KR101705457B1 - 면역학적 플라즈모닉스 기반 생체분자 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 국소표면 플라즈몬 공명을 이용한 기질의 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 금속 나노마블의 플라즈몬 공명 현상을 이용하여 기질의 존재유무, 발현량 및 활성을 측정할 수 있다. 또한, 이러한 기질의 측정을 통하여 상기 기질과 관련된 질병을 진단할 수 있다.

Description

면역학적 플라즈모닉스 기반 생체분자 검출 방법{Method for measuring biomolecule using immune-plasmonics}

본 발명은 면역학적 플라즈모닉스 기반 생체분자 검출 방법에 관한 것이다.

표면 플라즈몬(Surface Plasmon)이란 도체 표면, 이를테면 금속 박막의 표면을 따라 전파하는 자유전자의 양자화된 진동을 의미한다. 이와 같은 표면 플라즈몬은 프리즘과 같은 유전매체(dielectric medium)를 지나 유전매체의 임계각 이상의 각도로 금속 박막에 입사하는 입사광에 의해 여기되어 공명을 일으키는데, 이를 표면 플라즈몬 공명(surface Plasmon resonance: SPR)이라 한다.

단색 입사광을 사용할 때, 공명이 일어나는 입사광의 입사각(공명각) 및 공명이 일어나는 파장(공명파장)은 금속 박막에 근접한 물질의 굴절률 변화에 매우 민감하다. SPR 센서는 이러한 성질을 이용하여 금속 박막에 근접한 물질 즉, 시료의 굴절률 변화로부터 시료의 정량정성 분석 및 박막인 시료의 두게를 측정하는데에 이용되어 왔다.

한편, 금속 박막이 아닌 금속으로 이루어진 나노입자, 나노막대(nanorod) 및 나노구멍(nanohole) 등의 수 nm 내지 수백 nm 크기의 금속 나노구조체는 외부에서 입사되는 특정한 주파수(파장)의 빛에 의하여 나노구조체 전도대(conduction band)에 있는 전자들의 집단적 진동(collective oscillation)이 유발되어 전기 쌍극자 특성을 띠게 된다. 그 결과, 해당 주파수 영역의 빛을 강하게 산란 및 흡수를 하게 되는데, 이를 국소표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance; LSPR)이라 한다.

LSPR에 의한 산란과 흡수는 SPR과는 달리 프리즘 또는 회절격자 없이 단순 투과분광학적 방법에 의하여 흡광도(extinction) 측정이 가능하다. 금속 나노구조체의 외부 입사광에 대한 흡광도 특성, 즉 흡광세기, 흡광스펙트럼의 선폭, 흡광중심 파장 등은 금속의 종류, 금속 나노구조체의 크기 및 형상에 매우 강한 의존성을 보인다. 뿐만 아니라, SPR과 유사하게, 그들의 흡광 특성은 금속 나노구조체의 외부환경, 즉 금속 나노구조체 표면 주위 매질의 복소 유전율에 민감하게 반응하는데, 이러한 성질을 이용한 바이오 센서가 개발되고 있다.

1. 대한민국 공개특허 제2010-0026477호 2. 대한민국 공개특허 제2011-0038215호 3. 미국 공개특허 제2005/0181989호

본 발명의 목적은 면역학적 플라즈모닉스 기반 생체분자 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 압타머가 고정화된 금속 나노마블을 기질과 반응시키는 단계; 및

상기 금속 나노마블의 국소 표면 플라즈몬 공명 변화를 측정하는 단계를 포함하며,

상기 압타머가 고정화된 금속 나노마블은 한 종류의 기질과 반응하는 생체분자의 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 한 종류의 기질과 반응하는 압타머가 고정화된 금속 나노마블;

상기 금속 나노마블에 광을 입사시키는 광원부; 및

상기 금속 나노마블의 국소 표면 플라즈몬 공명 변화를 측정하는 수광부를 포함하는 생체분자 검출 센서를 제공한다.

