KR101726126B1 - 히알루론산 기반의 수화겔 복합체 및 이를 이용한 수화겔의 색상 및 상변이 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히알루론산 기반의 수화겔 복합체 및 이를 이용한 수화겔의 색상 및 상변이 조절 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 카테콜 치환된 히알루론산 및 Fe^{3 +} 이온을 포함하는, 주변 pH 조건에 따라서 색상 및 상전이가 가능한 히알루론산 기반의 수화겔 복합체 및 이를 이용한 수화겔의 색상 및 상변이 조절방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 다양한 pH 영역에서 각기 다른 상으로 존재하기 때문에 생체 환경에 유용하게 적용이 가능하고, 또한 종래 키토산의 겔화 반응에 비해서 월등하게 적은 양의 카테콜 치환을 통해서도 상전이가 가능하며, 더 나아가 주변 환경에 따라서 색상 변화를 수반하는 수화겔 복합체를 제공할 수 있으며, 이를 재생의학, 조직 공학, 줄기세포 배양 및 분화, 약물 전달체 등과 같은 다양한 바이오 분야에 폭넓게 응용할 수 있다.

Description

히알루론산 기반의 수화겔 복합체 및 이를 이용한 수화겔의 색상 및 상변이 조절 방법 {Hydrogel complex based on hyaluronic acid and method for controlling phase transition and color of hydrogel using the hydrogel complex}

본 발명은 히알루론산 기반의 수화겔 복합체 및 이를 이용한 수화겔의 색상 및 상변이 조절 방법에 관한 것이다.

바다 홍합은 거친 주변 환경에 적응하기 위해서 족사 (byssal thread)를 갖는 바, 이는 내부 연질층 및 외부 각질층으로 구성된다. 이러한 외부 각질층은 홍합 족부 단백질 1 (mfp-1)이라는 단백질로 주로 구성되며, 이는 충격 흡수재의 역할을 한다. 일련의 보고들에 따르면, 이러한 Mfp-1 단백질이 다양한 3,4-디히드록시페닐알라닌 (DOPA) 잔기 및 금속, 특히 Fe3+ 이온을 포함하는 것으로 보고되고 있다 (비특허문헌 1 및 2). 따라서, 홍합의 이러한 특성으로부터, 이를 모방한 충격 흡수재 물질들을 개발하기 위한 바이오엔지니어링이 진행되고 있기도 하다 (비특허문헌 3).

DOPA 잔기가 차지하고 있는 분자 구조들 중에서, Fe^{3 +}는 산화제로서뿐만 아니라, 1,2-디히드록시벤젠 (카테콜) 펜던트기와의 금속 착화합물 형성이라는 두 가지 역할을 수행한다 (비특허문헌 4). Fe^{3 +}-카테콜 복합체 (모노복합체에 대해서 log K = 20)의 반응은 즉각적인 반응으로서, pH 조절을 통해서 모노, 비스 및 트리스-착화합물과 같이 Fe³⁺-카테콜 배위결합의 정도를 조절한다 (비특허문헌 5).

겔화에 기반한 배위결합 복합체는 가역적인 겔화, 자가-치유, 부착, 광물화 없는 구조적 강도, 물에서의 관능성, 및 기계적 특성의 조절가능과 같은 놀라운 특성들을 갖는 수화겔을 제공할 수 있다 (비특허문헌 6 및 7). 반면에, Fe^{3 +}에 의한 카테콜 산화는 비가역적인 카테콜 커플링 반응을 야기한다 (비특허문헌 8). 비록, 카테콜 커플링의 속도는 배위결합 착화합물에 비해서 훨씬 느리지만, 비가역적인 공유결합에 의해서 외부 자극에 둔감한 고체 겔 구조가 형성될 수 있다.

홍합 각질층으로부터 영감을 얻은 최근의 연구들은 주로 천연 폴리머로서, 생물학적 응용에 유망한 것으로 간주되는 선형 아미노 다당류인 키토산에 주로 집중되어 있다 (비특허문헌 9 및 10). 그러나, 아민 관능성으로 인해서 야기되는 키토산의 강한 표면 양전하로 인해서, 매우 높은 정도의 카테콜 치환이 필요할 뿐만 아니라, 카테콜 커플링을 위해서 긴 겔화 시간을 통해서만 양이온 (Fe^{3 +})과 양이온성 폴리머 (키토산) 사이의 반발력이 감소된다는 단점이 있다 (비특허문헌 11).

히알루론산 (hyaluronic acid, HA)은 세포외 기질 존재하는 글리코스아미노글리칸으로서, 점탄성이 매우 높고, 공간을 채우는 특성이 있어서, 조직 공학에서 널리 사용되고 있다. 더 나아가, HA의 음이온 전하는 Fe^{3 +}와의 인력으로 인해서 겔화에 기여할 수 있다. 그러나, 종래에는 이러한 히알루론산의 우수한 특성을 활용하여 pH 등과 같은 소정 환경 변화에 따라서 능동적으로 변화하는 환경 응답성 수화겔을 제공한 예는 보고된 바가 없다.

