KR101708473B1 - Kit for detecting remained pesticide comprising reversed letter Y shape strip and method for detecting remained pesticide using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 역 Y자 형태의 진단 스트립을 포함하는 잔류농약 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 잔류농약 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a residual pesticide detection kit comprising an inverted Y-shaped diagnostic strip and a residual pesticide detection method using the kit.
화학물질의 개발은 인구 증가와 식량난 등의 문제를 해결하기 위해 많은 발전을 해왔다. 특히 화학물질로 이루어져 있는 농약은 비료의 개발을 시작으로 살충제, 제초제 등 인간생활의 편의와 농작물의 생산량 증가를 위하여 많이 개발되고 발전해왔다. 이로 인하여, 많은 농약이 농작물의 대량생산과 품질 향상을 위하여 다양하게 개발되고 그 사용량이 증가되었으나, 이러한 농약의 편의성과 오남용으로 인하여 화학물질이 인간의 건강과 삶에 해로운 영역까지도 침범하게 되었다. 자연환경의 오염, 해충의 내성 증가, 새로운 해충의 출현 등의 문제를 야기시키고 있으며 현재 알려진 내분비계 교란물질(endocrine disrupting chemicals, EDC)의 다수를 농약으로 인한 화학물질이 차지하고 있다.The development of chemicals has made a lot of progress to solve problems such as population growth and food shortages. In particular, pesticides made of chemical materials have been developed and developed for the convenience of human life such as insecticides and herbicides, and for increasing the production of crops, starting with the development of fertilizers. Therefore, many pesticides have been developed and increased in quantity for the purpose of mass production and quality improvement of crops. However, due to the convenience and abuse of these pesticides, chemical substances have also invaded areas harmful to human health and life. Pollution of the natural environment, increase of pest resistance, appearance of new insect pests, and many of the endocrine disrupting chemicals (EDC) currently known are occupied by pesticide-based chemicals.
이에 세계 각국에서는, 농약 오남용으로 인한 농작물 또는 농산물에 존재하는 농약의 잔류량을 규제 및 강화하게 되었으며 농약의 안정사용기준을 제한함으로써 각국의 국민들의 식품에 대한 안정성을 사전에 지키고 있다.Thus, the rest of the world has regulated and strengthened the residual amount of pesticides present in crops or agricultural products due to abuse of pesticides. By limiting the use standards of pesticides, they are protecting the food safety of each country in advance.
일반적으로 잔류농약의 검출 방법은 액체크로마토그래피(liquid chromatography, LC), 기체크로마토그래피(gas chromatography, GC), 질량분광기(mass spectroscopy, MS) 등 분석 장비를 통해 잔류농약의 허용 농도를 측정한다. 특히 LC와 GC는 검출 감도가 매우 높고 정확하며 많은 성분을 동시에 분석할 수 있는 장점이 있지만 분석 시료의 전처리에 따른 시간이 많이 소비가 되며 전문적인 인력, 고가의 장비, 전처리를 위한 많은 비용 등의 단점이 있어 이러한 단점을 보완하고 발전시키기 위하여 새로운 잔류농약 분석법들이 개발되고 있다.In general, the method of detecting residual pesticides measures the permissible concentrations of pesticide residues through analytical equipment such as liquid chromatography (LC), gas chromatography (GC), and mass spectroscopy (MS). In particular, LC and GC are highly sensitive and accurate, and can analyze many components at the same time, but it takes a long time due to preprocessing of the analytical sample and requires a lot of cost for professional manpower, expensive equipments and pretreatment. To overcome these drawbacks, new pesticide analysis methods are being developed.
본 발명자들은 기존에 보고되어 있는 아세틸콜린에스터라제 효소와 그의 기질인 아세틸싸이올콜린 반응에 금 나노입자가 엉기는 특성을 이용하여, 잔류농약을 검출할 수 있는 역 Y자 형태의 스트립을 제조하였다.The inventors of the present invention produced an inverted Y-shaped strip capable of detecting pesticide residues by using the characteristics of aggregation of gold nanoparticles in an acetylcholinesterase enzyme and an acetylthiolcholine reaction, Respectively.
