KR101710674B1 - Epo 수용체 및 pkc 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Epo 수용체 및 pkc 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질은 EPO-의존적 세포주에서 세포 증식 촉진 효능을 나타내고, 동물의 빈혈 모델에서 빈혈 완화 효능을 나타내며, 적혈구 콜로니 형성에서 EPO 활성에 대한 상승 효과를 나타내어 생체내 조혈 활성이 확인됨으로써, 빈혈의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 용도{Pharmaceutical composition for preventing or treating anemia comprising agent targeting EPO receptor as well as PKC as an active ingredient and the use thereof}
본 발명은 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
천연물로부터 유래된 인제놀 디테르페노이드 유도체는 항암(Challacombe et al., 2006; Jørgensen et al., 2013), 항바이러스(Hong et al., 2011), 및 혈소판생성(Racke et al., 2012)을 포함한 중요한 생의학적 활성을 가지는 것으로 보고되고 있다. 특히, 인제놀 메부테이트(ingenol mebutate, Picato®, PEP005, ingenol 3-angelate)는 최근 미국에서 광선각화증(actinic keratosis)에 대하여 FDA 승인을 받았으며, 인간 흑색종(Challacombe et al., 2006) 및 기저세포암(Siller et al., 2010)에 효과가 있는 것으로 보고되었다. 또한, 인제놀은 HIV 감염으로부터 인간 T 세포를 보호하고(Hong et al., 2011), 인제놀 트리아세테이트는 HIV 종의 복제를 억제한다고 보고된 바 있다(Fujiwara et al., 1996). 인제놀 3,20-디벤조에이트(ingenol 3,20-dibenzoate, IDB)는 거핵구성 분화(megakaryocytic differentiation)를 유도한다고 보고된 바 있다(Racke et al., 2001; 2012). 그러나, 이러한 인제놀 유도체의 다면발현적인 작용과 관련한 기전에 대하여는 잘 알려져 있지 않다.
인제놀 유도체는 세포내 신호 전달 및 기능의 원인이 되는 단백질 키나아제 C(protein kinase C, PKC)의 활성화 및 위치 이동에 의해 내인성 디아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)과 유사하게 작용하는 것으로 알려져 있다(Newton, 1995).
PKC 아이소자임(isozyme)은 α, β, 및 γ 동형(isoform)을 포함하는 전통적인 PKC(conventional PKC, cPKC); δ, ε, η, θ, 및 μ 동형을 포함하는 신규 PKC(novel PKC, nPKC); 및 ζ 및 λ 동형을 포함하는 비정형적 PKC(atypical PKC, aPKC) (Newton, 1995)의 3개 군으로 분류된다. 인제놀은 정제된 PKC와 결합하여 이를 부분적으로 활성화시키고(Hasler et al., 1992), 인제놀 메부테이트는 cPKC 및 nPKC와 결합한다고(Kedei et al, 2004) 보고된 바 있다. 그러나, 인제놀 유도체 및 PKC들 간의 상호작용은 [3H]PDBu 결합(Hasler et al., 1992; Kedei et al, 2004) 또는 도킹 모의실험 모델(docking simulation model, Grue-Sørensen et al., 2014)과 같은 간접적 방법으로 확인되었을 뿐이다.
IDB는 nPKC를 선택적으로 활성화할 수 있으나(Asada et al, 1998), 직접적인 결합 역학에 대하여는 규명된 바 없다. 분자 표적으로서의 PKC 대신, 포볼 또는 인제놀 에스테르에 대한 세포막 수용체의 존재에 대하여만 보고된 바 있다(Shoyab 및 Todaro, 1980; Driedger 및 Blumberg, 1980; Dunphy et al., 1980; Sando et al., 1981).
인간 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO)은 적혈구 전구 세포의 증식 및 분화를 자극하는 주요 사이토카인이다. EPO 수용체(EPO receptor, EPOR)는 EPO 활성을 매개한다. EPOR에 EPO가 결합하면 입체구조 변화(conformational change)가 일어나고, 이는 야누스 티로신 키나아제-2(Janus tyrosine kinase-2, JAK-2), EPOR 자체, 신호전달성 전사 인자 활성화 인자(signal transducer and activator of transcription-5, STAT-5)를 포함한 다른 신호전달 단백질의 인산화반응으로 이어진다(Constantinescu et al., 2001). PKC는 EPOR 시그널링, 특히, RAF-1 및 ERK1/2의 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Lindern et al, 2000; Szenajch et al., 2010).
빈혈을 치료하기 위하여 재조합 EPO 단백질 및 이의 변형체가 임상에서 사용되어 왔다. 그러나, EPO 내성 빈혈, 순수적혈구 무형성증(pure red cell aplasia, PRCA), 종양 촉진 효과, 고 비용, 및 침습성 투여 경로 등의 EPO의 한계로 인하여, EPOR 활성화에 관한 대체 분자에 대한 연구가 진행되고 있다(Kim et al., 2013). EPOR를 활성화시키는 EPO 유사 저분자 및 EPO 유사 펩티드에 대하여 보고된 바 있으나(Qureshi et al., 1999; Goldberg et al., 2002), 현재까지는 EPO 유사 저분자는 치료제로 사용될 정도의 효과를 나타내지 못했고, EPO 유사 펩티드는 현재 개발 중이다(Kessler et al., 2012).
UT-7/EPO는 오랜 기간 동안 유지할 수 있는, EPO에 절대적으로 의존적인 인간 적백혈병 세포주이다(Komatsu et al., 1993). UT-7/EPO 세포주는 EPO 생물학적 평가, EPO 시그널링 연구, 및 EPO 유사 약물 시험(Fan et al., 2006; Liu et al., 2007; Shin et al., 2010; 2012; Kessler et al., 2012) 등에 사용되어 왔으나, 현재까지는 비-펩티드성 저분자와 관련하여 UT-7/EPO 증식 활성이 보고된 바는 없다.
EPO 유사 저분자와 관련하여, 몇몇 천연물 추출물이 적혈구 생성을 촉진하는 것으로 보고된 바 있으나, 추출물에는 다수의 활성 화합물이 포함되어 있으므로 직접적으로 활성을 나타내는 표적 분자가 확인된 바는 없다. 합성 화학 라이브러리로부터 단일 활성 화합물을 찾으려는 시도도 있었으나(Qureshi et al., 1999; Goldberg et al., 2002), 현재까지는 성공적이지 않다.
