KR101703543B1 - Multi Mode Stimulated Emission Depletion Microscope System Combined with Digital Holography Method - Google Patents
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Abstract
여기파장 빔과 STED 빔을 이용하는 현미경시스템이 게시된다. 본 발명의 실시예에 따른 현미경시스템(100)은, 여기파장 빔(Excitation Beam) 발생장치(111)와 STED 빔(Stimulated Emission Depletion Beam) 발생장치(112)를 구비하는 빔 발생부(110); 여기파장 빔 발생장치(111)로부터 발생된 여기파장 빔을 DM(Dichroic Mirror, 121)을 통과시킨 후 측정대상(10)에 포커싱하고, 이와 동시에 STED 빔 발생장치(112)로부터 발생된 STED 빔을 위상마스크(PM; Phase Mask, 122) 및 DM(Dichroic Mirror, 123)을 통과시킨 후 측정대상(10)에 포커싱(Focusing)하여 측정대상(10)이 형광발광하게 하여, 측정대상(10)의 이미지 정보를 획득하는 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경부(120); STED 빔 발생장치(112)로부터 발생되고 형광단의 흡수파장에서 벗어난 STED 빔을 BS(Beam Splitter, 131)를 이용하여 두 경로로 나눈 후, 하나의 경로는 레퍼런스 빔(Reference Beam)으로서 측정센서(132)로 향하고, 나머지 경로는 시그널 빔(Signal Beam)으로서 측정대상(10)을 향하며, 측정대상(10)을 투과하여 광경로 변조가 발생된 시그널 빔과 레퍼런스 빔을 바탕으로 홀로그램 정보를 획득하는 디지털 홀로그래픽(Digital Holographic) 현미경부(130); 및 상기 STED현미경부(120)와 디지털 홀로그래픽 현미경부(130)를 통해 획득한 측정대상의 이미지 정보와 홀로그램 정보를 바탕으로 측정대상(10)의 이미지 정보를 복원하고 정량적 위상 정보를 산출하는 산술처리부(140);를 포함하는 것을 구성의 요지로 한다.A microscope system using excitation wavelength beam and STED beam is published. A microscope system 100 according to an embodiment of the present invention includes a beam generator 110 having an excitation beam generator 111 and a STED beam generating apparatus 112; The excitation wavelength beam generated from the excitation wavelength beam generating device 111 is passed through a DM (Dichroic Mirror) 121 and then focused on the measurement object 10 and simultaneously the STED beam generated from the STED beam generating device 112 After passing through a phase mask (PM) 122 and a DM (Dichroic Mirror) 123, the measurement target 10 is focused on the measurement target 10 to cause the measurement target 10 to emit fluorescence, An STED (Stimulated Emission Depletion) microscope 120 for acquiring image information; The STED beam generated from the STED beam generating device 112 and deviating from the absorption wavelength of the fluorescence end is divided into two paths using a BS (Beam Splitter) 131, and one path is used as a reference beam And the remaining path is a signal beam that is directed toward the measurement target 10 and acquires the hologram information based on the signal beam transmitted through the measurement target 10 and the optical path modulation generated and the reference beam A digital holographic microscope unit 130; And an arithmetic unit for reconstructing the image information of the measurement object 10 based on the image information of the measurement object and the hologram information acquired through the STED microscope unit 120 and the digital holographic microscope unit 130 and calculating the quantitative phase information And a processing unit (140).
Description
본 발명은 현미경시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 디지털 홀로그래피 방법을 결합한 다중모드 STED 현미경시스템에 관한 것이다.
The present invention relates to a microscope system, and more particularly, to a multimode STED microscope system incorporating a digital holography method.
도 1에는 종래 기술에 따른 디지털 홀로그래픽 현미경의 구성을 나타내는 모식도가 도시되어 있다.FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a digital holographic microscope according to the related art.
도 1을 참 종래 기술에 따른 디지털 홀로그래픽 현미경(Digital Holographic Microsocpy, DHM)은 이미지 센서(CCD 센서, CMOS 센서)를 홀로그램 입력장치로 사용하여 실시간으로 측정대상의 홀로그램 데이터를 입력받을 수 있다. 또한, 종래 기술에 따른 디지털 홀로그래픽 현미경은, 홀로그램 입력값을 수치적 회절 계산 방법을 통하여 위상 정보와 3차원 데이터를 추출할 수 있다.1, a digital holographic microscope (DHM) according to the related art can receive hologram data of a measurement object in real time using an image sensor (CCD sensor, CMOS sensor) as a hologram input device. In addition, the digital holographic microscope according to the related art can extract the phase information and the three-dimensional data through the numerical diffraction calculation method of the hologram input value.
디지털 홀로그래픽 현미경(Digital Holographic Microsocpy, DHM)은, 코히어런스를 확보하기 위해 레이저를 단일광원으로 활용한다.Digital Holographic Microsocopy (DHM) utilizes a laser as a single light source to ensure coherence.
