KR101719569B1 - 체외충격파를 이용한 세포로부터 세포외소포체 생성 및 분비 촉진 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 체외충격파를 이용한 세포로부터 세포외소포체 생성 및 분비 촉진 방법에 관한 것으로, 구체적으로 체외충격파를 이용하여 혈관 내피세포로부터 세포외소포체의 발생 및 분비가 증가됨을 확인하였으며, 이를 이용하여 siRNA를 다른 물질의 도움없이 세포 내로 이동시키고, 동물을 이용한 종양 모델에 siRNA를 도입시킴으로써 신생 혈관의 생성이 억제되는 것을 확인하였고, 체외충격파에 의해 분비되는 세포외소포체의 크기 및 분비량을 확인함으로써, 본 발명의 방법은 세포로부터 안전하게 세포외소포체의 생성 및 분비를 촉진시키는 방법으로 다양한 분야에 이용될 수 있다.

Description

체외충격파를 이용한 세포로부터 세포외소포체 생성 및 분비 촉진 방법{The novel method for secretion of extracellular vesicles from cells and tissues using shockwave}
본 발명의 목적은 체외충격파를 이용하여 세포로부터 세포외소포체의 생성 및 분비를 촉진시키는 방법에 관한 것으로, 세포 및 조직에 유해하지 않는 방법으로 세포외소포체의 생성 및 분비를 촉진시켜 다양한 연구 및 치료에 적용될 수 있다.
충격파(shock wave)는 특정 음파 발생기를 통해 생성되는 연속된 단일 음파로 100 MPa까지의 높은 피크 압력의 진폭을 갖고, 1 ㎛ 미만의 짧은 지속시간을 가지며, 0.005 내지 0.32 mJ/mm2 범위의 에너지 밀도로 특정 표적 부위에 전달될 수 있다.
높은 에너지의 체외 충격파 석쇄술(extracorporeal shock-wave lithotripsy, ESWL)은 35 내지 100 MPa의 압력을 인체 특정 부위에 조사하는 치료 방법으로 신장과 담관의 결석을 분해하는데 사용된 이래 다양한 분야에서 새로운 치료방법으로 시도되고 있다(Chaussy, C. et al. First clinical experience with extracorporeally induced destruction of kidney stones by shock waves. J Urol 127, 417.420 (1982)). 최근에는 체외 충격파 석쇄술이 근골격계 질환 치료에 이용되고, 항염증작용 및 혈류 증가에 효과가 있다고 보고되고 있다.
세포외소포체(extracellular vesicles)는 세포에서 분비되는 수 nm에서 수 ㎛에 이르는 미세한 크기의 입자를 지칭하며, 종래에는 이러한 세포외소포체가 세포에서 분비되는 찌꺼기로 여겨졌으나, 최근에는 세포외소포체들이 임상학적으로 의미있게 여겨지며, 다양한 연구가 진행되고 있다. 특히, 세포에 의해 배출되는 구형 소낭인 엑소좀(exosomes)은 모세포의 단백질, DNA 등의 다양한 정보를 지니고 있어, 이를 바이오 마커로 활용하여 암진단 마커 및 센서 개발이 활발히 진행되고 있다.
이에, 본 발명자들은 엑소좀(exosomes), 엑토좀(extosomes), 미세수포(microvesicle) 또는 세포자멸체(apoptotic body) 등을 포함하는 세포외소포체의 생성 및 분비를 촉진시키는 방법을 연구하던 중, 체외충격파를 처리한 세포에서 세포외소포체의 생성 및 분비가 증가하며, 체외충격파를 이용하여 원하는 DNA나 RNA 염기를 포함하는 세포외소포체를 대량으로 생산하는 방법을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 본 발명의 목적은 체외충격파를 이용하여 세포로부터 세포외소포체의 생성 및 분비를 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 체외충격파를 세포 또는 인간을 제외한 개체에 처리하는 단계를 포함하는 세포로부터 세포외소포체(extracellular vesicles)의 분비를 촉진시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 체외충격파를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포로부터 핵산, 단백질 및 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 세포외소포체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 체외충격파를 이용, 세포로부터 세포외소포체(extracellular vesicles) 생성 및 분비를 촉진하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 체외충격파를 가했을 때 혈관 내피세포로부터 세포외소포체의 발생 및 분비가 증가되고, 이 세포외소포체를 이용하여 siRNA와 같은 물질을 세포 또는 동물 모델에 용이하게 도입할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명의 방법은 세포 또는 인간을 제외한 개체로부터 안전하게 핵산, 단백질 또는 화합물을 포함하는 세포외소포체를 생성 및 분비를 촉진시키는 방법으로 다양한 분야에 활용될 수 있다.
도 1은 HUVECs(human umbilical vein endothelial cell)에 체외충격파를 이용하여 VEGFR2 siRNA 및 VE-cadherin siRNA를 형질전환하고 이를 확인한 도이다.
도 2는 HUVECs에 체외충격파 또는 리포펙타민(Lipofectamine)을 이용하여 VEGFR2 siRNA를 형질전환하고 이를 확인한 도이다;
도 2a는 HUVECs에 체외충격파 또는 리포펙타민을 이용하여 VEGFR2 siRNA를 형질전환하고, VEGFR2의 발현을 확인한 도이며,
도 2b는 도 2a를 수치화하여 나타낸 도이고;
도 2c 체외충격파 또는 리포펙타민을 이용하여 형질전환한 HUVECs 배양 배지에 형광 물질을 첨가하여 이를 확인한 도이며;
도 2d는 HUVECs에 Cy3-표지된 VEGFR2 siRNA를 체외충격파 또는 리포펙타민을 이용하여 형질전환하고 이를 확인한 도이다..