한편, 한국등록특허 제1050421호에는 금 나노입자에 두 종류의 이중 DNA를 고정화하여 효소-면역반응으로 잔류농약을 검출하는 '잔류 농약 검출용 키트 및 이를 이용한 잔류농약 검출방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0046466호에는 아세틸콜린에스터라제로 코팅된 막을 가지는 스트립과 잔류 농약 검출반응을 확인하기 위한 발색용 효소 기질을 포함하는 '아세틸콜린에스터라제를 이용한 잔류 농약 검출용 키트 및 이를 이용한 잔류 농약 검출방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 역 Y자 형태의 진단 스트립을 포함하는 잔류농약 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 잔류농약 검출 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.Korean Patent Registration No. 1050421 discloses a kit for detecting residual pesticides by which two kinds of double DNAs are immobilized on gold nanoparticles to detect residual pesticides by an enzyme-immune reaction and a method for detecting pesticide residues using the kit. Korean Patent Publication No. 2009-0046466 discloses a kit for detecting residual pesticides using acetylcholinesterase comprising a strip having a membrane coated with acetylcholinesterase and a chromogenic enzyme substrate for confirming residual pesticide detection reaction, A residual pesticide detection method using an inverse Y-shaped diagnostic strip of the present invention and a method for detecting pesticide residue using the kit have not been described.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 아세틸콜린에스터라제 효소와 그의 기질 반응물에 금 나노입자가 엉기는 현상을 이용하여 시료 내 잔류농약을 효과적으로 검출할 수 있는 진단 스트립을 개발하고자, 역 Y자 형태의 진단 스트립에 상기 효소-기질 반응물과 금 나노입자의 엉김현상이 최적화로 구현될 수 있는 조건들을 찾음으로써, 본 발명을 완성하였다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a diagnostic strip capable of effectively detecting residual pesticides in a sample using the phenomenon that gold nanoparticles are entangled in an acetylcholine esterase enzyme and a substrate reaction product thereof. In order to develop the present invention, the inventors have completed the present invention by finding conditions in which the enzyme-substrate reactant and gold nanoparticle entanglement phenomenon can be optimally realized in an inverted Y-shaped diagnostic strip.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서로 다른 시료가 투입되도록 분리된 다수개의 시료 처리부(1); 상기 각 시료 처리부의 일측과 연결되며, 시료 처리부를 통과하여 유입된 시료가 이동되는 분리된 다수개의 이동부(2); 상기 다수개의 이동부 일측이 서로 연결되는 연결부(3); 및 상기 연결부와 이어지며, 시료 반응의 결과가 나타나는 반응부(4);가 연결된 구조를 갖는 역 Y자 형태의 진단 스트립을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a sample processing apparatus comprising: a plurality of sample processing units (1) separated so that different samples are injected; A plurality of separated moving parts (2) connected to one side of each of the sample processing parts, through which the introduced sample passes through the sample processing part; A connection part (3) connecting one side of the plurality of moving parts to each other; And a reaction part (4) connected to the connection part and showing a result of a sample reaction are connected to each other.
또한, 본 발명은 상기 역 Y자 형태의 진단 스트립을 포함하는 잔류농약 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting pesticide residues comprising the above-described inverted Y-shaped diagnostic strip.
또한, 본 발명은 상기 잔류농약 검출용 키트를 이용한 시료 내 잔류농약 검출 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting residual pesticide residues in a sample using the residual pesticide detection kit.
본 발명의 역 Y자 형태의 진단 스트립은 비색용 물질을 사용하지 않고 금 나노입자의 엉김 현상을 이용하여 시료 내 잔류농약을 진단하는 것으로, 분광광도계 등의 분석기를 이용하지 않고 간단하게 잔류농약 유무를 진단할 수 있어 시간을 절약할 수 있으며 휴대가 간편한 형태로 현장에서 사용하기 편리한 장점이 있고 간단한 정량까지 할 수 있어, 추후 식품 및 환경 모니터링 분야에서 바이오센서로 유용하게 이용될 것으로 사료된다.The inverse Y-shaped diagnostic strip of the present invention diagnoses pesticide residues in the sample by using the phenomenon of aggregation of gold nanoparticles without the use of a coloring material, and it can be easily detected without using an analyzer such as a spectrophotometer It is possible to save time and it is convenient to use in the field because it is convenient to use in the field and it can be easily quantified and it will be usefully used as a biosensor in future food and environmental monitoring fields.
도 1은 본 발명의 역 Y자 형태의 진단 스트립의 평면도이다.
도 2는 본 발명의 역 Y자 형태의 진단 스트립을 포함하는 잔류농약 검출용 키트의 분해사시도이다.
도 3은 본 발명의 잔류 농약 검출을 위한 스트립 형태 및 구성도를 나타낸 것으로, a)는 실제 스트립을 제작하여 케이스에 적용했을 시의 모습이며, b)는 실제 스트립 구성 상태를 나타낸 것이며, c)는 농약에 의해 효소 아세틸싸이올콜린 에스터라제가 억제되지 않았을 때 금 나노입자가 "A"로 표시된 역 Y 형태의 스트립 꼭지점으로부터 엉기는 것을 나타낸 모식도이며, d)는 실제 농약 검출 유무를 테스트한 결과를 나타낸 도식이다.
도 4는 잔류 농약 검출을 위한 스트립 센서를 이용한 실험 과정의 도식이다.
도 5는 역 Y자 스트립의 다양한 채널 각도에 따른 금 나노입자의 엉김현상 정도를 확인한 결과이다. Type 1=180°; Type 2=180°; Type 3=120°; Type 4=104°; Type 5=90°; Type 6=80°; Type 7=72°; Type 8=64°; Type 9=60°.
도 6은 니트로셀룰로스 멤브레인의 공극(pore) 크기에 따른 금 나노입자의 엉김현상을 확인한 결과이다.
도 7은 잔류 농약 검출을 위한 스트립 센서에서 아세틸콜린에스터라제 효소 사용양 최적화를 위해, 농약 처리(A)와 무처리(B) 조건에서 다양한 농도의 효소 처리에 따른 금 나노입자의 엉김 정도를 확인한 결과이다.
도 8은 최적화된 조건을 이용하여 실제 역 Y자의 교차로에서 금 나노입자의 엉김현상을 광학현미경을 통해 확인한 사진이다.
도 9는 말라옥손의 농도별 민감도 실험 결과이다.
