KR101729861B1 - 나노-꽃잎 구조물을 포함하는 플라즈몬 입자의 제조방법 및 이에 따라 제조된 입자의 용도 - Google Patents

나노-꽃잎 구조물을 포함하는 플라즈몬 입자의 제조방법 및 이에 따라 제조된 입자의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 제1금속 표면을 가진 기재 표면 상에 비등방적으로 분지 및 성장된 금속 나노 구조물의 제조방법으로서, 상기 기재 상에, 제1금속 표면과 폴리도파민의 카테콜기와의 결합을 통해, 폴리도파민 코팅층을 형성하는 제1단계; 및 상기 금속 표면의 촉매작용을 통해 폴리도파민의 카테콜기를 퀴논으로 산화시켜, 폴리도파민 코팅층의 산화적 붕괴로 인해 산화적 나노박리를 유도하면서, 제2금속 전구체를 환원시켜 제1금속 기재 표면 상에 제2금속 나노 구조물을 비등방적으로 분지 및 성장시키는 제2단계를 포함하는 분지된 나노 구조물 제조방법 및 이와 같이 제조된 금속 나노 구조물을 포함하는 플라즈몬 입자의 광역학적 및/또는 광열 치료용 광감응제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

나노-꽃잎 구조물을 포함하는 플라즈몬 입자의 제조방법 및 이에 따라 제조된 입자의 용도{A method for preparation of a plasmon particle with core-petal nanostructure and use of the prepared particle}
본 발명은 적어도 제1금속 표면을 가진 기재 표면 상에 비등방적으로 분지 및 성장된 금속 나노 구조물의 제조방법으로서, 상기 기재 상에, 제1금속 표면과 폴리도파민의 카테콜기와의 결합을 통해, 폴리도파민 코팅층을 형성하는 제1단계; 및 상기 금속 표면의 촉매작용을 통해 폴리도파민의 카테콜기를 퀴논으로 산화시켜, 폴리도파민 코팅층의 산화적 붕괴로 인해 산화적 나노박리를 유도하면서, 제2금속 전구체를 환원시켜 제1금속 기재 표면 상에 제2금속 나노 구조물을 비등방적으로 분지 및 성장시키는 제2단계를 포함하는 분지된 나노 구조물 제조방법 및 이와 같이 제조된 금속 나노 구조물을 포함하는 플라즈몬 입자의 광역학적 및/또는 광열 치료용 광감응제로서의 용도에 관한 것이다.
플라즈몬 금속 나노구조물은 강하고 조절가능한 광학적 성질 및 바이오센싱, 바이오이미징 및 치료적 적용에 사용 가능성으로 인해 주목받고 있다. 광역학적 치료(photodynamic therapy; PDT) 및 광열 치료(photothermal therapy; PTT)와 같은 상기 플라즈몬 나노구조물을 이용한 근적외선(near-infrared; NIR)-매개 광-치료적 접근법은 높은 공간분해능, 향상된 표적 선택성, 감소된 부작용, 외과적 수술을 필요로 하지 않는 비침습성, 빠르고 효과적인 치료 및 종래 암치료에 비해 낮은 비용을 포함한 다양한 장점을 갖는다. PDT는 특정 파장의 빛에 위치 선택적인 노출을 이용하여 정상 조직 산소(3O2)를 고반응성 세포독성 단일항 산소(1O2)로 전환하는 유기 광감응제(photosensitizer; PS) 분자의 사용과 관련된다. 고도로 효과적인 PDT를 위하여, 상기 사용하는 빛의 파장은 NIR 영역(700-1100 nm; 혈액 및 조직의 간섭을 회피하기 위한 광치료적 NIR 윈도우) 내의 PS의 최대 흡수 파장과 일치하여야 한다. 불행하게도, 치료적 PS 분자 대부분은 가시광선 영역의 빛을 흡수하며 장기간 빛에 노출시 광분해하는 경향이 있으며, 지속적인 PDT 치료는 조직 산소 결핍으로 심각한 국부적 저산소증을 유발하여 추가적인 PDT 수행을 저해할 수 있다. 반면, PTT 법은 지속파 또는 펄스 레이저에 노출되어 이상고열(hyperthermia) 및/또는 이어지는 작은 충격파를 유도하여 국부적 온도 상승 의존적으로 자멸성(apoptotic) 또는 괴사성(necrotic) 암세포 사멸을 야기하는 금 나노입자(AuNPs)와 같은 플라즈몬 나노입자를 사용한다. PTT 법을 적용하는 경우에도 생체 내 수분 또는 적혈구 등에 의한 흡수로 인해 상기 나노입자가 흡수하는 빛의 세기가 감소될 수 있는 단점을 극복하기 위하여는 NIR 영역의 빛을 사용하는 것이 바람직하다. 암세포의 효과적인 고열 괴사성 파괴는 매우 높은 온도(＞70℃)가 관여하므로 정상 세포에 이차적인 손상 및 원치않는 나노구조물의 변형을 야기할 수 있다. 덜 침습적인 암세포 사멸을 위해, 저온(＜45℃)-기반 PTT 전략을 사용할 수 있다. 나아가, 지속적인 치료 조건 하에서, 암세포는 추가적인 치료에 대한 저항성을 획득할 수 있다.
이러한 이유로, 최근 개발되고 있는 다양한 형태의 나노구조물과 관련된 PDT-PTT 결합 플랫폼을 개발하고자 하는 시도가 있다. 이와 같은 이들 나노구조물은 활성 산소종(ROS)-매개 세포 내 손상과 함께 온건한 온열요법(moderate hyperthermia)을 사용할 수 있게 한다. PS 및 플라즈몬 나노구조물의 흡수파장 간의 가능한 불일치, PS와 나노구조물 간의 에너지전이, 낮은 수행온도 또는 비-열적 처리에 대한 요구, 나노구조물의 독성, 및 복합체 콘쥬게이션 화학을 포함하여 여전히 해결해야 할 과제들이 있으며, 이들 모두는 실제 적용을 위해 상기 하이브리드 나노구조물-기반 접근법의 사용으로 설명될 수 있다. 특히, 효과적인 광열 나노변환기(photothermal nanotransducer)는 높은 광학적 흡수 단면적(optical absorption cross-section), 생체적합성(biocompatibility), 용이한 합성, 고도의 구조적 정확성 및 합성수율, 및 NIR 영역에서 플라즈몬 조절가능성(tunability)을 가져야 한다. 지금까지, 유기 PS 분자를 필요로 하지 않는 잠재적 NIR 레이저-기반 암 광치료를 위하여 NIR-활성 플라즈몬 나노구조물의 ROS 생산력을 이의 내재적인 온열효과(hyperthermic effect)와 조합하고자 하는 거의 없었다.
나노스타, 나노플라워 및 나노레이스와 같이 분지된 플라즈몬 나노구조물은 가까이 위치하고 커플된 예리한 나노특징(nanofeature)에 의해 입자 내부에 강한 전자기장을 형성할 수 있다. 이와 같은 강한 플라즈몬 커플링과 넓은 표면적은 표면 증강 라만 분산(surface-enhanced Raman scattering; SERS), 광열 전환(photothermal conversion) 및 촉매 작용(catalysis)에 유용한 특징이다. 이와 같은 분지된 플라즈몬 나노구조물은 유용한 PDT 및 PTT 기질일 수 있으나, 고도의 구조적 정확성 및 조절가능성을 갖고 비등방적으로 분지된 Au 나노구조물을 성장시키기 위한 용액상 대규모 합성법은 Au 원자의 높은 확산계수 및 면심입방 면내기 경향(face-centered cubic faceting tendency)으로 인해 구현하기 어렵다. 이들 나노분지의 비등방성 성장은 반응속도론 지배적이며 고에너지 면의 성장은 저에너지 면의 성장보다 더 빠른 반응에서는 거의 나타나지 않는다. 나아가, 구조적으로 재현가능한 균일한 나노구조물을 대량으로 생산하기 위하여 계면활성제를 변화시키면서 이러한 반응 조건을 최적화하는 것은 어렵다.
[선행기술문헌]
ACS Nano. 7(10), 9384-9395
Nanomedicine(Lond). 8(1), 17-28
Electrochimica Acta 55(6), 2004-2009
이에 본 발명자들은 폴리도파민(pdop)의 산화적 나노박리 화학을 이용하여 금속 표면 상에 조절가능한 구조적 특성 및 밀도를 갖는 플라즈몬 나노분지된 구조물의 조절된 성장 및/또는 합성을 달성하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 금속 표면을 갖는 기재 표면 상에 카테콜기를 이용한 결합을 통해 폴리도파민 코팅층을 형성하고 금속 표면의 촉매작용을 통해 카테콜기를 퀴논으로 산화시켜 폴리도파민 코팅층의 산화적 박리를 유도하는 동시에 금속 전구체를 환원시켜 상기 금속 기재 표면 상에 비등방적으로 분지 및/또는 성장된 금속 나노 구조물을 형성함으로써 나노-꽃잎 구조물을 제조하였으며, 상기 나노-꽃잎 구조물은 우수한 광열효과 및 ROS 생성능을 가지므로 비침습적 항암치료법인 PTT/PDT에 효과적인 광감응제로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 양태는 적어도 제1금속 표면을 가진 기재 표면 상에 비등방적으로 분지 및 성장된 금속 나노 구조물의 제조방법으로서, 상기 기재 상에, 제1금속 표면과 폴리도파민의 카테콜기와의 결합을 통해, 폴리도파민 코팅층을 형성하는 제1단계; 및 상기 금속 표면의 촉매작용을 통해 폴리도파민의 카테콜기를 퀴논으로 산화시켜, 폴리도파민 코팅층의 산화적 붕괴로 인해 산화적 나노박리를 유도하면서, 제2금속 전구체를 환원시켜 제1금속 기재 표면 상에 제2금속 나노 구조물을 비등방적으로 분지 및 성장시키는 제2단계를 포함하는 분지된 나노 구조물 제조방법을 제공한다.