본 발명에 따르면, 금속 나노마블의 국소표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하여 대상 기질의 존재 유무, 발현량 및 활성을 측정할 수 있다.

특히, 본 발명에 따르면, 다양한 암 세포주의 해당 용해물을 특정 단백질에 따라 분류하여, 해당 세포 전체의 특정 분석물질의 분포를 확인할 수 있으며, 암의 정확한 진단 및 조기 진단이 가능하여 의학 및 센서공학 산업에서의 시장성이 우수하다.

도 1은 전체 세포 용해물 및 은 나노마블(silver nanomarble, SNM) 상에 결합된 EpCAN 압타머를 이용한 EpCAM 단백질(바이오마커)의 검출 과정을 도시한다.
도 2에서 a)는 은 나노마블(SNM)의 투과 전자현미경(transmission electron microscopy) 이미지로, scale bar는 50 nm이다.
b)는 공기에서 커버 슬라이드 상에 부착된 은 나노마블(SNM)의 암시야 현미경 광산란 이미지(Dark field microscopic light scattering image)로 scale bar는 20 ㎛이다.
c)는 여러가지 매질 환경에서의 싱글 은 나노마블(SNM)의 산란 스펙트럼을 나타낸다.
d)는 c)에서 이용한 매질의 굴절률(refractive index)과 LSPR 최대파장(maximum wavelength: Emax) 사이의 선형 관계(동그라미, 빨강) 및 일정한 값의 반치전폭 (Full width at half maximum: FWHM)을 나타내는 그래프이다.
e)는 bare 및 압타머 결합된 싱글 은 나노마블(SNM)의 산란 스펙트럼을 나타낸다. Bare SNM(왼편) 및 압타머 결합 ISNM(오른편)에 해당하는 암시야 현미경 이미지가 각각 삽입되었다.
f)는 DW와 세포 용해 버퍼(RIPA 버퍼)에서 SNM에 결합된 압타머의 산란 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 LSPR 센서의 검출한계를 확인하기 위한 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4에서 a)는 각 세포주에서 피크 파장 이동(Emax) 분포를 나타내고, b)는 파장(n=100)의 function으로서 전체 세포 용해물의 싱글 은 나노마블 SNM(SNC)의 평균 산란 스펙트럼을 나타내며, c)는 각 세포주에서의 ΔEmax를 나타낸다(n=100).
도 5는 표시되는 세포 용해 조건에서 압타머가 결합된 은 나노마블 SNM(SNC)의 암시야 현미경 이미지를 나타낸다. Scale bar는 각각 20 ㎛이다.

본 발명은 검출 대상 기질과 반응하는 압타머가 고정화된 금속 나노마블을 기질과 반응시키는 단계; 및 상기 금속 나노마블의 국소 표면 플라즈몬 공명 변화를 측정하는 단계를 포함하는 생체분자의 검출 방법을 제공한다. 국소 표면 플라즈몬 공명 신호 변화에 의해, 금속 나노마블은 금속 나노마블의 외부환경, 즉 금속 나노마블 표면 주위 매질에 따라 다른 흡광 특성을 나타나게 되고 이러한 특성을 이용하여 기질을 검출할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본원에서 나노마블(nanomarble, NM)은 나노큐브(nanomarble, NC))이라 할 수 있다.

국소표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance; LSPR) 신호 측정을 통하여, 검출 대상 기질을 검출하기 위하여 먼저 금속 나노마블을 제조한다. 상기 금속 나노마블을 제조하는 방법은 업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 방법으로 제한 없이 제조 가능하다. 제조된 금속 나노마블에 검출 대상 기질과 특이적으로 결합하는 압타머를 형성시킨다.

검출 대상 기질에 특이적으로 결합하는 압타머를 이용하여 검출 대상 기질 도입 전 후의 금속 나노마블의 LSPR 신호 측정을 통해 표적 기질을 검출할 수 있다.