도 3은 HUVECs에 GFP(Green fluorescent protein)를 암호화하는 벡터를 체외충격파 또는 리포펙타민을 이용하여 형질전환하고 이를 확인한 도이다.
도 4는 인간 평활근 세포(HSMCs)에 Cy3-표지된 GAPDH siRNA를 체외충격파 또는 리포펙타민을 이용하여 형질전환하고 이를 확인한 도이다.
도 5는 CT-26 세포에 Cy3-표지된 GAPDH siRNA를 체외충격파 또는 리포펙타민을 이용하여 형질전환하고 이를 확인한 도이다.
도 6은 PC-3, iMAEC 및 Cos-7 세포에 Cy3가 표지된 siRNA를 체외충격파 또는 리포펙타민을 이용하여 형질전환하고 이를 확인한 도이다.
도 7은 체외충격파 처리 후 배양 시간에 따른 형질전환 효과를 확인한 도이다.
도 8은 체외충격파 처리 후 배양 시간 또는 조건에 따른 형질전환 효과를 확인한 도이다;
도 8a는 Cy3가 표지된 siRNA와 체외충격파가 처리된 HUVECs를 지정된 시간(5분 및 24시간)에 따라 배양하고, siRNA가 제거된 배지로 24시간 배양하였을 때 형질전환 효과를 확인한 도이다;
도 8b는 HUVECs에 Cy3가 표지된 siRNA를 체외충격파 처리 및 비처리 조건으로 처리한 후, 상기 배지를 체외충격파가 처리되지 않은 HUVECs로 옮겨 배양하였을 때 형질전환 효과를 확인한 도이다;
도 8c는 HUVECs에 Cy3가 표지된 siRNA를 체외충격파 처리하여 형질전환한 후, 배지의 세포외소포체를 제거하고 다시 배양하였을 때 형질전환 효과를 확인한 도이다.
도 9는 생체 밖에서 체외충격파에 의한 형질전환 효과를 확인한 도이다;
도 9a는 마우스 대동맥 고리에서 VEGFR2 siRNA를 체외충격파 또는 리포펙타민으로 처리하여 형질전환하고 신생 미세 혈관 생성을 확인한 도이다.
도 9b는 도 9a를 도식화하여 나타낸 도이다.
도 10은 체외충격파에 의한 siRNA 형질전환을 이용하여 CT26 종양 치료 효과를 확인한 도이다.
도 10a는 CT26 종양 마우스 모델에 Cy3-표지된 VEGF siRNA를 체외충격파를 이용하여 형질전환하고 이를 확인한 도이다.
도 10b 및 도 10c는 CT26 종양에 VEGF siRNA와 체외충격파를 처리하였을 때 VEGF의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 10d 및 도 10e는 CT26 종양에 체외충격파를 처리하였을 때 CD31의 발현을 확인한 도이다.
도 11은 체외충격파에 의한 형질전환시 세포외소포체의 변화를 나노 입자 추적 분석(NTA)을 수행하여 확인한 결과이다.
도 12a 및 12b는 체외충격파를 이용한 형질전환시 세포외소포체의 분포를 FACS 분석을 수행하여 확인한 결과이다.
도 13a는 배지 및 세포 침전물(cell pellets)에서 세포외소포체를 투과 전자 현미경으로 확인한 도이다.
도 13b는 세포질(cytoplasm) 대형 입자에서 세포외소포체를 투과 전자 현미경으로 확인한 도이다.
도 14는 체외충격파를 이용하여 형질전환하고 세포외소포체의 분비를 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 용어를 상세히 설명한다.
본 발명의 용어 "세포외소포체"는 세포에서 유래되는 막으로 둘러싸인 작은 구체를 의미하며, 이러한 구체는 그 명칭이 만들어지는 세포의 기원이나 만들어지는 방법에 따라 매우 다양하나, 본 발명에서는 세포에서 만들어지는 방법에 따라 명칭된 엑소솜(exosome), 엑토솜(ectosome), 미세수포(microvesicle) 및 세포자멸체(apoptotic body)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 체외충격파(shock wave)를 세포 또는 인간을 제외한 개체에 처리하는 단계를 포함하는 세포로부터 세포외소포체(extracellular vesicles)의 분비를 촉진시키는 방법을 제공한다.
상기 체외충격파는 0.01 내지 1.0 mJ/mm2 에너지 범위에서 처리되는 것이 바람직하고, 0.01 내지 0.06 mJ/mm2 에너지 범위에서 처리되는 것이 더욱 바람직하며, 0.02 내지 0.04 mJ/mm2 에너지 범위에서 처리되는 것이 가장 바람직하고, 0.09 mJ/mm2를 초과하는 에너지에서는 세포가 사멸되어 오히려 세포외소포체 분비 촉진이 저해될 수 있다.
상기 세포는 개체로부터 분리된 세포인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 세포는 인간 및 비인간 포유류를 포함하는 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 다양한 종류의 면역 세포, 종양 세포 등 일 수 있으며, 이에 한정하지 않으나, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 인간 제대 정맥(human umbilical veins) 및 HSMC에서 분리된 HUVECs(human umbilical vein endothelial cell), 인간 평활근 세포(human smooth muscle cells, HSMCs), 마우스 결장 선암 세포(murine colon adenocarcinoma cells, CT26), 인간 전립선암 세포(human prostate cancer cell line, PC-3), 불멸화된 마우스 대 동맥 내피 세포(immortalized mouse aortic endothelial cells, iMAEC) 및 원숭이 신장 섬유아(COS-7) 세포(monkey kidney fibroblast (COS-7) cells)인 것이 바람직하다.