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본 발명자들은 빈혈을 치료하기 위하여 EPO 유사 저분자 물질에 대하여 연구하던 중, EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질이 EPO-의존적 세포주에서 EPO 유사 조혈 작용을 나타내고, 동물의 빈혈 모델에서 빈혈 완화 효능을 나타냄으로써, 빈혈의 예방 및 치료 효과를 달성할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질은 인제놀 에스테르, 인제놀 케탈 또는 포볼 에스테르일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질은 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015071183987-pat00001
[화학식 2]
Figure 112015071183987-pat00002
상기 식에서,
R1는 수소 또는 아실이거나, R2와 함께 케탈을 형성할 수 있고;
R2는 수소이거나, R1과 함께 케탈을 형성할 수 있고;
R3는 수소이거나, R4와 함께 케탈을 형성할 수 있고;
R4는 수소 또는 아실이거나, R3와 함께 케탈을 형성할 수 있고;
R1, R2, R3 및 R4 중 적어도 하나는 수소가 아니고;
R5는 아실이고; 및
R6는 수소 또는 아실이다.
일 구현예에서,
상기 R1은 수소, 안젤로일 또는 벤조일이거나, R2와 함께 아세토나이드를 형성할 수 있고;
상기 R2는 수소이거나, R1과 함께 아세토나이드를 형성할 수 있고;
상기 R3는 수소이거나, R4와 함께 아세토나이드를 형성할 수 있고;
상기 R4은 수소 또는 벤조일이거나, R3와 함께 아세토나이드를 형성할 수 있고;
상기 R5는 아세틸 또는 페닐아세틸이고; 및
상기 R6는 수소 또는 아세틸이다.
일 구현예에서, 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질은
[1] 인제놀 3,20-디벤조에이트,
[2] 인제놀 3-안젤레이트,
[3] 인제놀-3,4:5,20-디아세토나이드,
[4] 인제놀-5,20-아세토나이드,
[5] 인제놀-5,20-아세토나이드-3-O-안젤레이트,
[6] 12-데옥시포볼 13-아세테이트, 및
[7] 12-데옥시포볼 13-페닐아세테이트 20-아세테이트
로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일 구현예에서, 상기 빈혈은 EPO 농도 관련 빈혈, 신장 결함 관련 빈혈, 암치료시 발생되는 빈혈 및 이들의 혼합 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 예를 들어, 급성 또는 만성 빈혈, 신장 질환에 의한 빈혈, 신부전에 의한 빈혈, 혈액 질환에 의한 빈혈, 방사선요법-유발 빈혈, 화학요법-유발 빈혈, 수술 과정에 의한 빈혈, 감염에 의한 빈혈, 영양결핍성 빈혈, 비정상적인 적혈구생성, 조산의 초기 빈혈 또는 이들의 혼합 질환일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 EPO를 추가로 포함하거나, 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 의해, EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질이 EPO-의존적 세포주에서 세포 증식 촉진 효능을 나타내고, 동물의 빈혈 모델에서 빈혈 완화 효능을 나타내며, 적혈구 콜로니 형성에서 EPO 활성에 대한 상승 효과를 나타내어 생체내 조혈 활성이 확인됨으로써, EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물이 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 세포 수준 및 동물 생체내에서 우수한 적혈구 조혈 활성을 달성하여 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 IDB가 에리스로포이에틴(EPO) 절대 의존적인 UT-7/EPO 세포주의 증식 및 인간 골수 CD34+ 전구 세포의 증식을 자극한 결과를 나타낸다. (A) 천연물 유래 화합물 라이브러리에서 증식 활성이 있는 화합물을 확인하기 위하여 UT-7/EPO 세포를 24시간 동안 EPO 고갈시킨 후, EPO(0.2 IU/ml) 또는 라이브러리 화합물 1종(20 μg/ml)을 함께 배양하여, WST 분석으로 세포 생존율을 측정한 결과이다. (B) EPO(5 IU/ml), IDB(5 μg/ml), 또는 IGN(5 μg/ml)를 순차적으로 희석하여 UT-7/EPO 세포 증식에 미치는 용량-의존적 강화 효과를 나타낸 결과이며, 시료의 OD 값을 3회 측정하여 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. (C) 인간 골수 CD34+ 전구 세포의 증식에 미치는 EPO(4 IU/ml), IDB(1 μg/ml), 또는 IGN(1 μg/ml)의 영향을 나타낸 결과이며, 시료의 OD 값을 3회 측정하여 평균±표준 오차(SEM)로 나타내었다(운반체-처리군과 비교하여 * p < 0.05, *** p < 0.001). (D) 인제놀 3-안젤레이트(PEP005) 및 FR236924를 순차적으로 희석하여 UT-7/EPO 세포 증식에 미치는 용량-의존적 강화 효과를 나타낸 결과이며, 시료의 OD 값을 3회 측정하여 평균±표준편차(SD)로 나타내었다.
도 2는 C57BL/6 마우스에 5-FU를 IP 주사(3 mg/마우스)하여 빈혈을 유도한 후, EPO(100 IU/마우스), IDB(20 μg/마우스), 또는 운반체를 3, 7, 및 11일에 투여하고 정해진 시간(0, 4, 8, 12, 16, 및 20일)에 채취한 혈액 시료의 RBC(적혈구, 106 세포/μl) (A, B), HCT(헤마토크릿, %) (C, D), Hb(헤모글로빈, g/dl) (E, F), RET(망상적혈구, 103 세포/μl) (G, H), 및 PLT(혈소판, 103 세포/μl) (I, J) 등의 혈액학적 파라미터를 나타낸 결과이다. 독립적인 2개 실험을 수행하여, 운반체, EPO, 및 IDB 처리군의 마우스 5개체 데이터의 평균 ± 표준 오차(SEM)를 나타내었다(운반체-처리 마우스와 비교하여 * p < 0.05, ** p < 0.01).
도 3은 IDB의 EPO 상승적 활성이 PKC의 직접적 표적화에 기인함을 나타내는 결과이다. (A) IGN(0.08 μg/ml), IDB(0.08 μg/ml), EPO(0.08 IU/ml), 또는 EPO(0.08 IU/ml) 및 IDB(0.08 μg/ml)의 혼합물을 사용하여 UT-7/EPO 세포 증식에 있어서 IDB에 의한 EPO 활성 촉진을 측정한 결과이다. 시료를 3회 측정하여 평균±표준 편차(SD)로 나타내었다(EPO 단독 군과 비교하여 **p < 0.01, *** < 0.001). (B) 인간 CD34+ 골수 세포의 BFU-E 콜로니로의 분화에 있어서 EPO, 또는 EPO 및 IDB에 의한 BFU-E 콜로니 숫자의 변화(좌) 및 100 × 배율에서 촬영한 사진(우)이다. (C) EPO(3 IU/ml), IDB(3 μM), 또는 IGN(3 μM)을 24시간 동안 처리한 후에 PKC의 세포막으로의 위치 이동을 웨스턴 블럿(WB)으로 분석하고, WB 밴드는 밀도 분석으로 정량화한 결과이다. (D), (E) Go6976 또는 비스인돌릴말레이미드(BIM)를 10 μM로부터 순차적으로 2배 희석하여 세포에 첨가하여, PKC 억제제에 의한 EPO 및 IDB의 세포 증식 활성의 억제를 분석한 결과이다. (F), (G), (H), (I) 표준 아민 커플링 방법으로 CM5 센서 칩 상에 PKC-α 또는 PKC-ε를 고정하고, IDB 또는 IGN를 표시된 농도로 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 수행한 결과 및 측정된 친화도 상수(KD)를 나타내었다.
