KR101719035B1 - Preparation of d-lactic acid using new enzymes - Google Patents

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Abstract

본 발명은 젖산 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 D형 젖산을 생화학적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생산 방법은 아세트알데히드와 시안화염을 반응시켜 젖산을 제조하는 반응에 있어서, 효소를 이용하여 반응시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 효소를 이용한 젖산 제조 방법에 의해 무난한 반응 조건에서 간단한 반응 과정을 통해 D형 이성질체가 우세한 젖산을 제조할 수 있다.
본 발명의 효소를 이용한 젖산 제조 방법에 의해 반응 시간을 조절함으로써 제조한 젖산의 D형과 L형 이성질체의 비율을 조절할 수 있다.
본 발명의 효소 재사용 방법에 의해 본 반응에 대하여 최소 5회 이상 효소를 재사용 할 수 있어 저렴한 비용으로 젖산을 제조할 수 있다.The present invention relates to a method for producing lactic acid, and more particularly, to a method for biochemically producing a lactic acid type D form.
The production method according to the present invention is characterized in that the reaction is carried out using an enzyme in the reaction for producing lactic acid by reacting acetaldehyde with a cyanide salt.
Lactic acid having a D-isomer dominantly can be prepared through a simple reaction process under unfavorable reaction conditions by the process for producing lactic acid using the enzyme of the present invention.
The ratio of D-form and L-form isomers of lactic acid prepared by controlling the reaction time by the method of producing lactic acid using the enzyme of the present invention can be controlled.
The enzymes can be reused at least five times in the present reaction by the enzyme reuse method of the present invention, so that lactic acid can be produced at low cost.

Description

신규 효소를 사용한 D형 젖산의 제조{PREPARATION OF D-LACTIC ACID USING NEW ENZYMES}PREPARATION OF D-LACTIC ACID USING NEW ENZYMES < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 젖산 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 D형 젖산을 생화학적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing lactic acid, and more particularly, to a method for biochemically producing a lactic acid type D form.

젖산은 식품, 의약 분야의 원료로 널리 사용되며 생체플라스틱의 원자재인 다중젖산의 단위체로 활용 된다 [1) C. Akerberg, K. Hofvendahl, G. Zacchi, B. Hahn-Hagerdal, Appl . Microbiol . Biotechnol . 1998, 49, 682-690; 2) K. Hofvendahl, B. Hahn-Hagerdal, Enzyme Microb . Technol . 2000, 26, 87-107.]. 최근 생체플라스틱의 수요가 급증함에 따라 친환경 플라스틱이 주목받고 있는 가운데 다중젖산은 생분해성이자 탈석유 고분자로 각광 받고 있다. 다중젖산을 원자재로 사용하여 자동차, 가전, 하우징, 일회용 플라스틱 용기 등 생분해성 플라스틱을 제조할 수 있으며 젖산 이성질체의 비율에 따라 플라스틱의 가공성과 기계적 강도를 조절할 수 있다. 다중젖산의 활용성이 증가함에 따라 그 단위체인 젖산의 합성에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다.Lactic acid is widely used as a raw material in food and medicine fields and is used as a unit of multiple lactic acid, which is a raw material of bioplastics. [1] C. Akerberg, K. Hofvendahl, G. Zacchi, B. Hahn-Hagerdal, Appl . Microbiol . Biotechnol . 1998, 49682-690; 2) K. Hofvendahl, B. Hahn-Hagerdal, Enzyme Microb . Technol . 2000, 26, 87-107]. Recently, as eco-friendly plastics have been attracting attention as the demand for bio-plastics surge, multi-lactic acid has been attracting attention as a biodegradable oil and de-oiling polymer. By using multiple lactic acid as a raw material, biodegradable plastic such as automobile, home appliance, housing, disposable plastic container can be manufactured, and the processability and mechanical strength of plastic can be controlled according to the proportion of lactic acid isomer. As the utilization of multiple lactic acid is increased, the synthesis of lactic acid as a unit of lactic acid has been actively studied.

젖산은 화학적 방법과 생화학적 방법을 통해 제조할 수 있다. 대표적인 화학적 방법은 락토니트릴의 가수 분해 반응을 통해 젖산을 제조하는 것이다 [1) R. Datta, S. P. Tsai, P, Bonsignore, S. H. Moon, J. R. Frank, FEMS Microbiol . Rev . 1995, 16, 221-231; 2) Y. J. Wee, J. N. Kim, H. W. Ryu, Food Technolo . Biotechnol. 2006, 44, 163-172]. 락토니트릴은 염기 촉매 하에서 시안화수소와 아세트알데히드의 첨가 반응에 의해 10분 이내에 99% 이상의 전환율로 합성된다. 합성된 락토니트릴은 증류를 통해 분리와 정제 과정을 거친 뒤 황산 촉매를 사용한 가수 분해 반응을 거쳐 젖산으로 전환된다. 이 때 전환율은 99% 이상이지만 생성된 젖산은 하기와 같은 두 개의 이성질체 (D형 젖산과 L형 젖산)가 동일하게 혼합된 라세미 젖산이다.Lactic acid can be produced by chemical and biochemical methods. A typical chemical method is to produce lactic acid by hydrolysis of lactonitrile [1] R. Datta, SP Tsai, P, Bonsignore, SH Moon, JR Frank, FEMS Microbiol . Rev. 1995 , 16 , 221-231; 2) YJ Wee, JN Kim, HW Ryu, Food Technolo . Biotechnol. 2006, 44 , 163-172]. Lactonitrile is synthesized at a conversion rate of 99% or more within 10 minutes by the addition reaction of hydrogen cyanide and acetaldehyde in the presence of a base catalyst. The synthesized lactonitrile is separated and purified through distillation and then converted to lactic acid by hydrolysis using sulfuric acid catalyst. At this time, the conversion rate is more than 99%, but the produced lactic acid is a racemic lactic acid in which two isomers (D type lactic acid and L type lactic acid) are equally mixed.