보다 구체적으로, 단일광원 레이저를 빔스플리터(BS; Beamsplitter)를 이용하여 시그널 빔(Signal beam (S))과 레퍼런스 빔(Reference beam (R))으로 나누어 적용하?al beam (S))은 그대로 또는 콘덴서 렌즈로 집광되어 측정대상에 조사되고, 대물렌즈를 통해 상 또는 스케터링된 빛이 확대되어 튜브렌즈를 통해 또는 그대로 빔스플리터(BS; Beamsplitter)에서 앞서 갈라져 전파된 레퍼런스 빔(Reference beam (R))과 중첩되어 이미지 센서(CCD 센서, CMOS 센서)로 진행된다. 이미지 센서(CCD 센서, CMOS 센서)에서는 시그널 빔(Signal beam (S))과 레퍼런스 빔(Reference beam (R))의 간섭에 의해 홀로그램이 입력되며, 이렇게 입력된 데이터로부터 수치연산을 통해 이미지가 복원되고, 해당된 샘플에 의한 광경로차에 의한 위상정보를 계산하게 된다. 이러한 계산을 거쳐 얻은 위상이미지는 투명한 샘플에 대해 두드러진 가시적 이미지를 제공하지 못하는 일반적인 브라이트 필드(Bright field) 현미경과 달리 높은 콘트라스트(contrast, 대비)를 갖는 이미지를 제공한다.
More specifically, a single light source laser is divided into a signal beam (S) and a reference beam (R) by using a beam splitter (BS) Or a condenser lens and is irradiated onto the measurement object, and the image or the scattered light through the objective lens is enlarged and transmitted through the tube lens or as a reference beam (R) spread in the beam splitter ), And proceeds to an image sensor (CCD sensor, CMOS sensor). In the image sensor (CCD sensor, CMOS sensor), the hologram is input by the interference of the signal beam (S) and the reference beam (R), and the image is restored And phase information due to the optical path difference due to the corresponding sample is calculated. The resulting phase image provides an image with high contrast, unlike a conventional bright field microscope, which does not provide a conspicuous visible image for a transparent sample.
도 2에는 종래 기술에 따른 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경의 구성을 나타내는 모식도가 도시되어 있다.2 is a schematic diagram showing a configuration of a STED (Stimulated Emission Depletion) microscope according to the prior art.
일반적으로 마이크로미터 이하의 공간 분해능을 위해서는 고배율 현미경을 활용하지만, 3차원 측정을 위해서는 섹셔닝(sectioning)이 가능한 공초점 현미경을 사용한다. 그러나, 측정시간이 길다는 단점이 있기에 디지털 홀로그래픽 현미경(Digital Holographic Microsocpy, DHM) 기술의 원숏(one-shot)의 장점이 부각될 수 있다.Generally, a high magnification microscope is used for spatial resolution below micrometer, but a confocal microscope capable of sectioning is used for three-dimensional measurement. However, the advantage of one-shot of Digital Holographic Microsocopy (DHM) technology can be highlighted because of the disadvantage of long measurement time.
또한 일반 현미경 중에서 형광 현미경을 활용하는 경우, 측정대상의 단백질 또는 측정대상에 형광물질을 라벨링해서 형광체의 발광만을 보는 방법을 취해야 하는데, 이를 위해서 샘플을 형광처리한다. 그러나, 디지털 홀로그래픽 현미경(Digital Holographic Microsocpy, DHM)의 경우 측정대상에 어떠한 처리를 하지 않고도 관찰이 가능하고 살아있는 세포도 볼 수 있다.When a fluorescence microscope is used in a general microscope, a fluorescent substance is labeled on a protein or a measurement object to be measured, and a method of observing only the emission of the fluorescent substance is required. For this purpose, the sample is subjected to fluorescence treatment. However, in the case of Digital Holographic Microsocopy (DHM), it is possible to observe living cells without any treatment on the measurement target.
종래 기술에 따른 단점으로는 형광염료가 라벨링 되는 영역 외에는 관찰 불가하다는 것인데, 세포의 경우 세포골격과 같은 세부적인 부분을 볼 수 있지만 둘러싸고 있는 세포외형과 변형을 관찰하기 어렵다. 또한, 추가적인 형광을 이용해서 관측활용도를 높인다 하더라도 라벨링과정이 추가적으로 필요하다.
Disadvantages of the prior art are that the fluorescent dye can not be observed except for the labeled region. In the case of the cell, the details such as the cytoskeleton can be seen, but it is difficult to observe the surrounding cell shape and deformation. In addition, labeling is additionally needed even if additional fluorescence is used to increase the utilization of the observation.
본 발명의 목적은, 디지털 홀로그래픽 현미경과 STED 현미경(Stimulated Emission Depletion Microscopy)으로부터 데이터를 동시에 획득하여 별도로 처리하거나 상호보완하여 융합된 형태로 처리할 수 있고, 동일한 측정대상의 동일한 부분에 대한 서로 다른 종류의 데이터를 획득할 수 있으며, 여러 종류의 측정 데이터를 확보함에 있어 소요되는 시간을 단축시킬 수 있는 통합형태의 현미경시스템을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to simultaneously acquire data from a digital holographic microscope and a STED (Emission Depletion Microscopy) microscope and process them separately or complement each other and process them in a fused form, Type microscope system capable of acquiring various types of measurement data and shortening the time required for obtaining various types of measurement data.