도 4는 IDB의 EPO 억제 활성이 EPO 수용체(EPOR)에 대한 IDB 및 EPO의 경쟁적 결합에 기인한다는 결과를 나타낸다. (A) IGN(1.25 μg/ml), IDB(1.25 μg/ml), EPO(1.25 IU/ml), 또는 EPO(1.25 IU/ml) 및 IDB(1.25 μg/ml)의 혼합물을 사용하여 UT-7/EPO 세포 증식 분석에 미치는 영향을 측정한 결과이다. 시료의 OD 값을 3회 측정하여 평균±SD로 나타내었다(EPO 단독군과 비교하여 **p < 0.01, *** < 0.001). (B) 1 IU/ml의 일정한 EPO 농도에서 5 μg/ml까지 증가되는 IDB 또는 IGN과 동시-인큐베이션하여 UT-7/EPO 세포 증식을 분석한 결과이며, 비교를 위하여 IDB 또는 IGN을 단계적으로 희석한 액을 EPO 비존재 상태의 세포에 적용하였다. 시료의 OD 값을 3회 측정하여 평균±SD로 나타내었다. (C) CD34+ 세포를 IDB(0.1 μg/ml), EPO(3 IU/ml), 또는 IDB(0.1 μg/ml) 및 EPO(3 U/ml)의 존재 하에서 12~14일 동안 배양하여, 고농도 IDB에 의한 인간 CD34+ 골수 세포에서 BFU-E 콜로니로의 EPO-유도 분화의 억제를 측정한 결과이다. (D) UT-7/EPO 세포를 용해성 EPOR(sEPOR)(2.5 μg/ml로부터 2배 희석) 존재 하에서 IDB(0.8 μg/ml) 또는 EPO(0.25 IU/ml)와 함께 배양하여 세포 증식 활성의 억제 정도를 WST 분석으로 수행한 결과이다. 시료의 OD 값을 3회 측정하여 평균±SD로 나타내었다. (E) IDB(200, 100, 50, 25 μg/ml)의 존재 하에서 sEPOR로 코팅된 ELISA 플레이트에 EPO(5 μg/ml)를 결합시켜 IDB에 의한 sEPOR에 대한 EPO 결합의 억제를 측정한 결과이다. 시료의 OD 값을 3회 측정하여 평균±SD로 나타내었다(EPO 단독 처리된 세포와 비교하여 통계적 유의성 있음을 *p < 0.05, **p < 0.01, 및 *** < 0.001로 나타냄). (F) sEPOR(5 μg/ml)의 존재 하에서 5분 동안 IDB(0.8 μg/ml) 또는 EPO(0.25 IU/ml)에 의해 자극된 UT-7/EPO 세포에서 ERK1/2 시그널링을 웨스턴 블럿(WB)으로 분석하여, sEPOR와의 공동-인큐베이션에 의한 IDB- 또는 EPO-유도 ERK1/2 인산화반응의 억제를 측정한 결과이다. WB 밴드를 밀도 분석으로 정량화하여, 3회 실험의 평균±SD로 나타내었다(Student t-test, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). (G) EPOR 및 ERK1/2의 EPO(0.25 IU/ml)-유도 인산화반응에서 IDB(1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 또는 0.1 μg/ml) 공동-인큐베이션의 효과를 WB으로 분석하여 IDB에 의한 EPO-유도 EPOR 인산화반응의 용량-의존적 억제를 측정한 결과이다. WB 밴드를 밀도 분석으로 정량화하여, 3회 실험의 평균±SD로 나타내었다(1원 분산분석법(one-way ANOVA) 및 Dunnett 사후 검정법으로 분석함, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). (H) EPO(1, 0.25, 또는 0.0625 IU/ml), IDB(1.6, 0.4, 또는 0.1 μg/ml), 또는 IGN(1.6, 0.4, 또는 0.1 μg/ml)에 의한 JAK-2 인산화반응의 WB 분석을 수행하여 IDB에 의한 JAK-2 인산화반응의 무력화를 측정한 결과이다. WB 밴드를 밀도 분석으로 정량화하여, 3회 실험의 평균±SD로 나타내었다(1원 분산분석법(one-way ANOVA) 및 Dunnett 사후 검정법으로 분석함, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). (I), (J) 표준 아민 커플링 방법으로 CM5 센서 칩 상에 sEPOR를 고정하고, IDB 또는 IGN를 표시된 농도로 sEPOR-코팅된 플로우 셀에 주입하여 측정기기(BIAcore instrument)를 사용하여 SPR 분석을 수행한 결과이다. 소프트웨어(T-200 BIAevaluation software was)를 사용하여 기준값으로 보정하고 친화도 상수(KD)를 측정하였다.
본 발명은 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 빈혈의 예방 또는 치료에 사용하는 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 환자에게 치료학적으로 유효한 양의 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 투여하는 것을 포함하는 빈혈의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질은 인제놀 에스테르, 인제놀 케탈 또는 포볼 에스테르일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질은 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015071183987-pat00003
[화학식 2]
Figure 112015071183987-pat00004
상기 식에서,
R1는 수소 또는 아실이거나, R2와 함께 케탈을 형성할 수 있고;
R2는 수소이거나, R1과 함께 케탈을 형성할 수 있고;
R3는 수소이거나, R4와 함께 케탈을 형성할 수 있고;
R4는 수소 또는 아실이거나, R3와 함께 케탈을 형성할 수 있고;
R1, R2, R3 및 R4 중 적어도 하나는 수소가 아니고;
R5는 아실이고; 및
R6는 수소 또는 아실이다.
일 구현예에서,
상기 R1은 수소, 안젤로일 또는 벤조일이거나, R2와 함께 아세토나이드를 형성할 수 있고;
상기 R2는 수소이거나, R1과 함께 아세토나이드를 형성할 수 있고;
상기 R3는 수소이거나, R4와 함께 아세토나이드를 형성할 수 있고;
상기 R4은 수소 또는 벤조일이거나, R3와 함께 아세토나이드를 형성할 수 있고;
상기 R5는 아세틸 또는 페닐아세틸이고; 및
상기 R6는 수소 또는 아세틸이다.