본 발명은 금속 표면을 가진 기재 표면 상에 비등방적으로 크기와 밀도가 제어되도록 분지 및 성장된 금속 나노 구조물을 제조하기 위하여, 상기 기재 상에 폴리도파민 코팅층을 도입하였다. 상기 폴리도파민 코팅층은 도파민의 카테콜기가 금속 표면에 결합하여 형성되는 것으로 환원제 존재하에 금속 표면의 촉매 작용을 통해 카테콜기가 퀴논으로 산화하면서 코팅층의 붕괴로 인한 산화적 나노박리를 유도하게 되며 이와 동시에 제2금속 전구체를 환원시켜 분지된 나노 구조물을 형성할 수 있고, 상기 환원제의 종류 및/또는 농도, 금속 전구체의 종류 및/또는 농도를 조절함으로써 폴리도파민 코팅층의 나노박리 속도와 금속 나노 구조물을 형성하는 제2금속 전구체의 환원반응 속도를 조절하여 형성되는 금속 나노 구조물의 크기 및/또는 밀도를 조절할 수 있음을 최초로 확인하였다. 또한, 이와 같이 상기 금속 나노 구조물의 크기 및/또는 밀도를 조절함으로써 이를 포함하는 나노입자의 분광학적 특성을 조절할 수 있고, 광열효과 및/또는 ROS 생성능을 감소 또는 향상시킬 수 있는 것이 특징이다.
예컨대, 상기 제2단계는 환원제를 추가로 포함하여 수행할 수 있다. 상기 환원제로는 수산화아민, 아스코르브산, 하이드로퀴논, 소디움 보로하이드라이드, 하이드라진 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 수산화아민을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 환원제는 최종 혼합물 중 0.2 내지 10 mM 농도가 되도록 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 제2단계는 계면활성제를 더 포함하여 수행할 수 있다. 상기 계면활성제의 비제한적인 예는 PVP, PEG, 폴리에틸렌아민, CTAB 등이 있다. 바람직하게는 계면활성제로서 PVP를 포함하여 상기 제2단계를 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 계면활성제, 예컨대, PVP는 최종 혼합물에 대해 0.01 내지 0.5% (w/v) 농도로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 계면활성제를 추가함으로써 나노 구조물 형성과정 중 발생할 수 있는 나노 구조물의 표면이 불안정하여 개별 구조물로 유지되지 못하고 집합되는 현상(aggregation)을 차단할 수 있다. 이러한 목적으로는 전술한 계면활성제를 사용하는 이외에 산화그라핀이나 실리카를 이용한 코팅하는 방법을 택할 수도 있다.
예컨대, 상기 제2단계에서 폴리도파민의 산화적 붕괴 속도와 붕괴된 폴리도파민을 통한 분지된 나노 구조물의 환원적 성장의 반응 속도를 조절하여, 분지된 나노 구조물의 구조를 결정하기 위해, 제2금속 전구체 종류 및 이의 농도, 환원제 종류 및 이의 농도, 또는 이들 모두를 선정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2단계에서 폴리도파민의 산화적 붕괴 속도와 붕괴된 폴리도파민을 통한 분지된 나노 구조물의 환원적 성장의 반응 속도를 조절함으로써 형성되는 분지된 나노 구조물의 크기 및/또는 밀도를 조절할 수 있다.
예컨대, 상기 제1금속 표면을 가진 기재는 나노스피어, 나노로드, 코어-쉘 나노입자 또는 코어-갭-쉘 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 금 나노 스피어는 물론 본 발명자들이 이전에 개발한 코어-갭-쉘 구조의 나노입자를 기재로 사용하여 상기 기재의 표면 상에 분지된 금속 나노 구조물을 도입하였다. 이는 금속 표면을 가진 기재로서 예컨대, 폴리도파민이 이의 카테콜기를 통해 결합할 수 있고 환원제의 존재 하에 산화적 붕괴에 의한 나노박리를 나타낼 수 있는 한 상기 제1금속 표면을 가진 기재는 금속의 종류나 기재의 형태에 제한없이 당업자에 공지된 물질을 사용할 수 있다.
예컨대, 기재의 금속 표면을 형성하는 제1금속 및 분지된 금속 나노 구조물의 제2금속 종류는 서로 동일 또는 상이한 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 제1금속은 금이고, 제2금속은 금 또는 은일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 제2금속으로서 금을 사용하는 경우 그 전구체로는 HAuCl4를 사용할 수 있다. 이때, 상기 제2금속 전구체로써 제2단계에 사용하는 HAuCl4는 최종 혼합물 중 0.02 내지 1 mM 농도가 되도록 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 제2금속으로서 은을 사용하는 경우 그 전구체로는 AgNO3을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 방법으로 제조된 분지된 나노 구조물을 포함하는 플라즈몬 입자를 제공한다.
상기 플라즈몬 입자는 광열효과, 활성산소종(ROS) 생성능 또는 둘 모두를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 플라즈몬 입자를 포함하는 광역학적 치료용 광감응제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 플라즈몬 입자를 포함하는 광열 치료용 광감응제 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, 광역학적 치료(photodynamic therapy; PDT or photochemotherapy)는 빛에 선택적으로 노출되어 표적된 악성 및 다른 질병 세포에 독성(광독성)을 나타내는 비독성 광감응 물질을 사용하는 광치료의 한 형태를 지칭한다. 상대적으로 비침습적이며, 독성이 낮은 치료 방법으로 인식되고 있으며, 예컨대, 노화에 따른 시력감퇴(wet age-related macular degeneration) 또는 악성 종양의 치료에 사용될 수 있다. 상기 광역학적 치료에 있어서, 중요한 3가지 요소는 광감응제(photosensitizer), 광원 및 조직 산소이다. 이들 3개 요소의 조합에 의해, 광감응제의 선택적 전달 및 국부적인 광조사에 의해 달성될 수 있다. 광원의 파장은 활성 산소종을 생성하는 광감응제를 여기시킬 수 있는 적절한 파장으로 결정할 수 있다. 상기 활성 산소종은 자유 라디칼(제1형 PDT)이거나 단일항 산소(singlet oxygen; 제2형 PDT)일 수 있다. 보통의 상태에서 대부분의 다른 분자들은 단일항 상태로 존재하는 반면, 산소는 삼중항 상태로 존재한다. 양자역학적 관점에서 이들 간의 반응 즉, 삼중항 상태와 단일항 상태의 반응은 허용되지 않으므로 산소는 생리학적 조건에서 상대적으로 비반응성이다. 본 발명의 용어, '광감응제'는 빛을 흡수하여 여기 상태로 전이된 후, 산소와의 시스템간 교차(intersystem crossing)에 의해 단일항 산소를 생성하는 화합물을 지칭할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명에 있어서 광감응제는 빛 또는 전자기파를 흡수하여 여기 상태로 전환되고, 그 에너지를 다른 분자에 전달하여 그 상태를 전환하거나, 열로 방출하여 주위에 전달하는 물질을 광범위하게 지칭한다.
본 발명의 용어, 광열 치료(photothermal therapy; PTT)는 주로 적외선과 같은 전자기파(electromagnetic radiation)을 이용하여 다양한 질환을 치료하는 것을 의미하며, 상기 PTT로 치료가능한 질환으로는 암 등이 있다. 이는 특정 파장의 빛으로 여기된 광감응제를 사용하는 전술한 광역학적 치료의 연장선일 수 있다. 이는 전자기파를 조사하여 광감응제를 여기상태로 전환시켰을 때, 이로부터 방출되는 진동 에너지 즉, 열에 의해 표적된 세포를 사멸시키는 것이다. 그러나, 광역학적 치료와는 달리 표적 세포 또는 조직과의 상호작용을 위한 산소를 필요로 하지 않는다. 또한, 광열 치료는 보다 낮은 에너지를 갖는 보다 장파장의 빛을 이용하므로 다른 세포 및 조직에 덜 유해하다.
예컨대, 상기 조성물을 종양부위로 빠르고 정확하게 전달하기 위하여 상기 광감응제 조성물은 종양 표적 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 분지된 나노 구조물의 표면에 종양 세포에서 특이적으로 발현되는 단백질 등에 특이적으로 결합하는 리간드, 폴리펩티드 등을 결합시켜 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 분지된 나노 구조물은 750 nm 이상의 근적외선을 조사하여 광열효과를 나타내거나 ROS를 생성할 수 있으므로, 생체 내 주입하여 비침습적 광열 및/또는 광역학적 치료에 광감응제로 사용하기에 적합하다. 예컨대, 가시광선 등의 비교적 단파장의 빛을 이용하여 광열효과 및/또는 ROS 생성능을 나타내는 입자는 체외에서 광원으로 조사시 체내의 환부로 빛의 투과가 불가능하여 내시경이나 광섬유를 이용하여 환부에 조사해야 하는 등의 번거로움이 있으나, 750 nm 이상의 근적외선을 이용하는 경우 광감응제를 환부에 주사하고 체외에서 광원을 조사하여 PTT/PDT를 수행할 수 있으므로 비침습적인 암치료가 가능한 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 분지된 나노 구조물을 포함하는 표면증강라만산란(SERS) 기재를 제공한다.