이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면에 따른 현미경시스템은: 여기파장 빔(Excitation Beam) 발생장치와 STED 빔(Stimulated Emission Depletion Beam) 발생장치를 구비하는 빔 발생부; 여기파장 빔 발생장치로부터 발생된 여기파장 빔을 DM(Dichroic Mirror)을 통과시킨 후 측정대상에 포커싱하고, 이와 동시에 STED 빔 발생장치로부터 발생된 STED 빔을 위상마스크(PM; Phase Mask) 및 DM(Dichroic Mirror)을 통과시킨 후 측정대상에 포커싱(Focusing)하여 측정대상이 형광발광하게 하여, 측정대상의 이미지 정보를 획득하는 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경부; STED 빔 발생장치로부터 발생되고 형광단의 흡수파장에서 벗어난 STED 빔을 BS(Beam Splitter)를 이용하여 두 경로로 나눈 후, 하나의 경로는 레퍼런스 빔(Reference Beam)으로서 측정센서로 향하고, 나머지 경로는 시그널 빔(Signal Beam)으로서 측정대상을 향하며, 측정대상을 투과하여 광경로 변조가 발생된 시그널 빔과 레퍼런스 빔을 바탕으로 홀로그램 정보를 획득하는 디지털 홀로그래픽(Digital Holographic) 현미경부; 및 상기 STED현미경부와 디지털 홀로그래픽 현미경부를 통해 획득한 측정대상의 이미지 정보와 홀로그램 정보를 바탕으로 측정대상의 이미지 정보를 복원하고 정량적 위상 정보를 산출하는 산술처리부;를 포함하는 구성일 수 있다.
According to an aspect of the present invention, there is provided a microscope system including: a beam generator including an excitation beam generator and a STED beam generating device; The excitation wavelength beam generated from the excitation wavelength beam generator is passed through a DM (Dichroic Mirror) and then focused on the object to be measured. At the same time, the STED beam generated from the STED beam generator is subjected to phase mask (PM) (Stimulated Emission Depletion) microscope unit for acquiring image information of an object to be measured by passing the Dichroic Mirror, focusing the object to be measured, and causing the object to fluoresce; The STED beam generated from the STED beam generator and separated from the absorption wavelength of the fluorescence end is divided into two paths using a BS (Beam Splitter), and one path is directed to the measurement sensor as a reference beam (reference beam) A digital holographic microscope which is directed to a measurement object as a signal beam and acquires hologram information based on a signal beam transmitted through the measurement object and the optical path modulation is generated and a reference beam; And an arithmetic processing unit for restoring the image information of the measurement object based on the image information of the measurement object and the hologram information acquired through the STED microscope unit and the digital holographic microscope unit, and calculating the quantitative phase information.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 위상마스크(PM; Phase Mask)는 STED 빔 중앙부 빛의 세기 값이 0이 되도록, STED 빔을 도넛 형태의 빔으로 형성시킬 수 있다.In one embodiment of the present invention, the phase mask (PM) may form a STED beam into a donut-shaped beam such that the STED beam center intensity value is zero.
이때, 상기 위상마스크(PM; Phase Mask)는 VPP(Vortex Phase Plate) 또는 SLM(Spatial Light Modulator; 공간 빛 변조기)에 해당하는 것 일 수 있다.
In this case, the phase mask (PM) may be a Vortex Phase Plate (VPP) or a spatial light modulator (SLM).
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 여기파장 빔(Excitation Beam) 및 STED 빔은, CW레이저 또는 펄스레이저일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the excitation beam and the STED beam may be a CW laser or a pulsed laser.
이 경우, 상기 펄스레이저의 펄스 값은 10 fs(femtosecond) 내지 900 ps(picoseconds)이고, 측정대상에서 발생하는 형광 디플레션(Depletion) 효과가 일어나는 영역에 대응되도록 설정될 수 있다.In this case, the pulse value of the pulsed laser may be set to correspond to a region where a fluorescence depletion effect occurs in the measurement object, which is 10 fs (femtosecond) to 900 ps (picoseconds).
또한, 상기 여기파장 빔의 펄스 값은, 측정대상에 적용되는 염료의 흡수파장에 대응되는 펄스 대역의 펄스 값일 수 있다.Also, the pulse value of the excitation wavelength beam may be a pulse value of a pulse band corresponding to an absorption wavelength of the dye applied to the object to be measured.
또한, 상기 STED 빔 의 펄스 값은 100 ps 내지 1 ns이고, 측정대상에서 발생하는 형광 디플레션(Depletion) 효과가 일어나는 영역에 대응되도록 설정될 수 있다.
In addition, the pulse value of the STED beam may be set to correspond to a region where a fluorescence depletion effect occurs in the measurement object, which is 100 ps to 1 ns.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 현미경시스템은: 측정대상을 상부에 고정시키고, 측정대상의 위치를 수평방향(X방향), 수직방향(Y방향) 및 높이방향(Z방향)으로 이동시키는 스테이지를 더 포함하는 구성일 수 있다.