일 구현예에서, 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질은
[1] 인제놀 3,20-디벤조에이트,
[2] 인제놀 3-안젤레이트,
[3] 인제놀-3,4:5,20-디아세토나이드,
[4] 인제놀-5,20-아세토나이드,
[5] 인제놀-5,20-아세토나이드-3-O-안젤레이트,
[6] 12-데옥시포볼 13-아세테이트, 및
[7] 12-데옥시포볼 13-페닐아세테이트 20-아세테이트
로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
또한, 본 발명은 환자에 있어서 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질의 PKC 경유 또는 EPOR에의 결합에 의한 빈혈의 예방 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 하기 기재된 바의 EPO-조절 특성을 발견하고 직접적 분자 표적임을 확인함으로써 그 작용 기전을 규명하였다.
IDB는 포볼 관련 디테르페노이드로서, PKC-ε 활성화제로 알려져 있다. 본 발명에서 IDB는 EPO-의존적 세포주인 UT-7/EPO에서 유도 증식 활성이 있음이 확인되었고(도 1A 참조), EC50 0.27 μg/ml(485 nM), 최대 효과는 EPO의 약 70% 수준으로 용량-의존적으로 UT-7/EPO 세포 증식을 촉진시켰으며(도 1B 참조), EPO와 유사하게 인간 골수 CD34+ 전구 세포의 증식을 증가시켰다(도 1C 참조).
상기와 같은 UT-7/EPO 세포 증식의 촉진 효과는 인제놀 3-안젤레이트(PEP005), 12-데옥시포볼 13-아세테이트, 및 12-데옥시포볼 13-페닐아세테이트 20-아세테이트 화합물에서도 확인되었다.
또한, IDB는 5-플루오로우라실(5-FU)-유도 빈혈 모델에서 빈혈 완화 효능을 나타내었고(도 2A, 2C, 및 2E 참조), 이는 적혈구(RBC) 헤마토크릿(HCT), 헤모글로빈(Hb), 및 망상적혈구(RET)의 증가로 확인되었다(도 2B, 2D, 2F, 2G 및 2H 참조).
IDB의 처리 농도에 따른 활성과 관련하여, IDB는 불포화 농도에서 EPO와 함께 UT-7/EPO 세포 증식을 상승적으로 자극했지만(도 3A 참조), 포화 농도에서 IDB 단독으로 처리한 경우와 유사한 수준으로 EPO 활성을 억제하였으며(도 4A 참조), EPO 활성은 IDB에 의하여 용량-의존적 방식으로 하향조절되었으나, IDB 자체의 활성은 유지되었다(도 4B 참조). 또한, 0.003 μg/ml의 IDB 단독으로는 인간 골수 CD34+ 세포의 적혈구 콜로니(BFU-E)로의 분화를 자극하지는 않았지만 EPO 활성을 현저히 상승시켰으며(도 3B 참조), 0.1 μg/ml의 IDB는 EPO-유도 BFU-E 콜로니 형성(도 4C 참조)을 억제하였다.
PKC에 대한 효능과 관련하여, UT-7/EPO 세포에서 IDB-처리에 의해 PKC-α, PKC-δ, 및 PKC-ε가 막 분획으로 위치 이동하는 것이 확인되었고, EPO-유도 세포 증식은 PKC-α 및 PKC-β 억제제(Go6976)에 의하여 거의 완전히 차단되었지만, IDB-유도 세포 증식은 부분적으로 차단되었으며(도 3D 참조), 광범위 PKC 억제제인 비스인돌릴말레이미드(Bisindolylmaleimide, BIM)에 의해 EPO 및 IDB의 활성이 모두 거의 완전히 억제되었으며, IDB 활성이 보다 더 민감한 것으로 확인되었다(도 3E 참조). 또한, IDB는 PKC-α(도 3F 참조) 및 PKC-ε(도 3H 참조)에 유사한 결합 친화도(KD)로 직접적으로 결합하는 것이 확인되었다.
IDB의 EPOR에 대한 결합 역학과 관련하여, 고농도의 IDB는 EPO 활성을 IDB 단독 처리군 수준으로 하향조절하여(도 4A 및 4B 참조), EPO(1 IU/ml) 및 IDB(고농도) 동시 처리 활성의 대부분이 PKC 표적된 잔류 IDB에 기인하는 것으로 추정되었다. 또한, IBD의 세포 증식 활성은 sEPOR 공동-인큐베이션에 의해 부분적으로 제한되었으나, EPO 활성은 sEPOR에 의해 거의 완전히 억제되어(도 4D 참조), IDB가 적어도 2개 분자, 즉, sEPOR 및 PKC에 표적화할 가능성을 시사하였다.
또한, EPO 및 sEPOR의 단백질-단백질 상호작용이 IDB에 의해 실질적으로 파괴됨을 확인하여(도 4E 참조), IDB가 sEPOR에 결합하는데 있어서 EPO와 경쟁함을 시사하였다. 또한, sEPOR은 EPO 또는 IDB에 대한 직접적 결합을 통하여 EPO 및 IDB-유도 ERK1/2 인산화반응을 차단할 수 있는 것으로 확인되었으며(도 4F 참조), 친화도는 4.02 × 10-6 M의 KD로 측정되었다(도 4I 참조).
일 구현예에서, 상기 빈혈은 EPO 농도 관련 빈혈, 신장 결함 관련 빈혈, 암치료시 발생되는 빈혈 및 이들의 혼합 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 예를 들어, 급성 또는 만성 빈혈, 신장 질환에 의한 빈혈, 신부전에 의한 빈혈, 혈액 질환에 의한 빈혈, 방사선요법-유발 빈혈, 화학요법-유발 빈혈, 수술 과정에 의한 빈혈, 감염에 의한 빈혈, 영양결핍성 빈혈, 비정상적인 적혈구생성, 조산의 초기 빈혈 또는 이들의 혼합 질환일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 EPO를 추가로 포함할 수 있다. 즉, EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질 단독으로 또는 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질와 EPO를 병용하여 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 함유되는 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 0.001 내지 90 % 중량백분율로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 재료 및 시험
(1) 천연물 라이브러리 스크리닝을 위한 EPO 생물학적 평가 시스템 확립
구조가 알려진 502개의 정제 천연물의 상업적 라이브러리(BML-2865, Enzo Life Sciences, NY, USA)에 대하여 UT-7/EPO 세포(Shin et al., 2010)를 사용하여 스크리닝을 수행하였다. UT-7/EPO 세포는 습도 조절된 CO2 인큐베이터에서 10% FBS(Gibco BRL, NY, USA) 및 1 IU/ml 에리스로포이에틴(EPO, LG생명과학, 대한민국) 보충된 알파-MEM(alpha-MEM, Hyclone, UT, USA)으로 유지하였다. UT-7/EPO 세포를 알파-MEM으로 3회 세척한 후, EPO 비존재 배양 배지 중의 104 세포를 3개 웰에 첨가하여 1일 동안 영양분을 고갈시켰다. 그 후, EPO(0.2 IU/ml) 또는 천연물 화합물(20 μg/ml)을 세포에 첨가하고, 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 배양 후, EZ-Cytox 세포 생존율 WST 분석 키트(Daeil lab service, 대한민국)를 사용하여 세포 증식을 측정하였다. 키트 시약(15 μl)을 각 웰에 첨가하고, CO2 인큐베이터에서 1 내지 6시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 450 nm(기준 파장: 690 nm) 흡광도에서 광학밀도(optical density, OD)를 측정하여 그 결과를 도 1(A)에 나타내었다.