비특허문헌 1: C. J. Sun, J. H. Waite, J Biol Chem 2005, 280, 39332. 비특허문헌 2: N. Holten-Andersen, T. E. Mates, M. S. Toprak, G. D. Stucky, F. W. Zok, J. H. Waite, Langmuir 2009, 25, 3323. 비특허문헌 3: N. Holten-Andersen, A. Jaishankar, M. J. Harrington, D. E. Fullenkamp, G. DiMarco, L. H. He, G. H. McKinley, P. B. Messersmith, K. Y. C. Leei, Journal of Materials Chemistry B 2014, 2, 2467. 비특허문헌 4: D. E. Fullenkamp, D. G. Barrett, D. R. Miller, J. W. Kurutz, P. B. Messersmith, Rsc Advances 2014, 4, 25127. 비특허문헌 5: N. Schweigert, A. J. B. Zehnder,R. I. L. Eggen, Environ Microbiol 2001, 3, 81. 비특허문헌 6: C. C. Broomell, M. A. Mattoni, F. W. Zok, J. H. Waite, J Exp Biol 2006, 209, 3219. 비특허문헌 7: M. J. Harrington, J. H. Waite, Biomacromolecules 2008, 9, 1480. 비특허문헌 8: D. Smejkalova, P. Conte, A. Piccolo, Biomacromolecules 2007, 8, 737. 비특허문헌 9: I. Brzonova, W. Steiner, A. Zankel, G. S. Nyanhongo, G. M. Guebitz, Eur J Pharm Biopharm 2011, 79, 294. 비특허문헌 10: O. Zvarec, S. Purushotham, A. Masic, R. V. Ramanujan, A. Miserez, Langmuir 2013, 29, 10899. 비특허문헌 11: P. S. Yavvari, A. Srivastava, Journal of MaterialsChemistry B 2015, 3, 899.

이에, 본 발명에서는 주변 pH 조건에 따라서 색상 및 상전이가 가능하기 때문에, 재생의학, 조직 공학, 줄기세포 배양 및 분화, 약물 전달체 등과 같은 다양한 바이오 분야에 폭넓게 제공될 수 있는 히알루론산 기반의 수화겔 복합체 및 이를 이용한 수화겔의 색상 및 상변이 조절 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,

카테콜 치환된 히알루론산 및 Fe^{3 +} 이온을 포함하는, 주변 pH 조건에 따라서 색상 및 상전이가 가능한 히알루론산 기반의 수화겔 복합체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 카테콜 치환된 히알루론산은 상기 히알루론산의 카르복실산기가 카테콜기로 치환된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 카테콜 치환된 히알루론산은 상기 히알루론산의 카르복실산기 중 18% 내지 45%가 치환된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 카테콜과 상기 Fe^{3 +} 이온의 몰 비율은 상기 카테콜 1 몰에 대해서 상기 Fe³⁺ 이온 0.2몰 내지 0.8몰일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 복합체는 3 중량% 내지 10 중량%의 수용액으로 존재할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 복합체는 pH 2-3에서 황색, pH 4-5에서 녹색, pH 7-8에서 암녹색, pH 10-11에서 암적색을 나타낼 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 복합체는 pH 4-5에서 액체 상태, pH 7-8에서 액체와 겔의 중간 상태, pH 10-11에서 겔 상태로 존재할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, pH 4-5에서 액체 상태로 존재하는 상기 복합체는 상온에서 13 분 이상 방치할 경우 겔 상태로 변화될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 겔 상태로 변화된 상기 복합체는 이후 pH가 변화하더라도 겔 상태를 유지할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 수화겔 복합체를 이용한 수화겔의 색상 및 상변이 조절방법으로서, 상기 복합체의 주변 pH 조건을 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수화겔의 색상 및 상변이 조절방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 다양한 pH 영역에서 각기 다른 상으로 존재하기 때문에 생체 환경에 유용하게 적용이 가능하고, 또한 종래 키토산의 겔화 반응에 비해서 월등하게 적은 양의 카테콜 치환을 통해서도 상전이가 가능하며, 더 나아가 주변 환경에 따라서 색상 변화를 수반하는 수화겔 복합체를 제공할 수 있으며, 이를 재생의학, 조직 공학, 줄기세포 배양 및 분화, 약물 전달체 등과 같은 다양한 바이오 분야에 폭넓게 응용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라서 EDC/HOBt 커플링 반응에 의해서 합성된 HA-CA에 대한 ¹H NMR 스펙트럼을 도시한 도면이다.
도 2a 내지 2f는 HA-CA 중량비 및 Fe^{3 +}:카테콜의 몰 비율을 정량적으로 변화시킴에 따른 겔화 테스트 (도 2a 내지 2c), Fe^{3 +}:카테콜 몰 비율이 1:3인 경우 pH 조절에 따른 상변이 (도 2e), 다른 Fe^{3 +}:카테콜 몰 비율을 갖는 수화겔들의 UV-vis 스펙트럼 (도 2b 및 2d), 및 몰 비율 1:3에서의 pH 조절을 도시한 그래프 (도 2f)이다.
도 3a는 pH 3에서 Fe3+와 HA-CA의 혼합물 용액에 대한 SEM 사진 (도 3a) 및 pH를 증가시킨 이후 pH 10에서의 수화겔에 대한 SEM 사진 (도 3b)이다.
도 4는 Fe^{3 +}:카테콜 몰 비율이 1:3인 수화겔의 pH 조절에 따른 상 변이에 대한 유변학적 특성을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 전체 pH 영역에서 색상 변화를 수반하는 HA-CA 겔 형성 과정을 개략적으로 도시한 도면이며, 도 5b는 Fe^{3 +}:카테콜 몰 비율이 1:3인 수화겔에서 경화 시간 이후 진동 시간 스윕에 의한 강도를 측정한 그래프이고, 도 5c는 다양한 pH 수치값에서 HA-CA의 제타 포텐셜 곡선을 도시한 그래프이다.
도 6은 Fe^{3 +}:카테콜 몰 비율이 1:3인 수화겔에서 경화 시간 이후 pH 조절에 의해서 형성되는 HA-CA 수화겔의 라만 스펙트럼을 도시한 그래프이다.
도 7a 내지 7f는 Fe^{3 +}:카테콜 몰 비율이 1:3인 수화겔에서 경화 시간 이후 HA-CA 수화겔들의 SEM 영상들을 도시한 것으로서, 각각 13분 후 겔화된 표면 (도 7a), 황색 (도 7b), 녹색 (도 7c), 암녹색 (도 7d), 및 암적색 (도 7e) 수화겔들의 모폴로지를 도시한 것이며, pH 조절에 따른 배위결합 상태의 변화를 개략적으로 도시한 도면 (도 7f)이다.
도 8은 pH 2.5, 4.5, 7.0, 및 10.0에서 경화시간 이후 형성된 HA-CA 수화겔들의 유변학적 특성들을 주파수 스윕 특성화에 의해서 분석한 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에서는 주변 pH의 조절에 따라서 상전이 및 색상 변화가 가능한 히알루론산 기반의 수화겔을 제공하며, 본 발명에 따른 수화겔은, 크게 두 가지 특성, 즉 i) pH에 따라서 상전이가 가능하며, ii) 소정 조건에서 겔화된 복합체의 경우, 이후 pH 변화가 수반되더라도, 전체 pH 영역에 걸쳐서 겔 형성의 유지가 가능하다는 특성을 갖는다.

