상기 특허문헌에서 사용된 히알루론산-분해 효소는 GPI 앵커가 결실되어 세포에서 발현될 때 세포막에 결합하지 않기 때문에, CSII 과정 동안 더욱 지속적으로 혈당을 조절하는데 사용될 수 있으며, 따라서, 당뇨병 또는 다른 인슐린-관련 질환을 앓고 있는개체의 치료에 사용될 수 있다고 기재되어 있다.

약독화 Salmonella typhimurium과 같은 여러 약독화 박테리아는 종양 조직에 대한 표적화와 종양의 성장을 억제 할 수 있으나, 세균의 종양 치료 활성을 향상시키기 위해서는, 이들 세균들이 암세포를 둘러싸고 있는 세포외 기질을 잘 통과할 수 있도록 하여야 한다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 히알루론산 분해효소를 발현하도록 형질전환된 약독화 박테리아를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 히알루론산 분해효소를 발현하도록 형질전환된 약독화 박테리아 및 항암 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

마지막으로 본 발명을 상기 박테리아를 이용한 종양 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 히알루론산 분해효소(HAase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트로 형질전환되어 상기 히알루론산 분해효소를 발현하는 약독화 박테리아 균주가 제공된다.

히알루론산 분해효소 및 항암 단백질을 발현하도록 형질전환된 약독화 박테리아 균주가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약독화 박테리아 균주를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약독화 박테리아 균주 및 항암 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 약학적으로 유효한 양의 상기 약독화 박테리아를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 약학적으로 유효한 양의 상기 약독화 박테리아 및 항암 화합물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 분해효소(HAase) 발현 약독화 박테리아는 종양 조직을 둘러싸고 있는 세포외 기질을 효과적으로 분해함으로써 종양 치료용 박테리아의 종양조직으로의 침투를 용이하게 함으로써 그의 암치료효과를 극대화할 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위는 상기 효과에 의해 제한되는 것은 아니다.

도 1은 히알루론산(hyaluronic acid, 이하, 'HA'로 약칭함)과 그 수용체들의 상호작용에 의한 세포내 신호전달의 개시 및 그에 따른 조직의 항상성과 세포운동성의 상관관계를 나타내는 개요도(schematic diagram)이다.
도 2는 발현균주들의 제작 및 유전자 지도를 개략적으로 도식화 한 것으로 도 2A는 pGEMT/hysA의 유전자 지도, 도 2B는 pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 제작과정 도식도, 도 2C는 pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 유전자 지도, 도 2D는 상기 pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 pBAD-Hollin & Lysin 시스템을 나타낸 그림이다.
도 3은 히알루론산 분해효소(HAase)의 효소분석 결과를 나타내는 일련의 사진으로, 도 3A는 히알루론산 분해효소(HAase)의 형질전환 세균의 발현으로 S. typhimurium (SL and SLlux)균주와 pGEMT/hysA로 형질전환된 E. coli (MG1655)로 효소활성을 측정하기 위하여 한천배지에서 밤새 배양, 히알루론산 분해효소 (HAase)는 분해되어 균락 주위에 투명한 공란을 보여주었으며, 1, S. typhimurium SL; 2,pGEMT/hysA (SL/HAase)형질전환 SL; 3, S. typhimurium SLlux; 4, pGEMT/hysA (SLlux/HAase) 형질전환 SLlux; 5, E. coli (MG1655); 6, pGEMT/hysA (MG1655/HAase) 형질전환 MG1655 이고, 도 3B는 SLlux/HAase의 생체내 발광도이다. 한천배지에서 밤새 배양된 생체내 발광 합성 유전자를 암호화하는 typhimurium SLlux 오페론과 균주의 빛 방출을 측정한 사진이다. 도 3C는 DH5α/pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 균락 사진이며, 3D는 SL/pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 균락 사진이다.
도 4는 히알루론산 분해효소 (HAase)의 활성분석을 나타낸 것으로, 도 4A는 HAase를 발현하는 균의 분해물을 37℃에서 30분간 혼탁한 상태, 샘플의 탁도는 스펙트라 OD₆₀₀에서 측정하고, 각 효소의 활성(AU)은 아래의 예시된 방법에 따라서 측정한 것으로, HA와 배양하고, 대조군으로 pGEM-T vector로 형질 전환한 균을 사용하여 세균분해물을 이용한 HAase의 시험관내 효소 분석한 것이며, 도 4B는 HAase 효소활성의 상대적으로 정량한 그래프이다. 도 4C는 pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R) 효소활성의 상대적으로 정량한 그래프이다.
도 5는 생체내 종양 타겟 HAase 발현균을 나타낸 사진으로 도 5A는 S. typhimurium 함유 lux 오페론 (SLlux)의 생체내 발광 사진이며, 이는pGEMT/hysA (SLlux/HAase)로 형질전환되고, 균배양의 생체발광은 IVIS로 측정된 것이며, 여기서 1, SLlux; 2, SLlux/HAase;, 도 5B는 CT26 종양 마우스에서 광발산 S. typhimurium 발현 HAase의 타겟 종양의 사진으로, SLlux/HAase(5x10⁷ cfu)는 CT26 대장암 세포라인과 함께 BALB/c 마우스의 꼬리정맥으로 투여하고, 대조로써 PBS와 비전이세균(SLux)을 종양마우스로 주입하여 지시한 날짜에 세균 량과 부분영역을 생체발광으로 측정한 사진이며, 도 5C는 4T-1 종양 마우스에서 광발산 S. typhimurium 발현 HAase의 타겟 종양의 사진으로, SLlux/HAase(5x10⁷ cfu) 4T-1 유방암 세포라인과 함께 BALB/c 마우스의 꼬리정맥으로 투여하고, 대조로써 PBS와 비전이세균(SLux)을 종양마우스로 주입하여 지시한 날짜에 세균 량과 부분영역을 생체발광으로 측정한 사진이며, 도 5D는 4T-1 종양에서 세균의 생체내 발광도를 나타낸 사진으로, 세균주입 9일 후에 4T-1 마우스로부터 종양조직이 분리되어 생체내 발광신호를 IVIS로 측정한 것이다.
도 6은 HAase 발현균을 마우스로 주입한 후 종양크기변화를 나타낸 것으로, 도 6A는 SLlux/HAase균 투여후 CT26 종양 마우스의 사진이며, 도 6B는 Llux/HAase균 투여후 4T-1 종양 마우스의 사진으로, 종양의 사진은 균투여후 지시한 날짜에 찍었다.
도 7은 HAase 발현균을 종양마우스에 투여후 종양크기 변화를 측정한 것으로, 도 7A와 7B는 CT26 마우스와 4T-1 종양 마우스에서 각각 균투여 후 종양크기를 측정한 그래프이다.
도 8은 생체내 HAase 효과를 나타낸 것으로, 종양에서의 공초점현미경의 이미지를 나타낸 사진이다. 도 8A는 대조군 PBS의 공촛점 현미경 사진이며, 도 8B와 도 8C는 각각 ppGpp-lux 및 ppGpp-lux/HAase 의 살모넬라 및 그 조합의 발색단과 200x 배율로 비교된 공초점 현미경 사진들이다.
도 9는 HAase 발현균을 마우스로 주입한 후 종양크기 변화를 나타낸 것으로, SLlux/HAase균에 독소루비신(Doxorubicin)을 5 mg/kg을 주사액으로 추가하여 투여한 4T-1 종양 마우스의 사진으로, 종양의 사진은 균주 및 독소루비신 복합제 3회 투여후 지시한 날짜(3, 6, 9 일째)에 생체내 발광도를 찍은 사진이다.
도 10은 HAase 발현균을 종양마우스에 투여후 시간 경과에 따른 종양크기 변화를 측정한 것으로서, 4T-1 종양 마우스에 각각, PBS(-●-), SLlux(-▲-), 독소루비신(-○-), SLLux + 독소루비신(-▼-), SLlux/HAase균주(-◆-) 및 SLlux/HAase + 독소루비신(-□-) 투여 후 종양크기를 측정한 그래프이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "히알루론산 분해효소(HAase)"는 HA 분해와 관련이 있는 것으로, Hyal-1, -2, 및 -3, 그리고 PH-20가 존재한다. 세포표면의 Hyal-2 의해서 합성하는 수시간내에 분해되는 고분자 HA는 50-100 당류들의 분절, 엔도시토시스후에 리소좀 Hyal-1에 의해 4탄당으로 분해된다.