(2) IDB 및 EPO 의 용량-의존적 활성 분석을 위한 생물학적 평가
EPO, IDB(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, Enzo Life Sciences), 또는 인제놀(IGN, Santa Cruz Biotechnology)에 대한 UT-7/EPO 세포의 증식 반응을 하기와 같이 측정하였다. EPO(5 IU/ml로부터 4배 희석), IDB(5 μg/ml로부터 4배 희석), 또는 IGN(5 μg/ml로부터 4배 희석)을 세포에 첨가하고 3일 동안 배양하였다. 상기한 바와 동일한 방법으로 생존율 평가를 수행하여 그 결과를 도 1(B)에 나타내었다.
또한, 인제놀 3-안젤레이트(PEP005) 및 2-[(2-펜틸시클로프로필)메틸]시클로프로판옥타노익 에시드(2-[(2-Pentylcyclopropyl)methyl]cyclopropaneoctanoic acid, FR236924)를 순차적으로 희석하여 UT-7/EPO 세포 증식에 미치는 용량-의존적 강화 효과를, 상기한 바와 동일한 방법으로 평가하여 그 결과를 도 1(D)에 나타내었다.
또한, 12-데옥시포볼 13-아세테이트, 및 12-데옥시포볼 13-페닐아세테이트 20-아세테이트 화합물에 대하여 UT-7/EPO 세포 증식에서의 광학밀도(OD)를 상기한 바와 동일한 방법으로 측정한 결과, 하기와 같은 활성을 나타내었다.
화합물 OD1 OD2 평균
12-데옥시포볼 13-아세테이트 0.912 0.836 0.874
12-데옥시포볼 13-페닐아세테이트 20-아세테이트 0.800 0.596 0.698
(3) 인간 골수 CD34 + 전구 세포에 대한 IDB 또는 EPO 의 활성 분석
인간 골수 CD34+ 전구 세포(1 × 104 세포) (Lonza, Maryland, USA)를, 12-웰 조직 배양 디쉬에서 사이토카인 칵테일 CC100(StemCell Technologies, Vancouver, Canada) 보충된 배지(StemSpan SFEM) 중에서 EPO(4 IU/ml), IDB(1 μg/ml), 또는 IGN(1 μg/ml)과 함께 배양하였다. 37 ℃, 5% CO2에서 10일 동안 배양한 후, 상기한 바와 동일한 방법으로 생존율 평가를 수행하여 그 결과를 도 1(C)에 나타내었다.
(4) 5- 플루오로우라실 (5- FU )-유도 빈혈의 생체내 모델 확립
시험 시작 0일에 수컷 C57BL/6 마우스(8 내지 12 주령, 처리 군당 5개체)에 5-FU(Sigma-Aldrich, MO, USA) 3mg을 1회 복강내(IP) 주사하여 빈혈을 유도하였다. 주사 후, 3, 7, 및 11일에 식염수 0.2 ml 중의 EPO(100 IU), IDB(20 μg), 또는 운반체를 마우스에 투여하였다. 혈액 시료를 정해진 시간(0, 4, 8, 12, 16, 및 20일)에 헤파린 처리된 모세혈관으로 안와정맥으로부터 수집하였다. 혈액학적 파라미터를 혈액학 분석기(Procyte DX hematology analyzer, IDEXX Laboratories, CA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 2회의 실험을 독립적으로 수행하였다.
(5) EPO 및 IDB 혼합물의 활성 분석을 위한 생물학적 평가
EPO 및 IDB 혼합물의 UT-7/EPO 세포 증식 활성을 하기와 같이 측정하였다. IGN(0.078 μg/ml 또는 1.25 μg/ml), IDB(0.078 μg/ml 또는 1.25 μg/ml), EPO(0.078 IU/ml 또는 1.25 IU/ml), EPO(0.078 IU/ml) 및 IDB(0.078 μg/ml)의 혼합물, 또는 EPO(1.25 IU/ml) 및 IDB(1.25 μg/ml)의 혼합물을 사용하여 상기한 바와 동일한 방법으로 UT-7/EPO 세포 생물학적 평가를 수행하여 그 결과를 도 3(A) 및 도 4(A)에 나타내었다.
(6) 적혈구( BFU -E) 콜로니 분석 평가
hSCF(50 ng/ml), hGM-CSF(20 ng/ml), hIL-3(20 ng/ml), hIL-6(20 ng/ml), 및 hG-CSF(20 ng/ml) (PeproTech, NJ, USA)를 배지(MethoCult media, StemCell Technologies, Vancouver, Canada)에 첨가하여 인간 콜로니-형성 세포 평가를 위한 분석 배지(MethoCult assay media)를 제조하였다 . 인간 골수 CD34+ 전구 세포(1 × 104 세포) (Lonza, Maryland, USA)를 분석 배지 중의 EPO(30 IU/ml), IDB(0.03 또는 1 μg/ml), 또는 이들의 혼합물 0.3 ml과 함께 35 mm 디쉬에서 배양하였다. 37 ℃, 5% CO2에서 12~14일 동안 배양한 후, 도립 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 BFU-E 콜로니 숫자를 측정하여 그 결과를 도 3(B)에 나타내었다.