Figure 112014089274795-pat00001
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또 다른 화학적 방법은 철이나 코발트 등의 금속을 실리카 겔 지지체에 흡착시킨 촉매를 사용하여 아세트알데히드와 일산화탄소, 그리고 물 존재 하에서 젖산을 제조하는 것이다 [S. K. Bhattacharyya, S. K. Palit, A. R. Das, Ind . Eng . Chem. Prod . Res . Develop . 1970, 1, 92-95.]. 5.5 g의 아세트알데히드로부터 13 g의 촉매를 사용하여 3시간 반응을 진행한 결과 44%의 전환율로 젖산이 생성되었지만 고온고압 조건 (230℃, 350 기압)에서 반응을 진행해야 하며 촉매로 가격이 비싼 금속 촉매를 사용해야 하는 등 경제적으로 한계점이 있다.Another chemical method is to prepare lactic acid in the presence of acetaldehyde, carbon monoxide and water using a catalyst in which a metal such as iron or cobalt is adsorbed on a silica gel support [SK Bhattacharyya, SK Palit, AR Das, Ind . Eng . Chem. Prod . Res . Develop . 1970 , 1 , 92-95.). The reaction was carried out from 5.5 g of acetaldehyde to 13 g of catalyst for 3 hours. As a result, lactic acid was produced at a conversion of 44%. However, the reaction had to be carried out under high temperature and high pressure conditions (230 ° C., 350 atm) There is an economical limitation such as using a metal catalyst.

화학적 방법은 반응이 간단하고 시간이 비교적 짧다는 장점이 있지만 산업적으로 활용하기에 경제적인 측면에서 한계가 있으며, 또한 생성물로 두 개의 이성질체가 동일하게 혼합된 라세미 젖산만 제조가 가능하다는 단점이 있다. The chemical method is advantageous in that the reaction is simple and the reaction time is relatively short, but there are disadvantages in that it is economically advantageous to use industrially, and it is also disadvantageous that only racemic lactic acid in which two isomers are equally mixed as a product can be produced .

생화학적 방법은 세균이나 곰팡이 등의 미생물을 사용한 탄수화물의 발효 과정을 통해 젖산을 제조하는 것으로, 사용하는 탄수화물은 수크로스, 락토스, 전분, 덱스트린 등 매우 다양하다. 생화학적 방법으로 젖산을 제조하면 사용하는 미생물이나　 탄수화물에 따라서 D형 젖산과 L형 젖산을 각각 순수하게 얻을 수 있다 1) Y. J. Wee, J. N. Kim, H. W. Ryu, Food Technol . Biotechnol . 2006, 44, 163-172]..The biochemical method is to produce lactic acid through the fermentation process of carbohydrates using microorganisms such as bacteria and fungi. The carbohydrates used are diverse such as sucrose, lactose, starch and dextrin. When lactic acid is produced by biochemical method, D-lactic acid and L-lactic acid can be obtained purely according to the microorganism or carbohydrate to be used. 1) YJ Wee, JN Kim, HW Ryu, Food Technol . Biotechnol . 2006, 44 , 163-172].

일반적으로 젖산을 제조하는 데에는 세균 발효방법이 주로 사용된다. 락토바실러스 델브루키 LD 0025 (Lactobacillus delbrueckii)와 LD 0028이 생산하는 아밀라아제 (α-amylase, β-amylase), 풀루라나아제 (pullulanase)와 같은 효소들의 가수분해 작용을 이용하여 쌀가루(rice powder)를 발효하여 높은 순도의 D형 젖산을 생산한 바 있다 [K. Fukushima, K. Sogo, S. Miura, Y. Kimura, Macromol . Biosci. 2004, 4, 1021-1027]. 또한 L형 락테이트 디하이드로지나아제 유전자(L-lactate dehydrogenase gene)가 소실된 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)에 스트렙토코커스 보비스 148 (Streptococcus bovis 148)의 알파형 아밀라아제(α-amylase)를 해독하는 플라스미드를 도입하여 옥수수 전분으로부터 광학적으로 순수한 D형 젖산을 제조하였다 [K. Okano, Q. Zhang, S. Shinkawa, S. Yoshida, T. Tanaka, H. Fukuda, A. Kondo, Appl . Environ . Microbiol . 2009, 75, 462-467]. 락토바실러스 델브루키 NBRC 3534 (Lactobacillus delbrueckii) 균주는 스팀 처리한 사탕수수 찌꺼기를 탄소원으로 이용하여 다량의 D형 젖산을 제조한 결과도 보고된 바 있다　 [C. Sasaki, R. Okumura, A. Asakawa, C. Asada, Y. Nakamura, J. Phys . Conf. Ser . 2012, 352-361].Bacterial fermentation is generally used to produce lactic acid. Lactobacillus delbruei LD 0025 ( Lactobacillus delbrueckii ) and LD 0028 produce amylase (α-amylase, β-amylase), and pullulanase hydrolysis of enzymes such as fermentation of rice flour (rice powder) fermented high-purity D-type lactic acid It has produced [K. Fukushima, K. Sogo, S. Miura, Y. Kimura, Macromol . Biosci. 2004, 4 , 1021-1027]. In addition, Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus strain), in which the L-lactate dehydrogenase gene has been deleted, streptomycin in plantarum) Rhodococcus Vorbis 148 (Streptococcus bovis 148) was introduced to prepare optically pure D-lactic acid from corn starch [K. Okano, Q. Zhang, S. Shinkawa, S. Yoshida, T. Tanaka, H. Fukuda, A. Kondo, Appl . Environ . Microbiol . 2009 , 75 , 462-467]. Lactobacillus delbrueckii NBRC 3534 ( Lactobacillus Delbrueckii strain has been reported to produce a large amount of D-lactic acid by using steamed sugarcane residue as a carbon source [C. Sasaki, R. Okumura, A. Asakawa, C. Asada, Y. Nakamura, J. Phys . Conf. Ser . 2012 , 352-361].