본 문서에서 사용되는 용어, "히알루론산(HA)"은 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤라핀과 함께 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans, GAG)의 일종으로, N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 음이온성 천연고분자(polyanionic natural polymer)이다. 히알루론산은 동물의 안구, 태반, 관절의 윤활제, 능막액, 피부와 수닭의 벼슬 등으로부터 발견되며, 생체부분에 따라 103~107 달톤의 분자량을 가지고 있다. 또한, 히알루론산은 피부의 표피와 진피 등 모든 층의 조직에서 작용하고 있는 세포외기질(extracellular matrix) 구조를 유지하는 구조 역할을 하고, 모든 고등 동물의 활액, 탯줄, 피 등에 존재하며 그 중 50% 이상의 히알루론산이 피부, 호흡기, 및 장관에 존재하는 유일한 비황산화 글리코스아미노글리칸(non-sulfated glycosaminoglycan)이다. 또한, 히알루론산은 음으로 대전되어 있기 때문에 양성의 이온들과 결합하여 물을 흡수하는 삼투의 불균형과 하이드로겔 형태를 쉽게 만들 수 있다. 따라서, 히알루론산은 다른 세포외기질 성분의 훌륭한 대안으로, 자체의 뛰어난 함수성 때문에 생체 내에서 조직과 관절 부위의 수분 항상성을 제공하여 물리적 힘에 대한 완충작용으로 압축을 지탱할 수 있으며, 조직과 조직 간의 투과성 조절에 관여하여 관절 표면에서 마찰에 대한 윤활효과를 유도하고, 관절의 혈관이 없는 부위에 영양을 공급하거나 노폐물을 제거하는 전달체 역할을 하기도 한다. 따라서, 천연고분자인 히알루론산의 고 흡수성 및 고 점성도를 활용하여 히알루론산 자체로서 또는 그 유도체 등을 제조하여(Glenn D. Prestwich, Jing-wen Kuo, Chemically-Modified HA for Therapy and Regenerative Medicine, Current Pharmaceutical Biotechnology, 9(4), 242-245 (2008).) 화장품, 안구 등에 적용하기도 하며(E. A. Balazs, M. I. Freeman, R. Kloti, G. Meyer-Schwickerath, F. Regnault, and D. B. Sweeney, "Hyaluronic acid and replacement of vitreous and aqueous humor", Mod. Probl. Ophthalmol., 10, 3~21 (1972).), 이외에도 연골 및 뼈의 재생(A. H. Isdale, L. D. Hordon, H. A. Bird, and V. Wright, "Intra-articular hyaluronate (Healon): A dose-ranging study in rheumatoid arthritis and osteoarthritis", J. Drug Dev., 4, 93~99 (1991). M. Kawabata, M. Igarashi, R. Mikami, S. Ninomiya, and H. Oda, "Clinical evaluations of SLM-10 (sodium hyaluronate injection) in patients with osteoarthritis of the knee", Yakuri to Chiryo, 21, 257~283 (1993).)과 피부 등 연조직 재생, 및 함몰조직 또는 성형 등에 히알루론산 겔을 생체에 직접 주입하는 등 조직재생과 조직공학의 다방면에서 그 용도가 활용되고 있다.

본 문서에서 사용되는 "세포외기질(extracellular matrix, ECM)"는 주로 동물의 구조적 지지등을 담당하는 조직이다. 세포외기질은 동물의 결합 조직에 속한다. 세포외기질은 세포 사이의 기질과 기저막으로 구성된다. 세포 사이의 기질은 여러 세포들 사이의 공간을 채우는 기질이다. 다당류로 이루어진 겔과 단백질 섬유가 세포 사이에 채워져 있어 세포외기질의 완충 작용을 돕는다. 기저막은 얇은 종이처럼 구성되어 있으며, 그 위에 상피조직이 위치한다. 세포 외 기질은 약 100년 전 처음 발견되었고 초기에는 단순한 세포간 연결체로서 구조적인 역할을 하는 것으로 알려졌다. 그러나 이를 넘어서 세포의 분열과 분화 그리고 사멸 등 여러 세포생리 조절인자로서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 특히 세포 외 기질은 배아줄기세포나 성체줄기세포와 접목된 세포치료와 재생의학(regenerative medicine)을 위해서 최근 그 중요성이 더욱 강조되고 있다. 또한 세포 외 기질을 모방한 생체재료(biomaterials) 내에 세포를 배양하여 조직을 만들어 내고자 하는 조직공학(tissue engineering) 연구를 위해서도 이에 대한 이해가 더욱 필요하다. 세포 외 기질은 각 조직을 구성하는 세포들이 필요에 의해서 만들어낸 산물이다. 따라서 조직에 따라 서로 다른 성분으로 구성되어 있으며, 특수한 물리적 성질을 지니고 있다. 일반적으로 세포 외 기질은 콜라젠(collagen)이나 엘라스틴(elastin) 같은 구조 단백질(structural proteins)이 주를 이루며, glycosaminoglycan (GAG)이라는 다당류(polysaccharides), 그리고 세포의 부착을 돕는 부착 단백질 (adhesive proteins)이 고정되어 있으며, 성장인자(growth factors) 등 다양한 생화학적 인자들이 이동하며 분포되어 있다. 세포 외 기질을 이루고 있는 성분과 함량은 조직에 따라 다르다. 이는 생체 조직이 놓인 물리화학적, 역학적 환경에 적합하도록 설계되어 있으며, 세포는 이러한 세포 외 기질을 적절하게 만들어 내어야 생물학적 기능을 제대로 할 수 있다. 압축응력(compressive stress)에 대한 높은 탄성(elasticity)을 요하는 연골은 GAG 성분이 많이 필요하고, 높은 인장응력(tensile stress)을 요구하는 인대나 건은 인장력에 강한 콜라젠 성분이 주를 이룬다.