예를 들면, 금속 나노마블의 LSPR 신호를 측정한 후, 검출 대상 기질을 처리하여 상기 기질과 이에 특이적으로 결합하는 압타머를 반응시킨 후, 반응 전후의 LSPR 신호 변화를 측정할 수 있다. 상기 검출 대상 기질이 압타머와 결합하면, 금속 나노마블 주변의 LSPR 신호가 변하게 되어 적색 편이(적색-이동)이 나타나고, 이를 통하여 검출 대상 기질의 존재 유부를 판별할 수 있다. 뿐만 아니라, LSPR 신호 변화의 정도는 표적 기질의 농도에 의존적이므로 표적 기질의 발현량 및 활성을 측정할 수 있다.

본 발명에서 금속 나노마블은 단일 또는 둘 이상을 사용할 수 있다. 하나의 금속 나노마블은 한 종류의 검출 대상 기질과 결합할 수 있는데, 상기 금속 나노마블을 둘 이상 사용할 경우, 금속 나노마블 각각은 한 종류의 기질과 결합할 수 있다.

본 발명에서 기질에 결합되는 압타머는 기질의 종류에 따라 다양하게 존재할 수 있으며, 공지의 압타머를 사용하거나, 공지의 기술에 기반하여 합성하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, 기질은 이에 제한되는 것은 아니라, 예를 들어, EpCAM, ACVR1A, ACVR1B, ACVR2A, ACRL1. Akt, ALCAM, ASAM, Axl, Bcan, BMPR-2, Cathepsin B, Cathepsin C, CD118, CD11a, CD11b, CD4, CD48, CD58, CD81, CD84, CDH11, CDH12, CDH3, CDH5, CDH6, CDHE, CHL1, Claudin1, CNTFRA, CNTN4, CNTN5, DDR1, DLL4, DNAM1, EDAR, EGFR, EIF4A, EIF5B, Endoglin, EpCAM, EPHA10, EPHA2, EPHB4, EPHB6, ERBB2, ESAM, FGF R1 alpha(IIIb), FGF R1 alpha(IIIc), FGF R1 beta (IIIb), FGF R1 beta (IIIc), FGF R3 beta, FGF R3 C, FGF R4, FLT-3, Frizzled-1, GHR, Glypican1, GPC2, GPC3, GPC5, GPC6, GRP94, HGF R, HMGB1, HSP90a, ICAM2, ICAM3, ICOS, IFN-gamma(γ) R2, IGF1 R, IGSF4B, IL10 R alpha, IL12 R beta2, IL13 R alpha2, IL17R, IL17 R C, IL17 R D, IL1 R2, IL1 R APL2, IL23R, IL2 R alpha, IL2 R beta, IL2 R gamma, IL3 R alpha, IL5 R alpha, IL6 R, IL6ST, IL7 R alpha, IL9 sR, Integrin αVβ3, Integrin αVβ6, Integrin αVβ8, Interferon receptor, Insulin R, Klotho, Legumain, Leptin R, Lin28, LRIG3, LRP6, L-Selectin, MERTK, MPL, Mre11 & Rad50, NCAM-1, NGF R, NLGN4, Notch-1, Notch-2, Notch-3, NRP1, NRP2, OPCML, PDCD1 LG 1, PDCD1 LG 2, PDGF R beta, PECAM1, Plexin B3, Plexin C1, PRKCI, PRL R, RAGE, RET, RGM-C, RhoA, ROBO2, ROBO3, SCFR, SELP, SIGIR R, SIGLEC11, SIGLEC14, SIGLEC3, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC9, SLAMF3, SLAMF8, SN, SUMO1, SUMO2, TGF beta R III, TIE1, TIE2, TLR2, TLR3, TLR4, TNF sRII, TNFR, TNFRI, TNFR SF10A, TNFR SF10B, TNFR SF11A, TNFR SF11B, TNFR SF13B, TNFR SF13C, TNFR SF14, TNFR SF17, TNFR SF19, TNFR SF19L, TNFR SF21, TNFR SF25, TNFR SF3, TNFR SF4, TNFR SF5, TNFR SF6, TNFR SF6B, TNFR SF7, TNFR SF8, TRAIL R4, TRAIL, TrkB, TrkC, TROP2, TYRO3, Ubiquitin, VEGF R1, VEGF R2, VLA-3, VLA-5, VRK1, VSIG4, XEDAR 및 YES로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 한 종류의 기질과 반응하는 압타머가 고정화된 금속 나노마블;

상기 금속 나노마블에 광을 입사시키는 광원부; 및

상기 금속 나노마블의 국소 표면 플라즈몬 공명 변화를 측정하는 수광부를 포함하는 생체분자 검출 센서를 제공한다.