본 발명에 따른 수화겔 복합체는, 그 구성 성분으로서, 카테콜 치환된 히알루론산 및 Fe³⁺ 이온을 포함한다.

하기 실시예에서 후술하는 바와 같이, 상기 카테콜 치환된 히알루론산 (HA-CA)은, 히알루론산의 카르복실산기를 도파민 등과 같은 카테콜기로 치환시킴으로써 제조될 수 있으며, 이때 본 발명에 따른 복합체는 종래기술과 비교할 때, 현저하게 작은 정도의 카테콜 치환도에 의해서도 겔화를 야기할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 히알루론산의 카르복실산기 중 약 18% 내지 45%가 카테콜기로 치환될 수 있는 바, 치환도가 18% 미만인 경우에는 겔화 시간이 오래 걸린다는 문제점이 있고, 45%를 초과하는 경우에는 카테콜 치환을 위해서 사용되는 시약들의 소모량 또는 필요량이 많아진다는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.

한편, 본 발명에 따른 수화겔 복합체는 상기 HA-CA 이외에 다른 구성 성분으로서, Fe^{3 +} 이온을 포함하는 바, 이러한 Fe_{3 +} 이온의 몰 비율은 상기 카테콜 1 몰에 대해서 상기 Fe^{3 +} 이온 0.2몰 내지 0.8몰일 수 있다. 특히, 하기 실시예에서도 후술하는 바와 같이, Fe^{3 +}:카테콜 몰 비율은 수화겔의 겔화 특성에 중요한 영향을 끼치는 바, Fe^{3 +}가 상기 범위를 초과하는 몰 농도로 포함되는 경우, 강산인 Fe^{3 +} 이온의 양이 많아지면 반응시 pH가 감소하게 되고, 이는 카테콜 커플링 반응 (공유결합 생성)의 속도를 낮추어 겔화 시간이 오래 걸리거나 겔이 생성되지 않는 문제점이 있다. 또한, Fe^{3 +}가 상기 범위 미만인 경우, Fe^{3 +} 이온의 수가 상대적으로 적어져서 가고 반응에 참여하는 Fe^{3 +}의 수가 줄어들게 되므로 겔화가 오래 걸리거나, 아예 겔이 생성되지 않는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.

또한, 상기 복합체는 수용액 상태로 제조될 수 있는 바, 하기 실시예에서도 서술된 것처럼, 복합체의 수용액 중 농도가 3 중량% 미만인 경우에는 겔화가 진행되지 않는다. 한편, 수용액 중 농도가 10 중량%를 초과하는 경우에도 고가의 히알루론산을 과다하게 소모하게 되는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.

본 발명에 따른 복합체는 pH 조절에 따라서 색상 변화가 가능한 바, pH 2-3에서는 황색, pH 4-5에서는 녹색, pH 7-8에서는 암녹색, pH 10-11에서는 암적색의 색상을 나타낸다. 또한, pH에 따른 상변이의 경우, pH 4-5에서 액체 상태, pH 7-8에서 액체와 겔의 중간 상태, pH 10-11에서 겔 상태로 존재할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 복합체는 pH 4-5에서 액체 상태로 존재하다가도, 이를 상온에서 13 분 이상 방치할 경우 겔 상태로 변화되게 되면, 겔 상태로 변화된 복합체는 이후 pH가 변화하더라도 전 pH 영역에 걸쳐서 겔 상태를 유지할 수 있게 된다.

한편, 본 발명은 또한, 상기 수화겔 복합체를 이용한 수화겔의 색상 및 상변이 조절방법을 제공하며, 이는 전술한 주변 pH 조건 조절에 의해서 가능해진다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

재료

히알루론산 (HA, 200 kDa)은 Lifecore Biomedical (Chaska, MN, USA)로부터 구입하였다. 1-(3-디메틸아미노프로필) 에틸카르보다이이미드 하이드로클로라이드 (EDC)는 Alfa Aesar로부터 구입하였다. 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트 (HOBt, ≥ 97.0%), 도파민 하이드로클로라이드, 및 철 (III) 클로라이드 헥사하이드레이트는 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline (DPBS)은 WELGENE (Daegu, Korea)으로부터 구입하였다. 18.2 MΩ.cm 이상의 저항값을 갖는 탈이온수를 사용하였다.