도 10은 시마진의 농도별 민감도 실험 결과이다.
도 11은 아트라진의 농도별 민감도 실험 결과이다.
도 12는 시아나진의 농도별 민감도 실험 결과이다.
도 13은 EPN, 카보퓨란 및 디클로르보스에 대한 기준치 농도(100ppb)에 대해 추가 실험을 실시한 결과이다. pesticide free: 농약 무처리 대조군.Figure 1 is a top view of an inverted Y-shaped diagnostic strip of the present invention.
2 is an exploded perspective view of a residual pesticide detection kit comprising an inverted Y-shaped diagnostic strip of the present invention.
FIG. 3 is a view showing a strip form and a constitutional diagram for detecting residual pesticides according to the present invention, wherein a) is an actual strip manufactured and applied to a case, b) shows an actual strip configuration, and c) Is a schematic diagram showing that when the enzyme acetyl thiolcholene esterase is not inhibited by the pesticide, the gold nanoparticles are entangled from the vertex of the inverted Y-shaped strip marked "A", and d) Fig.
4 is a schematic of an experimental procedure using a strip sensor for detecting pesticide residues.
FIG. 5 is a graph showing the degree of entrapment of gold nanoparticles according to various channel angles of an inverse Y-shaped strip.
FIG. 6 shows the result of confirming the entanglement of gold nanoparticles according to the pore size of the nitrocellulose membrane.
FIG. 7 is a graph showing the degree of aggregation of gold nanoparticles according to enzymatic treatment at various concentrations in pesticide treatment (A) and no treatment (B) conditions for optimizing the amount of acetylcholinesterase enzyme used in a strip sensor for detecting pesticides The result is confirmed.
FIG. 8 is a photograph showing an aggregation phenomenon of gold nanoparticles in an actual inverted Y-shaped intersection through an optical microscope using optimized conditions.
FIG. 9 shows the sensitivity test results of the concentration of malaxone.
Fig. 10 shows the sensitivity test results of each concentration of simajin.
11 shows the sensitivity test results of atrazine concentration.
Fig. 12 shows the sensitivity test results of each concentration of cyanazine.
Figure 13 shows the results of further experiments on the reference concentration (100 ppb) for EPN, carbofuran and dichlorvos. pesticide free.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the object of the present invention,
서로 다른 시료가 투입되도록 분리된 다수개의 시료 처리부(1);A plurality of
상기 각 시료 처리부의 일측과 연결되며, 시료 처리부를 통과하여 유입된 시료가 이동되는 분리된 다수개의 이동부(2);A plurality of separated moving parts (2) connected to one side of each of the sample processing parts, through which the introduced sample passes through the sample processing part;
상기 다수개의 이동부 일측이 서로 연결되는 연결부(3); 및A connection part (3) connecting one side of the plurality of moving parts to each other; And
상기 연결부와 이어지며, 시료 반응의 결과가 나타나는 반응부(4);가 연결된 구조를 갖는 역 Y자 형태의 진단 스트립을 제공한다.Y-shaped diagnostic strip having a structure in which a reaction part (4) connected to the connection part and showing a result of a sample reaction is connected.
도 1에 개시한 바와 같이, 본 발명의 역 Y자 형태의 진단 스트립에서 상기 시료 처리부(1)는 각기 다른 시료가 들어있는 용액에 시료 처리부를 직접 담그거나, 시료를 떨어뜨려 시료가 투입되도록 하는 부위이며; 상기 이동부(2)는 투입된 시료가 시료 처리부를 통화하여 이동되는 부위이다.As shown in FIG. 1, in the inverted Y-shaped diagnostic strip according to the present invention, the
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 진단 스트립에 있어서, 시료 처리부와 이동부의 개수는 각각 2개 또는 그 이상일 수 있고, 바람직하게는 각각 2개의 시료 처리부 및 이동부로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the diagnostic strip according to an embodiment of the present invention, the number of the sample processing unit and the moving unit may be two or more, respectively, and preferably two sample processing units and a moving unit may be used, but the present invention is not limited thereto .
또한, 본 발명의 상기 연결부(3)는 이동부의 일측이 60~104°의 각도(θ)로 서로 연결되는 것을 특징으로 한다. 이동부간의 상기 연결 각도(θ)는 본 발명의 역 Y자 진단 스트립의 반응부에서 띠가 확인되는 각도로, 반응결과의 on/off가 명확하게 구분되는 최적화된 각도(θ)는 64°이나, 이에 제한되지 않는다.The connecting
또한, 본 발명의 상기 반응부(4)는 연결부와 이어지는 부위로, 연결부에서 만난 양 방향의 시료들이 반응하여 그 반응물이 이동되면서 시각적으로 상태를 표시하는 띠가 형성되는 부위이다.In addition, the reaction part (4) of the present invention is a site where a sample is visually displayed as a reaction is performed by reacting samples in both directions, which are encountered at a connection part, with a connection part.