본 문서에서 사용되는 "약독화"는 미생물의 병원성을 감소시키도록 변형시키는 것을 의미한다. 약독화는 미생물을 환자에게 투여한 경우 독성 및 다른 부작용을 감소시킬 목적으로 이루어진다. 약독화 박테리아는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 약독화는 박테리아가 숙주세포에서 생존하도록 하는 독성인자(virulence factor)을 결실시키거나 또는 파괴하여 달성된다. 상기 결실 및 파괴는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 상동성 재조합, 화학적 변이유발, 조사 변이유발 또는 트랜스포존 변이유발 등과 같은 방법에 의해 실시된다. 결실된 경우 약독화를 초래할 수 있는 Salmonella의 독성인자의 예는 다음과 같다: 5'-아데노신 모노포스페이트(Biochenko et al., Bull. Eksp. Biol. Med. 103: 190-192, 1987), 사이토라이신(Libby et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 489-493, 1994), 디펜신 내성 좌위(Fields et al., Science 243: 1059-1062, 1989), DNAK(Buchmeier et al., Science 248: 730-732, 1990), 핌브리애(Ernst et al., Infect. Immun. 58: 2014-2016, 1990), GroEL(Buchmeier et al., Science 248: 730-732, 1990), Inv loci(Ginocchio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5976-5980, 1992), 리포단백질(Stone et al., J. Bacteriol. 174: 3945-3952, 1992), LPS(Gianella et al., J. Infect. Dis. 128: 69-75, 1973), PhoP 및 PhoQ(Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5054-5058, 1989), Pho 활성화 유전자(Abshiro et al., J. Bacteriol. 175: 3734-3743, 1993), PhoP 및 PhoQ 조절 유전자(Behlau et al., J. Bacteriol. 175: 4475-4484, 1993), 포린(Tufano et al., Eur. J. Epiderniol. 4: 110-114, 1988, ), 독성인자(Loos et al., Immun. Infekt. 22: 14-19, 1994; Sansonetti, Rev. Prat. 42: 2263-2267, 1992). 약독화 박테리아에 대한 내용은 WO 96/40238A에 상세하게 개시되어 있으며, 이 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

발명의 상세한 설명:

상기 약독화 박테리아 균주는 혐기성 세균일 수 있으며, 상기 혐기성 세균은 통성 혐기성 세균(facultative anaerobic bacteria) 또는 절대적 혐기성 세균(obligate anaerobic bacteria)일 수 있다. 상기 통성 혐기성 세균은 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균, 시겔라 속(Shigella sp.) 균, 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균, 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.) 균, 세라티아 속(Serratia sp.) 균, 프로테우스 속(Proteus sp.) 균, 어위니아 속(Erwinia sp.) 균, 비브리오 속(Vibrio sp.) 균, 애로모나스 속(Aeromonas sp.) 균, 포토박테리움 속(Photobacterium sp.) 균, 파스퇴렐라 속(Pasteurella sp.) 균, 해모필러스 속(Haemophilus sp.) 균일 수 있고, 상기 절대적 혐기성 세균은 악티노마이세스 속(Actinomyces sp.) 균, 박테로이데스 속(Bacteroides sp.) 균, 클로스티리디움 속(Clostridium sp.) 균, 푸소박테리움 속(Fusobacterium sp.) 균, 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus sp.) 균, 포르피로노마스 속(Porphyromonas sp.) 균, 프레보텔라 속(Prevotella sp.) 균, 프로피오니박테리움 속(Propionibacterium sp.) 균, 또는 베일로넬라 속(Veillonella sp.) 균일 수 있다. 관점을 달리하여, 상기 약독화 균주는 그람양성균 또는 그람음성균일 수 있고, 상기 그람 양성균은 바실러스 속(Bacillus sp.) 균, 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 균, 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 속 균일 수 있고, 상기 그람 음성균은 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균 또는 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균일 수 있다.

상기 약독화 박테리아 균주에 있어서, 상기 약독화는 ppGpp 생합성의 결핍에 의해 달성될 수 있다.

상기 약독화 박테리아 균주에 있어서, 상기 ppGpp 생합성의 결핍은 relA 및/또는 spoT 유전자의 불활성화에 의해 달성될 수 있다.

상기 약독화 박테리아 균주에 있어서, 상기 히알루론산 분해효소는 그람음성균 또는 그람양성균 유래일 수 있고, 상기 그람양성균은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균, 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 균, 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.) 균, 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 균, 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus sp.) 균, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균, 또는 프로피니박테리움 속(Propinibacterium sp.) 균일 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 실시태양에 따르면 상기 히알루론산 분해효소는 Staphylococcus aureus 유래일 수 있고, 상기 Staphylococcus aureus 유래의 히알루론산 분해효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

상기 약독화 박테리아는 P_BAD 프로모터에 작동가능하게 연결된 홀린 및 라이신 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 추가로 포함하여, 아라비노스로 유도시 세포벽이 용해되어 상기 히알루론산 분해효소를 대량방출할 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 히알루론산 분해효소 및 항암 단백질을 함께 발현하도록 형질전환된 약독화 박테리아 균주가 제공된다.

상기 약독화 박테리아 균주에 있어서, 상기 히알루론산 분해효소는 그람음성균 또는 그람양성균 유래일 수 있고, 상기 그람양성균은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균, 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 균, 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.) 균, 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 균, 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus sp.) 균, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균, 또는 프로피니박테리움 속(Propinibacterium sp.) 균일 수 있으며, 더 바람직하게 상기 히알루론산 분해효소는 Staphylococcus aureus 유래일 수 있고, 상기 Staphylococcus aureus 유래의 히알루론산 분해효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

상기 약독화 박테리아 균주에 있어서, 상기 항암 단백질은 단백질 독소, 암항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 유전자(tumor suppressor gene) 또는 항혈관생성인자(antiangiogenic factor) 또는 플라겔린일 수 있고, 상기 단백질 독소는 사이토라이신 A(ClyA)일 수 있으며, 상기 플라겔린은 FlaB일 수 있다.

상기 약독화 박테리아 균주에 있어서, 상기 히알루론산 분해효소를 암호화하는 유전자 및 상기 항암 단백질을 암호화하는 유전자가 하나의 유전자 컨트스럭트 내에서 tetR/A 프로모터의 양 옆에 연결됨으로써 양방향으로 발현될 수 있고, 상기 상기 항암 단백질은 사이토라이신 A 또는 플라겔린 B(FlaB)일 수 있다.

아울러, 상기 약독화 박테리아 균주는 P_BAD 프로모터에 작동가능하게 연결된 홀린 및 라이신 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 추가로 포함하여, 아라비노스로 유도시 세포벽이 용해되어 상기 히알루론산 분해효소 및 상기 항암 단백질을 대량방출할 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 중 어느 하나 이상의 약독화 박테리아 균주를 유효성분으로 함유하는 암치료용 약학적 조성물이 제공된다.

뿐만 아니라 본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 중 어느 하나 이상의 약독화 박테리아 균주 및 항암 화합물을 유효성분으로 함유하는 암치료용 약학적 조성물이 제공된다.

상기 암치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 항암 화합물은 안트라사이클린(anthracycline), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 악티노마이신 D(actinomycin D), 카르보틀라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 빈크리스틴(vincristine) 또는 탁솔(taxol)일 수 있다.

