KR101707055B1 - 합주파수 생성을 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경 및 이의 용도 - Google Patents

합주파수 생성을 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 합주파수 생성 현상을 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 현미경은 3차원 이미지 및 결맞음 반스톡스 라마산란 이미지를 동시에 얻을 수 있고, 표지를 이용한 염색법이 통하지 않는 경우에 합주파수 생성을 이용하여 별도의 형광 표지나 전자의 진동과 같은 요인이 개제되지 않은 상태로 관찰할 수 있으며, 표지를 이용하지 않기 때문에 반복적으로 탈색없이 관찰할 수 있고, 3차원 구조를 단면별로 분석할 수 있기 때문에 한 지점에서 외피와 내장 부근을 나누어서 관찰할 수 있으며, 진동수를 선택적으로 이미징할 수 있고, 두 입사파의 극성 방향을 조절할 수 없는 다른 분석법에 비해 두 입사파의 극성 방향을 조절 가능하여, 그 정도를 조절하여 시료의 상태에 따라 최적의 이미지를 얻을 수 있으므로, 본 발명의 무표지 3차원 이미징 현미경은 살아있는 곤충의 근육 관찰, 예쁜 꼬마 선충의 다른 근육 기관인 외음부(vulva)나 항문(anus)와 같은 부위 근육에 대한 무표지 관찰, 노화에 따른 근육 변화 관찰, 미세 유체 공학(microfluidics)과의 접목을 통해 살아있는 상태에서의 관찰 및 인간의 근육 관련 질환 원인 유전자들의 기능 연구, 또한 이러한 이미징 기술의 고등 동물 적용에 이용할 수 있다.

Description

합주파수 생성을 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경 및 이의 용도{label-free three-dimensional imaging microscope using a sum frequency generation and use thereof}
본 발명은 합주파수 생성 현상을 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경 및 이의 용도에 관한 것이다.
생명과학의 발달에 따라 생존에 직접적으로 관련된 암과 같은 질병극복 뿐 아니라 삶의 질을 높일 수 있는 노화에 관한 연구로 그 범위가 점차적으로 넓어지고 있고 그에 따라 인간유전자의 조작을 살아있는 생명체에 적용함에 있어 짧은 시간에 결과를 판단할 수 있는 간단한 표준 동물의 필요성이 강조되고 있는 실정이다.
이에, 초파리나 예쁜 꼬마 선충과 같이 실험적으로 접근이 용이한 동물 모델이 많이 이용되고 있는 실정이며, 특히, 예쁜 꼬마 선충은 2~3주에 이르는 짧은 수명으로 인해 노화연구에 최적 동물로 알려져 있다. 또한, 예쁜 꼬마 선충의 뛰어난 운동성은 인간의 유전적 요인에 의한 근육관련 질병연구에 탁월한 표준 동물로 그 효용성이 일찍이 입증이 되어 수많은 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있는 실정이다.