또한, 본 발명의 상기 역 Y자 형태의 진단 스트립(9)을 구성하는 시료 처리부(1), 이동부(2), 연결부(3) 및 반응부(4)는 멤브레인 재질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "멤브레인"은 시료 물질이 통과할 수 있는 어떠한 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드(예: 셀룰로스 물질, 종이, 셀룰로스 아세테이트 및 니트로셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO4, 또는 다른 무기미분 물질; 자연 발생(예: 면) 및 합성(예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드; 등의 물질로부터 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 멤브레인은 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 또는 폴리프로필렌일 수 있고, 가장 바람직하게는 니트로셀룰로스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The
또한, 상기 진단 스트립의 반응부는 시료 반응 결과물이 반응부의 길이 방향으로 4cm 길이를 80~100초의 속도로 흘러가게 하는 공극 크기를 갖는 멤브레인 재질일 수 있으며, 보다 바람직하게는 4cm 길이를 90초의 속도로 흘러가게 하는 공극 크기를 갖는 멤브레인 재질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 시료 반응물의 흐름 속도가 80~100초보다 빠르거나 느린 경우에 반응부에서 띠 형성이 용이하지 않을 수 있다.In addition, the reaction part of the diagnostic strip may be a membrane material having a pore size allowing the result of the sample reaction to flow at a rate of 80 to 100 seconds at a length of 4 cm in the longitudinal direction of the reaction part, more preferably 4 cm at a speed of 90 seconds But is not limited to, a membrane material having a pore size that allows it to flow. If the flow rate of the sample reactant is faster or slower than 80 to 100 seconds, the belt may not be easily formed in the reaction part.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 역 Y자 형태의 진단 스트립을 포함하는 잔류농약 검출용 키트를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 상기 잔류농약 검출용 키트는In order to accomplish still another object of the present invention, the present invention provides a kit for detecting residual pesticides comprising an inverted Y-shaped diagnostic strip. Specifically, the residual pesticide detection kit of the present invention comprises
역 Y자 형태의 진단 스트립을 지지하는 하부 기판(6);A lower substrate (6) supporting an inverted Y-shaped diagnostic strip;
상기 하부 기판에 형성되는 역 Y자 형태의 진단 스트립(9);An inverted Y-shaped diagnostic strip (9) formed on the lower substrate;
상기 진단 스트립의 반응부 일부와 맞닿도록 연결된 흡수패드(5); 및An absorbent pad (5) connected to abut a portion of the reaction portion of the diagnostic strip; And
상기 진단 스트립의 반응부를 확인할 수 있는 개구부(8)가 형성되는 상부 기판(7);을 포함하여 구성되는 잔류농약 검출용 키트이다.And an upper substrate (7) on which an opening (8) for confirming a reaction part of the diagnostic strip is formed is a residual pesticide detection kit.
도 2에 개시한 바와 같이, 본 발명의 잔류농약 검출용 키트의 흡수패드(5)는 반응부의 일부와 맞닿도록 연결된 부위로, 역 Y자 형태의 진단 스트립에서 시료의 이동을 위한 유체의 이동력에 시너지를 주기 위해 구성된 것으로, 유체 흡수 기능을 갖는 것을 특징으로 한다.2, the
본 발명의 하부 기판(6)은 상기 역 Y자 형태의 진단 스트립(9)을 지지하는 역할을 하며, 상부 기판(7)은 반응부(4)의 결과를 확인할 수 있도록 중앙에 상하로 관통되어 형성된 개구부(8)가 형성된 것으로, 개구부의 형태는 반응부의 띠를 확인할 수 있는 크기 및 모양이면 어떠한 것으로도 제한되지 않는다.The
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 잔류농약 검출용 키트를 이용한 시료 내 잔류농약 검출 방법을 제공한다. 상기 잔류 농약 검출 방법은 구체적으로는, 잔류농약 함유가 의심되는 시료를 준비하는 단계; 및 본 발명의 잔류농약 검출용 키트에 상기 시료를 처리하여 반응부에서 결과를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.In order to accomplish still another object of the present invention, the present invention provides a residual pesticide detection method using a residual pesticide detection kit. Specifically, the residual pesticide detection method comprises: preparing a sample suspected of containing residual pesticide; And treating the sample with the residual pesticide detection kit of the present invention to confirm the result in the reaction part.
본 발명의 상기 잔류농약은 말라옥손(Malaoxon), 아트라진(Atrazine), 시마진(Simazine), 시아나진(Cyanazine), EPN, 카보퓨란(Carbofuran) 또는 디클로르보스(Dichlorvos)와 같은 유기인계 농약 또는 카바메이트계 농약일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The residual pesticide of the present invention may be an organic pesticide such as Malaoxon, Atrazine, Simazine, Cyanazine, EPN, Carbofuran or Dichlorvos, But is not limited to, a carbamate-based pesticide.
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 잔류농약 검출 방법에 있어서, 상기 잔류농약 검출용 키트의 시료 처리부는 한쪽은 나노입자를, 다른 쪽은 효소, 기질 및 의심시료를 투입할 수 있다.In the residual pesticide detection method according to an embodiment of the present invention, the sample processing unit of the residual pesticide detection kit may be loaded with nanoparticles on one side and enzymes, substrates and suspected samples on the other side.