L형 젖산도 D형 젖산과 마찬가지로 다양한 균주를 사용하여 순수하게 제조할 수 있다. 폐당밀을 기질로 하여 엔터로코커스 패카리스 (Enterococcus faecalis)를 사용한 발효 과정을 통해 높은 광학 순도를 갖는 L형 젖산을 제조한 결과가 보고된 바 있으며 [Y. J. Wee, J. N. Kim, J. S. Yun, H. W. Ryu, Enzyme Microb . Technol . 2004, 35, 568-573.], 스트렙토코커스 보비스 148 (Streptococcus bovis 148)을 사용한 생전분의 발효과정을 통한 L형 젖산의 제조도 보고되었다 [J. Narita, S. Nakahara, H. Fukuda, A. Kondo, J. Biosci . Bioeng . 2004, 97, 423-425.]. 또한 세균뿐만 아니라 곰팡이인 리조퍼스 종 (Rhizopus species)에 속하는 리조퍼스 오리재 (Rhizopus oryzae)를 사용하여 포도당으로부터 L형 젖산 생산에 미치는 영양분의 효과를 조사하여 대량 생산을 위한 적정 조건을 제시한 바 있으며, 섬유상 생물반응기를 개발하여 면 조각에 곰팡이 균사를 고정시켜 발효시키는 방법을 이용하여 라이조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)에 의해 포도당과 옥수수 전분으로부터 L형 젖산을 생산한 바 있다 [1) Y. Zhou, J. M. Dominguez, N. Cao, J. Du, G. T. Tsao, Appl . Biochem . Biotechnol . 1999, 78, 401-407;. 2) A. Tay, S. T. Yang, Biotechnol. Bioeng . 2002, 80, 1-12; 3) Y. Kosakai, Y. S. Park, M. Okabe, Biotechnol. Bioeng . 1999, 55, 461-470]. 최근에는 생산 단가를 낮추기 위하여 가격이 싼 배양원료인 글리세롤을 이용할 수 있는 유전자조작 세균으로 L-젖산을 생산하는 방법이 개발되었다 [S. Mazumdar, M. D. Blankschien, J. M. Clomburg, R. Gonzalez, Microb . Cell Fact . 2013, 12, 1-7]. 또한 자연에 가장 많이 존재하는 바이오매스인 셀루로즈로부터 납이온(2가) 촉매 하에 젖산을 합성하는 방법이 부분적으로 성공되었음이 보고되었다 [Y. Wang, W. Deng, B. Wang, Q. 코뭏, X. Wan, Z. Tang, Y. Wang, C. Zhu, Z. Cao, G. Wang, H. Wan, Nature Commun., 2013, 7, doi:10.1038/ncomms3141]. L-lactic acid can be produced purely by using various strains like D-lactic acid. Using molasses as a substrate, enterococcus faecalis faecalis) to the result of the fermentation process through the production of L-lactic acid with a high optical purity has been reported using [Wee YJ, JN Kim, Yun JS, HW Ryu, Enzyme Microb . Technol . 2004, 35, 568-573.], Streptococcus Vorbis 148 (Streptococcus bovis 148) was also reported [J. Narita, S. Nakahara, H. Fukuda, A. Kondo, J. Biosci . Bioeng . 2004 , 97 , 423-425.]. In addition to bacteria, Rhizopus belonging to the fungus Rhizopus species ( Rhizopus oryzae ) was investigated to investigate the effect of nutrients on the production of L-lactic acid from glucose. The development of a fibrous bioreactor to immobilize fungal mycelium on fermentation L-lactic acid was produced from glucose and corn starch by Rhizopus oryzae . [1] Y. Zhou, JM Dominguez, N. Cao, J. Du, GT Tsao, Appl . Biochem . Biotechnol . 1999, 78 , 401-407; 2) A. Tay, ST Yang, Biotechnol. Bioeng . 2002 , 80 , 1-12; 3) Y. Kosakai, YS Park, M. Okabe, Biotechnol. Bioeng . 1999 , 55 , 461-470). In recent years, a method for producing L-lactic acid has been developed as a genetically engineered bacterium that can utilize glycerol, which is a low-cost culture material, to lower the production cost [S. Mazumdar, MD Blankschien, JM Clomburg, R. Gonzalez, Microb . Cell Fact . 2013, 12 , 1-7]. It has also been reported that a method of synthesizing lactic acid under a lead ion (bivalent) catalyst from cellulose, the most abundant biomass in nature, has been partially successful [Y. Wang, W. Deng, B. Wang, Q. komuk,. X. Wan, Z. Tang, Y. Wang, C. Zhu, Z. Cao, G. Wang, H. Wan, Nature Commun, 2013, 7, doi: 10.1038 / ncomms3141].

생화학적 방법은 젖산을 광학적으로 순수하게 제조할 수 있다는 장점이 있지만 반응 과정이 화학적 방법보다 비교적 복잡하고 반응 시간이 오래 걸린다는 문제점이 있다. 또한 사용하는 세균이나 곰팡이가 혐기성일 경우 반응 과정이 산소에 민감하여 주의가 필요하다. 그리고 반응 과정 중 세균의 영양소로 반드시 필요한 효모 추출물이나 펩톤의 가격이 높기 때문에 경제적인 측면에서 한계점이 있다 [A. W. Schepers, J. Thibault, C. Lacroix, Enzyme Microb . Technol . 2002, 30, 176-186.].
Biochemical methods have the advantage that lactic acid can be produced optically pure, but the reaction process is relatively complicated and chemical reaction time is long. Also, if anaerobic bacteria or fungi are used, the reaction process is sensitive to oxygen. In addition, there is a limit in economic terms because of the high cost of yeast extract or peptone, which is essential for bacterial nutrients during the reaction [AW Schepers, J. Thibault, C. Lacroix, Enzyme Microb . Technol . 2002 , 30 , 176-186.].