(7) IDB 에 의한 PKC 활성화 시그널링 분석을 위한 웨스턴 블럿 ( WB ) 수행
PKC-α, PKC-δ, 또는 PKC-ε의 세포막으로의 EPO 또는 IDB-유도된 위치 이동을 하기와 같이 WB으로 분석하였다. EPO-고갈 UT-7/EPO 세포(2 × 106 세포)를 100 mm 플레이트에 제조하고, EPO(3 IU/ml), IDB(3 μM), IGN(3 μM), 또는 운반체로 24시간 동안 처리하였다. 키트(MEM-per plus membrane protein extraction kit, Thermo Scientific, IL, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 막 단백질 및 세포질성 단백질을 제조하였다. 각 시료로부터 30 μg의 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에 전기영동시키고 PVDF 막(Millipore, MA, USA)으로 옮겼다. 단백질 포함 막을 완충액(superblock T20 blocking buffer, Thermo Scientific)을 사용하여 블록시킨 후, 항-PKC-α 항체(Santa Cruz Biotechnology), 항-PKC-δ(Cell signaling, MA, USA), 또는 항-PKC-ε(Cell signaling)로 탐침(probe)하였다. 1차 항체를 5% 탈지유(skim milk, BD science) 포함 TBS 및 0.1% 트윈 20(Sigma-Aldrich) 중에 1:500 또는 1:1000으로 희석하였다. 화학발광에는 항-마우스 IgG HRP-컨쥬게이션된 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology) 및 시약(Super Signal West Pico Luminal/Enhancer solution, Pierce, IL, USA)을 사용하였다. 화학발광영상분석처리장치(chemidoc XRS+ system, Bio-rad, CA, USA)을 사용하여 모든 밴드를 검출하여 그 결과를 도 3(C)에 나타내었다.
(8) PKC 억제제에 의한 EPO 또는 IBD 활성 억제 분석을 위한 생물학적 평가
PKC 억제제에 의한 EPO 또는 IDB의 UT-7/EPO 세포 증식 활성의 억제를 측정하였다. Go6976(Calbiochem, NJ, USA) 또는 비스인돌릴말레이미드(BIM, Merck, Germany)를 10 μM 저장 용액(stock)으로부터 순차적으로 2배 희석하여 세포에 첨가하였다. CO2 인큐베이터에서 30분 인큐베이션한 후에, 상기한 바와 동일한 방법으로 EPO(0.25 IU/ml) 또는 IDB(0.8 μg/ml)에 대하여 UT-7/EPO 세포 생물학적 평가를 수행하여 그 결과를 도 3(D) 및 3(E)에 나타내었다.
(9) PKC -α 및 PKC -ε 와의 IDB 상호작용 분석을 위한 표면 플라스몬 공명( SPR )
IDB 및 인간 PKC-α(Abcam, MA, USA) 또는 PKC-ε(Abcam) 간의 결합 역학을 알아보기 위하여, 측정기기(Biacore T200 model, GE healthcare, NJ, USA)를 사용하여 25 ℃에서 5% DMSO 포함 완충 HBS-ET+(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 트윈-20)으로 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석을 수행하였다. pH 4.0, 4.5, 5.0, 및 5.5에서 10 mM 아세테이트 완충액에서 PKC 동형을 고정시키기 위한 pH 분석을 수행하였다. pH 4.5에서 표준 아민 커플링 방법으로 PKC-α를 CM5 센서 칩 상에 5012 반응 유닛(response unit, RU)까지 고정시키고, PKC-ε를 3356 RU까지 고정시켰다. IDB를 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 및 0.39 μM의 농도에서 20 μl/분 유속으로 45초 동안 PKC 동형-고정된 플로우 셀(flow cell)에 주입하고, 180초 동안 해리되도록 하였다. 소프트웨어(T-200 BIAevaluation software was)를 사용하여 기준값으로 보정하고 친화도 상수(KD)를 측정하여 도 3(F) 내지 3(I)에 나타내었다.
(10) IDB 양의 증가에 의한 EPO 활성 억제 분석을 위한 생물학적 평가
IDB 농도의 증가에 의한 EPO-유도 UT-7/EPO 세포 증식의 억제를 하기와 같이 측정하였다. EPO(1 IU/ml)를 IDB 또는 IGN(5 μg/ml로부터 4배 희석)과 동시-인큐베이션하고, 상기 기재된 바와 동일한 방법으로 UT-7/EPO 세포 생물학적 평가를 수행하여 그 결과를 도 4(B)에 나타내었다.
(11) sEPOR ( soluble EPOR )에 의한 IDB 활성 억제 분석을 위한 생물학적 평가
sEPOR에 의한 EPO-유도 및 IDB-유도 세포 증식의 억제를 알아보았다. UT-7/EPO 세포를 sEPOR(2.5 μg/ml로부터 2배 희석)의 존재 하에서 IDB(0.8 μg/ml) 또는 EPO(0.25 IU/ml)와 배양하고, 상기한 바와 동일한 방법으로 UT-7/EPO 세포 생물학적 평가를 수행하여 그 결과를 도 4(D)에 나타내었다.
(12) IDB 에 의한 sEPOR 에의 EPO 결합 억제 분석을 위한 효소결합 면역흡착 분석( Enzyme - linked immunosorbent assay , ELISA )
sEPOR을 PBS에 1 μg/ml로 희석하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 96-웰 플레이트(96-well Maxisorp Nunc Immunoplate, Nunc, Denmark) 상에 코팅하였다. 자동세척기(Bio-rad)를 사용하여 PBST(0.05% Tween-20 in phosphate buffered saline)로 세척한 후, 플레이트를 PBSA(PBS containing 1% BSA, Sigma-Aldrich)로 1시간 동안 실온에서 블록시켰다. 세척 후, PBSAT(1% BSA and 0.05% Tween-20 in PBS) 중 5 μg/ml EPO 또는 5 μg/ml EPO 및 IDB(25, 50, 100, 또는 200 μg/ml)의 혼합물을 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, PBSAT(1:200)에 희석된 항-EPO 항체(#ab20473, Abcam)를 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, PBSAT(1:2500)에 희석된 토끼 항-마우스 HRP 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 각 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, ABTS 용액(Roche, Germany)을 각 웰에 첨가하고 405 nm 흡광도에서 광학 밀도를 측정하여 그 결과를 도 4(E)에 나타내었다.
(13) sEPOR 에 의한 IDB 또는 EPO 시그널링의 억제를 분석하기 위한 웨스턴 블럿
sEPOR 공동-인큐베이션에 의한 IDB 또는 EPO-유도 ERK1/2 인산화반응의 억제를 웨스턴 블럿(WB)으로 분석하였다. 고갈 처리 UT-7/EPO 세포(2 × 106 세포)를 sEPOR(5 μg/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 5분 동안 EPO(0.25 IU/ml), IDB(0.8 μg/ml), 또는 운반체로 처리하였다. 프로테아제 억제제 칵테일(Fisher, MA, USA) 포함 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich)을 사용하여 총 단백질을 추출하여, 상기한 바와 동일한 방법으로 WB 분석을 수행하였다. 1차 항체로서 항-ERK1/2(Thermo Scientific) 및 포스포 (p)-ERK1/2(phospho (p)-ERK1/2, Thermo Scientific)를 사용하였고, 그 측정 결과를 도 4(F)에 나타내었다.