예컨대, 상기 SERS 기재는 그 표면 또는 내부에 라만활성물질을 추가로 포함하여 SERS 탐침으로 사용될 수 있다. 상기 라만활성물질의 비제한적인 예는 유기 또는 무기 분자, 원자, 복합체 또는 합성 분자, 염료, 천연발생 염료(피코에리스린 등), C60과 같은 유기 나노구조체, 벅키볼, 탄소 나노튜브, 양자점, 유기 형광 분자 등을 포함한다. 구체적으로, 라만 활성물질의 예로서, FAM, Dabcyl, TRITC(테트라메틸 로다민-5-아이소티오시아네이트), Rhodamine 6G, MGITC(말라키트 그린 아이소티오시아네이트), XRITC(X-로다민-5-아이소티오시아네이트), DTDC(3,3-디에틸티아디카보시아닌 아이오다이드), TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸), 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌(Cy3, Cy3.5, Cy5), 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인 또는 황 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 상기 SERS 기재는 코어-갭-쉘 입자를 기반으로 하는 경우, 상기 코어-갭-쉘 입자의 내부에 형성된 나노갭에, 그 표면에 형성된 분지된 금속 나노 구조물 사이에, 또는 나노갭 및 분지된 금속 나노구조물 사이 모두에 라만활성물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 코어-갭-쉘 입자는 내부에 형성된 갭에서 현저한 전자기장 증강 효과를 나타낸다. 따라서 이 갭에 라만활성물질을 포함하는 경우 우수한 표면증강라만산란 효과를 나타낼 수 있다. 아울러, 이의 표면에 형성된 분지된 금속 나노 구조물을 형성한 경우 일반적인 금속 나노입자 상에 유사한 분지된 금속 나노 구조물을 형성한 경우에 비해 보다 증강된 광열효과 및 ROS 생성능을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 상기 코어-갭-쉘 입자를 기재로 사용하고, 상기 갭에 라만활성물질을 포함하여 제조한, 표면에 분지된 나노 구조물을 포함하는 입자는 SERS 표지로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 광열효과 및 ROS 생성능을 나타내므로 조영제인 동시에 PTT/PDT를 위한 광감응제로서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리도파민 코팅층을 도입하는 단계를 포함하는 나노-꽃잎 구조물의 제조방법에 있어서, 폴리도파민은 금속 표면에서 안정하고 균일하게 조립될 수 있을 뿐 아니라, 카테콜기를 통한 결합은 Au(III)-유도 산화에 의해 폴리도파민 코팅층의 부분적인 분해를 유발하여 이를 토대로 형성되는 돌출의 길이 및/또는 밀도를 조절하여 비등방적으로 성장시킬 수 있다. 이러한 나노 구조물의 조절을 통해 흡수 스펙트럼을 조절할 수 있어 근적외선을 이용한 PTT/PDT 치료에 유용한 탐침의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 상기 방법으로 제조된 본 발명의 나노-꽃잎 구조물은 자체로서는 독성을 나타내지 않으나, 근적외선을 조사하여 광열효과는 물론 우수한 ROS 생성능을 나타내므로 이들의 시너지적인 효과에 의해 비교적 낮은 온도(~42℃)에서 효율적인 항암치료가 가능하므로 주변 정상세포에 대한 손상을 최소화할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 코어-꽃잎 구조물의 합성 방법 및 합성된 구조물의 형태를 나타낸 도이다. (a)는 플라즈몬 코어-꽃잎 나노구조(CPNs)의 합성을 위한 금 나노입자(AuNPs) 상에서 폴리도파민(pdop)의 산화적 나노박리 화학을 개략적으로 나타낸 도이다. (b)는 80-nm Au 코어 및 ~5-nm pdop 층을 갖는 pdop-AuNPs의 TEM 이미지를 나타낸다. (c)는 HAuCl4 첨가 직후 pdop-AuNPs의 TEM 이미지를 나타낸다. (d)는 pdop-AuNPs에 HAuCl4를 첨가하고 1분 후 TEM 이미지를 나타낸다. (e)는 CPNs의 SEM 이미지를 나타낸다. (f)는 CPNs의 TEM 이미지(좌측)와 빨간 색 박스 내의 확대된 꽃잎 이미지(우측)를 나타낸다. (g)는 좌측으로부터 우측으로 HAuCl4의 양을 증가시키면서 합성한 AuNP-CPN-1, AuNP-CPN-2, AuNP-CPN-3 및 AuNP-CPN-4의 TEM 이미지를 나타낸다. 도 1을 포함한 전체 도면에 있어서 CPN은 AuNP-CPN을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 pdop-AuNPs(80 nm Au 코어)의 XPS 분석 결과를 나타낸 도이다. (a)는 pdop-AuNPs의 XPS 서베이 스펙트럼이고, (b) 및 (c)는 각각 deconvoluted 고해상도 C 1s 및 O 1s 피크를 나타내며, (d)는 고해상도 N 1s 피크를 나타낸다. (e)에는 pdop-AuNPs와 citrate-AuNPs의 Au 4f 피크를 비교하여 도시하였다.
도 3은 HAuCl4 처리 전(하단 스펙트럼)과 후(상단 스펙트럼) pdop-AuNPs의 라만 스펙트럼(514 nm 레이저, 10 mW 레이저 출력)을 나타낸 도이다.
도 4는 HAuCl4 처리 전(하단 스펙트럼)과 후(상단 스펙트럼) pdop-AuNPs의 13C NMR(400 MHz in D2O)을 나타낸 도이다.
도 5는 합성된 AuNP-CPNs의 형태적 및 분광학적 특성을 나타낸 도이다. (a)는 10, 50, 100 및 200 몰당량(molar equivalent)의 수산화아민을 사용하여 합성한 CPNs의 TEM 이미지 및 이를 시각적 표현으로 나타낸 도이다. (b)에는 (a)에 나타난 TEM 이미지에 상응하는 UV-Vis 스펙트럼을 도시하였다.
도 6은 실온에서 HAuCl4 첨가 1시간 후 수산화아민을 첨가하지 않은 pdop-AuNPs(80 nm Au 코어)의 TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 코어-꽃잎 나노구조의 광학적 특성을 나타낸 도이다. (a)는 AuNPs, pdop-AuNPs, AuNP-CPN-1, AuNP-CPN-2, AuNP-CPN-3 및 AuNP-CPN-4의 UV/Vis 스펙트럼을 나타낸다. (b)는 pdop-AuNPs(상단) 및 CPN-4(하단)의 암시야 현미경 이미지를 나타낸다. (c)는 pdop-AuNPs(좌측) 및 AuNP-CPN-4(우측)으로부터 획득한 산란 세기 및 컬러 스펙트럼을 비교하여 나타낸다.
도 8은 합성된 AuNP-CPNs의 코어 크기에 따른 형태적 및 분광학적 특성을 나타낸 도이다. (a)는 10, 20, 30 및 60 nm 코어 크기를 갖는 AuNP-CPN의 TEM이미지를, (b)는 상응하는 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 AuNP-CPN의 PDT-PTT 효과를 나타낸 도이다. (a)는 AuNP-CPN에서 레이저-유도 광열 효과 및 ROS 생성을 개략적으로 나타낸 도이다. (b)는 각기 다른 금 나노탐침에 대한 온도 상승을 레이저 조사 시간의 함수로 나타낸 도이다. (c)는 각기 다른 금 나노탐침에 대한 온도 상승을 레이저 출력의 함수로 나타낸 도이다. (d)는 3회 연속적인 순환에서 광열 결과에 대한 재현성 실험을 나타낸다. (e)는 각기 다른 농도의 AuNP-CPN-4에 대한 농도 증가를 조사 시간의 함수로 나타낸 도이다. (f)는 레이저 조사 시간 증가에 따른 레이저-유도 1O2 생성 정량을 위한 각기 다른 나노구조물에 대한 RNO-히스티딘 비색분석법-기반 결과를 나타낸 도이다. (g)는 레이저 출력 증가에 따른 레이저-유도 1O2 생성 정량을 위한 각기 다른 나노구조물에 대한 RNO-히스티딘 비색분석법-기반 결과를 나타낸 도이다. 모든 에러바는 3회 반복 실험으로부터 획득하였다.
도 10은 5분 레이저 조사의 3회 순환 후 AuNP-CPN-4의 저배율(좌측) 및 고배율(우측) TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 11은 레이저 조사 후(검은 색) 및 N2 기체 정화 후(빨간 색) AuNP-CPN-4의 D2O 용액의 발광 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 12는 AuNP-CPNs 및 Au 나노로드(AuNRs)의 광열효과 및 단일항 산소(1O2) 생성을 비교하여 나타낸 도이다. 각각의 나노구조물에 대해, ROS 생성 및 광열 온도를 3회 측정하여 에러바를 얻었다.
도 13은 AuNP-CPNs의 직경 및 꽃잎길이(petal length)를 비교하여 나타낸 도이다. 각 AuNP-CPN 구조물 100개 입자를 ImageJ 프로그램을 사용하여 TEM 이미지로 분석하였다.
도 14는 AuNP-CPN 및 Au 나노로드의 계산된 전자기장 분포를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 AuNP-CPN-4 처리한 세포의 특성을 나타낸 도이다. (a)는 비처리 HeLa 세포의 암시야 현미경 이미지를 나타낸 도이다. (b)는 AuNP-CPN-4-처리한 HeLa 세포의 암시야 현미경 이미지를 나타낸 도이다. (c)는 AuNP-CPN-4 탐침으로 처리한 고정된 HeLa 세포의 저배율 (i) 및 고배율 (ii) 단편 TEM 이미지를 나타낸 도이다. AuNP-CPN-4 입자들은 엔도솜 내에 봉입되었다. (d)는 각기 다른 농도의 AuNP-CPN-4 입자로 처리한 HeLa 세포 생존율 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 세포 배양 배지의 온도 상승을 AuNP-CPN-4 탐침에 대한 레이저 조사 시간의 함수로서 나타낸 도이다.
도 17은 AuNP-CPN-4 탈이온수 용액 및 세포 배지의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명에 따른 레이저 조사에 의한 AuNP-CPN 처리한 세포의 사멸효과를 나타낸 도이다. (a)는 HeLa 세포에 대한 live/dead 세포 어세이로부터 중첩된 형광 이미지를 나타낸 도이다. 초록색 및 빨간색 반점은 각각 살아있는 세포와 죽은 세포를 나타낸다. (b)는 레이저 조사 존재 또는 부재 하에 AuNPs, AuNP-CPN-1, AuNP-CPN-2, AuNP-CPN-3 및 AuNP-CPN-4로 나노입자 처리한 HeLa 세포 사멸 결과를 나타낸 도이다. (c)는 AuNP-CPN-4 입자 및 레이저 조사 처리한 고정된 HeLa 세포의 고배율 절단된 TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 19는 AuNP-CPN-4 입자와 인큐베이션 후 세포 배양 접시의 디지털 사진 및 형광 이미지를 나타낸 도이다. 검은 색 원은 레이저-조사된 영역을 나타낸다. HeLa 세포의 live/dead 세포 어세이로부터의 저배율 형광 이미지는 레이저-조사된 영역에서 독점적인(exclusive) 세포 사멸을 나타내었다.