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 반응 시간이 짧으며 반응 조건이 간단하고, 반응 조건이 무난하며 높은 수율로 젖산을 얻을 수 있고, 광학 순도가 높은 젖산을 얻을 수 있는 D형 젖산 제조 공정을 제공하는 것이다.A problem to be solved by the present invention is to provide a process for producing D-lactic acid which is capable of obtaining lactic acid at a high yield and a lactic acid having high optical purity with a short reaction time, a simple reaction condition, will be.

본 발명에서 해결하고자 하는 다른 과제는 D-젖산의 함량을 분석하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for analyzing the content of D-lactic acid.

본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 과제는 D형 젖산 제조용 효소를 제공하는 것이다.
Another object to be solved by the present invention is to provide an enzyme for producing D-lactic acid.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 아세트알데히드와 시안화염을 이용하여 젖산을 제조하는 반응에 있어서, 효소를 이용하는 것을 특징으로 한다. The present invention is characterized by using an enzyme in the reaction for producing lactic acid using acetaldehyde and cyanide to solve the above problems.

본 발명에 있어서, 상기 효소는 아세트알데히드와 시안화염의 반응으로 형성되는 락토니트릴의 니트릴기를 가수분해할 수 있는 니트릴기 가수분해 능을 가지는 효소를 이용하는 것을 특징으로 한다. In the present invention, the enzyme is characterized in that an enzyme having a nitrile group hydrolyzing ability capable of hydrolyzing a nitrile group of lactonitrile formed by the reaction of acetaldehyde and cyanide is used.

이론적으로 한정된 것은 아니지만, 상기 효소는 아세트알데히드와 시안화염의 반응으로 생성된 락토니트릴 (lactonitrile) 가수 분해 반응 촉매로 작용하며, 상기 시안화 염은 칼슘, 나트륨, 수소일 수 있다. Although not to be limited in theory, the enzyme acts as a catalyst for the hydrolysis of lactonitrile produced by the reaction of acetaldehyde and cyanide, and the cyanide salt may be calcium, sodium, or hydrogen.

본 발명에 있어서, 상기 효소는 니트릴기 가수분해능을 가지면서, 가수 분해 반응을 통해서 D-젖산의 생성량이 L-젖산에 비해서 높은 효소이다. In the present invention, the enzyme has a nitrile group hydrolyzing ability, and the amount of D-lactic acid produced is higher than that of L-lactic acid through hydrolysis.

본 발명에 있어서, 상기 효소는 바람직하게는 생산된 전체 젖산에서 D-젖산의 비율이 60 몰% 이상, 바람직하게는 65 몰%이상, 보다 바람직하게는 70몰%이상, 가장 바람직하게는 80 몰% 이상인 효소이다.In the present invention, the enzyme preferably has a proportion of D-lactic acid in the total lactic acid produced of at least 60 mol%, preferably at least 65 mol%, more preferably at least 70 mol%, most preferably at least 80 mol % Enzyme.

본 발명에 있어서, 상기 효소는 미생물, 식물 또는 동물 유래로부터 유래될 수 있는 효소이다. 상기 효소 라는 용어는 효소 자체뿐만 아니라, 효소가 발현된 세포, 효소가 발현된 세포의 파쇄물 또는 이로부터 순수 분리된 효소, 및 이의 유전학적 처리물, 일예로 재조합 DNA 기술에 의해 대장균등의 다른 숙주에서 생산효소를 이용한 유전학적 생성물을 포함하는 것으로 이해된다. In the present invention, the enzyme is an enzyme that can be derived from microorganisms, plants or animals. The term " enzyme " refers not only to the enzyme itself, but also to a cell expressing the enzyme, a cell lysate of the enzyme, or an enzyme purified pure therefrom, and a genetically processed product thereof, such as E. coli, Lt; RTI ID = 0.0 > production enzymes. ≪ / RTI >

본 발명의 실시에 있어서, 상기 효소는 균체의 배양액을 원심분리하여 세포체를 얻고, 세포체를 파쇄한 뒤, 원심분리하여 상등액을 얻고, 이를 동결 건조하여 얻어질 수 있다. In the practice of the present invention, the enzyme may be obtained by centrifuging the cell culture broth to obtain a cell body, disrupting the cell body, centrifuging to obtain a supernatant, and lyophilizing the supernatant.

본 발명의 다른 실시에 있어서, 상기 효소는 정제 효소를 역상 크로마토그래피로 추가로 정제하여 단백질의 아미노산서열을 결정하고, 그 아미노산서열을 토대로 프로브를 작성하여 균체의 DNA 단편으로부터 니트릴기 가수분해 효소의 활성본체를 코드하는 DNA를 클로닝한다. 이어서 이것을 PCR로 증폭하여 재조합 플라스미드를 조제하고, 대장균 등으로의 도입, 해당 대장균 등을 배양하여 목적 효소를 얻을 수 있다. In another embodiment of the present invention, the enzyme is further purified by reversed phase chromatography to determine the amino acid sequence of the protein, and a probe is prepared based on the amino acid sequence of the protein to obtain a nitrile group hydratase Cloning DNA encoding the active body. Subsequently, this is amplified by PCR to prepare a recombinant plasmid, introduction into E. coli or the like, and cultivation of the corresponding E. coli or the like to obtain the target enzyme.