실험

카테콜 치환된 히알루론산의 합성

카테콜 치환된 히알루론산 (HA-CA)은 EDC/HOBt 커플링 반응에 의해서 합성하였는 바, 히알루론산의 카르복실산기를 도파민의 아민기로 치환하였다 (X. Xu, A. K. Jha, D. A. Harrington, M. C. Farach-Carson, X. Q. Jia, Soft Matter 2012 , 8, 3280). 히알루론산 300 mg을 100 mL의 DPBS에 용해시키고, 용액을 질소로 30분 동안 퍼징하였다. 1 M HCl을 사용하여 pH를 5.5로 감소시켰다. 이어서, 426 mg의 EDC 및 312 mg의 HOBt를 4 mL의 H2O:DMSO = 1:1 용액에 첨가하하고, 429 mg의 도파민 하이드로클로라이드를 첨가하였다. 용액의 pH를 1 M HCl 및 1 M NaOH를 사용하여 5.0 내지 5.5로 8 시간 동안 유지하였다. 반응시간 이후에, 용액을 1 M HCl로 조절된 pH 5.0 수용액에 대해서 2일 동안 투석하고 (MWCO: 6000-8000 g/mol SpectraPor) 미반응된 시약들 및 염들을 완전히 제거하기 위해서 1일 동안 탈이온수로 재투석하였다. 결과물인 용액을 2일 동안 동결건조시켰다. 반응물의 몰 비율은, HA:EDC:HOBt:도파민의 카르복실기가 1:3:3:3이었다. HA-CA의 카테콜 치환된 비율은 1H-NMR (Varian Mercury, 400 MHz)로 측정하였다. HA 백본 중 37% 카테콜 접합된 비율은 ppm 6.8-7.2 및 ppm 1.8-2.2 피크들 사이에서 비교함으로써 계산하였다. 25 ℃에서 HA-CA의 제타 포텐셜 수치는 Zetasizer Nano ZS Analyzer (Malvern Ltd., UK)로 측정하였다. 다양한 pH에서 HA-CA의 표면 전하를 측정하기 위해서 수용액 (탈이온수 중 1 mg/ml)을 사용하였다.

Fe ^{3 +} 유도된 HA-CA 하이드로겔의 제조

상기 동결건조된 HA-CA (37% 치환율)를 사용하여 모든 겔 형성 실험을 진행하였다. HA-CA를 탈이온수 중에 완전히 용해시켰다 (3% (w/v)). 겔화에 대한 Fe³⁺:카테콜 비율을 조사하기 위해서, 다양한 농도의 Fe^{3 +} 용액들 (1:3 비율에서 40 mM, 2:3 비율에서 80 mM, 및 3:3 비율에서 120 mM)을, 철 (III) 클로라이드 헥사하이드레이트 및 5% 아세트산 수용액 (v/v)의 분산액으로 제조하였다. 100 μL의 HA-CA 수용액을 페트리 디시 상에서 제조하였다. 23.4 μL의 Fe^{3 +} 용액을 HA-CA 용액에 첨가한 다음, 현탁액을 균일하게 혼합하였다. HA-CA 수화겔의 상 전이는 상기 혼합물을 20 μL의 1M NaOH로 처리하여 pH를 상승시킴으로써 이루어졌다. 겔로부터 액체로의 역 전이는 20 μL의 1M HCl로 처리함으로써 이루어졌다. 반면에, 전체 pH 영역 중 HA-CA 수화겔 형성의 유지는 HA-CA 및 Fe^{3 +} 용액의 혼합물로부터의 경화 시간으로부터 이루어졌다. 겔 형성의 종료점은 다른 시간 지점들에서 역전 방법에 의해서 확인하였다. 경화 시간 이후에, 10 μL의 1M HCl 및 1M NaOH를 샘플에 선택적으로 첨가하여 수화겔의 pH 감소를 야기하였으며, 이어서 충분히 혼합함으로써, 황색 (pH 2-3), 녹색 (pH 4-5), 암녹색 (pH 7-8), 및 암적색 (pH 10-11)의 HA-CA 수화겔을 제조하였다.

UV- Vis 스펙트로포토메트리

가교결합의 유형을 모니터링하기 위해서, Fe^{3 +} 유도된 HA-CA 겔화를, 1 cm 석영 큐벳을 사용하는 UV-Vis 스펙트로포토미터 (OPTIZEN 3220UV, Mecasys Co., Ltd.)로 분석하였다. Fe^{3 +} 및 카테콜기의 비율 효과에 대한 실험을, 5% 아세트산 블랭크 샘플과 비교하며 수행하였다. 50 μL의 3 wt% HA-CA를, 3 mL 5% 아세트산 중의 다양한 Fe^{3 +} 몰 비율을 갖는 용액 11.7 μL와 혼합한 다음, 제조된 용액을 충분히 혼합하였다. 1 M NaOH를 1:3 비율로 제조된 상기 용액에 첨가함으로써, pH 상승에 따른 배위결합 상태를 조사하였다.

겔의 모폴로지

수화겔의 모폴로지는 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해서 관찰하였다. 수화겔 표면의 SEM 영상들을 15 kV에서 구동되는 SNE-4000 M (SEC Co., South Korea)로 얻었다. 겔 형성 이후에 수화겔 샘플들을 바로 동결건조시켰다. 모든 샘플들은 금으로 코팅하였다.

라만 스펙트로스코피

본 실험에서 사용된 광역 조사 (wide area illumination, WAI) 방법은 Kaiser Optical Systems (Ann Arbor, MI, USA)에 의해서 개발된 것이다 (M. Kim, H. Chung, Y. Woo, M. Kemper, Anal Chim Acta 2006 , 579, 209). 큰 샘플 영역을 커버하기 위한 6 mm의 직경을 갖는 원형 조사 영역 (면적 28.3 mm²)을 형성하기 위해서는 여기 레이저 (785 nm, 다이오드 레이저)를 확대시켰다. 50개 광섬유의 어레이를 사용하여 산란 조사를 수집하였으며, 이를 전하-커플링 장치 (CCD) 검출기 (Kaiser Raman Rxn1 unit)로 전달하였다. 라만 스펙트로스코피를 위한 수화겔 샘플은 SEM 분석에 의해서 동일하게 제조하였다. 모든 실험들에는 2초 노출 시간으로 레이저 출력 20 mW를 사용하였다.