도 20은 본 발명에 따른 AuNP-CPN-4 처리한 세포를 이용한 세포 및 DNA 분석 결과를 나타낸 도이다. (a)는 살아있는 레이저에 노출되지 않은 AuNP-CPN-4-처리된 HeLa 세포의 암시야 현미경 이미지를 나타낸 도이다(삽입된 TEM 이미지는 손상되지 않은 세포막 구조를 나타낸다). (b)는 PDT-PTT 치료를 위한 AuNP-CPN-4 입자로 처리하고 레이저에 노출시킨 죽은 HeLa 세포의 암시아 현미경 이미지를 나타낸 도이다(삽입된 TEM 이미지는 손상된 세포막을 나타낸다). (c)는 AuNPs, AuNP-CPN-1, AuNP-CPN-2, AuNP-CPN-3, AuNP-CPN-4, 무입자(음성대조군) 및 인도시아닌 그린(ICG)(양성대조군)을 이용한 HeLa 세포 용해물로부터의 ROS 어세이 결과를 나타낸 도이다. (d)는 PDT-PTT-ROS 처리 후 유전자 DNA 분리 및 SERS 기반 DNA 특성분석 과정을 개략적으로 나타낸 도이다. (e)는 AuNP-CPN-4로 PDT-PTT-ROS-처리된(0, 2, 4 또는 6-분 레이저 노출 시간) HeLa 세포로부터 분리된 DNA의 라만 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 21은 785 nm 레이저로 6분 동안 조사하여 수행한 다양한 농도의 아스코르브산(AA)을 첨가한 AuNP-CPN-4 및 고분자-코팅된 AuNP-CPN-4의 아스코르브산-기반 세포 사멸 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 폴리도파민-코팅된 CPN-4(PD-CPN-4)의 저배율(좌측) 및 고배율(우측) TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 23은 H2O2로 수행한 HeLa 세포 생존율 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 AuNNP 탐침으로부터 합성한 나노-꽃잎 구조물의 합성 방법 및 PTT/PDT를 위한 생체 내 적용 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 25는 합성된 AuNNP-CPN의 (a) TEM, (b) SEM 및 (c) 암시야 현미경 이미지를 나타낸 도이다.
도 26은 AuNNP, AuNNP-CPN, AuNP-CPN-4 및 pdop-AuNNP의 (a) 광열반응 및 (b) 히스티딘 비색법에 의한 ROS 생성을 비교하여 나타낸 도이다.
도 27은 종양 마우스 모델에서 AuNNP-CPN 유도 PTT/PDT 치료를 나타낸 도이다. (a)는 레이저 조사에 의한 PTT/PDT 치료 과정을 나타내며, (b)는 AuNNP-CPN 부재 하에 레이저만을 조사한 대조군(좌측)과 AuNNP-CPN 투여군(우측)에서 PTT/PDT 치료 효율을 비교하여 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 물질 및 장치
모든 화합물은 구입하여 추가적인 정제과정 없이 그대로 사용하였다. 도파민·HCl은 시그마-알드리치(USA)로부터 구입하였다. 구형 금 나노입자는 BBInternational(USA)로부터 구입하였다. 염산 및 수산화나트륨은 대정 화합물 및 금속(Daejung Chemicals and Metals, Korea)으로부터 구입하였다. 트리스는 USB 코퍼레이션(USA)으로부터 구입하였다. 포름바르/탄소-코팅된 구리 그리드(formvar/carbon-coated copper grids)는 Ted Pella, Inc.(USA)로부터 구입하였다. 나노퓨어워터(Nanopure water, 18.0 MΩ-cm)를 모든 실험에 사용하였다. UV-Vis 분광광도계(Agilent 8453 spectrophotometer, USA)로 UV-Vis 스펙트럼을 획득하였다. 원소분석 및 결합 에너지 측정은 X-선 광전자 분광기(Axis HSi, KRATOS Analytical)를 이용하여 수행하였다. 동적 광산란 측정은 Malvern Zetasizer(Nano ZS)를 이용하여 수행하였다. TEM 이미지는 120 kV의 가속전압으로 에너지-여과 투과 전자 현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope, LIBRA 120, Carl Zeiss)을 사용하여 획득하였다. SEM 이미지 및 EDS-원소 맵핑 데이터는 전계방출 주사전자현미경(Field-Emission Scanning Electron Microscope, SUPRA 55VP, Carl Zeiss)을 사용하여 획득하였다. 라만 스펙트럼은 514 nm, 633 nm, 및 785 nm 레이저원(laser sources)을 구비한 Renishaw inVia 라만 현미경을 이용하여 획득하였다.
실시예 2: 폴리도파민 ( polydopamine ; pdop ) 코팅된 금 나노입자
상업적으로 사용가능한 1 mL의 80-nm 시트레이트-안정화된 AuNPs 콜로이드 용액(11 pM)을 원심분리하고 Tris·HCl 완충액(pH 8.5, 10 mM)에 재분산시켰다. 5 μL의 Tris·HCl 완충액(pH 8.5, 10 mM)에 용해시킨 도파민·HCl 용액(5 mg/mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 볼텍스(vortexing)하였다. 최종적으로, 반응 혼합물을 8000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. pdop-AuNPs를 포함하는 침전물은 탈이온수에 재분산시켰다. 80-nm Au 코어 상의 pdop 층의 두께는 TEM 분석으로부터 ~5 nm로 확인되었다.
실시예 3: 금 나노-꽃잎 구조물(core-petal nanostucture ; CPN )의 합성
나노-꽃잎 구조물을 합성하기 위하여, 상기 실시예 2로부터 수득한 폴리도파민으로 코팅한 금 나노입자, pdop-AuNP 용액(5 mL @1 nM)에 50 μL의 HAuCl4(5 mM), 100 μL의 PVP(5% w/v, 10,000 MW) 및 50 μL의 수산화아민(50 mM)을 연속하여 첨가하고 25℃에서 5분 동안 반응 혼합물을 격렬하게 교반하였다(이하, AuNP - CPN -1이라 표기). 나아가, 각각 100 μL, 200 μL 및 500 μL의 HAuCl4(5 mM)와 수산화아민 용액(50 mM)을 사용하는 것을 제외하고는 위와 동일한 방법으로 AuNP-CPN-2, AuNP-CPN-3 및 AuNP-CPN-4를 합성하였다.
구연산염으로 안정화된 AuNPs(직경 80 nm)를 10 mM Tris·HCl 완충액(pH 8.5)에 용해시킨 도파민·HCl로 실온에서 4시간 동안 처리하여 5-nm pdop-코팅된 AuNPs(pdop-AuNPs)을 형성하였다(도 1b). pdop-AuNPs의 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance; LSPR) 밴드는 AuNP와 pdop 간의 전하이동에 의해 소폭의 적색-이동(~9 nm)(구연산염-AuNPs 및 pdop-AuNPs에 대한 LSPR 밴드는 각각 522 nm 및 531 nm에 위치함)을 나타내었다. 또한 AuNPs 상의 pdop 코팅을 X-선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy; XPS)으로 확인하였다(도 2). pdop-AuNPs와 구연산염-AuNPs 간의 고해상도 Au 4f XPS 스펙트럼 비교시, 각각 Au 4f5/2(83.6 eV)와 Au 4f7/2(87.1 eV)에 상응하는 결합 에너지의 0.4 및 0.8 eV 만큼의 이동이 관찰되었다(도 2). 이들 결과는 AuNP 표면에 카테콜기가 결합하였음을 나타내는 것이다. 염기성 조건 하에서 중합반응 개시제(Tris) 존재시, 도파민은 이의 디온 유도체인 5,6-디히드록시인돌린(5,6-dihydroxyindolines) 및 다른 관련된 분자로 변환되고, 전하이동, π-π 중첩 및 수소결합과 같은 강한 초분자력(supramolecular forces)에 의해 조밀하게 채워져서 AuNPs 상에 pdop 층을 형성하였다. 전술한 바와 같이, pdop-AuNP 용액에 HAuCl4, PVP 및 수산화아민을 연속적으로 첨가하고 반응시켜, pdop-AuNPs로부터 CPNs를 합성하였다. 