상기 세포외소포체는 엑소솜(exosome), 엑토솜(ectosome), 미세수포(microvesicle) 또는 세포자멸체(apoptotic body)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자는 체외충격파를 처리하였을 때 혈관 내피세포에서 세포외소포체의 발생 및 분비가 증가하고, 원하는 siRNA가 세포 내로 이동하여 형질전환됨을 확인하였다(도 1 내지 도 3 참조). 또한, 이와 같은 효과가 리포펙타민과 비교하였을 때, 동등하거나 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 다양한 세포주에 체외충격파를 처리하였을 때 세포외소포체의 발생 및 분비가 증가하고, siRNA가 세포 내로 이동되어 형질전환됨을 확인하였다(도 2, 도 4 내지 도 6 참조).
또한, 체외충격파에 의한 형질전환 효과가 기존에 알려진 세포막의 pore를 통한 것이 아님을 확인하였으며(도 7 및 도 8 참조), 동물을 이용한 종양 모델에서 체외충격파를 이용하여 siRNA를 도입시킴으로써, 신생 혈관의 생성이 억제되는 것을 확인하였다(도 9 및 도 10 참조).
또한, 체외충격파에 의해 분비되는 세포외소포체를 나노입자 추적 분석(NTA) 및 FACS 분석을 통해 확인함으로써(도 11 내지 도 14 참조), 본 발명의 방법은 세포로부터 세포외소포체의 생성 및 분비를 촉진시키는 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 체외충격파를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포로부터 핵산, 단백질 및 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 세포외소포체를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 생산된 세포외소포체를 제공한다.
상기 체외충격파는 0.01 내지 1.0 mJ/mm2 에너지 범위에서 처리되는 것이 바람직하고, 0.02 내지 0.04 mJ/mm2 에너지 범위에서 처리되는 것이 가장 바람직하다.
상기 세포외소포체는 엑소솜(exosome), 엑토솜(ectosome), 미세수포(microvesicle) 또는 세포자멸체(apoptotic body)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 핵산은 DNA, RNA, microRNA, IncRNA 등 어느 것도 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 DNA 또는 RNA인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자는 체외충격파를 처리하였을 때 혈관 내피세포에서 세포외소포체의 발생 및 분비가 증가하고, 원하는 siRNA가 세포 내로 이동하여 형질전환되며(도 1 내지 도 3 참조), 이와 같은 효과가 다양한 세포주에서 동일한 효과를 갖는 것을 확임함으로써(도 2, 도 4 내지 도 6 참조), 본 발명의 방법은 원하는 DNA 및 RNA를 포함하는 세포외소포체를 생산하는 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양 및 체외충격파 처리
HUVECs(human umbilical vein endothelial cell)는 인간 제대 정맥(human umbilical veins)에서 분리하였고, HSMC는 Gibco(Inchinnan, Scotland, UK)에서 구매하였다. HUVECs 및 HSMCs는 5% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 low-serum growth supplement(LSGS; Cascade Biologics Inc., Winchester, MA, USA)가 포함된 Medium 200에서 배양하였다, 세포외소포체(extracellular vesicles)을 포함하는 FBS는 170,000 × g에서 2시간 동안 원심분리하여 모든 세포외소포체를 제거하였다. 불멸화된 마우스의 대동맥 내피 세포(aortic endothelial cells, iMAECs)는 Hanjoong Jo 박사(Emory University, Atlanta, Georgia, USA)로부터 제공받았으며, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 50 ㎍/㎖ EC growth supplement(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 및 비-필수 아미노산이 포함된 1× EMEM이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에서 배양하였다.
시험관 내에서(in vitro) 체외충격파를 처리하기 위해, 세포를 12-웰 플레이트에서 배양하고 체외충격파는 Dornier AR2 ESWT(Dornier MedTech, Germany)를 이용하여 처리하였다. 간략하게, 체외충격파 처리는 멸균된 체외충격파 프로브(probe)가 웰 플레이트에 수직으로 배지 표면에 접촉되도록 함으로써 수행하였다. 체외충격파 프로브와 플레이트 바닥의 세포 레이어(layer)와의 사이는 1.2 cm였으며, 배양된 세포는 3분 동안 지정된 에너지 레벨에서 체외충격파 1,000 shots에 노출되고, 37℃ 온도의 CO2 배양기에서 배양하였다.
< 실험예 1> 낮은 에너지 레벨의 체외충격파에서 내피세포(endothelial cells) 형질전환(transfection) 효과 확인
체외충격파(shock wave, SW)-유도 유전자 전달 시스템을 개발하기 위해, 1 cm의 직경 및 4 cm의 깊이에서 고정된 전자기의 체외충격파를 발생시키는 single-sonic generator(Dornier MedTech, Wessling, Germany)로써 이용하였다. 0.01 내지 0.04 mJ/mm2 범위의 낮은 에너지 레벨에서는 HUVEC(human umbilical vein endothelial cell)에 아무런 영향이 없었으나, 0.09 mJ/mm2를 초과하는 에너지 레벨에서는 높은 사멸 효과가 관찰되었다. 따라서, 0.04 mJ/mm2에서의 체외충격파 처리가 1차 배양 세포(primary cultured cells)에 siRNA를 형질전환(transfecting)시킬 수 있으면서 안전한 에너지 레벨이라 판단하였다.