In one embodiment of the present invention, the microscope system comprises: a measurement object being fixed to the upper part and moving the position of the measurement object in a horizontal direction (X direction), a vertical direction (Y direction) and a height direction (Z direction) Stage. ≪ / RTI >
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 현미경시스템에 따르면, 측정대상의 이미지 정보를 획득하는 STED 현미경부 및 측정대상의 홀로그램 정보를 획득하는 디지털 홀로그래픽 현미경부를 구비함으로써, 측정대상의 측정 데이터를 동시에 획득하여 별도로 처리하거나 상호보완하여 융합된 형태로 처리할 수 있다.As described above, according to the microscope system of the present invention, by including the STED microscope section for acquiring image information of a measurement object and the digital holographic microscope section for acquiring hologram information of the measurement object, And can be processed separately or complemented to be processed in a fused form.
또한, 본 발명의 현미경시스템은 멀티모드 현미경시스템으로서, STED 현미경시스템에 기반하여 디지털 홀로그래피 방법을 적용한 현미경 즉, 디지털 홀로그래픽 현미경을 동일한 시스템 내에 추가로 구축한 것이며, 본 발명의 현미경시스템을 통해 STED 현미경의 초고해상도 공초점 이미지와 와이드필드 디지털 홀로그래피 이미지를 동일한 시스템 내에서 얻을 수 있다.In addition, the microscope system of the present invention is a multimode microscope system, in which a microscope, i.e., a digital holographic microscope, to which a digital holography method is applied based on a STED microscope system, is additionally constructed within the same system, A microscope ultra-high resolution confocal image and a wide field digital holography image can be obtained in the same system.
또한, 본 발명의 현미경시스템에 따르면, 별도의 추가 장비 필요없이 측정대상의 홀로그램 정보와 이미지 정보를 동시에 획득할 수 있어, 측정 작업에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있고, 결과적으로 측정작업에 소요되는 비용을 절감시킬 수 있다.Further, according to the microscope system of the present invention, it is possible to simultaneously acquire the hologram information and the image information of the measurement object without the need for additional equipment, thereby shortening the time required for the measurement operation and consequently, Cost can be reduced.
또한, 본 발명의 현미경시스템에 따르면, 동일한 측정대상의 동일한 지점에 대한 이미지 정보와 홀로그램 정보를 동시에 획득할 수 있어, 동일한 부분에 대한 서로 다른 종류의 측정 데이터를 획득할 수 있게 되어, 종래 기술에 따른 한계를 극복할 수 있다.Further, according to the microscope system of the present invention, it is possible to acquire the image information and the hologram information for the same point of the same measurement object at the same time, and to acquire different kinds of measurement data for the same part, Can be overcome.
또한, 본 발명의 현미경시스템에 따르면, 동일한 부분에 대한 서로 다른 종류의 측정 데이터를 획득하면서, 이와 동시에 시간의 흐름에 따른 측정 데이터의 변화를 추적 가능하다.Further, according to the microscope system of the present invention, different kinds of measurement data for the same portion can be acquired, and at the same time, a change in measurement data according to the passage of time can be tracked.
또한, 본 발명의 현미경시스템에 따르면, 초고해상도 형광현미경인 STED 현미경에 디지털 홀로그래픽 현미경을 애드온타입(Add-on type)으로 병합 설치함으로써 측정대상을 한번의 촬영(One-shot)으로 빠른 이미지 정보를 획득할 수 있고, 경우에 따라서는 비디오레이트(Video rate) 수준의 빠르기로 이미지 정보를 획득할 수 있으며, 측정대상의 광경로 변조(modulation) 정보를 측정하고 이를 통해 추가적인 계산으로 측정대상의 두께 또는 굴절률 정보를 획득할 수 있다.
Further, according to the microscope system of the present invention, a digital holographic microscope is combined with an STED microscope, which is an ultra-high resolution fluorescence microscope, as an add-on type, In some cases, the image information can be acquired at a high video rate level, and the optical path modulation information of the measurement object can be measured, and through the additional calculation, the thickness of the measurement object Or refractive index information.
도 1은 종래 기술에 따른 디지털 홀로그래픽 현미경의 구성을 나타내는 모식도이다.
도 2는 종래 기술에 따른 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경의 구성을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 현미경시스템을 나타내는 구성도이다.
도 4는 도 3에 도시된 현미경시스템의 위상마스크를 통과한 후 도넛 형태의 빔으로 형성된 STED 빔과 여기파장 빔이 합쳐지는 모습을 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 현미경시스템의 STED 현미경부를 통해 획득한 측정대상의 이미지 정보와 디지털 홀로그래픽 현미경부를 이용하여 획득한 홀로그램 정보를 바탕으로 획득한 이미지 정보를 나타내는 그림이다.1 is a schematic diagram showing a configuration of a digital holographic microscope according to the related art.
2 is a schematic diagram showing a configuration of a STED (Stimulated Emission Depletion) microscope according to the prior art.
