KR101701927B1 - 종양-표적화 및 침투력 증진을 위한 생체고분자 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보론산기 포함 화합물 및 데옥시콜산이 콘드로이친황산 A에 결합된 생체고분자 화합물, 상기의 생체고분자 화합물을 포함하는 종양-표적화 및 침투력 증진을 위한 생체고분자 나노입자 및 상기 생체고분자 나노입자를 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 생체고분자 화합물, 생체고분자 나노입자, 및 암 또는 종양 치료용 약학 조성물은 암 치료 및 진단에 대한 나노시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

종양-표적화 및 침투력 증진을 위한 생체고분자 나노입자 및 이의 제조방법{Biopolymer-based nanoparticles for enhanced tumor-targeting and penetration and processes for the preparation thereof}
본 발명은 종양-표적화 및 침투력 증진을 위한 생체고분자 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 종양-표적화 및 침투력 증진을 위한 생체고분자 화합물, 이를 포함하는 생체고분자 나노입자(nanoparticle, NP) 및 이를 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
종양으로 적정량의 약물을 선택적으로 전달하는 것은 암치료 화학요법의 주된 목표이다. 수동적 종양 표적화 전략으로서 종양으로의 투과 상승 및 저류(enhanced permeability and retention, EPR) 효과가 이용될 수 있으며, 이러한 효과는 신생혈관형성(angiogenesis) 및 미성숙 림프계로 특징지어지는 종양의 비정상적 혈관 구조에 기반하는 것이다.
적합한 물리화학적 성질(예를 들어, 입자 크기, 형태, 및 표면 전하)을 가지는 나노전달체(nanocarrier)는 EPR 효과에 의해 종양에 축적되게 된다. 그러나, EPR 효과에 기반한 수동적 종양 표적화는 비특이적 방법으로, 종양-특이적 표적 잔기에 의한 선택적 종양 표적화를 증진시키기 위하여 이들이 나노전달체에 도입되고 있다. 이와 같이, 암세포에서 과발현되어 있는 수용체와 상호작용할 수 있는 종양-특이적 리간드(예를 들어, 저분자 화합물, 펩티드 및 항체)를 공유결합시키는 것을 능동적 종양 표적화 전략이라고 하며, 수동적 종양 표적화 전략과 함께 일반적으로 사용되어 왔다.
이러한 종양-표적화 전략을 사용하면 어느 정도의 항암 효능을 나타낼 수 있지만, 임상적으로 효과적인 치료를 위하여는 치료제가 종양 전반적으로 균일하게 분포되는 것이 요구된다. 그러나, 고형 종양으로의 약물의 전달은 종양의 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM) 경도의 증가 및 높은 세포간질액 압력(interstitial fluid pressure, IFP)과 같은 종양 특이적 특징에 의해 저해된다. 즉, 종양에서의 비정상적 ECM 및 높은 IFP는 종양 내부(core)로의 항암제 침투를 어렵게 한다. 따라서, 종양 내부로 항암제를 성공적으로 분포시킨다면 암 치료능을 증가시킬 수 있을 것이고, 더 나아가 암의 전이 및 재발을 방지할 수 있을 것이다.
고형 종양의 단단한 ECM 및 높은 IFP의 극복을 위하여 이용될 수 있는 몇가지 전략으로서, 효소를 이용하여 ECM을 분해시키는 방법(즉, 히알루로니데이즈(hyaluronidase) 및 콜라게네이즈(collagenase)의 사용); 종양-표적화 리간드를 도입하는 방법(즉, 엽산(folic acid)의 사용); 및 IFP를 감소시키는 물질을 사용하는 방법(즉, 혈관 표적화 물질, 혈관 파열화 물질, 혈관확장제, 종양 크기 증가 인자-베타 억제제의 사용) 등이 있다.
그러나, 현재까지 알려진 종양-표적화 전략으로서 암 세포 내부(코어)로의 충분한 약물 전달이 이루어지고 있지 않으며, 보다 효과적으로 균일하게 암 세포로의 항암 약물 전달을 달성할 수 있는 전략이 요구된다.
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본 발명자들은 암 세포 또는 종양 내부로 균일하게 약물이 전달될 수 있는 나노입자에 대하여 연구하던 중, 보론산(boronic acid)기 포함 화합물 및 데옥시콜산(deoxycholic acid, DOCA)이 콘드로이친황산 A(chondroitin sulfate A, CSA)에 결합된 생체고분자 화합물을 포함하는 생체고분자 나노입자가 EPR 효과를 이용하기에 적합한 평균 입자경을 가지고, 지속적인 약물 방출 양상을 나타내며, 개선된 세포내로의 도입율을 나타낼뿐만 아니라, 우수한 종양 표적화, 우수한 종양 침투능 및 우수한 항-종양 효능을 나타냄으로써, EPR 효과에 의한 수동적 종양 표적화 및 콘드로이친황산 A 및 CD44 수용체 간의 상호작용에 의한 능동적 종양 표적화를 달성하고, 보론산 및 시알산 간의 상호작용에 의하여 효과적으로 종양 표적화 및 종양내 침투도 증진 효과를 달성할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 보론산기 포함 화합물 및 데옥시콜산이 콘드로이친황산 A에 결합된 생체고분자 화합물, 상기의 생체고분자 화합물을 포함하는 종양-표적화 및 침투력 증진을 위한 생체고분자 나노입자 및 상기 생체고분자 나노입자를 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 보론산 기 포함 화합물 및 데옥시콜산이 콘드로이친황산 A에 결합된 생체고분자 화합물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 보론산기 포함 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 하기 R은 3-아미노메틸페닐일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015038121511-pat00001
[상기 식에서 R은 3-아미노메틸페닐, 4-아미노메틸페닐, 3-아미노페닐 또는 4-아미노페닐이다.]