먼저, 시험관 내에서(in vitro) 체외충격파에 의한 HUVEC로 siRNA의 형질전환의 효능을 확인하였다.
구체적으로, VEGFR2, VE-cadherin(vascular endothelial-cadherin), GAPDH를 표적으로 하는 siRNA 및 scrambled siRNA 대조군을 Integrated DNA Technologies(IDT; Coralville, IA, USA)사로부터 구매하였다.
인간 VEGFR2 및 VE-cadherin에 대한 siRNA 서열은 하기 표 1과 같다.
유전자 siRNA 서열
인간 VEGFR2 sense 5′- ACAAUGACUAUAAGACAUGCUAUGG (서열번호 1)
antisense 5′- CCAUAGCAUGUCUUAUAGUCAUUGUUC (서열번호 2)
인간 VE-cadherin sense 5′- GCAAUAGACAAGGACAUAACACCAC (서열번호 3)
antisense 5′- GUGGUGUUAUGUCCUUGUCUAUUGCGG (서열번호 4)
세포를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 80%의 밀집도(confluence)로 배양한 다음, 상기 siRNA를 배양 배지에 첨가하고, 1,000 shots의 체외충격파 0.04 mJ/mm2를 3분 동안 처리하였다. 그런 다음, 37℃에서 배양하고, 체외충격파 처리 24시간 째에 세포를 수득하였다. 리포펙타민 2000(Invitrogen, Waltham, MA, USA)은 siRNA 형질전환의 양성 대조군으로 이용되었으며, 기존에 공지된 방법에 따라 수행하였다(Wong, C. & Jin, Z. G. Protein kinase C-dependent protein kinase D activation modulates ERK signal pathway and endothelial cell proliferation by vascular endothelial growth factor. J Biol Chem 280, 33262.33269 (2005)).
상기 형질전환의 효과는 세포를 수득하여, SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 분석 및 면역 형광 분석법을 통해 확인하였다.
구체적으로, 상기 형질전환한 세포를 0.1% protease inhibitor mixture(simga)를 포함하는 용해 버퍼(0.5% Triton X-100, 0.5% Nonidet P-40, 10 mM Tris, pH 7.5, 2.5 mM KCl, 150 mM NaCl, 30 mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 및 1 mM Na3VO4)를 이용하여 수득하고, 원심분리하였다. 그런 다음, 상기 용해물의 농도를 브래드포트 방법(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용해 측정하였다. 단백질 복합체는 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리하고, 니트로 셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membranes)으로 옮겼다. 상기 멤브레인은 1차 항체와 함께 배양한 후, 세척하고, 2차 항체와 함께 배양하였다. 항-VEGF, VEGFR-2 및 VE-Cadherin(C-19) 항체는 Cell Signaling Technologies(Beverly, MA, USA)사로부터 구매하였으며. 항-β-actin 및 GAPDH 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)사로부터 구매하였다. 면역반응성(immunoreactive) 단백질은 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 시스템(Amersham Biosciences, Amersham, UK)을 이용하여 시각화하였다. 일부의 경우, 상기 멤브레인을 스트리핑(stripped)하고 다른 항체와 다시 결합시켰다.
면역 블롯의 농도 분석은 ImageJ 소프트웨어(the National Institutes of Health)를 이용하여 수행하였으며, 결과는 대조군의 세포를 '1.0'으로 설정하여 표준화하였다.
또한, Cy3-표지된 VEGFR2 siRNA를 형질전환하고 면역 형광 염색법을 통해 관찰하였다.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, VEGFR2 및 VE-cadherin를 표적으로 체외충격파(0.04 mJ/mm2)를 처리하여 siRNAs를 형질전환한 결과, HUVECs에서 VEGFR2 및 VE-cadherin의 발현이 현저하게 감소하였으며, 이는 1차 배양 세포(primary cultured cells)에서 siRNA 형질전환이 체외충격파에 의해 유도됨을 나타낸다(도 1).
다음으로, 체외충격파에 의한 형질전환 효율을 리포펙타민(Lipofectamine)과 비교하였다. 그 결과 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 리포펙타민과 비교하였을 때, 체외충격파 0.02 내지 0.06 mJ/mm2 범위에서 HUVECs로 VEGFR2 siRNA가 전달되었으며, Cy3-표지된 VEGFR2 siRNA의 형질전환 효율은 리포펙타민과 서로 유사하였다(도 2).
나아가 체외충격파로 유도된 플라스미드(plasmid)의 형질전환 효율을 조사하기 위해, HUVECs에 eGFP(enhanced green fluorescence protein, eGFP)의 전장을 암호화하는(encoding) 벡터를 체외충격파(0.04 mJ/mm2) 또는 리포펙타민을 이용하여 형질전환하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 리포펙타민 처리 그룹에서 높은 형질전환 효율을 보이며 GFP-양성 세포의 비율이 증가하였으나, 체외충격파 처리에서는 GFP-양성 세포가 더 적게 나타남을 확인하였다(도 3). 이러한 결과는 플라스미드의 형질전환은 체외충격파 처리에 의해 효율이 낮아질 수 있음을 시사한다.