하지만, 기존의 근육관련 이미징 기술은 독성이 있는 형광염료를 기반으로 하기 때문에 엄격히 독성이 없는 대사를 연구해야 할 경우 방해 요인이 되기가 쉽다. 또한, 유전적으로 발생시킨 표지물질인 녹색형광단백질(GFP)을 이용할 경우 크기가 상대적으로 큰 물질에 대한 이미징 기술을 기반으로 하고 있어서 규명하고자 하는 생명관련 인자의 크기가 그것보다 작은 경우에는 분석에 한계점이 노출되는 경우가 있어 근본적으로 이러한 형광표지 없이 예쁜 꼬마 선충 내의 근육분포를 잘 이미징 할 수 있는 기술이 매우 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 극복하기 위해 연구하던 중, 합주파수 생성을 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경이 3차원 이미지 및 결맞음 반스톡스 라마산란 이미지를 동시에 얻을 수 있고, 표지를 이용한 염색법이 통하지 않는 경우에 별도의 외부 염료나 유전적으로 발현되는 형광 단백질과 같은 형광 표지 및 전자의 진동과 같은 요인이 개제되지 않은 상태로 관찰할 수 있으며, 표지를 이용하지 않기 때문에 반복적으로 탈색없이 관찰할 수 있고, 3차원 구조를 단면별로 분석할 수 있기 때문에 한 지점에서 외피와 내장 부근을 나누어서 관찰할 수 있으며, 두 입사파의 파장 차이가 관찰하고자 하는 고유분자 진동수와 일치할 경우 그 진동수를 선택적으로 이미징할 수 있고, 두 입사파의 극성 방향을 조절할 수 없는 다른 분석법에 비해 두 입사파의 극성 방향을 조절 가능하여, 그 정도를 조절하여 시료의 상태에 따라 최적의 이미지를 얻을 수 있으므로, 상기 무표지 3차원 이미징 현미경을 살아있는 곤충의 분자 진동에 민감한 근육 관찰, 예쁜 꼬마 선충의 다른 근육 기관인 외음부(vulva)나 항문(anus)와 같은 부위 근육에 대한 무표지 관찰, 노화에 따른 근육 변화 관찰, 미세 유체 공학(microfluidics)과의 접목을 통해 살아있는 상태에서의 관찰 및 인간의 근육 관련 질환 원인 유전자들의 기능 연구, 또한 이러한 이미징 기술의 고등 동물 적용에 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 별도의 형광 표지 또는 전자의 진동이 필요없는 합주파수 생성파를 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경 및 이를 이용한 곤충의 근육 조직을 관찰하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 두 개의 펨토초(femtosecond, fs) 펄스 레이저를 출사하는 광원부;
광원부에서 출사되는 레이저의 강도(intensity)를 조절하는 반파장판(half-wave plate, HW);
반파장판을 통과한 광의 편광을 얻기위한 편광판(polarizer, P);
편광판에서 편광된 광을 반사하는 광학 거울(M);
반사된 광의 거리를 조절하는 전이부(translation stage, TS);
전이부에서 전이된 광을 반사하는 광학 거울;
반사된 광의 색을 선별하는 이색 거울(dichroic mirror, DM);
이색 거울을 통과한 광의 크기를 결정하는 렌즈부(lens, L);
렌즈부에서 출사되는 광의 파장을 결정하는 갈바노 미러(galvano mirror, GM);
갈바노 미러에서 선택된 파장을 가지는 광이 투과하면 해당 광을 검출하는 광검출부를 포함하며;
상기 광검출부는 상기 갈바노 미러에서 반사되는 광의 초점을 형성시키는 대물렌즈(objective lens, OL) 및 집속렌즈(condenser lens, C), 상기 렌즈를 투과하는 광의 특정 주파수만 출력하는 밴드 패스 필터(band pass filter, BF) 및 상기 필터를 통과한 광의 파장을 검출하는 광증폭 튜브(PMT)를 포함하는;
합주파수 생성파를 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경을 제공한다.
또한, 본 발명은 무표지 3차원 이미징 현미경을 이용하여 곤충의 근육 조직을 관찰하는 방법을 제공한다.