3 is a block diagram showing a microscope system according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a schematic diagram showing a state in which a STED beam formed of a donut-shaped beam and an excitation wavelength beam are combined after passing through a phase mask of the microscope system shown in FIG.
FIG. 5 is a diagram illustrating image information acquired based on image information of a measurement object acquired through a STED microscope unit of a microscope system and hologram information acquired by using a digital holographic microscope unit according to an embodiment of the present invention.
이하 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. Prior to the description, terms and words used in the present specification and claims should not be construed as limited to ordinary or dictionary meanings and should be construed in accordance with the technical concept of the present invention.
본 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.Throughout this specification, when a member is "on " another member, it includes the case where there is another member between the two members as well as when the member is in contact with the other member.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
Throughout this specification, when an element is referred to as "including" an element, it is understood that it may include other elements as well, without departing from the other elements unless specifically stated otherwise.
도 3에는 본 발명의 일 실시예에 따른 현미경시스템을 나타내는 구성도가 도시되어 있고, 도 4에는 도 3에 도시된 현미경시스템의 위상마스크를 통과한 후 도넛 형태의 빔으로 형성된 STED 빔과 여기파장 빔이 합쳐지는 모습을 나타내는 모식도가 도시되어 있다. 또한, 도 5에는 본 발명의 일 실시예에 따른 현미경시스템의 STED 현미경부를 통해 획득한 측정대상의 이미지 정보와 디지털 홀로그래픽 현미경부를 이용하여 획득한 홀로그램 정보를 바탕으로 획득한 이미지 정보를 나타내는 그림이 도시되어 있다.FIG. 3 shows a schematic diagram of a microscope system according to an embodiment of the present invention. FIG. 4 shows a STED beam formed by a donut-shaped beam after passing through a phase mask of the microscope system shown in FIG. A schematic view showing a state in which beams are combined is shown. 5 is a diagram illustrating image information acquired based on image information of a measurement object acquired through a STED microscope unit of a microscope system and hologram information acquired by using a digital holographic microscope unit according to an embodiment of the present invention Respectively.
이들 도면을 참조하면, 본 실시예에 따른 현미경시스템(100)은, 빔 발생부(110), STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경부(120) 및 디지털 홀로그래픽(Digital Holographic) 현미경부(130)를 포함하는 구성일 수 있다.Referring to these drawings, a microscope system 100 according to the present embodiment includes a
구체적으로, 빔 발생부(110)는 여기파장 빔(Excitation Beam) 발생장치(111)와 STED 빔(Stimulated Emission Depletion Beam) 발생장치(112)를 포함하는 구성일 수 있다.The
STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경부(120)는, 여기파장 빔 발생장치(111)로부터 발생된 여기파장 빔을 DM(Dichroic Mirror, 121)을 통과시킨 후 측정대상(10)에 포커싱하고, 이와 동시에 STED 빔 발생장치(112)로부터 발생된 STED 빔을 위상마스크(PM; Phase Mask, 122) 및 DM(Dichroic Mirror, 123)을 통과시킨 후 측정대상(10)에 포커싱(Focusing)하여 측정대상(10)이 형광발광하게 하여, 측정대상(10)의 이미지 정보를 획득할 수 있다.The STED (Stimulated Emission Depletion) microscope section 120 focuses the excitation wavelength beam generated from the excitation wavelength
더욱 구체적으로, 여기파장 빔은 대물렌즈(objective lens)에 의해 포커싱되어 형광단(fluorophore)을 여기시키고, STED 빔은 위상마스크(PM; Phase mask)에 의해 도넛모양의 단면을 지닌 후 동일하게 렌즈에 의해 형광단에 포커싱 된다. 여기서 여기파장 빔은 형광단의 전자를 여기시켜 높은 에너지준위로 올리고, STED 빔은 여기된 에너지준위를 내리면서 방출되는 에너지가 STED 빔과 같은 파장이 방출되도록 한다. 따라서, STED 빔의 도넛모양 가운데를 제외한 나머지 영역의 형광단은 본래의 형광발광현상이 억제(depletion)되고, 가운데 국소 영역에서만 영광반응이 일어나게 된다. 결과적으로, 여기파장 빔만을 쓴 경우(공초점현미경의 경우)의 형광발광 영역보다 적은 영역의 형광발광만이 일어나기 때문에 초고해상도 형광발광이 가능하다.More specifically, the excitation wavelength beam is focused by an objective lens to excite a fluorophore, and the STED beam has a donut-shaped cross section by a phase mask (PM) As shown in FIG. Here, the excitation wavelength excites the electrons of the fluorescent end to the high energy level, and the STED beam causes the energy emitted as the excited energy level is lowered to emit the same wavelength as the STED beam. Therefore, the fluorescence ends of the remaining regions except for the center of the donut shape of the STED beam are depletion of the original fluorescence emission phenomenon, and a glitter reaction occurs only in the middle local region. As a result, since only fluorescence emission in a region smaller than the fluorescence emission region in the case of using only the excitation wavelength beam (in the case of confocal microscope) occurs, ultra-high resolution fluorescence emission is possible.