한 구체예에서, 금속 나노마블은 기판 상에 형성될 수 있다. 금속 나노마블을 기판에 효과적으로 결합하기 위해서 금속 나노마블을 유기 기능성 분자로 개질시킬 수 있다. 예를 들어, 금속 나노마블을 유기성 표면 안정제 또는 계면활성제로 개질시킬 수 있다. 그리고 나서, 기판에 아민기를 도입시켜 개질된 금속 나노마블을 기판에 결합한 후, 표적 기질과 반응하는 압타머를 금속 나노마블이 결합된 기판에 결합하여 LSPR 기판을 제조할 수 있다.

한 구체예에서, 기판은 유리, 플라스틱, 금속, 실리콘, 석영, 알루미나, 산화물 결정 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 플라스틱은 PMMA, PC, COC 등일 수 있고, 금속은 니켈, 알루미늄, 철, 구리일 수 있으며, 산화물 결정은 SiO₂, TiO₂, Ta₂O₅, Al₂O₂일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한 구체예에서, 금속 나노마블은 금, 은, 구리, 알루미늄, 백금, 실리콘, 게르마늄 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명에서 금속 나노마블은 큐브 구조를 갖는다. 큐브는 일반적으로 정육면체를 의미하나, 본 발명에서의 큐브는 가로:세로:높이의 비가 1:0.8:0.8 내지 1:1.2:1.2 또는 1:0.9:0.9 내지 1:1.1:1.1인 육면체를 의미한다. 상기 육면체에서 변은 직선인 것이 바람직하나, 곡선을 이룰 수도 있다. 상기 나노마블의 한 변의 길이는 1 내지 100 nm, 5 내지 50 nm 또는 5 내지 30 nm일 수 있다.

상기 금속 나노마블은 크기 또는 종류에 따라 플라즈몬 밴드 파장 영역이 달라지며 이에 따라 측정 감도 또한 달라질 수 있다.

본 발명에서 금속 나노마블은 유기 기능성 분자와 결합되어 있을 수 있다. 상기 유기 기능성 분자는 금속 나노마블을 안정화시킬 수 있는 유기성 표면안정제 또는 계면활성제 등일 수 있다.

예를 들어, 표면안정제는 양친매성 화합물일 수 있고, 구체적으로 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, 소듐 도데실 설파이트 및 폴리에틸렌 글라이콜 솔비탄 모노리트 계열 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

계면활성제는 알킬 트라이메틸암모늄 할라이드(alkyl trimethylammonium balide)를 포함하는 양이온 계면활성제; 올레산(oleic acid), 라우르산(lauric acid) 또는 도데실산(dodecylic acid)와 같은 포화 또는 불포화지방산; 트리옥틸 포스핀 옥사이드(trioctylphosphine oxide: TOPO), 트리옥틸포스핀(trioctylphosphine: TOP) 또는 트리부틸포스핀(tributylphosphine)와 같은 트리 알킬포스핀; 트리알킬포스핀옥사이드, 올레익아민(oleic amine), 트리옥틸아민(trioctylamine) 또는 옥틸아민(octylamine)과 같은 알킬아민(alkyl amine); 알킬티올(alkyl thiol)을 포함하는 중성 계면활성제; 또는, 소디움 알킬 설페이트(sodium alkyl sulfate) 또는 소디움 알킬 포스페이트(sodium alkyl phosphate)를 포함하는 음이온 계면활성제를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

특히, 나노마블의 안정화 및 균일한 크기 분포를 고려할 때, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이 좋다.