(14) EPO 의 존재 또는 비존재 하에서 EPOR 및 ERK1 /2의 IDB -유도 인산화반응 분석을 위한 WB
고갈 처리 UT-7/EPO 세포(2 × 106 세포)를 EPO(0.25 IU/ml) 존재 또는 부존재 하에서 다수 농도의 IDB(1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 및 0.1 μg/ml)로 5분 동안 처리하였다. 프로테아제 억제제 칵테일(Fisher, MA, USA) 포함 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich)을 사용하여 총 단백질을 추출하여, 상기한 바와 동일한 방법으로 WB 분석을 수행하였다. 1차 항체로서 항-EPOR(Santa Cruz Biotechnology), p-EPOR(Santa Cruz Biotechnology), ERK1/2, 및 p-ERK1/2를 사용하였고, 그 측정 결과를 도 4(G)에 나타내었다.
(15) JAK -2의 IDB -유도 인산화반응 분석을 위한 WB
고갈 처리 UT-7/EPO 세포(2 × 106 세포)를 EPO(1, 0.25, 또는 0.0625 IU/ml), IDB(1.6, 0.4, 또는 0.1 μg/ml), 또는 IGN(1.6, 0.4, 또는 0.1 μg/ml)으로 5분 동안 처리하였다. 프로테아제 억제제 칵테일(Fisher, MA, USA) 포함 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich)을 사용하여 총 단백질을 추출하여, 상기한 바와 동일한 방법으로 WB 분석을 수행하였다. 1차 항체로서 항-JAK-2(세포 시그널링) 및 p-JAK-2(세포 시그널링)을 사용하였고, 그 측정 결과를 도 4(H)에 나타내었다.
(16) sEPOR 에 대한 IDB 결합 분석을 위한 SPR
IDB 및 인간 sEPOR 간의 상호작용을 분석하기 위하여, 10 mM 아세테이트 완충액에서 재조합 sEPOR을 고정시키기 위한 pH 분석을 pH 4.0, 4.5, 5.0, 및 5.5에서 수행하였다. pH 5.0에서 표준 아민 커플링 방법으로 sEPOR를 CM5 센서 칩 상에 1612 RU 까지 고정시켰다. IDB를 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 및 0.39 μM의 농도에서 20 μl/분 유속으로 45초 동안 sEPOR-고정된 플로우 셀에 주입하고, 180초 동안 해리되도록 하여 그 결과를 도 4(I) 내지 4(J)에 나타내었다.
2. 결과
(1) 세포 및 마우스 모델에서 IDB 의 EPO 유사 특성 확인
천연물 라이브러리의 스크리닝 결과, IDB가 EPO-의존적 세포주인 UT-7/EPO의 유도 증식 활성을 가짐을 확인하였다(도 1A 참조). IDB 및 IGN은 포볼 관련 디테르페노이드이고, IDB는 PKC-ε 활성화제로 알려져 있으며 IGN는 PKC-ε 및 PKC-δ의 약한 활성화제이다. IGN는 IDB와 동일한 모핵 구조를 가지지만 UT-7/EPO 증식을 유도하지 않는 것으로 확인되었다(도 1B 참조). IDB는 EC50 0.27 μg/ml(485 nM)으로 용량-의존적으로 UT-7/EPO 세포 증식을 촉진시켰으며(도 1B 참조), IDB의 최대 효과는 EPO의 약 70%로 측정되었다. 또한, IDB-유도 인간 골수 CD34+ 전구 세포의 증식을 평가한 결과, IDB 또한 EPO와 유사하게 1차 CD34+ 세포의 증식을 증가시켰다(도 1C 참조).
또한, IDB 외의 화합물에 대하여 UT-7/EPO 세포 증식에 미치는 용량-의존적 강화 효과 또는 UT-7/EPO 세포 증식에서의 광학밀도(OD)를 측정한 결과, 2-[(2-펜틸시클로프로필)메틸]시클로프로판옥타노익 에시드(FR236924)는 UT-7/EPO 세포 증식에 영향을 미치지 않은 반면에, 인제놀 3-안젤레이트(PEP005)는 EPO와 유사한 농도에서 UT-7/EPO 세포 증식 촉진 효과를 나타냈다. 또한, 12-데옥시포볼 13-아세테이트, 및 12-데옥시포볼 13-페닐아세테이트 20-아세테이트도 높은 광학밀도(OD)를 나타내어, UT-7/EPO 세포 증식 촉진 효과가 있음을 확인하였다.
5-플루오로우라실(5-FU)-유도 빈혈 모델에서 IDB의 활성 여부를 알아본 결과, 12 및 20일에 IDB 처리에 의하여 5-FU-유도 빈혈이 완화되었고(도 2A, 2C, 및 2E 참조), 이는 운반체 처리군과 비교하여 적혈구(RBC) 헤마토크릿(HCT), 및 헤모글로빈(Hb) 수준의 현저한 증가로 확인할 수 있다(도 2B, 2D, 및 2F 참조). IDB는 또한 16일차에 망상적혈구(RET)를 증가시켰다(도 2G 및 2H 참조).
(2) EPO 에 대한 IDB 의 상승적 및 길항적 효과
EPO 및 IDB의 활성이 협동적 또는 경쟁적인지 알아보기 위하여, 불포화 농도인 EPO 0.08 IU/ml 및 IDB 0.08 μg/ml의 혼합물(도 3A 참조), 또는 포화 농도인 EPO 1.25 IU/ml 및 IDB 1.25 μg/ml의 혼합물(도 4A 참조)을 사용하여 생물학적 평가를 수행하였다. 불포화 농도에서 IDB 및 EPO는 UT-7/EPO 세포 증식을 상승적으로 자극했지만(도 3A 참조), 포화 농도에서 IDB는 IDB 단독으로 처리한 경우와 유사한 수준으로 EPO 활성을 억제하였다(도 4A 참조).
농도-고정된 EPO(1 IU/ml) 및 순차적으로 희석된 IDB의 혼합물로 실험한 결과를 도 4B에 나타내었다. EPO 활성은 IDB에 의하여 용량-의존적 방식으로 하향조절되었으나, IDB 자체의 활성은 유지되었다(도 4B 참조).
유사하게, EPO 및 IDB 간의 상승적(도 3B 참조) 또는 길항적 활성(도 4C 참조)을 생체외(ex vivo) 분석으로 알아보았다. 0.003 μg/ml의 IDB 단독으로는 인간 골수 CD34+ 세포의 적혈구 콜로니(BFU-E)로의 분화를 자극할 수 없지만, EPO 활성을 현저히 상승화시켰다(도 3B 참조). 반대로, 0.1 μg/ml의 IDB는 EPO-유도 BFU-E 콜로니 형성(도 4C 참조)을 억제하였다. IDB의 EPO에 대한 분화 작용을 좀 더 상세하기 알아보기 위하여, 기저 기전을 연구하였다.