상기 약독화 박테리아 균주에 있어서, 상기 히알루론산 분해효소는 그람음성균 또는 그람양성균 유래일 수 있고, 상기 그람양성균은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균, 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 균, 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.) 균, 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 균, 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus sp.) 균, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균, 또는 프로피니박테리움 속(Propinibacterium sp.) 균일 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 실시태양에 따르면, 상기 히알루론산 분해효소는 Staphylococcus aureus 유래일 수 있고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 히알루론산 분해효소는 진핵생물 또는 원핵생물로부터 유래한 것일 수 있고, 상기 원핵생물은 그람 음성균 또는 그람양성균일 수 있으며, 상기 그람음성균은 비브리오 속(Vibrio sp.) 균, 애로모나스 속(Aeromoas sp.) 균, 베네케아 속(Beneckea sp.) 균, 프로테우스 속(Proteus sp.) 균, 푸소박테리움 속(Fusobacterium sp.) 또는 박테로이데스 속(Bacteriodes sp.) 균일 수 있다. 이때, 상기 프로테우스 속 균은 Proteus vulgaris 또는 Proteus mirabilis일 수 있고, 상기 박테로이데스 속 균은 Bacteroides fragilis, Bacteroides vulgatus, Bacteroides ovatus, Bacteroides melaninogenicus, 또는 Bacteroides asaccharolyticus일 수 있다. 상기 그람양성균은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균, 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 균, 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.) 균, 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 균, 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus sp.) 균, 바실러스 속(Bacillus sp., Guo et al., PLoS One., 9(4):e94156, 2014) 균, 또는 프로피니박테리움 속(Propinibacterium sp.) 균일 수 있다. 이 때, 상기 스트렙토코커스 속 균은 Streptococcus agalactiae, Streptococcus penumoneae, Streptococcus pyrogenes일 수 있고, 상기 스트렙토마이세스 속 균은 Streptomyces griseus, Streptomyces hyalurolyticus 또는 Streptomyces coelicolor일 수 있으며, 상기 스타필로코커스 속 균은 Staphylococcus aureus 또는 Staphylococcus hyicus subsp. hyicus일 수 있고, 상기 클로스트리드움 속 균은 Costridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium septicum 또는 Clostridium chauvoei일 수 있으며, 상기 프로피니박테리움 속 균은 Pripionibacterium acnes, Probionibacterium granulsum, 또는 Probionicabcterium hyalurolyticus일 수 있다. 상술한 히알루론 분해효소를 생산하는 세균들에 대한 내용은 선행문헌에 잘 기재되어 있다(Hynes and Walton, FEMS Microbiol. Lett., 183(2): 201-207, 2000). 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 히알루론산 분해효소는 상기 히알루론산 분해효소는 Staphylococcus aureus 유래일 수 있고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 항암 단백질은 단백질 독소, 암항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 유전자(tumor suppressor gene) 또는 항혈관생성인자(antiangiogenic factor)일 수 있다. 이 때, 상기 단백질 독소는 보툴리눔 독소(Botulinum toxin), 테타누스 독소(Tetanus toxin), 시가 독소(Shiga toxin), 디프테리아 독소(Diphtheria toxin, DT), 리신(ricin), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin, PE), 사이토라이신 A(cytolysin A, ClyA), 겔로닌(gelonin)일 수 있고, 상기 경색조직 조직 치료용 단백질은 혈관생성인자일 수 있으며, 상기 혈관생성인자는 VEGF(vscular endothelial growth factor), 안지오포이에틴1(angiopoietin 1, Ang1), 안지오포이에틴2(Ang2), 형질전환 성장인자-β(transforming growth factor-β, TGF-β), 인테그린(integrin), 혈관 내피 캐드헤드린(VE-cadherin), 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator, PA), 에프린(ephrin), AC-133, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 단핵구 주화성 단백질-1(MCP-1, monocyte chemotactic protein-1), 섬유아세포 성장인자(FGF), 태반성장인자(placenta growth factor, PIGF), 또는 플라겔린(Fla)일 수 있고, 상기 플라겔린은 FlaA 또는 FlaB일 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 히알루론산 분해효소(HAase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자컨스트럭트로 형질전환되어 상기 히알루론산 분해효소를 발현하는 약독화 박테리아 균주를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 프로모터는 tac 프로모터, lac프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터, T7 프로모터, pBAD 프로모터, Tet 프로모터, trc 프로모터, pepT 프로모터, sulA 프로모터, pol 11(dinA) 프로모터, ruv 프로모터, uvrA 프로모터, uvrB 프로모터, uvrD 프로모터, umuDC 프로모터, lexA 프로모터, cea 프로모터, caa 프로모터, recN 프로모터, pagC 프로모터, hip 프로모터, ansB 프로모터, pflE 프로모터 또는 tetR/A 프로모터인, 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 약독화 박테리아 균주는 혐기성 세균일 수 있으며, 상기 혐기성 세균은 통성 혐기성 세균(facultative anaerobic bacteria) 또는 절대적 혐기성 세균(obligate anaerobic bacteria)일 수 있다. 상기 통성 혐기성 세균은 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균, 시겔라 속(Shigella sp.) 균, 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균, 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.) 균, 세라티아 속(Serratia sp.) 균, 프로테우스 속(Proteus sp.) 균, 어위니아 속(Erwinia sp.) 균, 비브리오 속(Vibrio sp.) 균, 애로모나스 속(Aeromonas sp.) 균, 포토박테리움 속(Photobacterium sp.) 균, 파스퇴렐라 속(Pasteurella sp.) 균, 해모필러스 속(Haemophilus sp.) 균일 수 있고, 상기 절대적 혐기성 세균은 악티노마이세스 속(Actinomyces sp.) 균, 박테로이데스 속(Bacteroides sp.) 균, 클로스티리디움 속(Clostridium sp.) 균, 푸소박테리움 속(Fusobacterium sp.) 균, 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus sp.) 균, 포르피로노마스 속(Porphyromonas sp.) 균, 프레보텔라 속(Prevotella sp.) 균, 프로피오니박테리움 속(Propionibacterium sp.) 균, 또는 베일로넬라 속(Veillonella sp.) 균일 수 있다. 관점을 달리하여, 상기 약독화 박테리아 균주는 그람양성균 또는 그람음성균일 수 있고, 상기 그람 양성균은 바실러스 속(Bacillus sp.) 균, 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 균, 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 속 균일 수 있고, 상기 그람 음성균은 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균 또는 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균일 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 약독화는 ppGpp 생합성의 결핍에 의해 달성될 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 ppGpp 생합성의 결핍은 relA 및/또는 spoT 유전자의 불활성화에 의해 달성될 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 암은 고형암일 수 있고, 상기 고형암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 치료제는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 제약상 허용되는 담체를 비롯한 불활성 성분을 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "제약상 허용된 담체"란 조성물, 구체적으로 의약 조성물의 활성 물질을 제외한 성분을 지칭하는 용어이다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 결합제, 붕해제, 희석제, 충진제, 활택제, 가용화제 또는 유화제 및 염이 포함된다.

실제 사용에 있어서, 본 발명의 일실시예에 따른 약학적 조성물은 통상적인 제약 조제 기술에 따른 제약 담체와 조합될 수 있다. 담체는, 예를 들어 경구 또는 (정맥내 투여를 비롯한) 비경구 투여에 바람직한 제조에 따라 광범위하게 다양한 형태를 지닐 수 있다.

아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 고형암에 걸린 개체에 치료적으로 유효한 양의 상기 신규 히알루론산 분해효소 발현 약독화 박테리아 균주를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법이 제공된다.