또한, 본 발명에 따른 생체분자 검출 센서는 기질에 특이적으로 분해되는 펩타이드가 형성된 금속 나노구조체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 금속 나노구조체는 기판 상에 형성될 수 있는데, 형성 방법, 기판의 종류 등은 금속 나노마블에서 전술한 바와 같다.

상기, 기질에 특이적으로 분해되는 펩타이드가 형성된 금속 나노구조체는 기질과 반응하면, 본 발명의 금속 나노마블과 마찬가지로 국소 표면 플라즈몬 공명 신호가 변화게 되고, 금속 구조체의 외부환경에 따라 다른 흡광 특성을 나타나는 특성을 이용하여 기질을 검출할 수 있다. 구체적으로, 기질에 의해 펩타이드가 형성된 금속 나노구조체의 펩타이드가 분해되어 금속 나노구조체에서 분리되면, 금속 나노구조체 주변의 LSPR 신호가 변하게 되어 청색 편이(청색-이동)가 나타나고, 이를 통하여 기질의 존재 유무, 발현량 및 활성을 측정할 수 있다.

즉, 본 발명에서는 기판에 압타머가 고정화된 금속 나노마블과 함께 기질에 특이적으로 분해되는 펩타이드가 형성된 금속 나노구조체를 함께 사용하여, 적색-이동 및 청색-이동 변화를 통해 생체분자의 검출을 보다 정확하게 수행할 수 있다.

이때 사용되는 펩타이드는 검출하고자 하는 기질에 따라 다양하게 존재할 수 있으며, 공지의 펩타이드를 제한 없이 이용할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 단백질 분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, MMP-2/9, MMP-7, MMP-13, MT1-MMP 등을 포함하는 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases; MMP), 트롬빈, FXIIIa(factor Xiiia), 카스파제(caspase), 우로키나아제 플라스미노겐 활성제(urokinase plasminogen activator, uPA), 피지안(Fijian), 카텝신(cathepsins), HIV 프로테아제, DPP-IV(dipeptidyl peptidase), 프로테아좀(proteasome) 등에 특이적으로 분해되는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 기질은 이에 제한되는 것은 아니나, 생체효소일 수 있다. 한 구체예에서 생체효소는 단백질분해효소, 당대사 관련 효소, 글루타민 대사 관련 효소일 수 있다. 예를 들어, 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases; MMP), 트롬빈, FXIIIa(factor Xiiia), 카스파제(caspase), 우로키나아제 플라스미노겐 활성제(urokinase plasminogen activator, uPA), 피지안(Fijian), 카텝신(cathepsins), HIV 프로테아제, DPP-IV(dipeptidyl peptidase) 또는 프로테아좀(proteasome) 등의 단백질분해효소; 헥소키나아제(hexokinase), 포스포프룩토키나아제(phosphofructokinase), 피루베이트키나아제 M2(pyruvatekinase M2), 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvatedehydrogenase) 또는 락테이트 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase) 등의 당대사 관련 효소; 또는 글루타미나아제(glutaminase) 등의 글루타민 대사 관련 효소일 수 있다.

이중에서도, 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases; MMPs)는 효소적 활성에 따라 세포의 기질을 분해하고 변형시키는 기질로, 비침습성 암 세포의 거동을 조절하는데 있어 중요한 역할을 담당한다. 특히 MMPs의 큰 패밀리 가운데 멤브레인 타입 기질 단백분해효소(membrane-type MMP)는 종양세포가 연결조직으로 침습하는데 직접적이고 필수적인 역할을 하는 효소이다.

상기 펩타이드 및 표적 생체효소는 특정 질병과 관련이 있다고 알려져 있다. 따라서 ISPR 신호 변화의 측정을 통하여, 생체효소의 존재 유무, 발현량 또는 활성을 감지함으로써, 해당 관련 질병을 진단하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, MT1-MMP의 존재 유무, 발현량 또는 활성을 감지함으로써 암의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.