본 발명에 있어서, 상기 효소는 염생 식물인 천일사조에서 분리한 균주인 YC6258 (KCCM 43015)에서 추출하였으며, 추출한 효소를 사용하여 락토니트릴 (lactonitrile)의 가수 분해 반응을 하기 반응식 1과 같이 진행하였다. 1일 동안 75%의 분리 수율로 D형 이성질체의 비율이 높은 젖산을 제조할 수 있었다 ([α]26 =-1.14 (c=1.0 in water), 참고값: L형 젖산, [α]21-22=+2.60 (c=2.5 in water)).　 In the present invention, the enzyme was extracted from YC6258 (KCCM 43015), a strain isolated from a salmonellae, and the hydrolysis of lactonitrile was carried out according to the following reaction scheme 1 using the extracted enzyme. ([?] 26 = -1.14 (c = 1.0 in water), reference value: L-type lactic acid, [?] 21- 22 = + 2.60 (c = 2.5 in water).

Figure 112014089274795-pat00002
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본 발명에 있어서, 상기 다른 효소는 Lysobacter capsici YC5194T (KCTC 22007T=DSM 19286T), Martelella endophytica YC6887T 　(KCCM 43011T=NBRC 109149T), Hoeflea suaedae YC6898T 　(KACC 14911T=NBRC 107700T)에서 추출하였다. In the present invention, the other enzyme is Lysobacter capsici YC5194 T (KCTC 22007 T = DSM 19286 T ), Martelella endophytica YC6887 T 　 (KCCM 43011 T = NBRC 109149 T ), Hoeflea suaedae YC6898 T 　 (KACC 14911 T = NBRC 107700 T ).

본 발명의 실시에 있어서, 반응 온도는 25oC와 40oC 모두 가능하며, 바람직하게는 25oC에서 진행하는 것이 좋다.In the practice of the present invention, the reaction temperature may be 25 ° C or 40 ° C, preferably 25 ° C.

　본 발명의 실시에 있어서, 신규 효소는 pH 6, 7, 8에서 활성이 높게 유지되며 바람직하게는 pH 8이 젖산의 제조에 좋다.In the practice of the present invention, the novel enzyme is highly active at pH 6, 7, 8 and preferably pH 8 is good for the production of lactic acid.

본 발명에 있어서, 생성물인 D형과 L형 젖산은 화학식 (1)의 구조를 가지며 본 반응 방법을 통해 D형과 L형 젖산의 비율을 조절하여 생성물을 제조할 수 있다. In the present invention, the products D and L have the structure of formula (1), and the product can be prepared by adjusting the ratio of D-form and L-form lactic acid through the present reaction method.

본 발명의 실시에 있어서, 상기 효소는 투석막을 사용하여 5회 이상 재사용 가능하다.In the practice of the present invention, the enzyme is reusable five or more times using a dialysis membrane.

본 발명은 일 측면에 있어서, D형 젖산과 L형 젖산을 포함하는 젖산 혼합물을 벤질 락테이트(benzyl lactate) 로 변환시켜, HPLC를 이용하여 분석하는 방법을 제공한다. In one aspect, the present invention provides a method for converting lactic acid mixture containing D-lactic acid and L-type lactic acid into benzyl lactate and performing analysis using HPLC.

본 발명에 있어서, 상기 벤질 락테이트의 합성은 하기와 같은 반응식 (2)에 의해서 진행되었다.In the present invention, the synthesis of benzyl lactate was carried out by the following reaction formula (2).

Figure 112014089274795-pat00003
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본 발명에 있어서, D형과 L형 벤질 락테이트는 화학식 (2)의 구조를 가지며 키랄 컬럼을 사용한 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 D형과 L형 벤질 락테이트 각각의 면적비를 계산하고 이로부터 제조한 젖산의 광학 순도를 계산하였다.
In the present invention, D-type and L-type benzyl lactates have a structure of formula (2) and are calculated by high performance liquid chromatography using a chiral column to calculate the area ratio of each of D-type and L-type benzyl lactate, The optical purity of lactic acid was calculated.

본 발명의 효소를 이용한 젖산 제조 방법에 의해 무난한 반응 조건에서 간단한 반응 과정을 통해 D형 이성질체가 우세한 젖산을 제조할 수 있다.Lactic acid having a D-isomer dominantly can be prepared through a simple reaction process under unfavorable reaction conditions by the process for producing lactic acid using the enzyme of the present invention.

본 발명의 효소를 이용한 젖산 제조 방법에 의해 반응 시간을 조절함으로써 제조한 젖산의 D형과 L형 이성질체의 비율을 조절할 수 있다.The ratio of D-form and L-form isomers of lactic acid prepared by controlling the reaction time by the method of producing lactic acid using the enzyme of the present invention can be controlled.

본 발명의 효소 재사용 방법에 의해 본 반응에 대하여 최소 5회 이상 효소를 재사용 할 수 있어 저렴한 비용으로 젖산을 제조할 수 있다.
The enzymes can be reused at least five times in the present reaction by the enzyme reuse method of the present invention, so that lactic acid can be produced at low cost.

실시예1Example 1 . . YC6258YC6258 균주와 그 외 균주들의  Of strains and other strains 효소액Enzyme solution 제조방법 Manufacturing method

신규 균주인 YC6258을 대량배양용 액체배지(sucrose 1 g, yeast extract 2 g, casein 5 g, MgSO4 4 g, MgCl2 2 g/L)에서 28℃, 120 rpm 조건으로 72시간 진탕 배양한다.　 배양액을 8000 rpm, 20분간 원심 분리하여 세포체를 얻고, pH 6.5의 50 mM 인산완충액으로 현탁한다. 현탁액을 얼음에 둔 상태로 초음파 처리하여 세포를 파쇄한 뒤, 12000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상등액은 동결 건조하여 각 반응에 사용하였다. YC5194T, YC6887T, YC6898T의 효소액 만드는 방법 또한 위에서 기술한 YC6258의 방법과 같다. 단, YC5194T, YC6887T, YC6898T의 배양배지는 각각 50% Trytic soy broth, M10 broth(yeast extract 10 g, MgSO4 4 g, MgCl2 2 g, NaCl 5 g, K2HPO4 1 g, Sucrose 10 g/L), Marine broth를 사용하여 배양하였다.
YC6258, a new strain, is shake cultured at 28 ° C and 120 rpm for 72 hours in a liquid culture medium for mass culture (sucrose 1 g, yeast extract 2 g, casein 5 g, MgSO 4 4 g, MgCl 2 2 g / L) The culture is centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes to obtain a cell body, which is then suspended in 50 mM phosphate buffer, pH 6.5. The cells were disrupted by ultrasonication with the suspension placed on ice and centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes to obtain supernatant. The supernatant was lyophilized and used for each reaction. YC5194 T , The method of making the enzyme solution of YC6887 T , YC6898 T is also the same as the method of YC6258 described above. However, YC5194 T , YC6887 T , YC6898 T The culture broth was supplemented with 50% Trytic soy broth, M10 broth (10 g yeast extract, 4 g MgSO 4 , 2 g MgCl 2 , 5 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4 , 10 g / L Sucrose) And cultured.