< 실험예 2> 다양한 세포주에서 체외충격파로 유도된 siRNA 전달 효율 확인
체외충격파를 이용한 다양한 세포주에서 siRNA 형질전환의 유전자 억제(gene silencing) 효과를 확인하기 위하여, 인간 평활근 세포(human smooth muscle cells, HSMCs) 및 마우스 결장 선암 세포(murine colon adenocarcinoma cells, CT26)에 체외충격파(0.04 mJ/mm2) 또는 리포펙타민을 이용하여 Cy-3 표지된 GAPDH siRNA를 형질전환하였다.
구체적으로, 형질전환 및 이를 확인한 SDS PAGE, 웨스턴 블랏 분석 및 면역 형광 염색법은 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 수행되었다.
그 결과 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 체외충격파 처리 24시간 후, HSMCs 및 CT26의 형질전환 효율은 리포펙타민 처리군과 유사한 효율을 보였으며(도 4 및 도 5), GAPDH 단백질 발현 평균은 대조군과 비교하여 체외충격파에 의한 GAPDH siRNA의 형질전환에서 유의하게 낮았다(p < 0.05).
또한, 추가적으로 인간 전립선암 세포(human prostate cancer cell line, PC-3), 불멸화된 마우스 대 동맥 내피 세포(immortalized mouse aortic endothelial cells, iMAEC) 및 원숭이 신장 섬유아(COS-7) 세포(monkey kidney fibroblast (COS-7) cells)를 Cy3-표지된 VEGF, KDR 및 GAPDH의 siRNAs를 상기와 동일한 방법으로 체외충격파를 이용해 형질전환하였으며, 그 결과 도 6에 나타난 바와 같이 타겟 유전자 발현이 억제되었다(도 6).
이와 같은 결과는 낮은 에너지의 체외충격파에 의해 siRNA가 세포 내로 전달되어 타겟 유전자 발현을 억제하였음을 시사한다.
< 실험예 3> 체외충격파에 의한 형질전환의 기전 확인
최근 체외충격파로 유도된 형질전환의 효과가 세포막에 일시적인 pore가 발생, 이를 통해 타겟 유전자가 형질전환된다는 연구가 보고되었다.
이에, 체외충격파에 의한 siRNA 형질전환이 일시적으로 형성되는 pore에 의한 것인지 확인하기 위해, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 Cy-3 표지된 VEGFR2 siRNAs를 HUVEC 배양 배지에 첨가하고, 체외충격파(0.04 mJ/mm2)를 처리한 다음 48시간 동안 배양하고, 0분, 5분, 24시간 및 48시간에 따라 각각 면역 형광 염색법을 이용하여 형질전환 효과를 확인하였다.
그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 어떠한 siRNA도 체외충격파 처리 후 0 내지 5분 동안 형질전환되지 않았다(도 7). 그러나, 체외충격파 처리 후 1, 3, 6, 24 및 48시간 후의 배양 시간에는 HUVEC로 siRNA가 성공적으로 형질전환되며, 24시간이 최적 배양 시간임을 확인하였다(도 7).
체외충격파 처리에 의한 세포막의 pore 형성이 siRNA 형질전환에 필수적인지 확인하기 위해, HUVECs로 siRNA가 형질전환에 요구되는 배양 시간을 조사하였으며, 체외충격파 처리된 HUVEC 배지를 교환함으로써 확인하였다. 구체적으로, Cy3-표지된 VEGFR2 siRNAs를 체외충격파(0.04 mJ/mm2) 처리를 이용하여 HUVECs에 형질전환한 후, 체외충격파가 처리된 HUVECs는 지정된 시간에 따라 배양하고, siRNAs가 제거된 배지로 배지를 교환한 다음 24시간 배양하였다.
그 결과 도 8a에 나타난 바와 같이, 체외충격파 처리 후 5분 동안 배양한 HUVECs에서는 Cy3-표지된 VEGFR2 siRNAs 형질전환되지 않은 반면, 24시간 동안 배양된 HUVECs에서는 Cy3-표지된 VEGFR2 siRNAs의 형질전환 효율이 매우 높았다(도 8a).
기존 연구에서 체외충격파에 의한 유전자의 형질전환 효과는 수 초 후 형성되는 세포막의 pore를 통해 일어난다고 제안되어져 왔다. 그러나, 본 발명에서 체외충격파에 의한 siRNA 형질전환은 체외충격파 처리 후 일정한 배양 시간이 요구되며, 이는 본 발명의 체외충격파를 이용한 유전자 형질전환이 세포막의 pore를 통한 것이 아님을 나타낸다.
체외충격파에 의해 유도된 siRNA 담체(carriers)의 분비가 siRNA 형질전환에 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해, HUVECs에 Cy3-표지된 VEGFR2 siRNAs를 체외 충격파가 있는 조건 또는 없는 조건으로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 체외충격파가 처리된 HUVECs의 배지를 체외충격파가 처리되지 않은 HUVECs 플레이트로 옮긴 후, 24시간을 배양하였다.
그 결과 도 8b에 나타난 바와 같이, 체외충격파 처리를 하지 않은 세포에 VEGFR2 siRNA가 형질전환되었음을 확인하였다(도 8b).
이에, 분비된 세포외소포체(extracellular vesicles)에 의한 siRNA 전달을 확인하기 위해, 세포외소포체를 제거한 배지(MP-free medium)를 이용하여 체외충격파에 의한 형질전환의 효율을 확인하였다. HUVECs는 체외충격파 및 Cy3-표지된 VEGFR2 siRNAs을 처리하고 3시간 동안 배양한 다음, 상기 배지를 170,000×g에서 2시간 동안 원심분리하여 세포외소포체를 제거하였다. 세포외소포체를 제거한 배지는 새로운 HUVECs로 옮겨 24시간 동안 배양하였다.