반응에서 HAuCl4의 역할을 TEM으로 확인하였으며, 중간체적인 구조가 관찰되었다(도 1c 및 1d는 각각 HAuCl4 첨가 직후 및 1분 후 이미지임). Au 코어 상에서 pdop 층의 산화적 붕괴(oxidative disruption) 및 박리와 붕괴된 pdop 층을 통해 자라나는 꽃잎 구조(budding petal structures)가 명확히 관찰되었다(각각 도 1c 및 1d). 용액의 색은 점차 빨간색에서 파란색으로 변화하였고, 결과로 얻은 파란색의 용액은 UV-vis 분광법과 TEM 이미지로 확인한 바와 같이 어떠한 응집이나 이어지는 색의 변화 없이 수주 동안 안정하였다. 시료의 전자현미경 이미지로부터 구형 Au 코어 상에 근접하게 위치한 플라즈몬 꽃잎을 갖는 고도로 분지된 AuNP-CPNs의 형성을 확인하였다(도 1e 및 1f). HAuCl4 처리 전과 후 pdop-AuNPs의 라만 스펙트럼은 1617 cm-1에서 카테콜 피크의 감소 및 1651 cm-1에서 퀴논 피크의 상승을 나타내었다(도 3). 퀴논으로의 카테콜의 HAuCl4-매개 산화반응은 또한 142.9 ppm 및 143.7 ppm(카테콜 탄소 피크) 신호가 감소하는 반면 182.0 ppm 및 183.7 ppm에서 퀴논 탄소 신호 세기의 증가를 나타내는 13C NMR에 의해 확인되었다(도 4). 도 1a에 나타난 바와 같이, 카테콜의 퀴논으로의 산화는 카테콜과 퀴논 그룹 사이의 수소 결합의 부재로 인한 pdop 어셈블리의 붕괴를 유발하고, 퀴논과 AuNP 코어 간의 상호작용은 카테콜과 Au 코어 간의 결합보다 더 약하였다(붕괴된 pdop의 TEM 이미지를 도 1c에 나타내었다). 상기 과정에서, Au 코어로부터 돌출하는(budding) Au 나노꽃잎 구조는 임의로 배향된 산화된 pdop-개질된 AuNP 코어 상에서 성장하며, 이후 수산화아민에 의한 여분의 HAuCl4의 환원은 Au 꽃잎의 비등방성 성장을 유발하였다(돌출하는 Au 꽃잎을 도 1d에 나타내었다). AuNP-CPNs를 합성하는 동안 두 가지 주된 단계는 Au 코어 상의 pdop 어셈블리의 산화적 붕괴 및 Au 코어 상의 붕괴된 pdop 층을 통한 Au 꽃잎의 환원적 성장이다. 상기 두 가지 단계 각각의 반응속도는 최종 AuNP-CPN 구조의 결정에 중요하다. 보다 분해된 pdop 유닛이 고도의 꽃잎 돌출부를 유도한다. 수산화아민 양이 증가함에 따라 반응속도는 선형적으로 증가하며 보다 부드러운 입자-표면을 형성한다(도 5). 다량의 수산화아민에 의한 Au(III)의 보다 빠른 환원은 pdop의 산화적 나노박리를 억제함으로써, Au 코어 상의 꽃잎 형성을 저해한다. 반면, 수산화아민을 첨가하지 않은 경우, Au 코어로부터 pdop 층의 완전한 산화적 박리가 관찰되었다(도 6). 대조군으로서, pdop-AuNPs로부터 CPNs를 합성하는데 적용한 것과 동일한 조건 하에서 구연산염-안정화된 80-nm AuNPs를 HAuCl4 및 NH2OH와 반응시켰다. 이때, 돌출된 나노가지는 관찰되지 않았으나 구형 AuNPs의 직경은 80 nm로부터 83 nm로 증가하였다. 이로부터, 본 발명자들은 단순히 HAuCl4의 양을 변화시킴으로서 Au 코어 상에서 Au 꽃잎의 형성 및 상응하는 광학적 신호를 조절할 수 있음을 확인하였다(도 1g). HAuCl4의 양이 증가함에 따라 나노꽃잎의 수와 길이가 증가하며, 이러한 변화는 LSPR 피크를 가시광선 영역으로부터 근적외선 영역으로 이동시킨다(도 7; AuNP-CPN-1로부터 AuNP-CPN-4까지). 특히, AuNP-CPN-4는 강한 플라즈몬 커플링 기반 광학적 신호를 생성할 수 있는 Au 코어 상에 조밀하게 돌출된 나노꽃잎을 나타내었다. AuNP-CPN-4 입자로부터의 광범위하고 강한 스펙트럼은 생물학적 시료에 대한 근적외선의 깊은 투과로 인해 생물학적 응용에 바람직하다. 이상의 이유로, 이후 실험에서는 AuNP-CPN-4 입자를 사용하였다.
실시예 4: pdop - AuNPs 및 AuNP - CPN 탐침의 암시야현미경
세척한 유리 슬라이드를 2%(v/v) 3-아미노프로필-트리메톡시실란(3-aminopropyl-trimethoxysilane; APTS) 수용액으로 10초 동안 처리하고 탈이온수로 세척한 후 질소 분위기 하에서 건조하였다. 이후, 10 μL의 시료(pdop-AuNP 또는 AuNP-CPN, 0.1 nM)를 APTS-처리된 유리 슬라이드 상에 로딩하고 보다 얇은 유리 슬라이드로 덮었다. 칼 자이스 현미경(Carl Zeiss (DE/Axiovert 200) microscope)으로 암시야 이미지를 얻었다.
AuNP-CPNs의 UV-Vis 스펙트럼은 AuNP-CPNs의 나노꽃잎의 다중모드 커플링(multimodal couplings)에 의해 가시광선으로부터 근적외선까지 넓은 범위(530 to 975 nm)를 커버하였다(도 7a). 도 7b에 각각 pdop-AuNPs 및 AuNP-CPN-4 입자들의 암시야 현미경 이미지를 나타내었다. pdop-AuNPs로부터 플라즈마 커플된 나노꽃잎을 형성한 경우 강한 색상 변화 및 산란 신호의 향상이 관찰되었다. 초록색에 대한 빨간색의 비율(red-to-green color ratio; R/G)은 pdop-AuNPs에 대해 0.84로부터 AuNP-CPN-4 입자에 대해 1.62로 변화하였다. 도 7c에 나타난 바와 같이, 레일리 산란(Ray-leigh scattering)에서의 변화는 AuNP-CPN 입자들의 근접하게 위치한 금속 나노가지들 간의 광범위한 플라즈몬 커플링에 기인할 수 있다. 본 발명의 합성 방법은 다른 코어 크기 및 가지 형태를 갖는 다양한 가지형 나노구조물에 대한 강력하고 다목적의 경로를 제공할 수 있었다. 본 발명자들은 각각 10 nm, 20 nm, 30 nm 및 50 nm의 코어 크기를 갖는 AuNP-CPNs을 합성하였으며 이들 구조물 모두는 생체 내 적용에 중요한 요소인 근적외선 활성을 나타내었다(도 8).
실시예 5: RNO-히스티딘 어세이
2 mL의 AuNP-CPN 용액을 신선하게 준비한 RNO 수용액(50 μM)과 10 mM His(10 mL)에 첨가하고, 혼합된 용액을 1 mL 쿼츠 큐벳에 옮기고 레이저(785 nm, 2 W/cm2)를 조사하였다. 미리 정해진 조사 용량(predetermined irradiation dosage)에서 440 nm에서 UV/Vis 흡광도를 기록하였다.
실시예 6: 1 O 2 발광 검출
D2O에 분산시킨 AuNP-CPNs(1 mL)에 레이저를 조사하고, 방출되는 발광을 기록하였다. 측정은 빛을 차단하고(in the dark) 검출기와 결합된 온도조절장치 유닛(thermostat unit)을 이용하여 15℃의 일정한 온도에서 수행하였다.
이상과 같이, 본 발명자들은 치료적 응용을 위한 광열변환기(photothermal transducers)로서 AuNP-CPNs의 사용 가능성을 확인하였다(도 9a). 이를 위하여, 증가하는 밀도의 나노꽃잎을 갖는 4가지 다른 AuNP-CPNs(AuNP-CPN-1, AuNP-CPN-2, AuNP-CPN-3, and AuNP-CPN-4)을 사용하였다. 먼저, AuNP-CPN 용액(ICP-MS로 측정한 Au 함량 12 μg/mL)으로 채운 쿼츠 큐벳에 785-nm 레이저(2W/cm2)를 0분으로부터 10분까지 조사하고, 열전대(thermocouple)로 큐벳 내의 온도를 측정하였다. 도 9b에 나타난 바와 같이, AuNP-CPN-4 용액을 6분 동안 조사하였을 때, 온도는 23℃로부터 53.7℃까지 증가하였다(이후로는 온도 증가가 관찰되지 않았다). 이러한 결과로부터, 광열전환(photothermal conversion)은 AuNP-CPNs의 나노꽃잎 밀도에 의존적임을 확인할 수 있었다. 6분의 조사시간에 대해 용액의 온도는 레이저 출력에 선형적으로 비례하였다(도 9c). 구형 AuNPs를 이용한 대조 실험군에서는, 동일한 조사 조건(785 nm, 2 W/cm2) 하에서 열악한 광열 반응이 관찰되었다. 광열 가열(photothermal heating)에 대한 AuNP-CPNs의 안전성을 확인하기 위하여, 광열 가열-냉각 과정을 수차례 반복하였다. 나노입자 용액을 785-nm 레이저에 5분 동안 노출하고 30분 동안 실온으로 냉각되도록 하였다. 상기 과정을 3회 반복하였다. 상기 결과는 광열 가열 과정이 모든 4가지 다른 AuNP-CPNs에 대해 동일한 가열-냉각 프로파일을 갖는 완전히 반복가능함을 나타내는 것이다(도 9d). 본 발명자들은 5분 동안의 레이저 조사를 3회 순환한 후 AuNP-CPN 구조물로부터 어떠한 구조적 변화도 나타나지 않음을 확인하였다(도 10).