실시예2Example 2 . 신규 효소를 사용한 다양한 D형/L형 비율의 젖산 제조. Production of lactic acid of various D type / L type by using new enzyme

100 mL 둥근바닥 플라스크에 2.0 M 시안화칼륨 수용액 (1.0 당량, 50 mL, pH 8)을 넣고 신규 효소 YC6258 (200-500 mg)를 넣은 다음 아세트알데히드 (100 mmol)를 가하여 상온에서 교반시킨다. 1 노르말 농도 염화수소용액 (2.5 당량)을　 넣어 산성화시킨 다음 이소프로필 에테르로 24시간 연속 추출한 후 유기 용매를 제거하여 액체 생성물을 얻었다. 젖산 제조는 하기와 같은 [반응식 3]에 의해서 진행되었다.Add 2.0 M potassium cyanide aqueous solution (1.0 equivalent, 50 mL, pH 8) to a 100 mL round bottom flask, add the new enzyme YC6258 (200-500 mg), add acetaldehyde (100 mmol) and stir at room temperature. 1 normalized hydrochloric acid solution (2.5 equivalents) was added to the reaction mixture, and the mixture was acidified with isopropyl ether for 24 hours. Then, the organic solvent was removed to obtain a liquid product. The production of lactic acid was carried out according to the following Reaction Scheme 3.

Figure 112014089274795-pat00004
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제조한 젖산의 광학 순도를 확인하기 위하여 [반응식 2]에 제시된 벤질 락테이트 합성 반응을 수행하였다. 4 mL 유리병에 제조한 젖산 (1.0 mmol)과 메탄올 (0.5 mL)을 넣고 1,8-다이아자바이사이클로운데-7-켄 (1,8-diazabicycloundec-7-ene; DBU) (1.0 당량)을 적가한 후 상온에서 30분 간 교반한다. 그 후 메탄올을 제거하고 다이메틸폼아마이드 (dimethylformamide; DMF) (0.5 mL)를 넣고 벤질 클로라이드 (1 당량)를 적가한 뒤 상온에서 24시간 교반시킨다. 유기 용매를 제거하고 에틸아세테이트로 추출하여 농축한 뒤 에틸아세테이트와 헥산 (1:4 부피비)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 액체 생성물을 얻었다 (134 mg, 74% 수율). 합성한 벤질 락테이트의 광학 순도를 HPLC를 사용하여 측정하였다 (분석 조건; 컬럼: Chiralcel-OD, 전개용매: 헥산/이소프로필알코올=98/2, 유속=1.0 mL/분, UV = 217 nm, 머무름 시간: 16.2분 (L형 벤질 락테이트), 17.5분 (D형 벤질 락테이트)). 결과는 하기 표 1과 같다.To confirm the optical purity of the prepared lactic acid, the benzyl lactate synthesis reaction shown in Scheme 2 was carried out. 1,8-diazabicycloundec-7-ene (DBU) (1.0 eq.) Was added to a 4 mL glass bottle with 1.0 mmol of lactic acid and 0.5 mL of methanol. The mixture is stirred at room temperature for 30 minutes. Methanol is then removed, dimethylformamide (DMF) (0.5 mL) is added, benzyl chloride (1 equivalent) is added dropwise, and the mixture is stirred at room temperature for 24 hours. The organic solvent was removed, extracted with ethyl acetate, concentrated, and the liquid product was obtained by column chromatography using ethyl acetate and hexane (1: 4 by volume) (134 mg, 74% yield). Optical purity of synthesized benzyl lactate was measured using HPLC (analysis conditions: Chiralcel-OD, developing solvent: hexane / isopropyl alcohol = 98/2, flow rate = 1.0 mL / min, UV = 217 nm, Retention time: 16.2 minutes (L type benzyl lactate), 17.5 minutes (D type benzyl lactate)). The results are shown in Table 1 below.

순서order 효소양
(mg/mmol)Amount of enzyme
(mg / mmol) 반응 시간 (h)Reaction time (h) 젖산 전환율 (%)Lactic acid conversion (%) 분리 수율 (%)Separation yield (%) 광학순도 (ee %)Optical purity (ee%) D형/L형 젖산 (%)D type / L type lactic acid (%) 1One 22 1One 5252 3838 7272 45/745/7 22 22 1One 4848 4141 8484 44/444/4 33 55 1One 6060 5353 6565 49/1149/11 44 55 33 8080 6868 5151 60/2060/20 55 55 2424 9393 7575 4040 65/2865/28 66 55 2424 92(시안화나트륨)92 (sodium cyanide) 7373 3939 64/2864/28

본 발명에서 젖산 전환율은 NMR을 통해 측정된 반응물에서의 생성된 락토니트릴과 젖산의 면적비로부터 계산하였으며, 분리 수율은 연속 추출을 통해 정제한 뒤의 젖산의 무게를 측정하여 사용한 아세트알데히드의 양에 따른 생성물의 이론적 수득량으로부터 계산하였다.In the present invention, the conversion of lactic acid was calculated from the area ratio of lactonitrile and lactic acid produced in the reaction measured by NMR. The separation yield was determined by measuring the weight of lactic acid after the purification by continuous extraction and the amount of acetaldehyde Calculated from the theoretical gain of the product.