그 결과 도 8c에 나타난 바와 같이, 상기 세포외소포체를 제거한 배지에서 배양된 HUVECs에서 Cy3-표지된 VEGFR2 siRNAs를 확인할 수 없었다. 그러나, 세포외소포체가 있는 경우 HUVECs로 성공적으로 전달됨을 확인하였다.
이러한 결과는 체외충격파의 유전자 형질전환 요소가 담체(예를 들어, 세포외소포체 또는 단백질)를 통해 전달될 수 있음을 나타낸다. 또한, 본 발명은 체외충격파가 세포외소포체의 분비를 촉진하며, 이는 siRNA를 운반하는데 이용될 수 있음을 보여준다.
< 실험예 4> 생체 밖에서 체외충격파에 의한 형질전환 효과 확인
혈관에서 체외충격파에 의해 유도된 siRNA 형질전환의 효율을 확인하기 위해, 생체 외에서(ex vivo) 혈관형성(angiogenesis)을 위한 대동맥 고리 분석(aorta ring assay)을 수행하였다.
구체적으로, 마우스 대동맥 고리 혈관형성 분석(aortic ring angiogenesis assays)은 기존에 공지된 방법으로 수행되었다(Blache et al. Angiogenesis 4, 133.142(2001), Masson, V. V. et al. Biol Proced Online 4, 24.31(2002)). 간략하게, 마우스(C57BL/6J, 8주령, 수컷)의 흉부 대동맥을 해부하고, 입체 해부 현미경(stereo dissection microscope)을 통해 미세 절제 집게 및 미세해부 가위를 이용하여 대동맥 주변의 섬유지방조직(periaortic fibroadipose tissue)을 제거하였다. 대동맥 고리(길이 1 mm)는 20 U/㎖ 헤파린(heparin)이 첨가되고, 성장 인자가 감소된 마트리겔(Matrigel)에 고정시켰다. 상기 대동맥 고리를 VEGF(R&D system, Inc, Minneapolis, MN, USA) 또는 체외충격파와 함께 VEGF/VEGFR2 siRNA를 처리한 후, 미세혈관 생성(sprouting)의 최적 조건인 37℃, 5% CO2 조건에서 8일 동안 배양하였으며, 그 이미지는 Olympus BX41 microscope(Olympus, Center Valley, PA, USA)를 이용하여 확인하였다.
그 결과 도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, VEGF는 마우스에서 분리된 대동맥 고리로부터 생성되는 미세 혈관의 수를 증가시키나, 체외충격파로 VEGF siRNA를 형질전환시킨 경우 현저하게 VGEF에 의해 유도된 미세혈관 생성을 현저하게 감소시켰다(도 9a 및 도 9b).
이러한 결과는 체외충격파에 의한 형질전환에서 siRNA가 성공적으로 세포 안으로 도입되고, 생체 외에서 기능적으로 원활하게 작동됨을 나타내며, 또한, 이는 적출된 조직의 조직세포로 직접 siRNA를 도입하여 기능적으로 원활하게 작동하는 것이 가능함을 시사한다.
< 실험예 5> 생체에서 체외충격파에 의한 siRNA 형질전환을 이용한 CT-26 종양 치료 효과 확인
체외충격파 처리에 의하여 siRNA가 종양 조직으로 전달됨으로써 종양 억제 효과가 나타나는지 확인하였다.
먼저, CT26 이종 이식 종양(xenograft tumor) 마우스 모델과 관련된 실험은 이화여자대학교 동물 실험 윤리 위원회에 대한 동물 실험 지침에 따라 수행되었다. 구체적으로. 4.0 × 106 CT26 세포를 0.3 ㎖ PBS(phosphate-buffered saline)에 넣어 24-게이지 바늘을 이용하여 8주령 누드 마우스(Central Lab Animal Inc., Seoul, Korea)의 하부 측면에 피하 주입하였다. 2주 후 상기 종양이 1 ㎝3의 평균 부피에 도달하였을 때, CT26 종양 생성 누드 마우스에 Cy3-표지된 VEGFR2 siRNAs를 주입하고 체외충격파(0.02 mJ/mm2)를 처리하였다. 구체적으로, 20 ㎕ 멸균 PBS 용액에 희석된 Cy3-표지된 VEGFR2 siRNAs를 각각의 종양에 직접 주입으며, 체외충격파 없이 Cy3-표지된 VEGFR2 siRNAs가 주입된 마우스를 대조군으로 하였다. 상대적 형광도(붉은 색, Cy3-l표지된 siRNA; 파란 색, 핵)는 형광 현미경 시스템(Olympus)을 이용하여 시각화하였다.
또한, 종양 내 미세혈관 밀도를 분석하기 위해 기존의 공지된 방법으로 CD31을 면역 염색하고, CD31-양성 미세혈관을 계수하였다(Takei et al. Cancer research 64, 3365.3370(2004), Takei et al. Cancer 107, 864.873(2006), Takei et al. Cancer research 61, 8486.8491(2001)).
그 결과 도 10a에 나타난 바와 같이, 0.02 mJ/mm2의 체외충격파가 CT26 종양으로 siRNA가 성공적으로 형질도입되는 최적 조건임을 확인하였다(도 10a). 0.04 mJ/mm2 체외충격파에서는 많은 종양 세포들이 소실되었으며, 이는 조직에 심각한 손상이 가해졌음을 의미한다.