상기 나노입자는 검출가능한 표지로서 작용하는 나노입자를 의미한다. 상기 나노입자는 바람직하게는 금속의 나노입자이며, 상기 금속으로는 예를 들어, 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 이리듐(Ir), 로듐(Rh), 루테늄(Ru)의 귀금속; 티타늄(Ti), 지르코늄(Zr), 하프늄(Hf), 바나듐(V), 나이오븀(Nb), 탄탈럼(Ta), 크로뮴(Cr), 몰리브데늄(Mo), 텅스텐(W), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os)의 전이금속; 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co) 등의 금속; 산화마그네슘(MgO), 이산화티타늄(TiO2), 오산화바나듐(V2O5), 산화아연(ZnO)의 금속산화물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 나노입자는 가장 바람직하게는 금(Au) 나노입자이다.The nanoparticles mean nanoparticles that act as detectable labels. The nanoparticles are preferably nanoparticles of metal. Examples of the nanoparticles include gold (Au), silver (Ag), platinum (Pt), palladium (Pd), iridium (Ir) , Precious metal of ruthenium (Ru); (Ti), zirconium (Zr), hafnium (Hf), vanadium (V), niobium (Nb), tantalum (Ta), chromium (Cr), molybdenum (Mo), tungsten (Ru) and osmium (Os); Metals such as iron (Fe), nickel (Ni), and cobalt (Co); But are not limited to, metal oxides such as magnesium oxide (MgO), titanium dioxide (TiO 2 ), vanadium pentoxide (V 2 O 5 ), and zinc oxide (ZnO). The nanoparticles are most preferably gold (Au) nanoparticles.
또한, 본 발명의 상기 효소와 기질은 서로 반응하여 그 반응산물이 나노입자와 엉길 수 있는 특징을 가진 것으로, 이에 한정하지 않으나, 예를들면, 상기 효소는 아세틸콜린에스터라제일 수 있고, 기질은 아세틸싸이올콜린일 수 있다. 상기 아세틸콜린에스터라제는 2.0~3.0mU의 농도로 사용할 수 있고, 바람직하게는 2.5mU의 농도로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the enzyme of the present invention reacts with the substrate to cause the reaction product to bind to the nanoparticles. For example, the enzyme may be acetylcholinesterase, Acetylthiocholine. The acetylcholinesterase may be used at a concentration of 2.0 to 3.0 mU, preferably at a concentration of 2.5 mU, but is not limited thereto.
본 발명의 잔류농약 검출 방법은 아세틸콜린에스터라제 효소와 그의 기질인 아세틸싸이올콜린과의 반응물에 금 나노입자가 엉기는 현상을 이용한 것으로서, 검출하고자 하는 시료 내에 농약이 존재하면, 농약이 아세틸콜린에스터라제 효소를 비활성화시켜 효소-기질 반응물이 생성되지 않고, 금 나노입자의 엉김 현상이 발생하지 않기 때문에, 반응부에 어떠한 띠도 나타나지 않으나, 시료 내에 농약이 존재하지 않으면 아세틸콜린에스터라제 효소가 활성화되어 효소-기질 반응물이 생성되고, 금 나노입자의 엉김 현상이 발생하기 때문에, 반응부에 띠가 나타나는 현상을 이용한 것이다.
The residual pesticide detection method of the present invention utilizes the phenomenon that gold nanoparticles are entangled in a reaction product of an acetylcholinesterase enzyme and acetylthiocololine as a substrate thereof. When pesticides are present in the sample to be detected, The enzyme-substrate reaction product is not generated and the gold nanoparticle aggregation phenomenon does not occur, so that no band appears on the reaction part. However, if there is no pesticide in the reaction part, the acetylcholine esterase The enzyme is activated to produce an enzyme-substrate reaction product, and gold nanoparticles are entangled, so that a band appears in the reaction part.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
재료 및 방법Materials and methods
1. 재료 및 시약1. Materials and reagents
니트로셀룰로스 멤브레인 HF075, HF090, HF120, HF180 및 HF240은 Millipore(미국)에서, 아세틸콜린에스터라제(AChE)와 아세틸싸이올콜린( acethylthiolcholine)은 Sigma(미국)에서, 20nm 금 나노입자는 BBE(영국)에서, 말라옥손(Malaoxon), 아트라진(Atrazine), 시마진(Simazine), 시아나진(Cyanazine), EPN, 카보퓨란(Carbofuran) 및 디클로르보스(Dichlorvos)는 Sigma에서 구입하여 사용하였다.The nitrocellulose membranes HF075, HF090, HF120, HF180 and HF240 were purchased from Millipore (USA), acetylcholinesterase (AChE) and acetylthiolcholine from Sigma (USA), 20 nm gold nanoparticles from BBE , Malaoxon, Atrazine, Simazine, Cyanazine, EPN, Carbofuran and Dichlorvos were purchased from Sigma and used.
금 나노입자 엉김에 따른 스트립 상에 형성된 띄는 삼성 NX 200 카메라로 이미지를 촬영하였고, 분석은 Image J 프로그램(http://imagej.nih.gov/ij/)을 사용하였다.
Images were taken with a Samsung NX 200 camera, which was formed on the strip due to the aggregation of gold nanoparticles. The image was analyzed using the Image J program (http://imagej.nih.gov/ij/).