한 구체예에서, 금속 나노구조체는 금, 은, 구리, 알루미늄, 백금, 실리콘, 게르마늄 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명에서 금속 나노구조체의 형태는 제한되지 않으며, 예를 들어, 원기둥, 사각기둥, 삼각기둥, 오각기둥, 육각기동, 팔각기둥, 구, 반구, 구의 일부분, 타원구, 반타원구, 타원구의 일부분, 사각뿔, 사각쌍뿔, 사각뿔대, 삼각뿔, 삼각쌍뿔, 삼각뿔대, 원뿔, 원뿔대 또는 링일 수 있다.

한 구체예에서, 금속 나노구조체는 나노막대일 수 있는데, 상기 나노막대의 종횡비는 장축:단축의 길이가 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 5:1, 또는 1:1 내지 3:1일 수 있다. 상기 범위에서 물에 대한 흡광도가 낮아 생체분자의 검출 효율을 높일 수 있다.

본 발명에서 금속 나노구조체는 유기 기능성 분자와 결합되어 있을 수 있으며, 유기 기능성 분자 및 결합 방법은 금속 나노마블에서 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

[제조예 1] 은 나노마블(SNM)의 제조

은 나노마블은 다음과 같은 방법으로 합성되었다.

diethylene glycol 5 mL를 교반과 함께 150°C의 온도로 가열시킨 후, sodium hydrosulfide 60 ㎕(3 mM), hydrochloride 500 ㎕(3 mM) 및 poly(vinyl pyrrolidone) 1.25 mL(0.36 nM)을 순차적으로 상기 가열된 diethylene glycol 용액에 투입하였다. 2 분 동안 추가적인 교반을 진행한 후, trifluoroacetate 용액 0.4 mL(282 mM)를 투여하고, 150°C에서 30분 교반하였다. 가열된 용액은 얼음물을 이용하여 반응을 종료시키고, 원심분리(15,000rpm, 30분)를 통해서 정제를 한 뒤, 최종적으로 5 mL의 물(DW)에 분산시켰다.

물에 분산된 은 나노튜브의 흡광도 스펙트럼을 측정하였다 (Shimadzu, UV-1800). 은 나노마블의 종축 및 횡축 각각에 따라 은 나노마블 주변의 전자가 진동하여, 흡광도 피크가 발생한다.

[제조예 2] LSPR 기판의 제조

커버 글래스(12 mm φ)는 피라나 용액(3:1 H2SO4/30% H2O2)을 이용하여 세척하였다. 세척 후, 해당 커버 글래스는 DW를 이용하여 세 번 반복하여 세척한 뒤, 건조시켰다. 커버 글래스 표면을 아민 작용기로 코팅시키기 위해, APTMS(aminopropyltrimethoxysilane) 용액 100 ㎕가 포함된 수용액에 24 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 해당 커버 글래스는 과량의 DW 및 에탄올을 이용하여, 세척한 뒤, 건조하였다. 그 이후, 아민 작용기로 코팅된 커버 글래스를 은 나노마블 수용액에 담구어 24 시간 동안 반응시키고, DW로 세척한 뒤, 건조하였다.

아미노기가 도입된 유리 기판에 은 나노마블을 결합하고, 흡착된 은 나노마블을 텅스텐 할로겐 램프의 백색광의 매우 좁은 빔을 샘플 표면에 전달하는 초정밀 고개구율 암시야 콘덴서 (high numerical aperture dark field condenser; U-DCW, Olympus)를 이용하여 암시야 현미경(dark field microscopy; BX51, Olympus)으로 관찰하였다.

은 나노마블의 흡광도 스펙트럼은, 가시부에서 398 nm의 피크를 나타내므로 유리 기판상의 은 나노마블은 398 nm 파장의 빛을 강하게 흡수한다. 은 나노마블이 398 nm에서 빛을 강하게 흡수하기 때문에, 같은 파장을 갖는 빛을 산란한다.