디지털 홀로그래픽(Digital Holographic) 현미경부(130)는, STED 빔 발생장치(112)로부터 발생된 STED 빔을 BS(Beam Splitter, 131)를 이용하여 두 경로로 나눈 후, 하나의 경로는 레퍼런스 빔(Reference Beam)으로서 측정센서(132)로 향하고, 나머지 경로는 시그널 빔(Signal Beam)으로서 측정대상(10)을 향하며, 측정대상(10)을 투과하여 광경로 변조가 발생된 시그널 빔과 레퍼런스 빔을 바탕으로 홀로그램 정보를 획득할 수 있다.The digital holographic microscope 130 divides the STED beam generated from the
또한, 산술처리부(140)는, STED현미경부(120)와 디지털 홀로그래픽 현미경부(130)를 통해 획득한 측정대상의 이미지 정보와 홀로그램 정보를 바탕으로 측정대상(10)의 이미지 정보를 복원하고 정량적 위상 정보를 산출할 수 있다.
The
상기 언급한 본 실시예에 따른 구성을 바탕으로, 이하에서는 측정대상(10)을 측정하는 과정을 상세히 설명하기로 한다.The process of measuring the
도 3을 참조하면, 빔 발생부(110)의 여기파장 빔 발생장치(111)에서 발생되는 여기파장 빔은, 도 3에 도시된 바와 같이 녹색 선 경로와 같이 입사된다. 또한, STED 빔은 STED 빔 발생장치(112)로부터 발생되어 빨간 선 경로와 같이 입사된다.Referring to FIG. 3, the excitation wavelength beam generated by the excitation
상기 언급한 여기파장 빔과 STED 빔은 CW레이저 또는 일반적으로 활용되는 펄스레이저일 수 있다. 펄스레이저의 경우 STED 빔의 펄스값은 100 ps 내지 1 ns 범위 내의 값이 바람직하다. 이때, 측정대상에 적용되는 형광의 디플레션(depletion)효과가 가장 두드러지는 영역에 맞도록 설정됨이 가장 바람직하다.The above-mentioned excitation wavelength beam and the STED beam may be a CW laser or a pulsed laser generally used. For pulsed lasers, the pulse value of the STED beam is preferably in the range of 100 ps to 1 ns. At this time, it is most preferable that the depletion effect of the fluorescence applied to the object to be measured is set to match the region where the depletion effect is most conspicuous.
상기 언급한 여기파장과 STED 파장은 각각 형광염료의 흡수파장과 이에 벗어나는 파장으로 선정하되, STED 파장의 경우 형광염료의 디플리션 효과가 충분히 일어날 수 있는 파장을 선택해야 한다. 예를 들어, ATTO 647N 형광염료를 사용하는 경우에, 여기파장은 632 nm를, STED 파장은 750 nm 또는 780 nm를 사용함이 일반적이다.The above-mentioned excitation wavelength and STED wavelength should be selected as the absorption wavelength of the fluorescent dye and the wavelength deviating therefrom, respectively. In case of the STED wavelength, the wavelength at which the depletion effect of the fluorescent dye can sufficiently occur should be selected. For example, when an ATTO 647N fluorescent dye is used, it is common to use an excitation wavelength of 632 nm and a STED wavelength of 750 nm or 780 nm.
한편, 도 3에 도시된 바와 같이, 여기파장 빔은 DM(Dichroic Mirror)에서 반사되어 대물렌즈를 통해 측정대상(10)에 포커싱된다.On the other hand, as shown in FIG. 3, the excitation wavelength beam is reflected by a DM (Dichroic Mirror) and focused on the
또한, STED 빔은 위상마스크(PM; Phase Mask)를 지나면서, 도 4에 도시된 바와 같이, 가운데 빛의 세기값이 0 인 도넛형태 빔을 형성한다. 이후, DM(Dichroic Mirror)을 통해 반사된 빛은 여기파장 빔의 경로와 같이 측정대상에 포커싱되고, 도 4에 도시된 바와 같이, 형광영역에서 가운데 부분을 제외한 영역을 디플레션(depletion)하여 가운데 부분만을 형광발광하도록 한다. 이때 상기 언급한 위상마스크(PM; Phase Mask, 122)는 VPP(Vortex Phase Plate) 또는 SLM(Spatial Light Modulator; 공간 빛 변조기)에 해당하는 것 일 수 있다.Also, the STED beam passes through a phase mask (PM) and forms a donut-shaped beam having a center light intensity value of 0 as shown in FIG. Then, the light reflected through the DM (Dichroic Mirror) is focused on the object to be measured like the path of the excitation wavelength beam, and as shown in FIG. 4, the region excluding the center portion in the fluorescent region is depletion, Only the fluorescent light is emitted. Here, the phase mask (PM) 122 may be a Vortex Phase Plate (VPP) or a Spatial Light Modulator (SLM).