나아가, AuNP-CPN-4를 이용하여, 입자의 농도가 광열 가열에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. 4분 이상 조사한 0.5 nM AuNP-CPN-4 용액은 50℃ 이상 가열되었으며, 55℃ 이상으로 가열하기 위해서는 1 nM AuNP-CPN-4 용액에 대해 5분의 조사가 필요함을 확인하였다(도 9e; 785-nm laser, 2 W/cm2). 또한, 본 발명자들은 유기 광감응제-유리 ROS의 생성 및 이어지는 PDT 응용을 위한 AuNP-CPNs의 능력을 확인하였다. 금 나노구조물은 3O2로의 플라즈몬 전자이동에 관여하며 1O2로의 전환을 위한 3O2 활성화를 광감작할 수 있다. 개념입증연구실험으로서, AuNP-CPNs 또는 AuNPs(1 nM 농도)를 785-nm 레이저(2 W/cm2)에 5분 동안 노출시키고, N,N-디메틸-4-니트로소아닐린(RNO)-히스티딘 비색분석법을 이용하여 1O2의 존재를 모니터하였다(도 9f 및 9g). 상기 어세이에 있어서, 히스티딘의 이미다졸 모이어티는 1O2와 반응하여 결과로서 생성된 순간 복합체(transient complex)는 RNO 분자를 표백(bleach)한다. 즉, 1O2의 양은 UV-Vis 스펙트럼에서 RNO 밴드 세기의 감소와 직접적으로 연관될 수 있으며, 1O2의 생성은 나노구조물의 LSPR와 매치되는 파장의 빛으로 D2O 중의 AuNP-CPN-4 나노입자를 여기시켰을 때 ~1268 nm에서 특징적인 인광방출을 분석함으로써 확인하였다(도 11). 용액을 질소로 철저히 퍼징함으로써, 1268 nm에서 인광 방출은 감소하였으며, 이는 1O2 존재를 더욱 뒷받침하는 것이다(도 11). 도 9f 및 9g에 나타난 바와 같이, 생성된 1O2의 양은 보다 긴 레이저 노출시간 및 보다 높은 레이저 출력에 의해 증가하였다. 1O2의 최대량은 AuNP-CPN-4 사용시 달성되었으며, AuNPs는 최소량의 1O2(785-nm laser, 2 W/cm2)를 생성하였다. 이는 1O2 생성이 고도로 나노꽃잎 구조 및 밀도 의존적임을 나타내는 것이다. 상기 레이저 조사에 기초한 1O2 생성 반응 패턴은 AuNP-CPN 기반 광열 결과에 대한 패턴과 매우 유사하였다. 또한 AuNP-CPNs의 성능을 광열 및 광동역학 치료 및 플라즈모닉스에 널리 사용되는 금 나노로드(AuNRs)와 비교하였다. 공지의 방법으로 AuNP-CPN-4와 매치되는 흡수 최대 파장을 갖는 AuNRs를 합성하였다. 도 12에 나타난 바와 같이, AuNP-CPN-4 탐침(ΔT= 23.7℃)은 동일한 레이저 조사 조건(785-nm source 및 2 W/cm2) 하에서 AuNRs (ΔT= 9℃)보다 나은 광열 효과를 나타내었다. 또한 AuNP-CPN-4는 AuNRs에 비해 2배 이상의 1O2를 생성하였다(도 12). 상기 실험에서 AuNR 또는 AuNP-CPN-4 중의 Au 함량은 동일하도록 하였다. 각기 다른 크기 및 꽃잎 길이의 AuNP-CPNs를 도 13에 나타내었다. 금속 나노구조 간의 더 강한 플라즈몬 커플링이 보다 강한 전자기장을 형성하는 것과 금속 나노구조의 크기와 형태가 플라즈몬 나노구조의 전자기장에 영향을 미친다는 것 또한 잘 알려져 있다. 또한 본 발명자들은 3차원 유한요소법(three-dimensional finite-element method; 3D FEM) 시뮬레이션(COMSOL, Stockholm, Sweden)을 수행하여 AuNP-CPN 및 AuNR의 전자기장(electromagnetic field; EM field) 분포 및 향상을 분석하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, AuNP-CPN 상의 전자기장은 AuNR 상의 전자기장에 비해 훨씬 더 강하며, 이는 주로 꽃잎 구조와 AuNP-CPN 상에서의 상당한 플라즈몬 커플링에 기인한다. 마지막으로, AuNP-CPN-4의 광열 전환 효율(photothermal conversion efficiency; η)은 32%로 계산되었으며, 이는 AuNR(21%)에 비해 현저히 증가된 것이었다.
실시예 7: 세포 배양, AuNP - CPN 탐침 처리 및 암시야 이미징
나아가 본 발명자들은 살아있는 자궁경부암 세포(HeLa 세포)를 이용하여 AuNP-CPN의 암치료에 대한 적용 가능성을 확인하였다. 먼저, 나노입자의 세포 내면화(internalization)를 확인하였다.
HeLa 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1% 항생제용액(GIBCO, Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, 각 웰에 50 μL)에 104 cells/mL 농도로 96-웰 플레이트에 분주하여 37℃ 및 5% CO2에서 밤새도록 배양하였다. 이후 신선하게 준비한 DMEM으로 배양 배지를 교환하였다. PBS에 분산시킨 AuNP-CPN 용액을 다른 농도로 첨가하고 세포를 2시간 동안 배양 챔버에 두었다.
구체적으로, HeLa 세포를 35 mm 폴리라이신-개질된 유리 바닥 배양 접시(MatTek Corp., USA)에 배양하고 10% FBS 및 1% 항생제를 포함하는 DMEM 배지에서 밤새도록 성장시켰다(37℃, 5% CO2). 다음으로, 배지를 AuNP-CPN 나노탐침(0.1 nM)을 포함하는 신선한 배양 배지로 교환하고 세포를 2시간 동안 더 배양하였다. 이후, 유리 슬라이드를 PBS로 세척하여 여분의 AuNP-CPN 나노탐침을 제거하고 칼 자이스 현미경(Carl Zeiss (DE/Axiovert 200) microscope)으로 암시야 이미지를 얻었다.
HeLa 세포에 1 nM 나노입자 용액을 처리하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고 PBS로 세포를 세척하여 여분의 AuNP-CPNs를 제거하였다. 나노입자를 처리한 세포의 암시야 광산란 이미지로 내면화된 AuNP-CPNs를 직접 가시화할 수 있다. 도 15b에 나타난 바와 같이, AuNP-CPN-4 입자의 내면화는 세포 내의 밝은 빨강-오렌지색을 확인할 수 있다. 한편, 비처리 세포의 암시야 이미지는 훨씬 약한 나노입자-산란 신호를 나타낸다(도 15a). 세포 내에서 AuNP-CPNs의 정확한 위치를 확인하기 위하여, AuNP-CPN-4-처리한 세포를 고정하고, 절단하여 TEM으로 관찰하였다. TEM 이미지는 AuNP-CPN-4 입자들이 세포에 의해 내면화되었으며 세포질액(cytosol)에 분포함을 나타낸다(도 15c-i). 고배율 TEM 이미지는 AuNP-CPN-4 입자들이 주로 엔도좀에 위치함을 보였으며, 이는 세포내 섭취(endocytosis)를 나타낸다(도 15c-ii). ICP-MS 분석에 의한 HeLa 세포의 표면과 내부에 존재하는 CPN-4 입자의 평균 함량은 ~1260 입자/세포, 이는 상대적으로 큰 AuNP-CPN-4 입자의 크기(직경 ~100 nm)를 고려할 때 상당히 높은 수치이다. 이는 세포 막 투과를 촉진하는 분지된 형태의 효과 및 세포 성장 배지 중의 혈청 단백질 및 다른 세포막 요소에 의한 이온 가리움 효과(ionic screening effect)로 인한 것일 수 있다.
실시예 8: 투과전자현미경을 이용한 세포 단면 이미지
세포 단면 이미지를 얻기 위하여, 먼저 AuNP-CPNs와 배양한 세포를 웰 플레이트로부터 분리하였다. PBS 용액으로 세척한 후, ＞5×105 세포를 변형된 카르노프스키 고정액(modified Karnovsky's fixative; 2% 파라포름알데하이드 및 2% 글루타르알데하이드 in 0.05 M 카코딜산나트륨 완충액, pH 7.2)으로 2시간 동안 고정하였다. 4℃에서 0.05 M 카코딜산나트륨 완충액(pH 7.2)으로 반복하여 세척한 후, 세포를 0.05 M 카코딜산나트륨 완충액(pH 7.2)에 용해시킨 1% 사산화오스뮴으로 2시간 동안 고정하고 증류수로 2회 세척하였다. 고정된 세포를 0.5 % 아세트산우라늄(uranyl acetate)을 사용하여 4℃에서 밤새도록 En bloc 염색하고 일련의 단계적 농도의 에탄올로 탈수(30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %, 및 100 % 에탄올; 각 탈수 단계에 대해 10분)시켰다. 프로필렌 옥사이드와 Spurr's 레진을 사용하여 침투시킨 세포(infiltrated cells)를 70℃에서 24시간 동안 중합시켰다. 레진 블록의 다양한 구획을 초마이크로톰(ultramicrotome, MT-X, RMC, Tucson, AZ, USA)을 사용하여 절단하고 2% 아세트산우라늄과 레이놀드의 구연산납(Reynolds' lead citrate)으로 7분 동안 염색한 후, 관심 구획을 300 메쉬 구리 TEM 그리드 상에 옮겼다.
실시예 9: 세포독성 어세이
다양한 농도의 AuNP-CPN의 세포독성을 세포 계수 키트(Cell Counting Kit, CCK-8, Dojindo lab., Japan)를 사용하여 확인하였다. 세포를 100 μL의 FBS를 함유하는 DMEM으로 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. 분주한지 24시간이 지난 후로부터, 세포를 다양한 농도(100 pM로부터 1 μM까지)의 AuNP-CPN-4 탐침과 48시간 동안 인큐베이션하고, 세포 생존율 어세이를 수행하였다. CCK-8(탐침과 인큐베이션 후 생존하는 세포의 수를 결정하기 위한 민감한 비색분석법(colorimetric assay))을 이용하여 세포의 대사 활성을 측정하였다. 각 웰의 인큐베이션한 세포에 10 μL의 CCK-8 용액을 직접 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 포르마잔 염료의 양을 마이크로플레이트 리더(Anthos 2010, Anthos Labtec, Eugendorf, Austria)로 측정하였다.
실시예 10: 광열 치료
HeLa 세포를 AuNP-CPNs와 인큐베이션한 후, 세포 단일층을 PBS 완충액으로 3회 세척하고 근적외선 레이저로 조사하였다(785 nm, 2 W cm-2, 5 mm의 스팟 크기). 세포를 200 μL의 신선한 LIVE/DEAD 시약 용액(LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, Molecular Probes)과 빛을 차단하여 30분 동안 인큐베이션하였다. 초록색 반점은 건강한 세포를 나타내는 반면, 빨간색 반점은 죽은 세포를 나타내었다.