2. 역 Y자 형태의 테스트 스트립의 제조2. Manufacture of inverted Y-shaped test strips
역 Y자 형태의 스트립은 최근 보고된 Tear-off 기법을 이용하여 제작하였다(Lab Chip, 2015, 15, 3006-3012). 그 방법은 Craft-cutter기를 이용하여 A4 종이를 패터닝(patterning)하고 패터닝 된 A4 종이를 니트로셀룰로스를 녹일 수 있는 유기용매에 적용하고, 적용된 A4 종이를 스탬프처럼 이용하여 니트로셀룰로스 막에 적용시킨 후 건조하고 A4 종이를 제거하여 완료하였다.The inverted Y-shaped strip was fabricated using the recently reported tear-off technique (Lab Chip, 2015, 15, 3006-3012). A4 paper is patterned using a Craft-cutter machine, the patterned A4 paper is applied to an organic solvent capable of dissolving nitrocellulose, the applied A4 paper is applied to a nitrocellulose membrane as a stamp, and dried And A4 paper was removed.
다음 과정으로는 역 Y자 형태의 스트립을 1% 소혈청알부민(BSA)을 이용하여 블록킹하여 비특이적 반응을 억제하였다.
In the next step, the inverted Y-shaped strips were blocked with 1% bovine serum albumin (BSA) to inhibit nonspecific reactions.
3. 농약 분석 방법3. Pesticide analysis method
농약 검출 분석은 최종 제작된 잔류농약 검출용 스트립을 이용하여 수행되었으며, 스트립의 a쪽 가지에는 20nm의 금 나노입자를, b쪽 가지에는 아세틸콜린에스터라제, 아세틸싸이올콜린(ATC) 및 농약을 넣어주고(도 4) 동시에 흘려주어 금 나노입자 엉김 유무를 확인하였다.
The pesticide detection analysis was carried out using the strips for the final pesticide detection, and 20 nm gold nanoparticles on the a-branch of the strip, acetylcholinesterase (ATC) and pesticide on the b- (Fig. 4) and flowed at the same time to confirm whether gold nanoparticles were entrapped.
실시예 1. 잔류농약 검출을 위한 스트립의 최적화 - 채널 각도Example 1. Optimization of the strip for residual pesticide detection - Channel angle
역 Y자 형태의 스트립에서, 금 나노입자와 효소-기질-시료 반응물이 만나는 곳(채널)의 각도를 다양하게 제조하여 농약 검출 정도를 실험한 결과, 잔류농약 검출용 스트립에 반응선(또는 띠)이 생성되기 위한 조건으로는 채널의 각도가 중요한 영향을 끼친다는 것을 확인할 수 있었다. 다양한 각도의 실험 결과, 60~104°의 각도에서 금 나노입자의 엉김현상을 확인할 수 있었으나, 특히, 64°의 각도에서 금 나노입자의 엉김현상이 크게 발생함을 알 수 있었고, 역 Y자 형태의 스트립 센서의 최적화된 채널 각도는 64°로 결정하였다(도 5).
In the inverted Y-shaped strip, the degree of detection of the pesticide was measured by varying the angle at which the gold nanoparticle and the enzyme-substrate-sample reactant meet (channel). As a result, the reaction pellet As a result, it was confirmed that the angle of the channel had a significant influence on the generation of the channel. As a result of various angles, it was confirmed that gold nanoparticles were entangled at an angle of 60 to 104 °. In particular, gold nanoparticles were entangled at an angle of 64 °, The optimized channel angle of the strip sensor of Fig.
실시예 2. 잔류농약 검출을 위한 스트립의 최적화 - 멤브레인 재질Example 2. Optimization of strip for residual pesticide detection - Membrane material
채널 각도의 결정 후, 멤브레인 재질을 선정하는 실험을 수행하였다. 일반적으로 니트로셀룰로스 멤브레인 스트립은 4cm 길이를 기준으로 유체의 흘러오는 속도에 따라 스트립의 구성을 구분하는 것이 일반적이다. 즉, HF075는 75초에 4cm를 다 적신다는 것을 의미하여, HF240은 240초에 4cm를 다 적신다는 것을 의미한다.After the channel angle was determined, an experiment was performed to select the membrane material. In general, nitrocellulose membrane strips are generally divided into strips according to the flow rate of the fluid with respect to a length of 4 cm. In other words, HF075 means wetting 4cm in 75 seconds, HF240 means wetting 4cm in 240 seconds.
본 발명에서는 HF075, HF090, HF120, HF180 및 HF240을 이용하여 스트립을 제작하여 실험하였다. 그 결과, HF075 및 HF090을 이용하여 제작한 스트립에서 농약 무처리에 따른 반응선(금 나노입자의 엉김현상)이 확인되었으나, HF075를 이용한 스트립에서는 농약을 처리한 경우에도 반응선이 미세하게 나타나는 경향을 보여주어 검출이 제한됨을 확인할 수 있었다(도 6). 결과적으로, 금 나노입자의 엉김현상이 가장 잘 나타나며 on/off 시그널 대비가 최적화된, 4cm를 90초에 완전히 적실 수 있는 능력을 가진 니트로셀룰로스 멤브레인 스트립을 최적화된 멤브레인 재질로 선택하였다(도 6).
In the present invention, strips were fabricated using HF075, HF090, HF120, HF180 and HF240. As a result, reaction lines (gold nanoparticle entrainment phenomenon) were confirmed by the treatment with no pesticide in the strips produced using HF075 and HF090, but the tendency that the reaction lines appeared fine even in the case of treating the pesticides with the strips using HF075 (Fig. 6). As a result, nitrocellulose membrane strips with the ability to fully wet the 4 cm to 90 seconds, with the most noticeable aggregation of gold nanoparticles and optimized on / off signal contrast, were selected as optimized membrane materials (Figure 6) .