도 2 a)는 은 나노마블(SNM)의 투과 전자현미경(transmission electron microscopy) 이미지로, scale bar는 50 nm이며 은 나노마블은 가로 및 세로가 약 5내지 30 nm인 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 2 b)는 공기에서 커버 슬라이드 상에 고정된 은 나노마블의 암시야 현미경 광산란 이미지(Dark field microscopic light scattering image)로 scale bar는 20 ㎛이며, 은 나노마블은 청색 컬러 도트로 관찰되었다.

은 나노마블이 결합된 유리 기판을 caffeic acid 100 ㎕(2 μM) 용액에 반응시키고, 추가적으로 EDC (2.3 μmol), sulfo-NHS (2.4 μmol) 및 anti-EpCAM DNA aptamer 100 ㎕(1 μM)용액에 12 시간 동안 반응시켜 은 나노마블에 압타머를 반응시켰다

이로써 은 나노마블에 압타머가 결합된 LSPR 기판을 제조하였다(도 1).

[실시예 1] 은 나노마블의 LSPR 신호 분석을 통한 생체분자의 측정

세포 용해액 준비

세포 용해액은 각 세포주의 세포 개수가 1 X 10⁶개가 될 때까지 배양하고, 이 세포들의 부산물을 제거하기 위해 PBS 용액으로 세척하였다. 원심분리(1,100 rpm, 3분)를 통해 세포를 일정 부피로 농축시킨 뒤, 다시 PBS 용액으로 세척 후 상기의 조건으로 원심분리를 한번 더 진행하였다. 세포를 용해시킬 수 있는 세포 용해 버퍼(radioimmunoprecipitation assay: RIPA) 1 mL를 세포에 투여하여 세포 용해액을 제조하였다.

LSPR 신호의 검지

모든 LSPR 신호는 현미경 및 분광사진기(imaging spectrograph)기반의 시스템을 통해서 얻었다. 현미경용 CCD 카메라를 통해 은 나노마블의 정확한 위치를 확인하고, 스펙트럼을 얻고자 하는 은 나노마블을 현미경 영상의 정중앙에 위치시킨 후, 분광사진기의 슬릿을 조절하여 현미경 영상에서 스펙트럼을 측정하고자 하는 하나의 은 나노마블만이 영상화 되도록 하였다. 분광사진기를 통해 현미경 광원으로 나오는 빛의 스펙트럼을 얻은 뒤, 단일 은 나노마블의 스펙트럼을 측정하여 현미경 광원의 스펙트럼을 빼주어, 단일 은 나노마블의 LSPR 스펙트럼을 획득하였다.

민감도 측정

침습성 암 세포에서 압타머의 활성을 알아보기 위하여 제조예 2에 따라 준비된 LSPR 기판을 이용하여 실험하였다. 다른 굴절률 (refractive index; RI)을 갖는 다양한 유전 매질(공기: 1.000, 물: 1.333, 에탄올: 1.362, 1-프로판올: 1.387, 디메틸포름아미드: 1.428, 및 클로로포름: 1.490)을 이용하여 은 나노마블이 코팅된 기판의 민감도 지수를 LSPR 흡광도(extinction) 스펙트럼을 측정하여 알아보았다(도 2 c). 유전 매질 (dielectric media)의 RI가 증가함에 따라, 흡광도 스펙트럼의 피크 파장에 적색-천이가 일어났다. 그리고 나서, 매질의 굴절률(refractive index)과 LSPR 최대파장(maximum wavelength: Emax) 사이의 선형 관계(동그라미, 빨강) 및 일정한 값의 반치전폭 (Full width at half maximum: FWHM)을 도 2 d)에 나타냈다.

또한, 제조예 2에 따라 준비된 LSPR 기판(압타머가 고정된 싱글 은 나노마블(SNM)) 및 bare 기판(압타머 결합 전의 은 나노마블)의 산란 스펙트럼을 측정하여 알아보았다(도 2 e)). 은 나노마블에 압타머를 결합한 결과 스펙트럼의 피크 파장에 적색-천이가 일어났다.