구체적으로, HeLa 세포를 각기 다른 양(100 pM로부터 1 μM)의 AuNP-CPN-4 입자와 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 생존율 결과를 얻었다(도 15d). 그 결과는 AuNP-CPN-4 입자들이 높은 탐침 농도(＞100 nM)에서도 HeLa 세포에 대해 세포독성을 거의 나타내지 않음을 나타낸다. 나아가 근적외선을 이용한 이중 PTT-PDT 응용을 위한 AuNP-CPN의 사용 가능성을 확인하였다. 먼저, 세포 성장 배지(DMEM, 10% FBS, 1% 항생제)에서 15분까지 레이저 조사(785 nm, 2 W/cm2) 시간의 함수로서 AuNP-CPN-4의 광열 반응을 측정하였으며, 용액의 온도가 54℃까지 증가하는데 약 10분 정도 소요되었다(도 16). UV-Vis 분광법으로 세포 배지 내에서 단지 미량의 AuNP-CPN-4 입자 응집을 확인하였다(도 17). 세포 배지에 풍부하게 존재하는 단백질들은 나노입자와 강하게 상호작용할 수 있고(ACS Nano, 2010, 4(1): pp 365-379), 레이저-지지형 광열 가열(laser-assisted photothermal heating)에 의해 형태변화가 나타날 수 있다(Nano Lett., 2014, 14(1): pp 6-12). 상기 과정 동안, AuNP-CPN 탐침으로부터의 열은 일부 소멸될 수 있다. 이와 같은 단백질 기반 열 소멸(protein-based heat dissipation) 및 일부 나노입자의 응집은 상기 가열 과정을 지연시킬 수 있다. 온건한 근적외선 레이저 출력(~2 W/cm2)으로의 45℃＜까지의 온도 증가는 PDT-PTT 치료의 임상적 적용에 있어서 불필요한 정상 조직의 가열을 최소화하기 위해 중요하다. 상기 실험은 AuNP-CPNs 및 구형 AuNPs로 수행하였다. HeLa 세포를 0.5 nM 나노입자 용액과 2시간 동안 인큐베이션하고, 785-nm 레이저(2 W/cm2)로 6분 동안 조사하여, 온도가 42±1℃까지 증가하였다. 비색법에 의한 live/dead 세포 생존율 어세이 키트(Invitrogen)를 사용하여 조사 후 세포 생존율을 결정하였다. 도 18a 및 도 19에 나타난 바와 같이, 초록색 및 빨간색을 띠는 세포는 각각 살아있는 및 죽은 세포를 나타낸다. 나노입자를 처리하지 않은 세포의 생존율은 6분 동안 레이저를 조사한 후에도 거의 100%였다. 이는 6분의 레이저 조사(785-nm 레이저; 2 W/cm2)는 플라즈몬 나노입자가 존재하지 않을 때 세포를 손상시키지 않음을 나타낸다. 보다 많은 돌출된 나노가지를 갖는 나노구조물은 세포를 785-nm 레이저에 노출시켰을 때 효율적인 세포 사멸을 유도하였다(도 18b). 특히, CPN-4 입자들은 6분 동안의 레이저 조사 후 ~42℃까지 온도를 증가시켜 암세포를 거의 완전히 사멸시켰다. 785-nm 레이저에 각기 다른 시간 동안 노출시킨 후 고정한 세포의 절단된 TEM 이미지를 도 18c에 나타내었다. 이는 레이저를 조사하지 않은 경우(t = 0분), AuNP-CPN-4 입자들은 엔도좀 내에 봉입되어 있음을 나타낸다. 그러나, 세포를 785-nm 레이저로 3분 및 6분 동안 조사한 후, 엔도좀은 붕괴되기 시작하였으며, AuNP-CPN-4 입자들의 엔도좀 탈출(endosomal escape)이 뚜렷이 관찰되었다(도 18c-i-iii). 다음으로, 본 발명자들은 OxiSelect 어세이(세포 용해물 중 총 ROS 활성 측정을 위한 형광 신호 기반 기법)를 사용하여 나노입자-처리된 HeLa 세포로부터 레이저 조사 후 생성된 ROS 양을 정량분석하였다.
이상의 결과는 ROS의 양이 AuNP-CPN 구조의 차이와 연관됨을 나타내었다(도 20c). 이는 또한 AuNP-CPN-4 입자들이 PTT-PDT 이중 치료를 통해 상대적으로 온건한 온도 증가(~42℃)에 의해 암세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있음을 나타내는 것이다. 광열 및 광동역학적 기여를 독립적으로 정량하기 위하여, 레이저 유도 암세포 사멸 실험을 진행하는 동안 잘 알려진 항산화제인 아스코르브산(ascorbic acid; AA)을 각기 다른 농도로 첨가하였다. AA 첨가 후, 세포 생존율은 82%까지 증가(500 μM AA의 경우)하였다(도 21). 이는 ＞500 μM을 초과하는 AA 농도에서 ROS 생성이 중단될 수 있으며, 이 경우 광열적 기여는 ~18%임을 나타내었다.
이를 보다 확실히 하기 위하여, AuNP-CPN-4를 ~5-nm 폴리도파민 층으로 코팅하여 Au 표면에서 1O2 생성을 차단하였다(도 22). 폴리도파민-코팅된 AuNP-CPN-4는 단지 ~17%의 세포만을 사멸시킬 수 있었다(도 21). AuNP-CPN-4에 의해 생성되는 ROS 수준을 근적외선 흡수 광감응제인 인도시아닌 그린(indocyanine green; ICG)에 대한 값과 비교하였다. 도 20c에 나타난 바와 같이, AuNP-CPN-4 존재시 ROS 수준은 ICG의 경우에 비해 1.8-배 더 높았다. 이후 본 발명자들은 광-유도 PDT-PTT에 의해 영향을 받는 세포 요소의 운명을 확인하였다. 자멸성 세포는 세포 골격 및 외부로 돌출된 세포막의 누수특성으로 인해 죽은 세포의 핵을 염색하는 에티디움 브로마이드(ethidium bromide; EB)를 이용하여 형광현미경으로 직접 모니터할 수 있었다. 레이저 조사한 AuNP-CPN-4 입자 존재시 EB-처리한 HeLa 세포는 강한 빨간 색을 나타내었다. 이는 AuNP-CPN-4-매개 PDT-PTT 효과에 의해 세포막의 기포형성(blebbing)이 유도되었음을 나타내는 것이다. AuNP-CPN-4 입자로 처리하고 레이저 조사한 후, 암시야 현미경 이미지로부터 불규칙적 타원형으로부터 원형으로 세포 형태의 변화 및 응집이 관찰되었으며(도 20b), 이는 높은 산화적 스트레스 하에서 세포질의 수축 및 핵의 축소에 기인한다. 도 20b의 TEM 이미지는 세포막에서 막에 부착된 소낭(vesicles)의 형성을 나타내며, 이들 소낭은 막의 세포질 면으로부터 세포외 면으로의 이동에 의해 형성되었다.
실시예 11: 유전자 DNA 분리
AuNP-CPN-4 나노탐침을 이용하여 0, 2, 4, 및 6 분 동안 광열 치료를 적용한 후, 세포를 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1 % SDS, 및 0.5 mg/mL proteinase K를 포함하는 4 mL의 용해 완충액으로 용해시켰다. 혼합물을 55℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 2 mL의 포화 NaCl(6 M)을 첨가하고, 시료를 55℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 5000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후, DNA를 포함하는 상층액을 냉각시킨 과량의 무수에탄올(absolute ethanol)과 혼합하고 혼합물을 조심스럽게 뒤집어(gently inverting) DNA를 스풀링하였다. 튜브를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 실온에서 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 DNA를 회수하였다. DNA를 70% 에탄올로 서너번 완전히 세척하고 최종적으로 실온에서 공기 건조하였다.
실시예 12: AuNP - CPN -4 탐침을 이용한 분리된 DNA의 SERS 측정
또한, 본 발명자들은 표면증강라만산란(surface-enhanced Raman scattering; SERS) 탐침으로서 AuNP-CPN-4 입자를 사용하여 핵산에서의 ROS-매개 변화를 확인하였다. 각기 다른 기간 동안 PDT-PTT 처리 후 HeLa 세포로부터 분리한 DNA(10 μL, 0.1 mg/mL)를 AuNP-CPN-4 나노탐침(10 μL, 5 nM)과 혼합하고, 785-nm 레이저 및 50× 대물렌즈를 구비한 Reinshaw InVia 라만 분광기를 이용하여 유리 슬라이드 상의 혼합물로부터 SERS 스펙트럼을 기록하였다.
고도로 분지된 형태를 갖는 플라즈몬 AuNP-CPN-4 구조물은 우수한 SERS 기질임을 확인하기 위하여, AuNP-CPN-4 입자로 HeLa 세포를 처리한 후, 시료를 785-nm 레이저에 2분, 4분, 및 6분 동안 노출시키고, 공지의 추출 방법으로 유전자 DNA를 분리하였다(도 20d). 이후 SERS 신호를 이용하여 ROS-매개된 일차 및 이차 구조 변화를 연구하였다(도 20e). SERS 스펙트럼 측정을 위하여 10 μL의 DNA 용액(0.1 mg/mL)을 10 μL의 5 nM AuNP-CPN-4 용액과 혼합하였다(DNA 염기가 Au 표면과 상호작용할 수 있음은 알려져 있다). 1O2 및 다른 세포내 이차 ROS는 돌연변이를 유발하고(mutagenic), 유전독성이며(genotoxic), 많은 생물학적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 단일항 산소에 의한 지질 산화로부터 과도하게 생성되는 히드록실 라디칼은 당-인산 DNA 골격의 용매에 노출된 영역으로부터 수소 원자를 추출할 수 있으며, 이로 인해 DNA 가닥의 β-절단(cleavage) 및 DNA 염기의 중첩붕괴(unstacking)을 유발할 수 있다. 1082 cm-1에서 인산-골격-특성(phosphate-backbone-characteristic) 라만 피크(PO2- 대칭신장)은 1075 cm-1로 이동하였으며, 그 세기는 AuNP-CPN-4 처리한 시료에서 785-nm 레이저에 노출이 증가함에 따라 점차 증가하였다. 이러한 변화는 DNA 인산-골격 손상 및 DNA 응집에 의해 발생하였다. DNA 상에서 다른 ROS-매개 화학적 개질은 DNA 염기의 산화이다(예컨대, 구아닌의 산화반응으로 8-옥소구아노신 병소(lesion)를 형성). 구아닌의 라디칼-호흡(radical-breathing) 진동 모드에 상응하는 662 cm-1에서의 라만 피크는 PDT-PTT 처리 후 ~649 cm- 1 로 이동하였다. 이동된 라만 밴드는 구아닌의 anti-형으로부터 8-옥소구아닌의 syn-형으로의 바람직한 형태(conformational) 변화에 기인할 수 있으며 구아닌에 비해 8-옥소구아닌의 높은 수소결합 채움(occupancy)에 의한 전자적 환경에서의 변화에 기인할 수도 있다. 상기 모든 결과는 세포를 AuNP-CPN-4 입자로 처리하고 785-nm 레이저로 조사하였을 때, 세포 내의 DNA에서의 화학적 구조적 변화가 있음을 나타내는 것이다.