일 구현예에서, 상기 보론산기 포함 화합물은 1 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 태양에 따라, 상기의 생체고분자 화합물을 포함하는 종양-표적화 및 침투력 증진을 위한 생체고분자 나노입자가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 생체고분자 나노입자는 50 ∼ 400 nm의 평균 입자경을 가질 수 있으며, 암 또는 종양 치료용 약물을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 태양에 따라, 상기 생체고분자 나노입자를 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 암 또는 종양은 폐암, 유방암, 간암, 뇌종양, 피부암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 태양에 따라, (a) 콘드로이친황산 A의 카르복실산 기에 데옥시콜산을 결합시켜 콘드로이친황산 A-데옥시콜산 공유결합체를 제조하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 콘드로이친황산 A-데옥시콜산 공유결합체의 카르복실산 기에 보론산기 포함 화합물을 결합시켜 콘드로이친황산 A-데옥시콜산-보론산기 포함 화합물 공유결합체를 제조하는 단계를 포함하는 생체고분자 화합물의 제조방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 일 태양에 따라, (a) 상기 생체고분자 화합물을 용매에 용해시키는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 용액에서 용매를 휘발시키는 단계를 포함하는 생체고분자 나노입자의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 의해, 보론산기 포함 화합물 및 데옥시콜산이 콘드로이친황산 A에 결합된 생체고분자 화합물을 포함하는 생체고분자 나노입자가, EPR 효과를 이용하기에 적합한 평균 입자경을 가지고, 좁은 입도분포, 음(-)의 표면전하, 및 구형 형태를 나타내며, 지속적인 약물 방출 양상을 나타내어 약물의 감소된 투여 빈도 및 개선된 약리학적 효능 달성을 가능하게 할 뿐만 아니라, 약산성 pH에서 증진된 약물 방출을 나타냄으로써, 항종양 효능의 증진 및 원하지 않는 부작용의 감소를 달성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 생체고분자 나노입자가 세포내로의 약물의 도입율 개선, 고형 종양 내부로 균질한 약물 분포, 우수한 종양 성장 억제 효과, 우수한 종양 표적화 및 침투능에 의한 약물 종양 선택적 전달, 우수한 항-종양 효능 및 증가된 세포사멸을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 생체고분자 화합물, 생체고분자 나노입자 및 이를 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물은 EPR 효과에 의한 수동적 종양 표적화 및 콘드로이친황산 A-CD44 수용체 및 보론산-시알산 간의 상호작용에 의하여 능동적 종양 표적화 및 증진된 종양 침투도를 달성하여 암 치료 및 진단에 대한 나노시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 CSA-DOCA-AMPB 공유결합체(conjugate) 합성에 대한 반응식(A) 및 합성된 CSA-DOCA-AMPB의 1H-NMR 스펙트럼(B)이다. 'a'(1.8 ppm), 'b'(0.6 ppm), 및 'c'(7.6-7.7 ppm)의 피크는 각각 CSA, DOCA, 및 AMPB 기를 나타낸다.
도 2는 CSA-DOCA/DOX NP 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP의 평균 입자경에 따른 입도 분포(%)(A) 및 2개 NP군의 TEM 사진(기준자의 길이는 200 nm임)(B)이다.
도 3은 pH 7.4, 6.8, 및 5.5에서 배양 시간에 따라 CSA-DOCA NP 및 CSA-DOCA-AMPB NP로부터 방출되는 약물(DOX)의 방출량(%)을 나타낸 그래프이다(평균±표준편차, n = 3).
도 4는 대조군(control, 약물 비처리), DOX 용액(DOX solution), CSA-DOCA/DOX NP 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP(DOX 100 μM에 해당함)를 A549 세포에서 1시간 동안 배양한 후, A549 세포내로의 도입율을 측정한 공초점 주사 레이져 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM) 사진이다('+sialic acid'는 배양 세포에 첨가하기 전에 NP 현탁액과 유리 시알산(500 μM)을 전-배양(pre-incubation) 처리한 군을 의미하고, 파랑색 및 붉은색은 각각 DAPI 및 DOX를 나타내며, 기준자의 길이는 10 μm임).