겔의 유변학적 분석

수화겔들의 기계적 특성들은 20 mm 평행판을 구비한 회전 유동계 (Gemini 150, Malvern Instruments, UK)를 사용하여 분석하였다. 겔을 사용한 모든 테스트들은, 액상 및 진동 시간 스윕 연구 (oscillatory time sweep study)를 제외하고는, 겔 샘플을 샘플 스테이지 상으로 옮긴 후에 수행하였다. 주파수 스윕은 10% 불변 진동성으로 0.1-10 Hz 영역에서 수행하였다. 진동 시간 스윕은 불변 1 Hz, 10% 스트레인 조건에서 측정하였다. 모든 실험들은 25 ℃에서 수행하였다.

결과 및 검토

카테콜 치환된 히알루론산 (HA-CA)를 제조하기 위해서, HA을, EDC/HOBt 커플링 반응을 통해서, 도파민, 카테콜성 모노머로 치환하였다. HA 백본 중 카테콜 치환의 정도는 ¹H-NMR 스펙트로스코피에 의해서 측정하였으며, 그 결과 37% 치환 비율이 나타났다 (도 1 참조).

1. pH에 따라서 상 변이가 가능한 HA-CA 수화겔 (역전가능 상전이 수화겔 )

HA 수화겔의 상 전이를 위한 최적의 겔화 조건은, Fe^{3 +}와 카테콜 사이의 중량비 및 몰 비율을 정량적으로 변화시킴으로써 조사하였다. HA 수화겔의 겔화는, pH 3.2에서의 HA-CA 및 Fe^{3 +}의 용액이 pH 증가와 함께 pH 10-11에서 상 전이 가능할 때 조사하였다.

도 2a를 참조하면, 1 wt% 및 2 wt%에서 겔화가 진행되지 않는다는 점에 비추어, pH 10-11에서 수화겔 형성을 위한 HA-CA 수용액의 최소 농도는 3 wt%라는 점을 알 수 있다. 일정한 Fe^{3 +}에 대해서 카테콜 몰 비율을 변화시킴으로써 용액의 색상이 변화하였는 바, 특히 1:3 (Fe:카테콜) 비율에서 더욱 그러하였다. 투명한 녹색은 모노-복합체의 형성을 나타내며, 이는 하나의 카테콜이 하나의 Fe3+에 배위결합했다는 것을 의미한다. 금속-카테콜 복합체의 상태는 UV-Vis 스펙트로스코피로 확인하였다. 모노-복합체의 넓은 흡수 피크는 (714 nm)는 1:3 비율에서 뚜렷하게 관찰되었는데, 이는 1:2에서는 거의 흡수가 나타나지 않고, 1:1에서는 불확실한 것과는 대조적인 것이었다 (도 2b 참조).

Fe^{3 +}와의 리독스 반응으로 인해서, 400 nm에서 산화된 카테콜, o-퀴논의 좁은 흡수 피크가 관찰되었다. 그러나, 400 nm에서 1:2와 1:3 사이의 갭은 모노-복합체 피크의 그것에 비해서 훨씬 더 작은 것이었는데, 이는 산성 pH에서는 1:3 비율이 모노-복합체 형성 면에서는 최적의 조건이라는 것을 의미하는 것이다.

도 2c에는 일정한 카테콜에 대해서 Fe^{3 +} 이온의 효과가 도시되어 있는 바, Fe³⁺ 비율이 증가함에 따라서 1:3에서의 녹색이 암황색으로 변화하였다. 더 나아가, Fe^{3 +} 비율이 증가함에 따라서 모노-복합체의 흡수 피크는 조금 높아지는데 반해서, o-퀴논의 흡수 피크는 더욱 강화되었다 (도 2d 참조).

이러한 결과들은 1:3으로부터 3:3으로 Fe^{3 +} 이온이 부가됨으로써 카테콜 산화에서 더 큰 역할을 수행하게 되고, 이는 염기성 pH에서 비스-, 트리스-복합체 형성에 참여하는 카테콜기의 양을 감소시킨다는 점을 입증하는 것이다. 따라서, 배위결합 복합체 중 환원된 카테콜의 최대 함량을 이용하기에는 1:3 비율이 가장 적당하다. pH 점프에 따른 액체-겔 상 전이는 1:3 비율 조건에서 수행되었다. pH 점프에 의한 축적 희석에도 불구하고 상 전이 사이클의 최대 회수는 3회로 관찰되었다. pH 3-4에서의 녹색 용액은 pH 증가에 따라서 즉시 겔화하였다. 도 2e는 초기 용액은 pH 10-11에서 암적색 수화겔로 완전히 변화함에 반해서, pH 7-8에서는 액체와 겔 사이의 중간 상태로 존재함을 보여준다. 도 2f에서 흡수 스펙트럼의 청색 시프트는, pH 증가에 따라서, Fe^{3 +}-카테콜의 배위결합 상태가 모노-복합체 (714 nm)로부터 비스-복합체 (570 nm)를 거쳐서 트리스-복합체 (490 nm)로 변화하는 것을 의미한다. 이는, Fe^{3 +}-카테콜이 충분한 카테콜 커플링 반응 없이 가교결합제로서 주로 영향을 받는 경우에는, 완전한 겔화를 위해서 주로 트리스-배위결합이 요구된다는 것을 입증하는 것이다.