본 발명은 합주파수 생성 현상을 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 무표지 3차원 이미징 현미경은 3차원 이미지 및 결맞음 반스톡스 라마산란 이미지를 동시에 얻을 수 있고, 표지를 이용한 염색법이 통하지 않는 경우에 합주파수 생성을 이용하여 별도의 외부 염료나 유전적으로 발현되는 형광 단백질과 같은 형광 표지 및 전자의 진동과 같은 요인이 개제되지 않은 상태로 관찰할 수 있으며, 표지를 이용하지 않기 때문에 반복적으로 탈색없이 관찰할 수 있고, 3차원 구조를 단면별로 분석할 수 있기 때문에 한 지점에서 외피와 내장 부근을 나누어서 관찰할 수 있으며, 두 입사파의 파장 차이가 관찰하고자 하는 고유분자 진동수와 일치할 경우 그 진동수를 선택적으로 이미징할 수 있고, 두 입사파의 극성 방향을 조절할 수 없는 다른 분석법에 비해 두 입사파의 극성 방향을 조절 가능하여, 그 정도를 조절하여 시료의 상태에 따라 최적의 이미지를 얻을 수 있으므로, 본 발명의 무표지 3차원 이미징 현미경은 살아있는 곤충의 분자 진동에 민감한 근육 관찰, 예쁜 꼬마 선충의 다른 근육 기관인 외음부(vulva)나 항문(anus)와 같은 부위 근육에 대한 무표지 관찰, 노화에 따른 근육 변화 관찰, 미세 유체 공학(microfluidics)과의 접목을 통해 살아있는 상태에서의 관찰 및 인간의 근육 관련 질환 원인 유전자들의 기능 연구, 또한 이러한 이미징 기술의 고등 동물 적용에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 무표지 3차원 이미징 현미경의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 도 1의 현미경을 이용하여 합주파수 생성(sum frequency generation, SFG)을 확인한 도이다:
(a)는 예쁜 꼬마 선충의 이광자 형광과 합주파수 생성을 동시에 겹친 이미지를 나타낸 것이고, (b)는 (a)의 네모로 표시된 위치에서 측정된 입력 전력(input poser)에 따라 달라지는 합주파수 생성을 나타낸 도이다.
도 3은 후부식도구(terminal bulb) 및 근육(muscle)에서의 합주파수 생성 신호의 강도 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 합주파수 생성 및 이광자 형광을 이용하여 예쁜 꼬마 선충의 내부 이미지를 확인한 도이다.
도 5는 합주파수 생성 및 이광자 형광을 이용하여 예쁜 꼬마 선충의 외피 근육 이미지를 확인한 도이다.
도 6의 (a)는 합주파수 생성 및 결맞음 반스톡스 라만산란의 개략도 및 이미지를 나타낸 도이고, (b) 내지 (c)는 (a)에 나타낸 지점(1 내지 3)의 합주파수 생성 및 결맞음 반스톡스 라만산란에 대한 의존성을 나타낸 도이다.
도 7은 합주파수 생성을 이용하여 두 개의 펄스파의 극성 의존성을 나타낸 도이다.
도 8은 합주파수 생성을 이용하여 예쁜 꼬마 선충의 구강 근육을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
두 개의 펨토초(femtosecond, fs) 펄스 레이저를 출사하는 광원부;
광원부에서 출사되는 레이저의 강도(intensity)를 조절하는 반파장판(half-wave plate, HW);
반파장판을 통과한 광의 편광을 얻기위한 편광판(polarizer, P);
편광판에서 편광된 광을 반사하는 광학 거울(M);
반사된 광의 거리를 조절하는 전이부(translation stage, TS);
전이부에서 전이된 광을 반사하는 광학 거울;
반사된 광의 색을 선별하는 이색 거울(dichroic mirror, DM);
이색 거울을 통과한 광의 크기를 결정하는 렌즈부(lens, L);
렌즈부에서 출사되는 광의 파장을 결정하는 갈바노 미러(galvano mirror, GM);
갈바노 미러에서 선택된 파장을 가지는 광이 투과하면 해당 광을 검출하는 광검출부를 포함하며;
상기 광검출부는 상기 갈바노 미러에서 반사되는 광의 초점을 형성시키는 대물렌즈(objective lens, OL) 및 집속렌즈(condenser lens, C), 상기 렌즈를 투과하는 광의 특정 주파수만 출력하는 밴드 패스 필터(band pass filter, BF) 및 상기 필터를 통과한 광의 파장을 검출하는 광증폭 튜브(PMT)를 포함하는;
합주파수 생성파를 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경을 제공한다.