실시예 3. 잔류농약 검출을 위한 스트립의 최적화 - 효소 사용양Example 3. Optimization of strips for detection of residual pesticides - Amount of enzyme used
다음으로는 금 나노입자를 엉기게 하는 효소 반응을 유도하는 효소의 사용양에 대한 최적화 실험을 실시하였다. 실험은 금 나노입자 전개 부분에 금 나노입자 1012개를 포함하는 50㎕의 용액을 전개하였고, 효소 반응이 일어나는 부분에서는 분해 후 엉기게 하는 기질인 아세틸싸이올콜린 100uM을 고정하여 아세틸콜린에스터라제를 0, 1.25, 2.5, 5, 7.5, 10, 100 및 1,000mU의 다양한 농도로하여 말라옥손 100ppb을 처리한 후, 나타나는 반응선의 강도를 분석하였다.Next, an optimization experiment was conducted on the amount of enzyme used to induce the enzyme reaction that entangled the gold nanoparticles. In the experiment, 50 μl of a solution containing 10 12 gold nanoparticles was developed in a gold nanoparticle development portion. In the portion where the enzyme reaction occurred, 100 μM of acetylthiocholine, which is a substrate to decompose after decomposition, was fixed and acetylcholinesterase After treating 100 ppb of malaxone at various concentrations of 0, 1.25, 2.5, 5, 7.5, 10, 100 and 1,000 mU, the intensity of the reaction line was analyzed.
그 결과, 말라옥손 100ppb가 적용된 경우, 아세틸콜린에스터라제가 2.5mU 이하일 때 농약에 의해 효소가 비활성화되어 기질을 분해하지 못하고 금 나노입자가 엉기지 않는 것을 확인할 수 있었고(도 7A), 농약을 적용하지 않은 경우에는 효소가 활성화되어 어떠한 농도에서도 금 나노입자가 엉김을 확인할 수 있었다(도 7B). 이에, 본 발명에서는 잔류농약 검출을 위한 스트립에 적용할 최적의 효소 양을 2.5mU으로 선정하였다.
As a result, it was confirmed that when 100 ppb of malaxone was used, when the acetylcholine esterase was less than 2.5 mU, the enzyme was inactivated by the pesticide and the substrate could not be decomposed and the gold nanoparticles could not be entrapped (Fig. 7A) The enzyme was activated and it was confirmed that the gold nanoparticles were aggregated at any concentration (FIG. 7B). Thus, in the present invention, the optimum amount of enzyme to be applied to the strip for detecting pesticide residues was selected as 2.5 mU.
실시예 4. 최적화된 조건으로 제작된 잔류농약 검출 스트립의 농약 검출 분석Example 4. Pesticide detection analysis of residual pesticide detection strips produced under optimized conditions
상기의 실시예들을 통해 최적화한 조건(채널각도 64°, HF090, 효소양 2.5mU)으로 제작된 역 Y자 형태의 잔류농약 검출 스트립 센서를 이용하여, 말라옥손 100ppb를 적용시킨 센서와 적용시키지 않은 센서의 결과를 광학현미경(Olympus BX43, Olympus, 미국)으로 확인하였다.Using the inverted Y-shaped residual pesticide detection strip sensor fabricated with optimized conditions (channel angle 64 °, HF090, enzyme amount 2.5mU), the sensor with 100 ppb of malaxone and the sensor The results of the sensor were confirmed with an optical microscope (Olympus BX43, Olympus, USA).
그 결과, 도 8에서 보여지는 것처럼, 말라옥손을 처리한 스트립 센서에서는 금 나노입자의 엉김이 발생하지 않아 반응선이 나타나지 않음을 관찰할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 8, it was observed that in the strip sensor treated with malaxone, no aggregation of gold nanoparticles occurred and no reaction line appeared.
실시예 5. 잔류농약 검출 스트립의 농약 검출 민감도 분석Example 5. Sensitivity analysis of pesticide detection of residual pesticide detection strips
최적화된 조건으로 제작된 잔류농약 검출 스트립을 다양한 종류의 농약으로 테스트하여 검출 민감도를 확인하였다. 사용한 농약은 말라옥손, 시마진, 아트라진 및 시아나진이며, 각 농약은 기준치 농도 미만까지의 농도로 하여 실험을 실시하였다. 일반적으로 농약의 경우, 한국식품의약품안전처(KFDA)의 기준이 100~500ppb이다.The detection sensitivity of the residual pesticide detection strip fabricated under optimized conditions was tested with various kinds of pesticides. The pesticides used were malaxone, simajin, atrazine, and cyanazine, and the concentrations of each pesticide were adjusted to the concentration below the reference value. In general, for pesticides, Korea Food and Drug Administration (KFDA) standard is 100-500 ppb.