주된 트리스-복합체에 의한 상 전이는 또한 겔 구조에도 영향을 준다. 수화겔의 모폴로지를 주사 전자 현미경 (SEM)으로 분석하였다. 도 3a 및 3b는 1:3에서 초기 용액의 평탄한 모폴로지가 pH 10에서 기공 구조로 급격히 변화하는 것을 보여준다. 주된 트리스-배위결합에 의한 즉각적인 응집은 겔 구조에 비균질성을 야기하며, 여기에서 트리스-복합체에 의한 더 조밀한 HA 부분들은 덜 조밀한 기공 부분들과 비교할 때 주된 겔 네트워크를 포함하게 된다. 상 변화가능한 수화겔의 점탄성 특성들을 알아보기 위해서, 다른 pH를 갖는 각각의 결과물들에 대해서 주파수 스윕에 의해서 진동 유변계로 측정하였다. 도 4는 pH 3에서 Fe^{3 +} 및 HA-CA의 혼합물이 가교결합의 부족으로 인해서 저주파수에서 탄성 특성 (G' < G'')을 나타냄을 보여준다. 더 나아가, 교차 지점인 6.2 Hz는 pH 3 용액에서만 관찰되었는 바, 이는 pH 7 및 10 결과물들이 모두 탄성 특성 (G' > G'')을 나타내는 것과 비교하여 맥스웰-점탄성 모델 특성을 나타낸다는 것을 의미한다 (D. G. Barrett, D. E. Fullenkamp, L. H. He, N. Holten-Andersen, K. Y. C. Lee, P. B. Messersmith, Advanced Functional Materials, 2013, 23, 1111). 저장 계수는 1 Hz 주파수 지점에서, 24.9 Pa (pH 7)을 거쳐서, 7.2 Pa (pH 3)로부터 191.3 Pa (pH 10)까지 급속하게 증가하였는 바, 이는 겔화에 주된 트리스-복합체가 강하게 기여한다는 점을 보여주는 것이다.

2. 모든 pH에서 겔 형태를 유지하며 색상 변화를 나타내는 HA-CA 수화겔

전술한 바와 같이 상전이 가능한 수화겔을 형성함에 있어서, Fe^{3 +} 이온의 이중적 역할, 즉 산화제 및 배위결합제로서의 역할은, 배위결합에 참여라는 관점에서 지나치게 강조된 바 있다. Fe^{3 +}-카테콜 배위결합은 즉각적인 반응이며, o-퀴논이 환원된 카테콜과 커플링 반응을 수행하는 것을 방지하는 바, 이는 금속 착화합물 형성에 비해서 많은 시간을 필요로 한다. 그러나, 카테콜 커플링에 충분한 시간 동안 모노-착화합물로 유지되는 정도에 의해서, 향상된 공유결합 가교화 비율이 유도되고, 이는 외부 자극으로부터 겔 구조를 유지하는데 기여한다.

도 5a는 1:3 (Fe^{3 +}:카테콜) 비율의 용액이 13분 동안의 경화 시간 이내에 점진적으로 겔화됨을 보여준다. 1:3 용액에서의 진동 시간 스윕 (oscillatory time sweep)을 측정하여 겔화 과정을 모니터링하였다. 도 5b는 초기 시간 지점에서의 점성 반응 (G' < G'')이 크로스오버 지점인 200초 이후에 탄성 특성 (G' > G'')으로 변화함을 보여준다. 탄성 특성은 특정 안정기 없이 G'을 증가시킴으로써 지속적으로 향상되었다. 특히, 용액의 인버전 (inversion) 방법에 의해서 얻어진 겔화 시간인 13분은 탄성 결과와 잘 일치하였는 바, 이러한 탄성 결과는 825초에서 급격하게 증가하였다. 더 나아가, 겔화 시간 이후에 점진적으로 증가하는 탄성으로부터, 느린 카테콜 커플링 반응이 완전히 완성되지 않았음을 알 수 있다.

겔화 시간 이후에 미처리된 o-퀴논에 의한 부가적인 공유결합 가교에 의해서, 저장 탄성률 (storage modulus)이 2000초에서 1000 Pa 근방까지 증가되는 바, 이러한 탄성치는 높은 기계적 강도를 요구하는 응용 분야에도 적용가능한 수치이다. 겔화 시간은 HA 중 카테콜 변환 비율을 증가시킴으로써 단축될 수 있으며, 이에 의해서 더 많은 가교결합기들이 생성된다.

한편, 이전의 유사한 보고들에 따르면 카테콜 변환된 키토산이, Fe⁺³ 유도된 커플링 반응에 충분한 경화 시간이 주어지면 산성 조건 (~pH 3)에서 겔화될 수 있는 것으로 보고된 바 있다 (Z. W. Guo, K. F. Ni, D. Z. Wei, Y. H. Ren, Rsc Advances 2015, 5, 37377). 그러나, 키토산의 강한 양이온성 전하로 인해서, Fe_{3 +}와 키토산 사이의 반발성 상호작용에 반해서 겔화 시간을 감소시키기 위해서는, 높은 수준의 변형된 카테콜 비율 (~70 %)이 요구된다. 키토산에 비해서, HA 수화겔의 겔화 시간은, 카테콜의 치환 비율이 낮음에도 불구하고, 현격하게 감소되는 바, 18% 카테콜 치환된 키토산은 겔화에 9 시간이 소요됨에 반해서, 19% 카테콜 치환된 HA는 35분이 소요된다. 따라서, HA의 겔화에는 카테콜 커플링 뿐만 아니라, 다른 요인들도 중요한 영향을 미치는 것으로 보인다. HA-CA의 제타 포텐셜 수치는 거의 모든 pH 영역, 심지어 강산성인 pH 2에서도 음이온성 제타 수치를 나타낸다 (도 5c 참조). HA의 강 음이온성 특성은 주로 HA 백본 중 카르복실레이트기의 존재 때문이다 (D. Y. Ko, H. J. Moon, B. Jeong, Journal of Materials Chemistry B 2015, 3, 3525). HA 중의 카르복실레이트기가 Fe^{3 +}와 함께 HA 겔화에 적용되었으며, 이는 Fe³⁺와 카르복실레이트기의 정전기적 상호작용에 의해서 가교결합의 역할을 하게 된다. 비록, 1:3 비율에서의 반응 조건이고, 카르복실산의 pKa (~3.75)보다 더 낮은 pH 3.21로 인해서, 음이온성 카르복실레이트의 보조가 부분적으로 가능하지만, 음의 제타 수치는 여전히 인력 상호작용에 의한 자발적 겔화에 기여한다.