제조한 젖산의 D형/L형 젖산의 비율은 젖산을 벤질 락테이트로 전환한 뒤 HPLC를 사용하여 D형 벤질 락테이트와 L형 벤질 락테이트의 면적비를 측정하고 이것을 젖산 전환율을 고려하여 계산하였다. 젖산의 광학 순도는 ((D형 벤질 락테이트 면적비 - L형 벤질 락테이트 면적비)/(D형 벤질 락테이트 면적비 + L형 벤질 락테이트 면적비)x100)의 식을 통해 계산하였다. The ratio of D-type / L-type lactic acid of the lactic acid produced was determined by converting the lactic acid to benzyl lactate, measuring the area ratio of the D-type benzyl lactate and L-type benzyl lactate using HPLC, and considering the lactic acid conversion . The optical purity of lactic acid was calculated by the formula ((D-type benzyl lactate area ratio-L-type benzyl lactate area ratio) / (D-type benzyl lactate area ratio + L-type benzyl lactate area ratio) x 100).

사용하는 신규 효소의 양과 반응 시간을 다르게 변화시켜 가면서 생성된 젖산의 광학 순도를 측정하였다. 그 결과 젖산 전환율이 낮을수록 생성된 젖산의 광학순도가 높게 나타났다. 본 방법을 통해 최고 84%의 광학순도를 갖는 D-젖산을 41%의 분리 수율로 생성할 수 있었으며, 40%의 광학순도를 갖는 D-젖산을 최고 75%의 분리 수율로 생성하였다. The optical purity of the produced lactic acid was measured while varying the amount of the new enzyme used and the reaction time. As a result, the optical purity of the produced lactic acid was higher as the conversion rate of lactic acid was lower. With this method, D-lactic acid with optical purity of up to 84% was produced with a yield of 41% and D-lactic acid with optical purity of 40% was produced with a yield of up to 75%.

시안화칼륨 대신 시안화나트륨을 사용한 경우에도 동일한 반응 조건에서 39%의 광학 순도를 갖는 D-젖산을 73%의 분리 수율로 생성하였다.
Even when sodium cyanide was used instead of potassium cyanide, D-lactic acid having an optical purity of 39% was produced in a yield of 73% under the same reaction conditions.

실시예3Example 3 . 다양한 신규 효소를 사용한 젖산 제조. Production of lactic acid using various new enzymes

100 mL 둥근바닥 플라스크에 2.0 M 시안화칼륨 수용액 (1.0 당량, 50 mL, pH 8)을 넣고 신규 효소 (500 mg)를 넣은 다음 아세트알데히드(100 mmol)를 가하여 상온에서 3시간 교반시킨다. 1 노르말 농도 염화수소용액(2.5 당량)을　 넣어 산성화시킨 다음 이소프로필 에테르로 24시간 연속 추출한 후 유기 용매를 제거하여 액체 생성물을 얻었다. 결과는 하기 표 2와 같다.A 2.0 M potassium cyanide aqueous solution (1.0 equivalent, 50 mL, pH 8) was added to a 100 mL round-bottomed flask, and a new enzyme (500 mg) was added thereto, followed by addition of acetaldehyde (100 mmol) and stirring at room temperature for 3 hours. 1 normalized hydrochloric acid solution (2.5 equivalents) was added to the reaction mixture, and the mixture was acidified with isopropyl ether for 24 hours. Then, the organic solvent was removed to obtain a liquid product. The results are shown in Table 2 below.

순서order 효소의 종류Types of Enzymes 젖산 전환율 (%)Lactic acid conversion (%) 분리 수율 (%)Separation yield (%) 광학순도 (ee %)Optical purity (ee%) D형/L형 젖산 (%)D type / L type lactic acid (%) 1One YC6258YC6258 5757 4848 6565 47/1047/10 22 YC5194YC5194 5656 5050 6464 46/1046/10 33 YC6887YC6887 5151 3939 6868 43/843/8 44 YC6898YC6898 5454 4141 6666 45/945/9

다양한 균주로부터 추출한 신규 효소를 사용하여 반응을 수행한 결과 본 반응에 대한 다양한 신규 효소들의 반응성은 유사했다. 3시간동안 반응을 수행하여 51-57%의 전환율로 젖산이 생성되었고 생성된 젖산의 광학 순도를 측정한 결과 64-68%로 나타났고 전체적으로 D형 이성질체가 우세한 젖산이 생성되었다.
As a result of carrying out the reaction using the new enzyme extracted from various strains, the reactivity of the various novel enzymes for this reaction was similar. The reaction was carried out for 3 hours to yield lactic acid at a conversion rate of 51-57%. The optical purity of the produced lactic acid was found to be 64-68%, and lactic acid was predominantly predominant in the D-isomer.

실시예4Example 4 . 투석막을 사용한 신규 효소 재사용. Reuse of new enzyme using dialysis membrane

신규 효소 (500 mg)를 증류수 (5 mL)에 녹인 후, 분획 분자량 (molecular weight cut-off) 10,000인 투석막에 넣어 “효소막”을 만든 뒤, 100 mL 비이커에 넣고 2.0 M 시안화칼륨 수용액 (1.0 당량, 45 mL, pH 8)과 아세트알데히드(100 mmol)를 가하여 상온에서 24시간 교반시킨다. 1 노르말 농도 염화수소용액(2.5 당량)을 넣어 산성화시킨 다음 이소프로필 에테르로 24시간 연속 추출한 후 유기 용매를 제거하여 액체 생성물을 얻었다. 결과는 하기 표 3와 같다.　　 An enzyme membrane was prepared by dissolving 500 mg of the new enzyme in 5 mL of distilled water and then adding it to a dialysis membrane having a molecular weight cut-off of 10,000. Then, the enzyme membrane was placed in a 100 mL beaker, and a 2.0 M potassium cyanide aqueous solution Equiv., 45 mL, pH 8) and acetaldehyde (100 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. 1 normalized hydrochloric acid solution (2.5 equivalents) was added to the reaction mixture, and the mixture was acidified with isopropyl ether for 24 hours. Then, the organic solvent was removed to obtain a liquid product. The results are shown in Table 3 below.