도 2 e)는 은 나노마블에 EpCAM 압타머를 결합시킨 뒤, 세포 용해 버퍼인 RIPA 버퍼에 의해서는 LSPR 신호에 변화가 없다는 것을 보여주기 위한 실험으로, 뒤에 나오는 도 3에서의 결과가 각 세포주들의 EpCAM 발현량에 따라 LSPR 신호의 변화가 다르다는 내용을 말해주고 있는데, 이에 앞서 세포 용해에 사용한 RIPA 버퍼가 실험에 영향을 주지 않는다는 것을 밝히고 있다.

또한, 도 2 f)는 DW와 세포 용해 버퍼(RIPA 버퍼)에서 SNM에 결합된 압타머의 산란 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명에서 3은 LSPR 센서의 검출한계를 확인하기 위한 실험의 결과로서, 앞서 압타머 선택성 실험에서 이용하였던 MCF7 및 MKN45 세포주에 대해서 희석을 통해 세포 개수를 줄여감에 따라 LSPR 신호 변화를 세포주 별로 나타내었다.

도 4 a)는 각 세포주에서 피크 파장 이동(Emax) 분포를 나타내고, b)는 파장(n=100)의 function으로서 전체 세포 용해물의 싱글 은 나노마블 SNM(SNC)의 평균 산란 스펙트럼을 나타내며, c)는 각 세포주에서의 ΔEmax를 나타낸다(n=100).

상기 도 4 a)에서는 도 3에서의 histogram을 세포주 별로 나누어서 표현하였으며, LSPR 신호를 100번 측정하고 이를 평균한 신호를 4 b)에 나타내었다. 그리고 이 때의 신호에서의 peak 위치를 막대그래프로 도 4 c)에 나타내었다.

도 5는 표시되는 세포 용해 조건에서 압타머가 결합된 나노마블 SNM(SNC)의 암시야 현미경 이미지를 나타낸다. Scale bar는 각각 20 ㎛이다.

Claims (11)

1. 압타머가 고정화된 금속 나노마블을 검출 대상 기질과 반응시키는 단계; 및
   상기 금속 나노마블의 국소 표면 플라즈몬 공명 변화를 측정하는 단계와
   기질에 특이적으로 분해되는 펩타이드가 형성된 금속 나노구조체를 기질로 처리하는 단계; 및
   상기 금속 나노구조체의 국소 표면 플라즈몬 공명 변화를 측정하는 단계를 포함하며,
   상기 압타머가 고정화된 금속 나노마블은 한 종류의 기질과 반응하는 생체분자의 검출 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   압타머가 고정화된 금속 나노마블을 둘 이상 포함하며,
   상기 압타머가 고정화된 금속 나노마블 각각은 한 종류의 기질과 반응하는 생체분자의 검출 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   압타머는 기질과 특이적으로 결합하는 생체분자의 검출 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   기질은 EpCAM인 생체분자의 검출 방법.
   
5. 한 종류의 기질과 반응하는 압타머가 고정화된 금속 나노마블;
   기질에 특이적으로 분해되는 펩타이드가 형성된 금속 나노구조체;
   상기 금속 나노마블 및 금속 나노구조체에 광을 입사시키는 광원부; 및
   상기 금속 나노마블 및 금속 나노구조체의 국소 표면 플라즈몬 공명 변화를 측정하는 수광부를 포함하는 생체분자 검출 센서.
   
6. 제 5 항에 있어서,
   금속 나노마블은 기판 상에 형성되는 생체분자 검출 센서.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   기판은 유리, 플라스틱, 금속, 실리콘, 석영, 알루미나, 산화물 결정 또는 이들의 혼합물인 생체분자 검출 센서.
   
8. 제 5 항에 있어서,
   금속 나노마블은 금, 은, 구리, 알루미늄, 백금, 실리콘, 게르마늄 또는 이들의 혼합물인 생체분자 검출 센서.
   
9. 제 5 항에 있어서,
   금속 나노마블의 가로:세로:높이의 비는 1:0.8:0.8 내지 1:1.2:1.2인 생체분자 검출 센서.
   
10. 삭제
11. 제 5 항에 있어서,
    금속 나노구조체는 기판 상에 형성되는 생체분자 검출 센서.
    

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