공유 카테콜 가교결합 및 인력 상호작용을 기반으로, pH 조절에 의한 부가적인 배위결합에 의해서 전체 pH 영역에 걸쳐서 색상 변화와 함께 수화겔 형성이 야기된다. 다른 pH에서 HA 수화겔의 네 가지 색상들은 카테콜 잔기와의 Fe^{3 +}의 배위 상태를 나타낸다. 도 2f에서 서술한 바와 같이, HA 수화겔이 pH 4-5에서 녹색, pH 7-8에서 암녹색 및 pH 10-11에서 암적색을 나타내는 것은 (도 5a 참조), 각각 Fe^{3 +}와 카테콜 사이에서 모노-, 비스-, 및 트리스-배위결합이 이루어지기 때문이다. 상전이 겔의 액체 및 중간 상태와 비교할 때, 본 발명의 겔화 방법에 의해서는 pH 4-8에서 수화겔의 유지가 가능하며, 특히 암녹색 수화겔이 생리적 조건에서 적용될 수 있다. 더 나아가, 수화겔 형성은 강산 조건인 pH 2-3에서도 유지되는 바, 이는 해리된 배위결합 복합체로 인해서 겔화에는 부적합한 pH 조건이라 할 수 있다.

HA 수화겔 네트워크 중 Fe^{3 +}-카테콜 배위결합의 공명 라만 스펙트럼 특성은 광폭 라만 스펙트로스코피 (wide Raman spectroscopy)에 의해서, 근적외선 (785 nm) 레이저를 사용하여 수행하였다. 도 6은 pH에 따른 Fe^{3 +}와 카테콜의 페놀성 산소 원자들 사이의 상호작용이, 531, 590, 및 633 cm^-1 근방의 피크들에서 관찰되는 반면, 1270, 1325, 1420, 및 1483 cm^-1 근방의 피크들은 Fe^{3 +}-카테콜 복합체의 고리 진동을 나타냄을 보여준다. Fe-O 상호작용 및 고리 진동에 관련된 피크들은 pH 2.5에서는 관찰되지 않았는 바, 이는 Fe가 존재하지 않는 HA-CA와 유사한 것이다. 그러나, pH 7을 경유하여 pH가 4.5로부터 10으로 증가함에 따라서, Fe^{3 +}-카테콜 배위결합에 관여하는 강도의 증가가 유도된다. 531 cm^-1 근방에서의 피크는 Fe^{3 +}와 카테콜의 산소 사이의 바이덴테이트 킬레이트 (bidentate chelate)의 전하 수송 (CT) 상호작용을 나타내는 것이다. 다른 Fe-O 상호작용 피크들 (590, 633 cm^{- 1})에 대한 CT 피크의 면적 비율은, 각각 pH 4.5에서 19%, pH 7.0에서 25%, 및 pH 10에서 31%로 측정되었다. pH 증가에 따라서 면적 비율이 증가하는 것은 바이덴테이트 착물화의 증가를 의미하는 것으로서, HA 수화겔 네트워크에서의 Fe^{3 +}-카테콜 배위결합이 모노-착화합물에서, 비스-착화합물을 거쳐서 트리스-착화합물로 변화되는 것을 의미한다.

pH 조절에 따라서 수화겔의 구조가 변화하는 것은 SEM으로 조사하였다. 경화 시간에 걸쳐서 1:3 비율 용액의 평탄한 모폴로지는 겔화 도중에 유지되었다 (도 7a 참조). 그러나, pH 감소를 위해서 HCl 처리를 수행함으로써 수화겔 표면이 평탄해지지 않았으며, 이는 불규칙한 벌집 형태를 닮은 것이었다 (도 7b 참조). 수화겔 표면 상의 빈 공간들은 주로 pH 2-3에서 모노-착화합물로부터 Fe^{3 +}가 해리되는 것에 기인한 것이며, 이로 인해서 공유결합 가교 네트워크만 남게 된다. 도 7c는 황색으로부터 녹색 수화겔로 pH가 증가함에 따라서 황색 겔의 네트워크 패턴을 따라서 겔 구조의 팽창이 야기되는 바, 이는 pH 증가에 따라서 모노-착화합물의 도입 및 HA의 팽창 능력이 향상되는 것에 기인한 것이다. 반면에, 일련의 pH 증가는 평탄한 겔 네트워크를 주름진 구조로 변화시키는 것으로 나타났다. 녹색 겔과 비교할 때, 암녹색 수화겔의 겔 네트워크는 곧게 펼쳐진 겔 구조로 응축되었다 (도 7d 참조). 응축된 겔 구조는 pH 10-11에서 완전히 말려졌으며, 이로 인해서 겔 네트워크가 상방향으로 들어올려졌다 (도 7e 참조). pH 증가에 따라서 점차적으로 응축되는 겔 구조는 배위결합 상태가 증가함에 따른 응축성 강화때문이며, 이때 트리스-착화합물이 가장 강력한 응집 특성을 나타낸다.