실시예 13: 코어-갭-쉘 구조물(AuNNP)을 이용한 나노-꽃잎 구조물의 합성
코어로서의 금 나노입자의 형태 및/또는 개질에 따른 PTT/PDT에서의 효과를 확인하기 위하여, 본 발명자들이 이전에 개발한 코어-갭-쉘 구조의 나노입자를 이용하여 나노-꽃잎 구조물을 제조하였다.
구체적으로, 'S.J. Hurst et al., Anal. Chem., 2006, 78: 8313'에 개시된 방법에 따라, 직경 20 nm 크기의 금 나노입자의 표면을 DNA(서열: 3'-HS-(CH2)3-A10-PEG18-AAACTCTTTGCGCAC-5')로 개질하였다. 상기 DNA가 개질된 금 나노입자 코어를 둘러싼 금 쉘을 형성하기 위하여, 상기 DNA로 개질된 금 나노입자를 금 전구체(gold precursor; HAuCl4), 환원제(NH2OH-HCl) 및 1% 폴리-N-비닐-2-피롤리돈(poly-N-vinyl-2-pyrrolidone; PVP; MW 40,000)과 포스페이트 완충 용액(phosphate-buffered solution; 0.3 M NaCl; 10 mM PB; pH 7.4)에서 반응시키고, 상온에서 30분간 가볍게 볼텍싱하였다.
구체적으로, DNA로 개질된 금 나노입자 용액(100 μL; 0.3 M PBS에서 1 nM 농도)을, 50 μL의 1% PVP 용액과 혼합하였다. 상기 용액을 1.5 μL, 5.2 μL, 10.3 μL 또는 30.4 μL의 하이드록시아민 하이드로클로라이드 용액(hydroxylamine hydrochloride solution; 10 mM)과 혼합시킨 후, 각각 1.5 μL, 5.2 μL, 10.3 μL 또는 30.4 μL의 클로로아우릭산 용액(chloroauric acid solution; 5 mM)과 혼합시켰다. 고해상도 TEM으로 관찰한 결과, 상기와 같이 제조한 코어-쉘 입자는 코어와 쉘 사이에 약 1.2 nm의 나노갭이 형성되었으며, 쉘이 부분적으로 코어 표면에 접촉되어 나노브릿지를 형성하고 있는 것을 확인하였다. 또한, 금 코어-갭-쉘 입자의 평균직경은 약 46 nm였다.
상기 수득한 AuNNP 용액에 대해서도, 도파민·HCl 용액은 0.1 mg/mL 농도의 것을 사용하고, 반응 혼합물은 1시간 동안 볼텍스하는 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 방법으로 상기 AuNPs 콜로이드 용액에 대해서와 동일한 방법으로 반응시켜 pdop 층을 코팅하였다. TEM 분석으로부터 AuNNP 상에 코팅된 pdop 층의 두께 역시 ~5 nm임을 확인하였다.
또한, 상기 pdop-AuNNP에 대해서도, 500 μL의 HAuCl4을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 상기 AuNP-CPN-1와 동일한 제조방법으로 표면에 나노-꽃잎 구조물을 합성하였다(이하, AuNNP - CPN이라 표기). 상기 제조방법을 도 24에 개략적으로 나타내었으며, 합성된 AuNNP-CPN의 TEM, SEM 및 암시야 현미경 이미지를 도 25에 나타내었다. 도 25의 TEM 이미지는 AuNNP 코어 상에 가깝게 위치한 플라즈몬성 꽃잎 형태를 갖는 고도로 분지된 나노-꽃잎 구조물이 성공적으로 형성되었음을 나타내었으며, 그 내부에 약 1 nm 간격의 나노갭이 존재함을 나타내었다.
실시예 14: AuNNP - CPN의 PTT /PDT를 위한 생체 내 적용 및 효과
상기 실시예 13에서 제조한 AuNNP-CPN은 내부에 포함된 나노갭 영역에서 강한 전자기장을 형성하는 것으로 확인된 바, 이를 기초로 본 발명의 나노분지 구조를 도입하여 나노-꽃잎 구조물에서도 효율적인 PTT/PDT가 가능한지 또는 상기와 같은 코어의 개질에 의해 보다 상승적으로 증가된 효과를 나타낼 수 있는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 13에 따라 제조한 AuNNP-CPN을 이용하여 광열효과 및 ROS 생성을 확인하였다. 도 26에 나타난 바와 같이, 금 함량이 동일한 경우, AuNNP-CPN은 AuNP-CPN-4 입자에 비해서도 훨씬 더 증가된 광열반응 및 ROS 생성율을 나타내었다.
나아가, 이와 같이 증가된 광열효과 및 ROS 생성율을 토대로 생체 내에서 효율적인 PTT/PDT 치료 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대되는 AuNNP-CPN을 종양 마우스에 투여하여 생체 내 PTT/PDT에 의한 암 치료효과를 확인하였다. 모든 실험동물은 동물관리 프로토콜에 따라 수행하였다. 구체적으로 HEK-293 세포를 주사하여 종양 마우스를 생상한 후, 종양 내부로 AuNNP-CPN을 주사하고 785 nm 파장의 레이저를 조사하였다. 상기 PTT/PDT 치료 후 캘리퍼로 종양의 크기를 측정하였다(도 4). AuNNP-CPN 투여군에서는 광조사 후 종양이 효과적으로 제거되었으며, 재발하지 않고 원래의 종양이 발생한 위치에 검은 흉터를 남김을 확인하였다.

Claims (17)

  1. 적어도 하나의 제1금속 표면을 가진 기재 표면 상에 비등방적으로 분지 및 성장된 금속 나노 구조물의 제조방법으로서,
    상기 기재 상에, 제1금속 표면과 폴리도파민의 카테콜기와의 결합을 통해, 폴리도파민 코팅층을 형성하는 제1단계; 및
    환원제의 존재 하에, 상기 금속 표면의 촉매작용을 통해 폴리도파민의 카테콜기를 퀴논으로 산화시켜, 폴리도파민 코팅층의 산화적 붕괴로 인해 산화적 나노박리를 유도하면서, 제2금속 전구체를 환원시켜 제1금속 기재 표면 상에 제2금속 나노 구조물을 비등방적으로 분지 및 성장시키는 제2단계를 포함하며,
    상기 제1금속은 금이고, 상기 제2금속은 금 또는 은인, 분지된 나노 구조물 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 환원제는 수산화아민, 아스코르브산, 하이드로퀴논, 소디움 보로하이드라이드, 및 하이드라진으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 분지된 나노 구조물 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제2단계는 계면활성제를 추가로 포함하여 수행되는 것인 분지된 나노 구조물 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 계면활성제는 PVP(polyvinylpyrrolidone), PEG(polyethylene glycol), 폴리에틸렌아민, 및 CTAB(cetyl trimethylammonium bromide)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 분지된 나노 구조물 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제2단계에서 폴리도파민의 산화적 붕괴 속도와 붕괴된 폴리도파민을 통한 분지된 나노 구조물의 환원적 성장의 반응 속도를 조절하여, 분지된 나노 구조물의 구조를 결정하기 위해,
    제2금속 전구체 종류 및 이의 농도, 환원제 종류 및 이의 농도, 또는 이들 모두를 선정하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 분지된 나노 구조물 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1금속 표면을 가진 기재는 나노스피어, 나노로드, 코어-쉘 나노입자 또는 코어-갭-쉘 나노입자인 것인 분지된 나노 구조물 제조방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 분지된 나노 구조물을 포함하는 플라즈몬 입자로서,
    상기 분지된 나노 구조물은 코어-갭-쉘 나노입자인 제1금속 기재 표면 상에 제2금속 나노 구조물이 비등방적으로 분지되어 형성된 것인 플라즈몬 입자.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 플라즈몬 입자는 광열효과, 활성산소종(ROS) 생성능 또는 둘 모두를 갖는 것인 플라즈몬 입자.
  12. 제10항에 기재된 플라즈몬 입자를 포함하는 광역학적 치료용 광감응제 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    종양 표적 물질을 추가로 포함하는 것인 광역학적 치료용 광감응제 조성물.
  14. 제10항에 기재된 플라즈몬 입자를 포함하는 광열 치료용 광감응제 조성물.
  15. 제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 분지된 나노 구조물을 포함하는 표면증강라만산란(SERS) 기재로서,
    상기 분지된 나노 구조물은 코어-갭-쉘 나노입자인 제1금속 기재 표면 상에 제2금속 나노 구조물이 비등방적으로 분지되어 형성된 것인 표면증강라만산란 기재.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 SERS 기재는 기재의 표면 또는 내부에 라만활성물질을 추가로 포함하여 SERS 탐침으로 사용되는 것인 표면증강라만산란 기재.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 코어-갭-쉘 입자의 내부에 형성된 나노갭에, 그 표면에 형성된 분지된 금속 나노 구조물 사이에, 또는 나노갭 및 분지된 금속 나노구조물 사이 모두에 라만활성물질을 포함하는 것인 표면증강라만산란 기재.
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