상기 광원부는 두 개의 펨토초 펄스 레이저를 출사하는 펨토초 이중 오실레이터(femtosecond dual oscillator)를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 두 개의 펨토초 펄스 레이저는 하나는 600 내지 1300 nm의 가변 파장이며, 또 다른 하나는 1000 내지 1100 nm 중 하나로 고정된 파장인 것이 바람직하고, 하나는 680 내지 1300 nm의 가변 파장이며, 또 다른 하나는 1040 nm의 고정된 파장인 것이 보다 바람직하다.
상기 두 개의 펨토초 펄스 레이저는 50 내지 200 fs이고, 50 내지 100 MHz인 것이 바람직하고, 120 fs 이하이고, 80 MHz인 것이 보다 바람직하다.
펄스레이저의 펄스폭(120 fs), 대역(80MHz) 및 OPO(optical parametric oscillator)로 얻어질 가변 파장(λ1) 과 고정파장(λ2)은 정해진 것일 필요가 없으며(두 개의 파장이 같은 경우도 가능하며 이 경우 이차조화파(second harmonic generation)라고 칭함), 두 개의 펄스가 시공간적으로 겹쳐진 상태에서 관찰하고자 하는 곤충에 닿게 만들 수만 있으면 의도하는 합주파수가 근육 부분에서 생긴다. 단, 이 경우에 생성되는 합주파수의 파장(λS)과 두 개의 파장의 관계는 1/λS = 1/λ1 + 1/λ2의 관계를 가지게 되어 이에 맞은 파장에 해당되는 필터를 광증폭 튜브 앞에 사용하여야 한다.
상기 광학 거울 사이에는 광의 파장을 변화시키기 위한 처핑 거울(chirping mirror, CG) 및 상기 처핑 거울에 반사시키기 위한 접이 거울(FM)을 더 포함하며, 상기 광학 거울, 처핑 거울 또는 접이 거울은 전동모터로 구동되는 이동성을 갖는 것이 바람직하다.
상기 밴드 패스 필터는 420 내지 500 nm 파장의 광을 분리하는 것이 바람직하다.
한편, 도 1을 통해 본 발명의 무표지 3차원 이미징 현미경에 관한 구성을 도시하였으며, 이하, 도면을 참조하여 본 발명에 따른 무표지 3차원 이미징 현미경을 상세히 설명한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 무표지 3차원 이미징 현미경은 펨토초 이중 오실레이터를 포함하는 광원부를 통해 120 fs 이하, 80 MHz 대역의 680 nm 내지 1300 nm의 가변 파장 및 1040 nm로 고정된 고정 파장인 두 개의 펨토초 펄스 레이저를 출사하고, 출사된 가변 파장은 전동모터로 구동되는 광학 거울을 통해 반사되어 레이저의 강도를 조절하는 반파장판을 통과하며, 반파장판을 통과한 광은 편광판을 통해 광의 편광을 얻고, 편광판에서 편광된 광은 광학 거울을 통해 반사되어 반사된 광의 거리를 조절하는 전이부로 이동하며, 전이부에서 전이된 광은 광학 거울을 통해 반사되고, 반사된 광은 접이 거울을 지나 광학 거울을 통해 처핑 거울로 반사되며, 반사된 광은 처핑 거울을 통해 파장이 변화되고, 파장이 변한 광은 광학 거울을 지나 접이 거울을 통해 반사되어 이색 거울로 이동한다.
펨토초 이중 오실레이터를 포함하는 광원부를 통해 출사된 고정 파장은 광학 거울을 통해 반사되어 레이저의 강도를 조절하는 반파장판을 통과하며, 반파장판을 통과한 광은 편광판을 통해 광의 편광을 얻고, 편광판에서 편광된 광은 여러 개의 광학 거울을 통해 반사되고, 반사된 광은 접이 거울을 지나 광학 거울을 통해 처핑 거울로 반사되며, 반사된 광은 처핑 거울을 통해 파장이 변화되고, 파장이 변한 광은 광학 거울을 지나 접이 거울을 통해 반사되어 이색 거울로 이동한다.