(3) 불포화 농도에서 PKC 에 대한 직접적 결합을 통한 EPO 와 IDB 의 상승적 효과
PKC 동형의 활성화 및 막 위치 이동에 미치는 IDB의 효과를 UT-7/EPO 세포에서 알아보았다(도 3C 참조). PKC-α, PKC-δ, 및 PKC-ε는 IDB-처리 세포에서 막 분획으로 위치 이동하였고 EPO는 PKC-δ 및 PKC-ε를 약간 활성화시켰다. IGN 처리에 의하여는 PKC는 영향받지 않았다. IDB 또는 EPO-매개 UT-7/EPO 세포 증식에 대한 전통적인 PKC 억제제의 효과를 확인하였다(도 3D 및 3E 참조). EPO-유도 세포 증식은 PKC-α 및 PKC-β 억제제인 Go6976에 의하여 용량-의존적 방식으로 거의 완전히 차단되었지만, IDB-유도 세포 증식은 부분적으로 차단시켰다(도 3D 참조).
광범위 PKC 억제제인 비스인돌릴말레이미드(Bisindolylmaleimide, BIM)를 EPO 또는 IDB-처리 세포에 첨가하였다(도 3E 참조). EPO 및 IDB의 활성은 BIM 처리에 의해 용량-의존적 방식으로 거의 완전히 억제되었으며, IDB 활성이 보다 더 민감하였다(도 3E 참조).
PKC에 대한 IDB의 작용을 보다 상세히 알아보기 위하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 수행하였다(도 3F, 3G, 3H, 및 3I 참조). 정제된 PKC-α 또는 PKC-ε를 CM5 센서 칩의 덱스트란 매트릭스에 공유 결합에 의해 가교시키고, 다수 농도의 IDB를 상기 표면 및 기준 표면으로 통과시켰다. 기준값-보정된 센서그램을 도 3F 내지 도 3I에 나타냈다. IDB는 PKC-α(도 3F 참조) 및 PKC-ε(도 3H 참조)에 유사한 결합 친화도(KD)로 직접적으로 결합하였지만, IGN은 결합하지 않았다(도 3G 및 3I 참조).
(4) IDB 의 EPO 수용체( EPOR )에 대한 직접적 결합을 통한 EPO 와의 경쟁 및 방해 작용 확인
관찰 결과, 비교적 고농도의 IDB는 EPO 활성을 IDB 단독 처리군 수준으로 하향조절하였다(도 4A 및 4B 참조). EPO(1 IU/ml) 및 IDB(고농도) 활성의 대부분은 PKC 표적된 잔류 IDB에 기인하는 것으로 여겨지며, EPOR에 대한 직접적 경쟁을 통하여 EPO 차단에 참여한 IDB에 의한 것은 아닌 것으로 여겨진다.
이를 확인하기 위하여, IDB 관련 활성에 대한 용해성 EPOR의 영향을 조사하였다. IBD의 세포 증식 활성은 sEPOR 공동-인큐베이션에 의해 부분적으로 제한되었으나, EPO 활성은 sEPOR에 의해 거의 완전히 억제되었다(도 4D 참조). sEPOR 공동-인큐베이션에 의한 IDB 활성의 부분적 억제는, IDB가 적어도 2개 분자, 즉, sEPOR 및 PKC에 표적화할 가능성을 시사한다.
IDB가 분자 수준에서 sEPOR에 결합하는데 있어서 EPO와 경쟁하는지 확인하기 위하여, EPO 및 sEPOR 간의 상호작용을 ELISA를 사용하여 분석하였다. EPO 및 sEPOR의 단백질-단백질 상호작용은 용량-의존적 방식으로 EPO 시료에 IDB를 첨가함으로써 실질적으로 파괴되었다(도 4E 참조). 또한, sEPOR은 EPO 또는 IDB에 대한 직접적 결합을 통하여 EPO 및 IDB-유도 ERK1/2 인산화반응을 차단할 수 있는 것으로 여겨진다(도 4F 참조).
IDB가 EPOR에 직접적으로 결합하는 것으로 보이므로, IDB가 내재적 EPOR-관련 시그널링을 자극할 수 있을 것인지 확인하였다. IDB는 ERK1/2 인산화반응을 자극하였으나, EPOR 및 JAK-2 인산화반응은 자극하지 않았다(도 4G 및 4H 참조). IDB에 의해 EPO-유도 EPOR 인산화반응이 차단되는 것(도 4G 참조)과 4.02 × 10-6 M의 KD 값에 의한 IDB 및 EPOR간 특이적 결합 역학이 확인되었으므로(도 4I 및 4J 참조), IDB가 EPO와의 경쟁적인 방식으로 EPOR에 결합하고, EPOR-개시 시그널링 경로는 활성화시키지 않는다고 결론지었다.
요약건대, IDB는 이중 기능, PKC를 통한 EPO-보조적 활성 및 EPOR를 통한 EPO-억제적 활성을 나타냈다. 이는 본 발명에서 IDB의 실질적인 시험관내 효능(EPO의 약 70%) 및 생체내 조혈 활성을 확인함으로써 알 수 있었다. IDB는 전통적인 PKC를 활성화시키는 것으로 보이며, 이는 PKC-α 억제제에 의한 IDB 활성의 부분적 억제(도 3D 참조), 광범위 PKC 억제제에 의한 완전한 억제(도 3E 참조), 및 IDB의 PKC-α 및 PKC-ε와의 물리적 상호작용(도 3F 및 3H 참조)에 의해 확인되었다. 본 발명은 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질인 인제놀 에스테르가 EPOR 표적화와 동시에 길항함을 최초로 밝혔다.

Claims (9)

  1. 인제놀 3,20-디벤조에이트; 인제놀 3-안젤레이트; 12-데옥시포볼 13-아세테이트; 및 12-데옥시포볼 13-페닐아세테이트 20-아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질을 유효성분으로 포함하는, 급성 또는 만성 빈혈, 신장 질환에 의한 빈혈, 신부전에 의한 빈혈, 혈액 질환에 의한 빈혈, 방사선요법-유발 빈혈, 화학요법-유발 빈혈, 수술 과정에 의한 빈혈, 감염에 의한 빈혈, 영양결핍성 빈혈, 비정상적인 적혈구생성, 조산의 초기 빈혈 및 이들의 혼합 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 빈혈(단, EPO 수용체 및 PKC 동시 표적물질이 12-데옥시포볼 13-아세테이트; 또는 12-데옥시포볼 13-페닐아세테이트 20-아세테이트, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 때, 급성 또는 만성 빈혈, 혈액 질환에 의한 빈혈, 방사선요법-유발 빈혈, 화학요법-유발 빈혈, 감염에 의한 빈혈 및 비정상적인 적혈구생성은 제외한다)의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, EPO를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
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