포커싱된 여기파장 빔을 통해 형광염료는 형광을 발광하여 같은 대물렌즈로 집광되어 거꾸로 진행한다. 이후, 형광파장을 투과하는 DM(Dichroic Mirror)를 지나 각종 측정센서(124)가 받는다. 이렇게 획득한 측정대상(10)의 이미지 정보는, 산술처리부(140)에 송신되어, 운용자의 의도에 따라 가공될 수 있다.Through the focused excitation wavelength beam, the fluorescent dye emits fluorescence and is converged by the same objective lens and proceeds inversely. Thereafter,
측정대상(10)이 고정된 스테이지(150)는, 측정대상(10)의 위치를 수평방향(X방향), 수직방향(Y방향) 및 높이방향(Z방향)으로 이동시킴으로써, 측정대상의 각 점의 정보를 손쉽게 검출할 수 있다.The
한편, 디지털 홀로그램 데이터를 획득하기 위해, STED 빔은 위상마스크(122)를 통과하기 전에 빔 스플리터(BS; Beam Splitter, 131)를 통해 갈라져, 측정대상(10)으로 곧장 향한다. 측정대상(10)에 입사되기 전 빔 스플리터(BS; Beam Splitter, 131)를 통해 두 경로로 나뉘게 되는데, 측정센서(124)로 향하는 레퍼런스 빔(Reference beam)과 측정대상(10)을 일루미네이션(illumination) 하는 시그널 빔(Signal beam)으로 갈린다. 시그널 빔(Signal beam)은 투명한 샘플을 지나면서 광경로의 변조가 발생하게 되고, 이를 대물렌즈로 받아서 측정센서(124) 앞 빔 스플리터(BS; Beam Splitter,131)에서 레퍼런스 빔(Reference beam)과 만나 측정센서(124)에서 간섭을 통해 홀로그램을 형성한다. 이렇게 획득한 홀로그램 데이터는, 산술처리부(140)로 송신되어 수치적 방법을 통해 이미지 복원과 정량적 위상 정보 획득의 과정을 거친다.On the other hand, in order to obtain the digital hologram data, the STED beam is split through a beam splitter (BS) 131 before passing through the
상기 언급한 바와 같이, 산술처리부는 각 측정센서(124, 132)를 통해 획득한 데이터를 바탕으로, 도 5에 도시된 바와 같이, 정량적 위상과 형광 이미지를 융합한 데이터를 획득할 수 있고, 경우에 따라서, 측정대상에 대한 다양한 종류의 측정데이터를 획득할 수 있다.As described above, the arithmetic processing unit can acquire data fused with the quantitative phase and fluorescence image, as shown in Fig. 5, based on the data obtained through the
경우에 따라서, 측정대상의 동일한 부분에 대한 서로 다른 종류의 측정 데이터를 획득하면서, 이와 동시에 시간의 흐름에 따른 측정 데이터의 변화를 추적 가능하다.
In some cases, different types of measurement data for the same part of the measurement object may be acquired while at the same time the change of the measurement data over time may be tracked.
이상의 본 발명의 상세한 설명에서는 그에 따른 특별한 실시예에 대해서만 기술하였다. 하지만 본 발명은 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.In the above description of the present invention, only specific embodiments thereof are described. It is to be understood, however, that the invention is not to be limited to the specific forms thereof, which are to be considered as being limited to the specific embodiments, but on the contrary, the intention is to cover all modifications, equivalents, and alternatives falling within the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. .
즉, 본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
That is, the present invention is not limited to the above-described specific embodiment and description, and various changes and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims. And such variations are within the scope of protection of the present invention.
10: 측정대상
100: 현미경시스템
110: 빔 발생부
111: 여기파장 빔 발생장치
112: STED 빔 발생장치
120: STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경부
121: DM(Dichroic Mirror)
122: 위상마스크(PM; Phase Mask)
123: DM(Dichroic Mirror)
124: 측정센서
130: 디지털 홀로그래픽(Digital Holographic) 현미경부
131: BS(Beam Splitter)
132: 측정센서
140: 산술처리부
150: 스테이지10: Measurement target
100: Microscope system
110: beam generator
111: excitation wavelength beam generator
112: STED beam generator
120: STED (Stimulated Emission Depletion) microscope part
121: DM (Dichroic Mirror)
122: Phase Mask (PM)
123: DM (Dichroic Mirror)
124: Measuring sensor
130: Digital Holographic Microscope
131: Beam splitter (BS)
132: Measurement sensor
140: Arithmetic processing unit
150: stage
Claims (8)
여기파장 빔 발생장치(111)로부터 발생된 여기파장 빔을 DM(Dichroic Mirror, 121)을 통과시킨 후 측정대상(10)에 포커싱하고, 이와 동시에 STED 빔 발생장치(112)로부터 발생된 STED 빔을 위상마스크(PM; Phase Mask, 122) 및 DM(Dichroic Mirror, 123)을 통과시킨 후 측정대상(10)에 포커싱(Focusing)하여 측정대상(10)이 형광발광하게 하여, 측정대상(10)의 이미지 정보를 획득하는 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경부(120);
STED 빔 발생장치(112)로부터 발생되고 형광단의 흡수파장에서 벗어난 STED 빔을 BS(Beam Splitter, 131)를 이용하여 두 경로로 나눈 후, 하나의 경로는 레퍼런스 빔(Reference Beam)으로서 측정센서(132)로 향하고, 나머지 경로는 시그널 빔(Signal Beam)으로서 측정대상(10)을 향하며, 측정대상(10)을 투과하여 광경로 변조가 발생된 시그널 빔과 레퍼런스 빔을 바탕으로 홀로그램 정보를 획득하는 디지털 홀로그래픽(Digital Holographic) 현미경부(130); 및
상기 STED현미경부(120)와 디지털 홀로그래픽 현미경부(130)를 통해 획득한 측정대상의 이미지 정보와 홀로그램 정보를 바탕으로 측정대상(10)의 이미지 정보를 복원하고 정량적 위상 정보를 산출하는 산술처리부(140);
를 포함하고,
상기 위상마스크(PM; Phase Mask, 122)는, STED 빔 중앙부 빛의 세기 값이 0이 되도록, STED 빔을 도넛 형태의 빔으로 형성시키는 것을 특징으로 하는 현미경시스템(100).