이색 거울로 모인 가변 파장 및 고정 파장은 이색 거울을 통해 특정 색을 선별하고, 광학 거울을 통해 반사되어 광의 크기를 결정하는 렌즈부로 이동하며, 렌즈부에서 출사되는 광은 갈바노 미러를 통해 광의 파장을 결정하고, 갈바노 미러에서 선택된 파장은 광학 거울을 통해 반사되어 광의 초점을 형성시키는 대물렌즈 및 집속렌즈를 투과하며, 광학 거울을 통해 반사되어 광의 특정 주파수만 출력하는 밴드 패스 필터(420 nm 내지 500 nm)를 통과하고, 통과한 광의 파장을 검출하는 광증폭 튜브로 전기적인 신호로 전환하여 3차원 이미지를 만들거나, 광증폭 튜브를 사용하여 결맞음 반스톡스 라만산란(coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS) 이미지를 만든다.
또한, 본 발명은 무표지 3차원 이미징 현미경을 이용하여 곤충의 근육 조직을 관찰하는 방법을 제공한다.
상기 무표지 3차원 이미징 현미경에 대해 두 개의 펄스 레이저를 이색 거울을 통해 두 개의 펄스 레이저의 겹침을 조절함으로써 곤충에 시간적으로 동시에 입사하는 것이 바람직하다.
상기 무표지 3차원 이미징 현미경에 있어서, 집속 렌즈와 이색 투과 거울을 통해 발생되는 합주파수 생성파를 밴드 패스 필터를 이용하여 특정 파장을 분리하고, 광증폭 튜브로 전기적인 신호로 전환하여 이미지를 만들고, 광 스캐너를 이용하여 3차원 이미지를 얻게되는 것이 바람직하다.
상기 곤충은 예쁜 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans, C. elegans) 또는 초파리(Drosophilidae)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명의 무표지 3차원 이미징 현미경은 3차원 이미지 및 결맞음 반스톡스 라마산란 이미지를 동시에 얻을 수 있고, 염색법이 통하지 않는 경우에 합주파수 생성을 이용하여 별도의 형광 표지나 전자의 진동같은 요인이 개제되지 않은 상태로 관찰할 수 있으며, 표지를 이용하지 않기 때문에 반복적으로 탈색없이 관찰할 수 있고, 한 지점에서 외피와 내장 부근을 나누어서 관찰할 수 있으며, 두 입사파의 파장 차이가 관찰하고자 하는 고유분자 진동수와 일치할 경우 그 진동수를 선택적으로 이미징할 수 있고, 두 입사파의 극성 방향을 조절할 수 없는 다른 분석법에 비해 두 입사파의 극성 방향을 조절 가능하여, 그 정도를 조절하여 시료의 상태에 따라 최적의 이미지를 얻을 수 있으므로, 상기 무표지 3차원 이미징 현미경은 살아있는 곤충의 근육 관찰, 예쁜 꼬마 선충의 다른 근육 기관인 외음부(vulva)나 항문(anus)와 같은 부위 근육에 대한 무표지 관찰, 노화에 따른 근육 변화 관찰, 미세 유체 공학(microfluidics)과의 접목을 통해 살아있는 상태에서의 관찰 및 인간의 근육 관련 질환 원인 유전자들의 기능 연구, 또한 이러한 이미징 기술의 고등 동물 적용에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 예쁜 꼬마 선충( Caenorhabditis elegans , C. elegans )의 준비
본 발명에 사용한 예쁜 꼬마 선충(C. elegans)(Caenorhabditis Genetics Center)은 표준방법에 의하여 NGM(nematode growth medium)에 대장균의 일종인 OP50을 먹이로 첨가하여 20℃ 배양기에서 3.5일 동조화시킨 종을 배양하여 어린 성충(young adult)으로 실험을 실시하였다.