이중 가교결합 수화겔의 기계적 특성들은 주파수 스윕을 통해서 조사하였다. 도 8은 탄성 기울기가 pH 증가에 의해서 감소하는 것을 보여준다. 이러한 결과는 주로 각각의 pH 조건에서 미반응된 카테콜과의 부가적인 겔화 및 HA 사슬 재배열에 변이가 발생하기 때문이다. 수화겔 네트워크 중 미반응된 카테콜 잔기들은 Fe^{3 +}와의 배위결합 뿐만 아니라, 여분의 커플링 반응을 유도하는 바, 여분의 배위결합 사이트로 인해서 트리스-착화합물보다는 모노-착화합물 및 비스-착화합물에서 더욱 결합가능하다. 부가하여, 고분자량 HA의 사슬 재배열은 최소 자유 에너지에 도달하기 위해서 상당한 시간을 필요로 한다. 재배열 과정은 주파수 스윕, 특히 고주파수 지점, 더 낮은 pH에서 활발하게 진행되는데, 이는 강한 트리스-배위결합에 따라서 미리 재배열된 암적색 겔과는 비교되는 것이다. 저장 탄성의 비교를 통해서, 기계적 강도의 향상은 배위결합 상태에 비례하는 것을 알 수 있다. 다른 겔들과 비교해서, 암적색 겔은 전형적인 Hookean 탄성 모델 또는 Newtonian 특성과 부합하지 않는 비정상적인 특징을 나타내었다. 이러한 현상은 모노-배위결합 및 비스-배위결합보다 가해진 로드로부터 에너지를 더욱 잘 분산시키는 트리스-배위결합의 특성에 기인한 것으로서, 홍합 족사 상의 각피층의 충격-흡수 역할과 유사한 것이라 할 수 있다.

요약하면, 본 발명에서는 두 가지 형태의 HA-CA 수화겔 형성 특성을 소개하는 바, 이는 액체로부터 겔로의 상전이, 또한 전체 pH 영역에서 겔의 유지이며, 이러한 특성들은 Fe^{3 +}에 의해서 유도된 공유결합 및 배위결합에 의해서 조절된다. 카테콜성 HA 중 Fe^{3 +}의 두 가지 역할, 즉 Fe^{3 +}-카테콜 배위결합 및 카테콜 산화, 이어서 커플링 반응은 다양한 겔화를 위해서 선택적으로 사용될 수 있다. 결과적으로, 상전이 가능한 HA-CA 겔이 즉각적인 pH 조절과 Fe^{3 +}-카테콜 배위결합에 의해서 제조될 수 있다. 반면에, 공유결합에 소요되는 경화시간으로 인해서 pH 조절에 따라서 색상 변화가 가능한 HA-CA 겔이 제공되는데, 이때 겔 구조는 이중 가교결합 및 Fe^{3 +}와 HA-CA 사이의 정전기적 상호작용에 의해서 유지된다. 수화겔의 모폴로지 및 기계적 특성들로부터, 배위결합으로 인한 향상된 응집성 및 충격 흡수 특성을 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 HA 수화겔은 손쉽게 상, 겔 네트워크화, 및 점탄성을 조절할 수 있으므로, 다양한 생물학적 분야에 응용될 수 있다.

Claims (10)

1. 카테콜 치환된 히알루론산 및 Fe³⁺ 이온을 포함하는, 주변 pH 조건에 따라서 색상 및 상전이가 가능하며, 상기 카테콜과 상기 Fe³⁺ 이온의 몰 비율은 상기 카테콜 1 몰에 대해서 상기 Fe³⁺ 이온 0.2몰 내지 0.8몰인 것을 특징으로 하는 히알루론산 기반의 수화겔 복합체.
2. 제1항에 있어서,
   상기 카테콜 치환된 히알루론산은 상기 히알루론산의 카르복실산기가 카테콜기로 치환된 것을 특징으로 하는 수화겔 복합체.
3. 제1항에 있어서,
   상기 카테콜 치환된 히알루론산은 상기 히알루론산의 카르복실산기 중 18% 내지 45%가 치환된 것을 특징으로 하는 수화겔 복합체.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 복합체는 3 중량% 내지 10 중량%의 수용액으로 존재하는 것을 특징으로 하는 수화겔 복합체.
6. 제1항에 있어서,
   상기 복합체는 pH 2-3에서 황색, pH 4-5에서 녹색, pH 7-8에서 암녹색, pH 10-11에서 암적색을 나타내는 것을 특징으로 하는 수화겔 복합체.
7. 제1항에 있어서,
   상기 복합체는 pH 4-5에서 액체 상태, pH 7-8에서 액체와 겔의 중간 상태, pH 10-11에서 겔 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 수화겔 복합체.
8. 제7항에 있어서,
   pH 4-5에서 액체 상태로 존재하는 상기 복합체는 상온에서 13 분 이상 방치할 경우 겔 상태로 변화되는 것을 특징으로 하는 수화겔 복합체.
9. 제8항에 있어서,
   상기 겔 상태로 변화된 상기 복합체는 이후 pH가 변화하더라도 겔 상태를 유지하는 것을 특징으로 하는 수화겔 복합체.
10. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 수화겔 복합체를 이용한 수화겔의 색상 및 상변이 조절방법으로서, 상기 복합체의 주변 pH 조건을 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수화겔의 색상 및 상변이 조절방법.

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