말라옥손, 시마진, 아트라진 및 시아나진을 0, 10ppb, 50ppb, 100ppb, 1ppm, 10ppm 및 100ppm의 농도로 처리하고 스트립 상에서 금 나노입자의 엉김현상을 관찰한 결과, 본 발명의 스트립이 상기 4 종류의 농약에 대해 모두 기준치 미만의 농도(50ppb)까지도 분명하게 구분할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 9 내지 도 12).As a result of observing the aggregation phenomenon of gold nanoparticles on the strips, it was found that the strips of the present invention exhibited the above four types of strips, (50 ppb) lower than the reference value can be clearly distinguished for the pesticide of the present invention (Figs. 9 to 12).
또한, 상기 농약 외 추가로 3종(EPN, 카보퓨란 및 디클로르보스)에 대한 100ppb 농도 적용 실험 결와에서도 금 나노입자의 엉김 현상이 확인되지 않음을 확인할 수 있었다(도 13).
In addition, it was confirmed that gold nanoparticles aggregation phenomenon was not observed even at the concentration of 100 ppb concentration test on three kinds of the pesticides (EPN, carbofuran and dichlorvos) (FIG. 13).
실시예 6. 농약 첨가 농작물 시료에서의 잔류농약 검출 분석Example 6 Analysis of Residual Pesticide Detection in Agricultural Crops Containing Pesticides
보다 실제적인 발명 검증을 위하여 실제 시료인 상추에 농약을 적용하여 본 발명의 잔류농약 검출 스트립의 농약 검출 유무를 테스트하였다. 분무기를 이용하여 말라옥손을 각 농도별로 상추에 적용시킨 후 6시간 흐른 뒤에 시료를 각 1g씩 절편하여 에틸알코올을 이용하여 부유한 후 부유액을 이용하여 스트립에 적용시켰다.In order to verify a more practical invention, pesticide was applied to lettuce, which is an actual sample, to test whether or not the pesticide detection strip of the present invention was detected. After 6 hours, malachoxone was applied to the lettuce at each concentration using an atomizer. The sample was sliced at 1 g each, suspended in ethyl alcohol, and applied to the strip using a supernatant.
그 결과 아래 표 1에서 확인할 수 있듯이, HPLC(Ultimate 3000, Thermo scientific, 미국)를 이용한 잔류농약의 검출법과 비교하여도 해당 결과에 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Table 1 below, it was confirmed that there was no difference in the results compared with the detection method of residual pesticides using HPLC (Ultimate 3000, Thermo scientific, USA).
1: 시료 처리부 2: 이동부
3: 연결부 4: 반응부
5: 흡수패드 6: 하부 기판
7: 상부 기판 8: 개구부
9: 진단 스트립1: sample processing unit 2: moving unit
3: connection part 4: reaction part
5: Absorption pad 6: Lower substrate
7: upper substrate 8: opening
9: Diagnostic Strip
Claims (8)
상기 각 시료 처리부의 일측과 연결되며, 시료 처리부를 통과하여 유입된 시료가 이동되는 분리된 다수개의 이동부(2);
상기 다수개의 이동부 일측이 서로 연결되는 연결부(3); 및
상기 연결부와 이어지며, 시료 반응의 결과가 나타나는 반응부(4);가 연결된 구조를 갖는 역 Y자 형태의 진단 스트립으로서,
상기 반응부(4)의 재질이 시료 반응 결과물이 반응부의 길이 방향으로 4cm 길이를 80~100초의 속도로 흘러가게 하는 공극 크기를 갖는 멤브레인인 것을 특징으로 하는 역 Y자 형태의 진단 스트립.A plurality of sample processing units 1 separated so that different samples are injected;
A plurality of separated moving parts (2) connected to one side of each of the sample processing parts, through which the introduced sample passes through the sample processing part;
A connection part (3) connecting one side of the plurality of moving parts to each other; And
Y-shaped diagnostic strip having a structure in which a reaction part (4) connected to the connection part and showing a result of a sample reaction is connected,
Characterized in that the material of the reaction part (4) is a membrane having a pore size which causes the result of the reaction of the sample to flow at a rate of 80 to 100 seconds at a length of 4 cm in the longitudinal direction of the reaction part.
역 Y자 형태의 진단 스트립을 지지하는 하부 기판(6);
상기 하부 기판에 형성되는 역 Y자 형태의 진단 스트립(9);
상기 진단 스트립의 반응부 일부와 맞닿도록 연결된 흡수패드(5); 및
상기 진단 스트립의 반응부를 확인할 수 있는 개구부(8)가 형성되는 상부 기판(7);을 포함하여 구성되는 잔류농약 검출용 키트.The pesticide residue detecting kit according to claim 4,
A lower substrate (6) supporting an inverted Y-shaped diagnostic strip;
An inverted Y-shaped diagnostic strip (9) formed on the lower substrate;
An absorbent pad (5) connected to abut a portion of the reaction portion of the diagnostic strip; And
And an upper substrate (7) having an opening (8) for confirming a reaction part of the diagnostic strip.
제4항의 잔류농약 검출용 키트에 상기 시료를 처리하여 반응부에서 결과를 확인하는 단계를 포함하는, 시료 내 잔류농약의 검출 방법.Preparing a sample suspected of containing pesticide residues; And
A method for detecting pesticide residues in a sample, comprising the step of treating the sample with the residual pesticide detection kit of claim 4 and confirming the result in the reaction part.
7. The method according to claim 6, wherein the sample treating unit of the residual pesticide detection kit is charged with nanoparticles on one side and enzyme, substrate and suspected sample on the other side.
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