상기 신규 히알루론산 분해효소 발현 약독화 박테리아 균주는 비경구 투여로 상기 개체에 투여될 수 있으며, 상기 비경구 투여는 정맥내 투여(intravenous injection), 복강내 투여(intraperitoneal injection), 근육내 투여(intramuscular injection), 피하 투여(subcutaneous injection), 뇌내 투여(intraventricular injection), 두 개내 투여(intracranial injection), 뇌척수액내 투여(intracerebrospinal injection) 또는 종양내 투여(intratumoral injection)일 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예

종양 치료의 한계를 극복하기 위해, 바이러스, DNA, 면역 세포 및 세균을 이용한 방법이 시도되고 있다. 약독화 Salmonella typhimurium과 같은 여러 약독 화 박테리아는 종양 표적 조직과 종양 덩어리를 억제 할 수 있다. 세균이 종양 치료 활성을 향상시키기 위해, 독소, 효소, 각종 종양 표적 바이오 마커에 대한 면역 조절 물질등의 종양치료물질을 발현 하도록 설계되어야 한다. 종양 세포와 조직의 성장은 종양 조직의 세포 외 길질(ECM)의 형성에 의존하기 때문에 ECM 또한 종양의 치료를 위한 표적물질이다. 히알루론산은 ECM의 다당류 성분이고 종양 조직에 항암 약물의 확산을 억제하는 상당한 양의 물을 흡수함으로써 종양 조직 간 분압을 증가시킨다. 본 연구에서는 세균을 이용하여 ECM을 분해시켜 종양 치료제의 활성을 증가시키는 가능성을 평가하였다. 본 발명자들은 이를 위해 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래의 히알루론산 분해효소(HAase)를 pGEM-T 벡터에 클로닝했다. 이 벡터에 의해 형질 전환 된 E. coli MG1655 및 ppGpp 결손 S. typhimurium(SL)는 한천 배지에서 히알루론산을 분해하는 효소 활성을 보였다. 세균 분쇄 상층액은 대조 세균에 비해 16 배 이상 히알루론산 분해효소 활성을 보였다. 히알루론산 분해효소를 과발현하는 세균의 치료능력을 조사하기 위하여 4T-1 유방암 및 CT26 대장암 세포가 피하에 접목된 종양 모델 쥐에서 정맥 주사하여 날짜 별로 종양의 크기를 조사하였다. 히알루론산 분해효소 과발현 발광 약독화 S. typhimurium(SLlux/HAase)는 대조군 세균과 비슷한 날짜별 종양 표적효과를 보였으며 치료효과도 큰 차이를 보이지 않았다. 하지만, 세균으로부터 HAase 발현 후, 4T-1 종양 조직에 ECM의 분해가 관찰 되었다. 종합해 보건데, 히알루론산 분해효소에 의한 종양 조직의 ECM 저하는 화학적 치료제의 효과를 증가함으로써 치료 효과에 유익할 것이다.

실시예 1: 균주와 플라즈미드의 제조 배양

1-1: pGEMT/hysA로 HAase 발현

본 발명의 일 실시예에서 E. coli 균주와 DH5α MG1655, S. aureus (ATCC 29213), S.typhimurium ΔppGpp(relA ^- , spoT ^- )(SL, SHJ2037, KCTC 10787BP), S. typhimurium ΔppGpp-Lux(lux ⁺,relA ^- ,spoT ^- )(SLlux, 대한민국 공개특허공보 제2011-0095528호)는 LB 배지에서 배양되어 클로닝과 다른 실험에 사용되었다. HAase 유전자를 얻기위해서, LB 배지에서 배양된 S. aureus를 원심분리하여 증류수에 용해하였다. 가열후, 상등액은 유전자를 증폭시키기 위하여 중합연쇄반응기(PCR)에 탬플레이트로 사용하였다. 본 실험에서 사용한 두 프라이머: S.a_HAase_NcoI(5'-GCC ATG GCC ACA TAT AGA ATG AAG AAA TGG CAA AAA TTA TCC ACC-3', 서열번호 2) 및 S.a_HAase_PmeI(5'-CCG TTT AAA CTT ATT TAG TTA ATT CAA AGT GTA CGC CGG ATT C-3', 서열번호 3). 2.43 kb의 DNA 단편은 분리되어 직접 pGEM-T easy vector (Promega,USA)에 클론되어 pGEMT/hysA로 명명하였다. HAase 발현은 IPTG를 이용하여 유도되었으며, 상기 pGEMT/hysA의 유전자 지도는 도 2A에 도시되어 있다.

1-2: pTet-HAase ClyA 듀얼 발현

상기 실시예 1-1에 기술한 방법과 같이 제조한 DNA 분절은 분리되어 A와 R 방향으로 이중발현을 하도록 직접 pGEM-T easy vector(Promega,USA)에 클론되어 pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)로 명명하였다. HAase 발현은 pJL39를 이용하여 유되되었으며, 상기 pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 제작방법은 개략적으로 도 2B에 도식화하였고, HAase 발현은 독시사이클린(doxocycline) 200 ng/ml로 유도되었으며, 상기 pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)유전자 지도는 도 2C에 도시 되었고, 상기 pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 pBAD-Hollin & Lysin 시스템은 도 2D에 도시되었다.

실시예 2: HAase의 효소활성 측정

2-1: HA 한천배지에서 효소활성 측정

HA를 함유하는 한천배지는 Hart 등의 방법에 의해 제조되었다(Hart et al., Int. J. Microbiol., 614371, 2009). 6 g의 tryptic soy broth(Becton Dickinson, USA)를 120 ml의 물에 용해하여, 1.2 g의 아가로즈를 더한 후, 멸균기로 멸균처리하였다. 50℃ 정도로 한천을 냉각하는 동안에 40 ml of 5% (w/v) BSA, 40 ml of 1 mg/ml HA 및 200 μl of 100 mg/ml 앰피실린(ampicillin)를 첨가하여 10 cm 패트리디시에 부었다. pGEMT/hysA로 형질전환된 균주는 HA 한천배지에 심어서 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 2 M 아세트산 5 ml를 더한 후, HAase 발현 균락 주위에 투명한 원형이 관찰되었다. pGEMT/hysA를 세균, E coli 균주 MG1655, SL 및 S_Llux를 한천배지에 배양한 후 관찰한 결과들은 도 3에 나타났으며, 도 3A는 pGEMT/hysA로 형질전환된 S. typhimurium (SL and SLlux) 균주와 E. coli (MG1655) 균주에서 발현된 히알루론산 분해효소(HAase)의 활성을 나타내고: 1: S. typhimurium SL; 2: pGEMT/hysA(SL/HAase) 형질전환 SL; 3: S. typhimurium SLlux; 4: pGEMT/hysA (SLlux/HAase) 형질전환 SLlux; 5: E. coli (MG1655); 6: pGEMT/hysA (MG1655/HAase) 형질전환 MG1655, 도 3B는 SLlux/HAase의 luciferase의한 세포 내 발광 여부를 관찰한 결과를 나타낸다.

2-2: pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 In vitro HA 효소활성 측정

본 발명의 일 실시예에서 E. coli 균주와 DH5α MG1655를 포함하고, 상기 실시예 2-1에 기술한 방법에 따라서 200 ng/ml의 독시사이클린(doxycycline)을 첨가한 HA 한천배지에서 DH5α/pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)를 배양한 후 관찰하였다. 도 3C에서 보는 바와 같이, HAase 발현 균락 주위에 투명한 원형이 관찰되었다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 E. coli 균주와 S.typhimurium ΔppGpp(relA ^- , spoT ^- )(SL, SHJ2037, KCTC 10787BP)를 포함하고, 상기 실시예 2-1에 기술한 방법에 따라서 doxycycline을 첨가하지 않은 것을 음성대조군으로 하여, 200 ng/ml의 독시사이클린(doxycycline)을 첨가한 HA 한천배지에서 SL/pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)를 배양한 후 관찰하였다. 도 3D에서 보는 바와 같이, HAase 발현 균락 주위에 투명한 원형이 관찰되었다.