또한, 도 10b 및 도 10c에 나타난 바와 같이, 대조군 종양 그룹은 높은 VEGF 발현을 나타낸 반면, 체외충격파(0.02 mJ/mm2)가 처리된 종양 그룹에서는 적은 양의 VEGF만이 발현되었다(도 10b 및 도 10c). 또한 대조군 종양 그룹은 강한 CD31 염색(staining)(붉은 색)을 보였으며, 이는 높은 미세 혈관 밀도를 나타내는 반면, 체외충격파가 처리된 그룹은 약한 CD31 염색을 나타냈고, 이는 미세혈관(microvasculature)이 감소함을 나타낸다(도 10d 및 도 10e). 이와 같은 결과는 생체내 암 조직의 조직세포로 직접 siRNA를 도입하여 미세혈관신생을 감소시키는 치료 효과를 확인한 것으로, 본 발명이 생체 내로 직접 siRNA를 도입하여 치료 용도로 이용될 수 있음을 시사한다.
< 실험예 6> 체외충격파에 의해 분비된 세포외소포체 분석
체외충격파에 의한 세포로부터 다양한 세포외소포체가 분비되는 조절 기전을 확인하기 위해, NanoSight NS300(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 이용하여 나노입자 추적 분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA) 및 FACS 분석을 수행하였으며, 투과 전자 현미경을 통해 관찰하였다.
구체적으로, FACS 분석은 BD FACS Canto II(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)을 이용하여 수행하였으며, 파티클은 표준-크기의 비드(standard-sized beads)에 따라 220, 440, 880 및 1,340 nm의 크기로 분류하였다. 세포외소포체의 데이터를 수집하기 위하여 상기 비드를 기본 설정 하의 유세포분석기(flow cytometer)를 통해 이동시켰으며, 이로부터 FSC(Forward scattering) 측정 평균을 산출하였다.
시험관 내 체외충격파 실험은 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 수행되었다. 융합된 HUVECs는 35 mm 배양 접시에서 배양되고 체외충격파를 처리하였다. 대조군은 동일하게 준비되었으나 체외충격파를 처리하지 않았다. FACS 분석을 위해, 수집된 샘플을 180×g로 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였으며, 상등액(supernatant)을 새 튜브로 옮겨 1,500×g로 10분 동안 원심분리하여 크기가 큰 입자를 제거하였다. 상기 상등액은 FACS 분석을 위해 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브로 옮겨담았다. 세포외소포체의 크기 및 숫자는 BD FACSCanto II(Beckman Coulter)를 이용하여 측정하였으며, 세포외소포체의 크기는 SPHERO™ Flow Cytometry Nano Polystyrene and Nano Fluorescent Size Standard Kits(Spherotech, Lake Forest, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. 오류를 줄이고자 세포외소포체는 100초 동안 수동 및 자동으로 분석하였다.
또한, 미세 소포(Microvesicles)는 NanoSight NS300(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 이용하여 분석하였으며, 이를 통해 입자 단위로(particle-by-particle basis)로 액체 현탁액 속 나노파티클의 브라운 운동(Brownian motion)의 추적이 가능하다. Nanoparticle Tracking Analysis(NTA) 3.0 소프트웨어는 미세 소포의 크기 및 농도를 분석하기 위해 사용되었으며, 시료 준비는 상기 FACS 시료 준비와 동일하고 샘플은 1:10으로 희석하여 사용하였다.
또한, 투과 전자 현미경을 이용하여 세포외소포체를 확인하고자, 세포를 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 및 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)가 포함된 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer)에 관류(perfused)시킨 다음, 준비된 세포 블록(cell blocks)을 2% 사산화 오스뮴 (osmium tetroxide)에 후-고정(post-fixed)하고, 탈수한 다음 에폭시 레진(epoxy resin)에 고정시켰다. 그런 다음 1 ㎛ 두께의 섹션으로부터 관심있는 지역을 선택하고, 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색하였다. 대략, 울트라마이크로톰(Reichert-Jung/Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 60 × 60 nm의 매우 얇은 섹션으로 절단하였으며, 상기 섹션을 1 ~ 2% 수성 아세트산우라닐(uranyl acetate)으로 염색하고 1% 시트르산 납(lead citrate)으로 염색하였다. 염색된 섹션은 H-7650 투과 전자 현미경(Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰하고 촬영하였다.
NTA 수행 결과 도 11에 나타난 바와 같이, 체외충격파 처리 후 30분 내지 1시간 동안 세포외소포체의 분비가 증가하였으며, 이후 천천히 감소하였다(도 11). 체외충격파 처리에 따라, 상대적으로 소형 입자보다 대형 입자가(>200 mm) 많이 나타났다(도 11).
또한, FACS 수행 결과 도 12a 및 12b에 나타난 바와 같이, NTA 결과와 유사하게, 세포외소포체의 수는 체외충격파 처리 후 30분 후 크게 증가하였으며, 이후 천천히 감소하였다(도 12a 및 12b). 이러한 결과는 체외충격파 처리에 의한 다양한 세포외소포체의 분비가 매우 짧은 시간 내에 유도됨을 나타낸다. 또한, 대형 세포외소포체의 분포 분석을 통해 체외충격파 처리에 의해 즉각적으로 직경 220 nm 내지 440 nm 세포외소포체가 가파르게 상승함을 확인하였다. 상기 NanoSight 및 FACS의 결과는 체외충격파가 200 내지 500 nm 직경의 세포외소포체를 처리 30분 내지 1시간 사이에서 현저하게 유도하였음을 나타낸다.