< 실시예 2> 합주파수(sum frequency generation, SFG ) 생성에 의한 이미징용 현미경의 준비
도 1에 나타낸 모식도로 구성되는 미국 Newport사에서 제작된 Insight deepsee dual 기종의 ~120 fs, 80 MHz 대역의 하나는 680 nm 내지 1300 nm의 가변파장(λ1)과 다른 하나는 1040 nm로 고정된 파장(λ2) 두 개의 펄스(pulse) 레이저를 이용하여 전동모터로 구동되는 이색 거울을 통해 두 펄스의 겹침을 조절하여 예쁜 꼬마 선충에 시간적으로 동시에 입사하게 하여 이미지를 얻는다. 이때, 파장 진행 방향에 집속렌즈(condenser lens, C)와 갈바노 미러(galvano mirror, GM)를 놓아 발생되는 합주파수 생성파(sum frequency generation, SFG)를 밴드 패스 필터(bandpass filter, BF)(420 nm 내지 500 nm, semrock)를 이용하여 분리하여 광증폭 튜브(photomultiplier tube, PMT)로 전기적인 신호로 전환하여 이미지를 만들 수 있으며, 이 경우 올림푸스 현미경에 내재된 xyz 빔 스캐너를 이용하여 3차원 이미지를 얻게되고, 독립된 또 다른 하나의 광증폭 튜브를 사용하여 결맞음 반스톡스 라마산란(coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS) 이미지도 동시에 얻을 수 있다. 또한, 파장 진행의 역방향에서도 예쁜 꼬마 선충에 유전적 조작을 통하여 관심있는 위치에 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)을 발현시킬 경우, 녹색형광단백질의 형광신호를 별도의 빛을 사용할 필요없이 낮은 파장(680 nm 내지 900 nm) 대의 입사 펄스파에 의해 발생하는 이광자형광(two photon fluorescence, TPF)을 추적함으로써 그 위치를 합주파수 생성 이미지의 위치와 비교할 수 있다(도 1).
< 실험예 1> 합주파수 생성의 확인
상기 <실시예 1>의 현미경을 이용하여 합주파수 생성(SFG)을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 준비한 예쁜 꼬마 선충을 가지고, 상기 <실시예 2>의 현미경을 사용하여 합주파수 생성 및 이광자 형광(TPF)을 동시에 확인하였고, 합주파수 생성 신호를 확인하였다. 먼저, 현미경용 슬라이드 유리 위에 시그마 알트리치사에서 구입한 아가로스(Agarose) 젤을 덮고 그 위에 마취제(NaN3)를 바른 뒤 상기 방법에 의해 배양된 예쁜 꼬마 선충을 백금 와이어로 된 루프형태의 핀셋으로 옮긴 뒤, 위를 커버슬립으로 덮고 가장자리를 매니큐어로 발라 고정시킨 뒤 현미경의 고정대에 맞추고 적절한 대물렌즈(예; 올림푸스사의 MPLAPON)를 이용하여 관찰하였다.
그 결과 도 2 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, 합주파수 생성 및 이광자 형광을 동시에 겹쳐서 확인함으로써, 예쁜 꼬마 선충을 확인할 수 있었고, 이러한 합주파수 생성 신호의 강도는 입력 전력(input power)에 따라 달라지는 것을 확인하였으며(도 2), 합주파수 생성에 사용된 두 펄스파의 겹침의 정도에 따라 후부식도구(terminal bulb) 및 근육(muscle)에서의 합주파수 생성 신호의 강도 변화를 확인하였다(도 3).