2-3: 균분해산물을 이용한 효소활성 측정

HAase 효소활성의 시험관내 분석은 Shin et al.(Kor. Chem. Eng. Res., 46: 764-768, 2008) 방법에 의해 측정되었다. pGEMT/hysA로 형질전환된 균주를 앰피실린을 보충한 LB 배지에서 밤새 배양하였다. 인산완충용액(PBS)으로 단순세척후, 1 ml(1 OD₆₀₀/ml)의 세균을 초음파로 분해하여 원심분리하였다. 상등액은 0.45 μm-미세여과기(Pall Corporation, Korea)로 멸균하고 효소 샘플들을 분석하였다. 300 μl 상등액을 200 μl의 반응 완충액[0.02 M sodium phosphate buffer(pH 6.9), 0.45% NaCl 및 1mg/ml bovine serumalbumin(BSA)]과 혼합하였다. 그런 후, 500 μl의 기질용액(0.4 mg/ml HA)과 혼합하여 37℃에서 30분간 배양하였다. 효소반응은 5 ml의 산성용액(0.1 M acetic acid and 0.1% BSA)을 더하여 37℃에서 10분간 배양 한 후 종료하였다. HA 분해는 600 nm에서 분광광도계로 측정하였다. 본 발명의 일실시예에서 효소단위(AU)는 아래와 같이 정의되었다:

AU = [(OD₆₀₀기질이 있는 샘플)-(OD₆₀₀기질이 없는 샘플)]/

[(OD₆₀₀기질이 있는 대조군)-(OD₆₀₀기질이 없는 대조군)]

그 결과 도 4A에 도시된 바와 같이, 히알루론산 분해효소(HAase)를 암호화하는 유전자로 형질전환되지 않은 비형질전환 균주들(SL, SLlux 및 MG1665)의 경우 탁도가 그대로 유지된 반면, 히알루론산 분해효소(HAase)를 암호화하는 유전자로 형질전환된 균주들(SL/HAase, SLlux/HAase 및 MG1665/HAase)의 경우 반응액이 투명해졌다. 이는 이들 형질전환 균주에서 HAase가 발현됨에 따라 반응액 내에 존재하는 히알루론산이 분해되었음을 나타내는 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 균주들은 정상적으로 활성 형태의 HAase를 발현하고 있음을 알 수 있다.

2-4: pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 In vitro HA 효소활성 정량분석

상기 실시예 2-3의 기술한 방법에 따라서 HA 효소활성을 정량하였다. 그 결과 도 4C에 도시된 바와 같이, doxycycline이 처리된 pTet-HAase ClyA(A)-HAase(R)의 효소활성이 제일 큰 것으로 나타났다.

실시예 3: 이식종양 마우스 모델 및 균주의 투여

종양모델 마우스는 Jiang 등이 보고한 방법에 의해 제작하였다(Jiang and Park, Mol. Ther. 21: 1985-1995, 2013). 마우스 대장암 CT26 세포(ATCC^® CRL-2638™)와 마우스 유방암 4T-1 세포는 10% 태아 소혈청(FBS)(Gibco BRL,USA), 페니실린 100 units/ml 및 스트렙토마이신 0.1 mg/mL(Gibco BRL, USA)를 보충한 DMEM(Gibco, USA)배지에서 37℃, 5% CO²의 배양기에서 배양하였다. 트립신/EDTA으로 탈착한 후, 세포들을 PBS로 세척하였고 세포수는 헤마토사이토미터로 계수하였다. 5-6주령 수컷 BALB/c 마우스는 마우스공급자(Orient Company, Korea)로부터 공급받았다. 이 마우스들은 종양이식모델을 제작하는데 이용하였다. 종양세포들(5x10⁵)은 피하에 주입하였다. 종양부피(mm²)는 수식 (L*H*W)/2(여기서 L은 길이, W는 넓이, H는 종양의 높이)을 이용하여 측정하였다. 100-150 mmㅃ정도의 종양크기가 되는데에는 일주일이 걸렸다. 균주는 앰피실린으로 보충된 LB 배지에서 밤새 배양하여 두 번 세척하고, PBS로 현탁하였다. 마우스 당 100 μl의 균주(3x10⁷cfu/ml)를 꼬리정맥으로 주입하였다. 우선, 도 5A에 나타난 바와 같이, lux 유전자만 발현하는 SLlux와 HAase를 암호화하는 유전자가 형질전환된 SLlus/HAase 모두 균체 내에서 동일한 정도의 생체발광을 나타냈으며, 이들을 각각 대장암 세포인 CT-26 주입 모델 동물(도 5B)과 유방암 세포인 4T-1 주입 모델 동물(도 5C)에 투여한 결과, 종양조직에 축적됨을 확인하였다. 특히 HAase를 발현하는 형질전환 살모넬라 균주(SLlux/HAase)를 4T-1 유방암 세포를 이식한 동물 모델에 투여한 경우 비형질전환 살모넬라 균주(SLlux)보다 더 오랫동안 생물발광을 나타내, 이들 형질전환 균주가 종양 조직내로 더 잘 침투하고 있음을 알 수 있었다. 이에 본 발명자들은 실제 이들 HAase 유전자를 암호화하는 유전자로 형질전환된 균주를 투여하는 경우 종양 조직 내에 이들 균주들이 잘 축적되는지 확인하기 위해 세균 주입 9일 후 종양조직을 적출하여 이에 대한 생체발광 조영을 수행하였다. 그 결과 도 5D에 도시된 바와 같이, SL만을 투여한 모델 동물에서는 생체발광이 거의 나타나지 않은 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 살모넬라 균주(SLlux/HAase)를 투여한 모델 동물에서는 상당히 강한 생체발광이 확인되었다. 이는, 상기 도 5C에 나온 결과를 확인시켜주는 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 균주가 종양조직 특히 유방암 조직에 보다 효율적으로 침투하여 종양 조직 내에서 오래동안 생존할 수 있음을 의미하는 것이다. 이는 이러한 특성을 이용할 경우 다른 항암제와의 병용투여를 통해 항암효과를 극대화하거나 또는 투여되는 형질전환 균주에 다른 항암 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 형질전환시켜 이들 형질전환 균주로부터 발현되는 상기 항암 단백질의 항암 활성을 극대화할 수 있음을 시사하는 것이다.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 균주들을 상기 모델 동물들에 투여한 후 시간의 경과에 따른 종양의 크기를 관찰한 결과, 도 6 및 7에 도시된 바와 같이, 비형질전환 살모넬라 균주(SLlux) 및 형질전환 살모넬라 균주(SLlux/HAase) 모두 유사한 정도의 항암활성이 나타남을 확인하였다. 이는 종양조직으로의 침투용이성을 별론으로 본 발명의 일 실시예에 따른 HAase 발현 균주 자체의 항암활성은 일반 약독화 살모넬라 균주보다 더 뛰어난 것은 아님을 시사하는 것이다.