또한, 투과 전자 현미경으로 관찰 시 배양 배지 내 HUVECs의 다포성소체(multi-vesicular body) 및 세포막을 따라 세포외소포체의 수가 많음을 확인하였다(도 13a 및 13v).
체외충격파 처리 후 siGIO 혼입도(incorporation)는 NanoSight(Malvern Instruments)를 이용하여 조사하였다.
그 결과 도 14a 및 도 14b에 나타난 바와 같이, 직경 200mm 이상의 세포외소포체의 절대적인 수는 200 nm이하의 세포외소포체보다 적으나, 대형 세포외소포체는 100 nm 크기 이하의 세포외소포체 및 100 ~ 200 nm의 세포외소포체보다 10배 이상 siGlo를 흡수하였다(도 14a 및 도 14b).
상기 <실시예 3> 및 <실시예 6>의 결과는 체외충격파 처리에 의해 분비되는 세포외소포체는 siRNA와 상호작용(interact)하며, 체외충격파를 처리하지 않은 세포로 형질전환될 수 있음을 제시한다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> The novel method for secretion of extracellular vesicles from cells and tissues using shockwave <130> 2015P-11-037 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 acaaugacua uaagacaugc uaugg 25 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ccauagcaug ucuuauaguc auuguuc 27 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 gcaauagaca aggacauaac accac 25 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 gugguguuau guccuugucu auugcgg 27

Claims (8)

  1. ⅰ) 배양 배지에 핵산, 단백질 및 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 처리하여 개체로부터 분리된 세포에 도입시키는 단계; 및
    ⅱ) 체외충격파를 개체로부터 분리된 세포에 처리하는 단계;로 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산, 단백질 또는 화합물이 다량함유된 세포외소포체의 대량생산방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 ⅰ)단계에서 도입된 핵산, 단백질 및 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 세포외소포체를 통해 조직세포에 전달되는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산, 단백질 또는 화합물이 다량함유된 세포외소포체의 대량생산방법
  3. 제 1항에 있어서, 상기 체외충격파는 0.01 내지 1.0 mJ/mm2 에너지 범위에서 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 세포외소포체는 엑소좀(exosome), 엑토솜(ectosome), 미세수포(microvesicle) 또는 세포자멸체(apoptotic body)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, microRNA, small interfering RNA(siRNA) 또는 long non-coding RNA(IncRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018221954A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Ewha University-Industry Collaboration Foundation Delivery method of target material into extracellular vesicles using extracorporeal shockwave
KR20180132518A (ko) * 2017-06-02 2018-12-12 이화여자대학교 산학협력단 체외충격파를 이용한 세포외소포체 내로의 표적물질 전달방법
WO2020105800A1 (ko) 2018-11-22 2020-05-28 (주)엑솔런스바이오테크놀로지 체외충격파를 이용한 표적물질 전달 장치

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140054622A (ko) * 2012-10-29 2014-05-09 이화여자대학교 산학협력단 충격파를 이용한 시험관 내에서 체내 혈류를 모방하는 환경을 제공하는 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140054622A (ko) * 2012-10-29 2014-05-09 이화여자대학교 산학협력단 충격파를 이용한 시험관 내에서 체내 혈류를 모방하는 환경을 제공하는 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Circ Res., Vol. 113, No. 1, pp. 7-8 (2013.06.21.)* *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018221954A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Ewha University-Industry Collaboration Foundation Delivery method of target material into extracellular vesicles using extracorporeal shockwave
KR20180132518A (ko) * 2017-06-02 2018-12-12 이화여자대학교 산학협력단 체외충격파를 이용한 세포외소포체 내로의 표적물질 전달방법
CN110869506A (zh) * 2017-06-02 2020-03-06 艾科索伦斯生物科技 利用体外冲击波的向细胞外囊泡内靶物质传递方法
KR102109950B1 (ko) * 2017-06-02 2020-05-12 (주)엑솔런스바이오테크놀로지 체외충격파를 이용한 세포외소포체 내로의 표적물질 전달방법
JP2020521821A (ja) * 2017-06-02 2020-07-27 エクソレンス、バイオテクノロジーＥｘｏｌｌｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 体外衝撃波を用いた細胞外小胞体内へ標的物質を伝達する方法
EP3630988A4 (en) * 2017-06-02 2020-12-16 Exollence Biotechnology METHOD OF ADMINISTRATION OF A TARGET MATERIAL IN EXTRACELLULAR VESICLES USING AN EXTRACORPORAL SHOCK WAVE
AU2018276723B2 (en) * 2017-06-02 2021-07-01 Exollence Co., Ltd. Delivery method of target material into extracellular vesicles using extracorporeal shockwave
CN110869506B (zh) * 2017-06-02 2023-11-03 艾科索伦斯有限公司 利用体外冲击波的向细胞外囊泡内靶物质传递方法
WO2020105800A1 (ko) 2018-11-22 2020-05-28 (주)엑솔런스바이오테크놀로지 체외충격파를 이용한 표적물질 전달 장치
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CN112534037A (zh) * 2018-11-22 2021-03-19 艾科索伦斯生物科技 利用体外冲击波的目标物质传递装置
KR102232757B1 (ko) * 2018-11-22 2021-03-26 (주)엑솔런스바이오테크놀로지 체외충격파를 이용한 표적물질 전달 장치

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