< 실험예 2> 합주파수 생성 및 이광자 형광에 의한 예쁜 꼬마 선충의 내부 및 근육 이미지 확인
<2-1> 합주파수 생성 및 이광자 형광에 의한 내부 이미지 확인
합주파수 생성 및 이광자 형광을 이용하여 예쁜 꼬마 선충의 내부 이미지를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 준비한 예쁜 꼬마 선충을 가지고, 상기 <실시예 2>의 현미경을 사용하여 예쁜 꼬마 선충의 외피 근육에 특정적으로 발현하는 녹색형광단백질을 이용하여, 도 4에 나타낸 바와 같이, 예쁜 꼬마 선충의 해부도에 표시된 α 면(외피) 및 β면(내장부근)에 대한 합주파수 생성 이미지 및 이광자 형광을 이용한 녹색형광단백질 이미지를 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, α 면 및 β면에서 녹색형광단백질에 의한 이광자 형광 이미지와 예쁜 꼬마 선충의 근육에서 직접 나오는 합주파수 생성 이미지 및 겹침 이미지를 확인하였으며, 외피 쪽에서 합주파수 생성 및 이광자 형광이 겹치는 것을 확인하였다(도 4).
<2-2> 합주파수 생성 및 이광자 형광에 의한 근육 이미지 확인
합주파수 생성 및 이광자 형광을 이용하여 예쁜 꼬마 선충의 외피 근육 이미지를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 준비한 예쁜 꼬마 선충을 가지고, 상기 <실시예 2>의 현미경을 사용하여 예쁜 꼬마 선충의 외피 근육에 녹색형광단백질을 발현시켜 염색된 마이오신(myosin)의 이미지(TPF) 및 합주파수 생성 이미지(SFG)를 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 예쁜 꼬마 선충의 외피 근육에 특정적으로 발현하는 이광자 형광 이미지와 근육에서 직접 나오는 합주파수 생성 이미지가 겹치는 것을 확인하였다(도 5).
상기 결과들로 별도의 표지없이, 예쁜 꼬마 선충의 3차원 구조를 단면별로 분석할 수 있고, 합주파수 생성의 발생지점이 근육의 마이오신 지점임을 확인하였다.
< 실험예 3> 합주파수 생성 및 결맞음 반스톡스 라만산란에 의한 예쁜 꼬마 선충의 확인
합주파수 생성 및 결맞음 반스톡스 라만산란을 이용하여 예쁜 꼬마 선충에서의 이미지 및 입사 파장에 대한 의존성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 준비한 예쁜 꼬마 선충을 가지고, 상기 <실시예 2>의 현미경을 사용하여 C-H 공진 조건 부근에서 예쁜 꼬마 선충의 이미지를 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 확인하였고, 입사파장에 대한 의존성을 확인하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, C-H 공진 조건 부근에서 합주파수 생성 및 CARS의 개략도 및 이미지를 확인하였고, (a)에 나타낸 지점(1 내지 3)의 합주파수 생성 및 CARS 신호의 입사파장에 대한 의존성은 끝단 구강조직이 외피근육보다 더 높은 것을 확인하였다(도 6).
< 실험예 4> 합주파수 생성을 이용한 예쁜 꼬마 선충의 구강 근육 확인
예쁜 꼬마 선충의 구강 근육은 녹색형광단백질과 같은 염색법이 적용되지않아 눈으로 관찰이 어려운 부위이다. 이를 합주파수 생성을 이용하여 관찰하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 준비한 예쁜 꼬마 선충을 가지고, 상기 <실시예 2>의 현미경을 사용하여 합주파수 신호의 극성 의존성 및 예쁜 꼬마 선충의 구강 근육 이미지를 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과 도 7 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, 두 개의 펄스파가 평행하거나 교차할 경우의 극성 의존성을 보여주며, 두 펄스파를 평행하게 또는 교차되어 입사할 경우에 시간적으로 예쁜 꼬마 선충의 구강 근육의 이미지를 확인하여, 반복적으로 탈색없이 그 정도를 컨트롤하여 시료의 상태에 따라 최적의 이미지를 얻을 수 있음을 확인하였다(도 7 내지 도 8).