실시예 4: 면역조직화학적 염색

본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 HAase 발현 균주가 투여된 종양조직에서 실제 HAase가 존재하는지 확인하기 위해 히알루론산에 특이적이적으로 결합하는 단백질을 이용하여 면역조직화학분석을 수행하였다. 구체적으로 상기 실시예 3에서 균주를 투여한 종양모델 동물로부터 균주 투여 4일 후, 종양조직을 적출하여 3.7% 포름알데하이드로 2시간 동안, 30% 슈크로즈로 상온에서 밤새 고정하였다. 적출된 종양은 종단으로 절단하여 포매제인 OTC(optimal cutting temperature) 화합물 내에 포매처리하였다. 면역형광염색은 4 μm 두께로 절편화된 OTC 포매 조직을 아미노프로필트리에톡시실란(aminopropyltriethoxysilane)으로 코팅한 슬라이드 위에 적재한 후, -20℃에 보관된 아세톤 용액에 담궈 15분간 고정을 하였다. 5% BSA가 들어있는 PBS-T 용액에서 차단반응(blocking)을 수행하고 난 후, 슬라이드를 1:200으로 희석된 스트렙타비딘-결합 히알루론산 결합단백질(HABP, 5 μg/mL, MerckMillipore, USA)와 스텝타비딘-결합 항-Salmonella 항체(rabbit IgG)로 4℃에서 반응시켰다. 이후, PBS-T에서 0.1% BSA로 3회 세척 후, 상온에서 2시간동안 1:200으로 희석된 염소 항-토끼 항체-FITC와 비오틴-결합 PE 형광 dye을 넣고 염색하였다. 최종적으로 DAPI 염색을 실시한 후 공초첨 형광현미경을 사용하여 관찰하였다.

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 음성대조군인 PBS 투여군과 비형질전환 균주인 SLlux를 투여한 종양 모델 동물로부터 적출된 종양조직에서는 히알루론산이 강하게 검출된 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 HAase 발현 균주인 SLlux/HAase를 투여한 종양 모델 동물로부터 적출된 종양조직의 괴사부위에서는 히알루론산이 현저하게 감소되어 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: Hyaluronidase 발현 박테리아의 독소루비신(Doxorubicin)복합 암치료능

이에 본 발명자들은 종양조직으로 침투가 문제가 되어 약효가 떨어지는 대표적인 항암제인 독소루비신을 본 발명의 일 실시예에 따른 HAase 발현 형질전환 균주와 병용처리시 상승작용이 나타나는지 확인하기 위해, 동물 모델로 4T-1 종양 마우스를 사용하여, 실험군을 음성대조군으로 PBS 투여군, 독소루비신(5 mg/kg 주사) 단독 처리군, Slux 단독 처리군, Slux + 독소루비신 처리군, Slux/HAase 단독 처리군, Slux/HAase + 독소루비신 처리군으로 나누어 독소루비신에 의한 생체내 발광이미지와 투여후 시간의 경과에 따른 종양의 크기를 분석하였다. 구체적으로 생체내 발광이미지를 얻기 위하여 마취한 동물들을 냉각된 전하쌍 장치 카메라를 장착한 IVIS 이미지시스템(Caliper Life Sciences, USA)의 광차단 챔버에 두었다. 광방출균으로부터 방출된 광자를 포집하여 1분동안 통합하였다. 광자수를 가리키는 가상색 이미지를 Living Image software v. 2.50(Caliper Life Science, USA)를 이용하여 수득한 마우스의 이미지 위에 중첩시켰다.

그 결과 도 9 및 10에 나타난 바와 같이, 4T-1 종양모델 마우스에서 비형질전환 살모넬라(SL) 단독으로는 종양성장을 유의하게 억제하지 못하였고, 독소루비신 단독 처리시 종양성장이 억제되었으나, 비형질전환 살모넬라 + 독소루비신 투여군(SL + Doxorubicin)과 HAase 발현 형질전환 살모넬라(SL-HAase)의 효과와 유사한 정도를 나타냈다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 HAase 발현 형질전환 살모넬라(SL-HAase) + 독소루비신의 병용 투여군에서는 종양조직이 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 HAase 유전자 형질전환 약독화 균주가 단독으로는 비형질전환 살모넬라 + 독소루비신 병용 투여군이나 독소루비신 단독 투여군보다 더 나은 항암활성을 나타내지는 않지만 종래의 항암제와 함께 병용투여할 경우 상승작용을 나타냄을 시사하는 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 HAase 발현 박테리아는 종래의 항암제와의 병용 요법에 사용되거나 또는 사이토라인신 A(ClyA)나 플라겔린 B(FlaB)와 같은 항암 단백질을 동시에 발현할 수 있도록 유전자조작될 경우 매우 효율적인 항암치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