순서order 효소 사용 횟수Number of enzymes used 젖산 전환율 (%)Lactic acid conversion (%) 분리 수율 (%)Separation yield (%) 광학순도 (ee %)Optical purity (ee%) D형/L형 젖산 (%)D type / L type lactic acid (%) 1One 1One 9191 7070 4040 64/2764/27 22 22 9191 7070 4040 64/2764/27 33 33 9292 7171 4040 65/2765/27 44 44 9090 7171 3939 63/2763/27 55 55 9090 7070 4040 63/2763/27

신규 효소를 효소 막을 제조하여 재사용한 결과 최소 5번 이상 효소의 재사용이 가능하다는 것을 확인하였다. 또한 반응의 젖산 전환율과 수율도 일정하게 유지되었으며 생성된 젖산의 광학순도도 유지되는 것을 확인하였다.　 As a result, it was confirmed that the enzyme can be reused at least 5 times. Also, the conversion and yield of lactic acid in the reaction were maintained constant and the optical purity of lactic acid produced was maintained.

발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니하며, 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서 본 발명의 범위는 위의 실시 예에 국한해서 해석되어서는 안 되며, 후술하는 특허 청구범위뿐만 아니라 이 특허 청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.
[출처]
본 발명은 농촌진흥청 연구사업(세부과제명: 신규효소의 분리 정제, 대량 생산 및 특성 조사, 세부과제번호: PJ009494)의 지원에 의해 이루어진 것임.
It is to be understood that the invention is not limited to the specific embodiments described above, and that various changes and modifications may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims. Accordingly, the scope of the present invention should not be construed as being limited to the above-described embodiments, but should be determined by equivalents to the appended claims, as well as the following claims.
[source]
The present invention was accomplished by the RDA's research project (detailed title: separation and purification of new enzymes, mass production and characterization, detailed reference number: PJ009494).

Claims (17)

아세트알데히드와 시안화염을 니트릴기 가수분해 능을 가지는 효소로 반응시켜 D형 젖산이 L형 젖산보다 많은 젖산 혼합물을 제조하는 방법. A method for producing lactic acid mixture of D type lactic acid more than L type lactic acid by reacting acetaldehyde and cyanide with an enzyme having nitrile group hydrolysis ability. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 시안화염은 시안화칼슘, 시안화나트륨, 시안화수소에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 1, wherein the cyanide is selected from one or more of calcium cyanide, sodium cyanide, and hydrogen cyanide. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 효소는 균주인 YC6258 (KCCM 43015), Lysobacter capsici YC5194T (KCTC 22007T=DSM 19286T), Martelella endophytica YC6887T　(KCCM 43011T=NBRC 109149T), 또는 Hoeflea suaedae YC6898T　(KACC 14911T=NBRC 107700T)에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.3. A method according to claim 1 or 4, wherein the enzyme is a strain of YC6258 (KCCM 43015), Lysobacter capsici YC5194 T (KCTC 22007 T = DSM 19286 T), Martelella endophytica YC6887 T (KCCM 43011 T = NBRC 109149 T), or Characterized in that it is derived from Hoeflea suaedae YC6898 T (KACC 14911 T = NBRC 107700 T ). 제5항에 있어서, 상기 효소는 균체의 배양액을 원심분리하여 세포체를 얻고, 세포체를 파쇄한 뒤, 원심분리하여 상등액을 얻고, 이를 동결 건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.[Claim 6] The method according to claim 5, wherein the enzyme is obtained by centrifuging the cell culture broth to obtain a cell body, disrupting the cell body, centrifuging to obtain a supernatant, and lyophilizing the supernatant. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 효소는 효소막 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 1 or 4, wherein the enzyme is used in the form of an enzyme membrane. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 효소는 재조합 유전자에 의해서 발현되는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.5. The method according to claim 1 or 4, wherein the enzyme is an enzyme expressed by a recombinant gene. 제1항 또는 제4항에 있어서, 기질로 알데히드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.5. The method of claim 1 or 4, further comprising aldehyde as a substrate. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 반응은 25~40℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법. The method according to claim 1 or 4, wherein the reaction is carried out at 25 to 40 占 폚. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 반응은 pH6~8의 범위에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법. The method according to claim 1 or 4, wherein the reaction takes place in the range of pH 6-8. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 반응은 24시간 이하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the reaction is carried out within 24 hours. 삭제delete 삭제delete 아세트알데히드와 시안화염을 니트릴기 가수분해 능을 가지는 효소로 반응시켜 D형 젖산이 L형 젖산보다 많은 젖산 혼합물을 제조하고,
상기 젖산 혼합물을 벤질 락테이트(benzyl lactate) 로 변환시켜, HPLC를 이용하여 D형/L형 젖산의 비율을 분석하는 방법.Reacting acetaldehyde and cyanide with an enzyme having a nitrile group hydrolyzing ability to produce a lactic acid mixture of D type lactic acid more than L type lactic acid,
A method of converting the lactic acid mixture into benzyl lactate and analyzing the ratio of D type / L type lactic acid by HPLC. 제15항에 있어서, 상기 HPLC는 키랄 컬럼을 가지는 HPLC인 것을 특징으로 하는 방법.16. The method of claim 15, wherein the HPLC is HPLC with a chiral column. 삭제delete
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