본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 두 개의 펨토초(femtosecond, fs) 펄스 레이저를 출사하는 광원부;
    광원부에서 출사되는 레이저의 강도(intensity)를 조절하는 반파장판(half-wave plate, HW);
    반파장판을 통과한 광의 편광을 얻기위한 편광판(polarizer, P);
    편광판에서 편광된 광을 반사하는 광학 거울(M);
    반사된 광의 거리를 조절하는 전이부(translation stage, TS);
    전이부에서 전이된 광을 반사하는 광학 거울;
    반사된 광의 색을 선별하는 이색 거울(dichroic mirror, DM);
    이색 거울을 통과한 광의 크기를 결정하는 렌즈부(lens, L);
    렌즈부에서 출사되는 광의 파장을 결정하는 갈바노 미러(galvano mirror, GM);
    갈바노 미러에서 선택된 파장을 가지는 광이 투과하면 해당 광을 검출하는 광검출부를 포함하며;
    상기 광검출부는 상기 갈바노 미러에서 반사되는 광의 초점을 형성시키는 대물렌즈(objective lens, OL) 및 집속렌즈(condenser lens, C), 상기 렌즈를 투과하는 광의 특정 주파수만 출력하는 밴드 패스 필터(band pass filter, BF) 및 상기 필터를 통과한 광의 파장을 검출하는 광증폭 튜브(photomultiplier tube, PMT)를 포함하며, 상기 밴드 패스 필터는 420 내지 500 nm 파장의 광을 분리하는 것을 특징으로 하는 합주파수 생성파를 이용한 무표지 3차원 이미징 현미경.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 광원부는 두 개의 펨토초 펄스 레이저를 출사하는 펨토초 이중 오실레이터(femtosecond dual oscillator)를 포함하는 것을 특징으로 하는 무표지 3차원 이미징 현미경.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 두 개의 펨토초 펄스 레이저는 하나는 600 내지 1300 nm의 가변 파장이며, 또다른 하나는 1000 내지 1100 nm 중 하나로 고정된 파장인 것을 특징으로 하는 무표지 3차원 이미징 현미경.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 두 개의 펨토초 펄스 레이저는 50 내지 200 fs이고, 50 내지 100 MHz인 것을 특징으로 하는 무표지 3차원 이미징 현미경.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 광학 거울 사이에는 광의 파장을 변화시키기위한 처핑 거울(chirping mirror, CG) 및 상기 처핑 거울에 반사시키기 위한 접이 거울(FM)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 무표지 3차원 이미징 현미경.
  6. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 광학 거울, 처핑 거울 또는 접이 거울은 전동모터로 구동되는 이동성을 갖는 것을 특징으로 하는 무표지 3차원 이미징 현미경.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1항의 무표지 3차원 이미징 현미경을 이용하여 곤충의 근육 조직을 관찰하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 무표지 3차원 이미징 현미경에 대해 두 개의 펄스 레이저의 거울을 통해 두 개의 펄스 레이저의 겹침을 조절함으로써 곤충에 시간적으로 동시에 입사하는 것을 특징으로 하는 곤충의 근육 조직을 관찰하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 무표지 3차원 이미징 현미경에 있어서, 집속 렌즈와 이색 투과 거울을 통해 발생되는 합주파수 생성파를 밴드 패스 필터를 이용하여 특정 파장을 분리하고, 광증폭 튜브로 전기적인 신호로 전환하여 이미지를 만들고, 광 스캐너를 이용하여 3차원 이미지를 얻게되는 것을 특징으로 하는 곤충의 근육 조직을 관찰하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 곤충은 예쁜 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans, C. elegans) 또는 초파리(Drosophilidae)인 것을 특징으로 하는 곤충의 근육 조직을 관찰하는 방법.
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