통계분석

본 발명의 실시예에서 사용된 통계분석은 SPSS 21.0 통계패키지(SPSS, USA)를 이용하여 수행하였다. 양쪽분포 Student's t-tests 대조군과 치료군사이의 일차종양성장에서 통계적 차이점의 중요성을 결정하는데 사용하였다. 모든 분석에 P 값 < 0.05 은 중요하게 고려되었다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현되었다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel bacteria expressing hyaluroniase and use thereof <130> PD15-5203 <160> 3 <170> KoPatentIn <210> 1 <211> 809 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Met Thr Tyr Arg Met Lys Lys Trp Gln Lys Leu Ser Thr Ile Thr Leu 1 5 10 15 Leu Met Ala Gly Val Ile Thr Leu Asn Gly Gly Glu Phe Arg Ser Ile 20 25 30 Asp Lys His Gln Ile Ala Val Ala Asp Thr Asn Val Gln Thr Pro Asp 35 40 45 Tyr Glu Lys Leu Arg Asn Thr Trp Leu Asp Val Asn Tyr Gly Tyr Asp 50 55 60 Lys Tyr Asp Glu Lys Asn Asp Ala Met Lys Lys Lys Phe Asp Ala Thr 65 70 75 80 Glu Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Ser Ser Met Lys Thr Glu Ser Gly 85 90 95 Arg Thr Tyr Leu Trp Asp Ser Ala Lys Asp Leu Asp Asn Lys Ser Ala 100 105 110 Asp Met Thr Arg Thr Tyr Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ala Glu Ala Met 115 120 125 Arg His Pro Lys Thr Thr Leu Asn Thr Asp Glu Asn Lys Lys Lys Val 130 135 140 Lys Asp Ala Leu Glu Trp Leu His Lys Asn Ala Tyr Gly Lys Glu Pro 145 150 155 160 Asp Asn Lys Val Lys Glu Leu Thr Glu Asn Phe Lys Ile Thr Asp Ser 165 170 175 Ser Lys Lys Lys Ala Leu Asn Trp Trp Asp Tyr Glu Ile Gly Thr Pro 180 185 190 Arg Ser Leu Thr Asn Thr Leu Ile Leu Leu Asn Asp Gln Phe Ser Asn 195 200 205 Glu Glu Lys Lys Lys Phe Thr Ala Pro Ile Lys Thr Phe Ala Pro Lys 210 215 220 Ser Asp Glu Ile Leu Ser Ser Val Gly Lys Ala Glu Pro Ala Lys Gly 225 230 235 240 Gly Asn Leu Val Asp Ile Ala Lys Val Lys Leu Leu Glu Ser Ile Ile 245 250 255 Glu Glu Asp Lys Asp Met Met Lys Asn Ser Ile Asp Ser Phe Asn Lys 260 265 270 Val Phe Thr Tyr Val Gln Asp Ser Ala Thr Asp Lys Glu Arg Asn Gly 275 280 285 Phe Tyr Lys Asp Gly Ser Tyr Ile Asp His Lys Asp Val Pro Tyr Thr 290 295 300 Gly Ala Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Gly Ile Ser Gln Met Met Pro 305 310 315 320 Met Ile Lys Glu Thr Pro Phe Asn Asp Lys Thr Gln Asn Asn Thr Thr 325 330 335 Leu Lys Ser Trp Ile Asp Asp Gly Phe Leu Pro Leu Ile Tyr Lys Gly 340 345 350 Glu Met Met Asp Leu Ser Arg Gly Arg Ala Ile Ser Arg Glu Asn Glu 355 360 365 Thr Ser His Ser Ala Ser Ala Thr Val Met Lys Ser Leu Leu Arg Leu 370 375 380 Ser Asp Ala Met Asp Asp Ser Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Lys Ile Val 385 390 395 400 Lys Thr Ser Val Lys Ser Asp Ser Ser Tyr Gly Gln Asn Asp Thr Leu 405 410 415 Ser Ser Tyr Ser Asp Ile Ser Lys Met Lys Ser Leu Met Glu Asp Ser 420 425 430 Thr Ile Ser Thr Asn Gly Leu Thr Gln Gln Leu Lys Ile Tyr Asn Asp 435 440 445 Met Asp Arg Val Thr Tyr His Asn Lys Asp Leu Asp Phe Ala Phe Gly 450 455 460 Leu Ser Met Thr Ser Lys Asn Val Ala Arg Tyr Glu Ser Ile Asn Gly 465 470 475 480 Glu Asn Leu Lys Gly Trp His Thr Gly Ala Gly Met Ser Tyr Leu Tyr 485 490 495 Asn Ser Asp Val Lys His Tyr Arg Asp Asn Phe Trp Ala Thr Ala Asp 500 505 510 Met Lys Arg Leu Ala Gly Thr Thr Thr Leu Glu Asn Glu Glu Pro Lys 515 520 525 Gly Thr Asp Val Lys Lys Ser Ser Lys Thr Phe Val Gly Gly Thr Lys 530 535 540 Phe Asp Asp Gln His Ala Ser Ile Gly Met Asp Phe Glu Asn Gln Asp 545 550 555 560 Lys Thr Leu Thr Ala Lys Lys Ser Tyr Phe Ile Leu Asn Asp Lys Ile 565 570 575 Val Phe Leu Gly Thr Gly Ile Lys Ser Thr Asp Ser Ser Lys Asn Pro 580 585 590 Val Thr Thr Ile Glu Asn Arg Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr 595 600 605 Asp Asp Lys Gln Thr Thr Ala Ser Asp Asn Gln Gly Thr Asn Ser Val 610 615 620 Phe Leu Glu Ser Thr Asn Lys Pro Lys Asn Asn Ile Gly Tyr His Phe 625 630 635 640 Leu Asn Glu Ser Lys Ile Thr Val Lys Lys Glu Ser His Thr Gly Lys 645 650 655 Trp Ser Asp Ile Asn Lys Ser Gln Lys Gln Asp Ser Lys Thr Asn Gln 660 665 670 Tyr Tyr Glu Val Thr Gln Lys His Ser Asn Thr Asp Ser Lys Tyr Ala 675 680 685 Tyr Val Leu Tyr Pro Gly Leu Ser Lys Asp Asp Phe Asn Thr Lys Lys 690 695 700 Asp Lys Val Thr Val Val Lys Gln Asp Asp Asp Phe His Val Val Lys 705 710 715 720 Asp Asn Glu Ser Val Trp Ala Gly Val Asn Tyr Ser Asn Ser Thr Gln 725 730 735 Thr Phe Asp Ile Asn Asn Thr Lys Val Glu Val Lys Ala Lys Gly Met 740 745 750 Phe Ile Leu Lys Asn Lys Asp Asp Asn Thr Tyr Glu Cys Ser Phe Tyr 755 760 765 Asn Pro Glu Ser Thr Asn Thr Ala Ser Asp Ile Glu Ser Lys Ile Ser 770 775 780 Ile Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Asn Lys Asn Thr Ser Thr Ser Asn Glu 785 790 795 800 Ser Gly Val His Phe Glu Leu Thr Lys 805 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S.a_HAase_NcoI forward primer <400> 2 gccatggcca catatagaat gaagaaatgg caaaaattat ccacc 45 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S.a_HAase_PmeI reverse primer <400> 3 ccgtttaaac ttatttagtt aattcaaagt gtacgccgga ttc 43

Claims

히알루론산 분해효소(HAase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트로 형질전환되어 상기 히알루론산 분해효소를 발현하는 약독화 박테리아 균주 및 항암 화합물을 포함하며, 히알루론산은 포함하지 않는, 암 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프로모터는 tac 프로모터, lac프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터, T7 프로모터, P_BAD 프로모터, Tet 프로모터, trc 프로모터, pepT 프로모터, sulA 프로모터, pol 11(dinA) 프로모터, ruv 프로모터, uvrA 프로모터, uvrB 프로모터, uvrD 프로모터, umuDC 프로모터, lexA 프로모터, cea 프로모터, caa 프로모터, recN 프로모터, pagC 프로모터, hip 프로모터, ansB 프로모터, pflE 프로모터 또는 tetR/A 프로모터인, 암 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산 분해효소는 그람음성균 또는 그람양성균 유래인, 암 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 그람양성균은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균, 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 균, 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.) 균, 클로스트리디움 속(Clostridium sp.) 균, 펩토스트렙토코커스 속(Peptostreptococcus sp.) 균, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균, 또는 프로피니박테리움 속(Propinibacterium sp.) 균인, 암 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 히알루론산 분해효소는 Staphylococcus aureus 유래인, 암 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 히알루론산 분해효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는, 암 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약독화 박테리아 균주는 P_BAD 프로모터에 작동가능하게 연결된 홀린 및 라이신 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 추가로 포함하여, 아라비노스로 유도시 세포벽이 용해되어 상기 히알루론산 분해효소를 대량방출하는, 암 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약독화 박테리아 균주는 히알루론산 분해효소 외에 항암 단백질을 추가적으로 발현하도록 형질전환된, 암 치료용 약학적 조성물.
삭제
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제8항에 있어서,
상기 항암 단백질은 단백질 독소, 암항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 유전자(tumor suppressor gene) 또는 항혈관생성인자(antiangiogenic factor) 또는 플라겔린인, 암 치료용 약학적 조성물.
제13항에 있어서,
상기 단백질 독소는 사이토라이신 A(ClyA)인, 암 치료용 약학적 조성물.
제13항에 있어서,
상기 플라겔린은 플라겔린 B(FlaB)인, 암 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 히알루론산 분해효소를 암호화하는 유전자 및 상기 항암 단백질을 암호화하는 유전자가 하나의 유전자 컨트스럭트 내에서 tet 프로모터의 양 옆에 연결됨으로써 양방향으로 발현되는, 암 치료용 약학적 조성물.
제16항에 있어서,
상기 항암 단백질은 사이토라이신 A(ClyA) 또는 플라겔린 B(FlaB)인, 암 치료용 약학적 조성물.
제8항, 및 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
P_BAD 프로모터에 작동가능하게 연결된 홀린 및 라이신 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 추가로 포함하여, 아라비노스로 유도시 세포벽이 용해되어 상기 히알루론산 분해효소 및 상기 항암 단백질을 대량방출하는, 암 치료용 약학적 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 항암 화합물은 안트라사이클린(anthracycline), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 악티노마이신 D(actinomycin D), 카르보틀라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 빈크리스틴(vincristine) 또는 탁솔(taxol)인, 암치료용 약학적 조성물.