A beam generating unit 110 including an excitation beam generating device 111 and a STED beam generating device 112;
The excitation wavelength beam generated from the excitation wavelength beam generating device 111 is passed through a DM (Dichroic Mirror) 121 and then focused on the measurement object 10 and simultaneously the STED beam generated from the STED beam generating device 112 After passing through a phase mask (PM) 122 and a DM (Dichroic Mirror) 123, the measurement target 10 is focused on the measurement target 10 to cause the measurement target 10 to emit fluorescence, An STED (Stimulated Emission Depletion) microscope 120 for acquiring image information;
The STED beam generated from the STED beam generating device 112 and deviating from the absorption wavelength of the fluorescence end is divided into two paths using a BS (Beam Splitter) 131, and one path is used as a reference beam And the remaining path is a signal beam that is directed toward the measurement target 10 and acquires the hologram information based on the signal beam transmitted through the measurement target 10 and the optical path modulation generated and the reference beam A digital holographic microscope unit 130; And
An arithmetic processing unit for restoring the image information of the measurement object 10 based on the image information of the measurement object and the hologram information acquired through the STED microscope unit 120 and the digital holographic microscope unit 130, (140);
Lt; / RTI >
Wherein the phase mask (PM) 122 forms the STED beam into a donut-shaped beam such that the STED beam center intensity value is zero.
상기 위상마스크(PM; Phase Mask, 122)는 VPP(Vortex Phase Plate) 또는 SLM(Spatial Light Modulator; 공간 빛 변조기)에 해당하는 것을 특징으로 하는 현미경시스템.
The method according to claim 1,
Wherein the phase mask (PM) 122 corresponds to a Vortex Phase Plate (VPP) or a Spatial Light Modulator (SLM).
상기 여기파장 빔(Excitation Beam) 및 STED 빔은, CW레이저 또는 펄스레이저인 것을 특징으로 하는 현미경시스템.
The method according to claim 1,
Wherein the excitation beam and the STED beam are a CW laser or a pulsed laser.
상기 펄스레이저의 펄스 값은 10 fs(femtosecond) 내지 900 ps(picoseconds)이고,
측정대상(10)에서 발생하는 형광 디플레션(Depletion) 효과가 일어나는 영역에 대응되도록 설정되는 것을 특징으로 하는 현미경시스템.
5. The method of claim 4,
The pulse value of the pulse laser is 10 fs (femtosecond) to 900 ps (picoseconds)
Is set so as to correspond to a region where a fluorescence depletion effect occurring in the measurement target (10) occurs.
상기 여기파장 빔의 펄스 값은, 측정대상(10)에 적용되는 염료의 흡수파장에 대응되는 펄스 대역의 펄스 값인 것을 특징으로 하는 현미경시스템.
5. The method of claim 4,
Wherein the pulse value of the excitation wavelength beam is a pulse value of a pulse band corresponding to an absorption wavelength of the dye applied to the measurement target (10).
상기 STED 빔 의 펄스 값은 100 ps 내지 1 ns이고,
측정대상(10)에서 발생하는 형광 디플레션(Depletion) 효과가 일어나는 영역에 대응되도록 설정되는 것을 특징으로 하는 현미경시스템.
5. The method of claim 4,
The pulse value of the STED beam is 100 ps to 1 ns,
Is set so as to correspond to a region where a fluorescence depletion effect occurring in the measurement target (10) occurs.
상기 현미경시스템(100)은:
측정대상(10)을 상부에 고정시키고, 측정대상(10)의 위치를 수평방향(X방향), 수직방향(Y방향) 및 높이방향(Z방향)으로 이동시키는 스테이지(150)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 현미경시스템.
The method according to claim 1,
The microscope system 100 comprises:
Further includes a stage 150 which fixes the measurement target 10 on the upper side and moves the position of the measurement target 10 in the horizontal direction (X direction), the vertical direction (Y direction) and the height direction (Z direction) And the microscope system.
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