도 5는 A549 스페로이드(spheroid) 모델에서 Cy5.5-표지된 NP(CSA-DOCA/DOX NP 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP)를 24시간 배양한 후에 관찰한 CLSM 사진(기준자의 길이는 200 μm임)(A), 배양 시간(4일)에 따른 스페로이드의 광학 사진(기준자의 길이는 200 μm임)(B) 및 배양 시간(4일)에 따른 A549 스페로이드의 크기 증가 양상을 나타낸 그래프(평균±표준편차, n = 5, 다른 그룹과 비교시 *p < 0.05)(C)이다.
도 6은 Cy5.5-표지된 CSA-DOCA/DOX NP 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP를 A549 종양-이종이식된 마우스 모델에 꼬리 정맥으로 투여한 후, 0(투여 전), 1, 3, 6, 및 24 시간에 촬영한 근적외선 형광(near-infrared fluorescence, NIRF) 전신 스캔 사진(붉은색 점선 표시 원이 종양 부위를 나타냄)(A) 및 시간에 따른 종양 부위에서의 형광 강도(fluorescence intensity, photon counts/mm2)의 양상을 나타낸 그래프(평균±표준편차, n = 3)(B)이다.
도 7은 Cy5.5-표지된 CSA-DOCA/DOX NP 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP를 A549 종양-이종이식된 마우스 모델에 정맥 주사한 후, 24시간에서의 각 군의 종양 조직의 Z축 기준 사진(A) 및 종양 조직에서의 형광 광도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프(평균±표준편차, n = 3, CSA-DOCA/DOX NP 그룹과 비교시 #p < 0.05)(B)이다.
도 8은 A549 종양-이종이식된 마우스 모델에 DOX 용액, CSA-DOCA/DOX NP 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP를 12, 14, 16, 18, 및 20일에 정맥주사한 후, 24일 동안 시간에 따른 종양 부피(mm3) 양상을 나타낸 그래프(평균±표준편차, n = 4, 다른 그룹과 비교시 *p < 0.05)(A), 시간에 따른 체중 변화(g)를 나타낸 그래프(B), 투여 후 24일 후의 각 그룹의 종양 부위 사진(C) 및 투여 후 24일 후의 각 그룹의 종양/심장 조직을 염색한 현미경 사진(종양의 H&E 염색(I), 종양의 TUNEL 시험(II), 및 심장의 H&E 염색(III))(D)이다.
본 발명은 보론산기 포함 화합물 및 DOCA이 CSA에 결합된 생체고분자 화합물을 제공한다.
본 발명에서는 (ⅰ) EPR 효과에 의한 수동적 종양 표적화 및 (ⅱ) CSA 및 CD44 수용체 간의 상호작용에 의한 능동적 종양 표적화를 달성하고, (ⅲ) 암 세포 내 도입 및 종양 내부로의 약물 침투를 용이하게 하기 위하여 보론산 및 시알산 간의 상호작용을 이용한다.
(ⅰ) EPR 효과에 의한 수동적 종양 표적화는 하기 기술할 생체고분자 나노입자에 의하여 달성할 수 있다.
(ⅱ) 능동적 종양 표적화는 암 세포에 발현된 CD44 수용체에 결합한다고 알려져 있는 CSA를 생체고분자 화합물의 친수성 골격(hydrophilic backbone)으로 사용함으로써 달성할 수 있다. 구체적으로, 소수성 펜던트(pendant) 기인 DOCA를 친수성인 CSA에 공유결합시켜 양친매성 CSA-DOCA 공유결합체(CSA-DOCA conjugate)를 제조하여 사용할 수 있다.
(ⅲ) 보론산 및 시알산 간의 상호작용으로 매개된 암 세포 내 도입 및 종양 침투 전략은 상기에서 제조된 양친매성 CSA-DOCA 공유결합체에 보론산(예를 들어, 페닐보론산[AMPB])을 공유결합시켜 CSA-DOCA-AMPB 공유결합체를 형성함으로써 달성될 수 있다.
상기 전략은 시알산-표적화를 이용하여 나노전달체의 종양 세포내 도입 및 종양 조직내 수송을 증진시키는 전략이다. 암 세포에는 시알화된 에피토프(sialylated epitope)[N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid) 포함 글리칸 체인 등]가 과발현되며, 이들이 암의 전이, 진행, 세포사멸 및 화학요법에 대한 내성에 관여하는 것으로 보고된 바 있으며, 이러한 시알화된 에피토프에 대한 보론산의 상호작용을 매개로 한다.
하기 개념도는 모델 약물로서 독소루비신(DOX)을 사용하여 DOX가 함유된 CSA-DOCA-AMPB NP의 종양 표적화 및 침투 전략을 개략적으로 나타낸다. 구체적으로, CSA-DOCA에 페닐보론산이 공유결합되어 형성된 CSA-DOCA-AMPB는 암 세포 표면에 있는 시알산과 상호작용하여 보론산염 에스테르를 형성할 수 있다.
[개념도]
Figure 112015038121511-pat00002
본 발명에서 사용되는 보론산기 포함 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 하기 R은 3-아미노메틸페닐일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015038121511-pat00003
[상기 식에서 R은 3-아미노메틸페닐, 4-아미노메틸페닐, 3-아미노페닐 또는 4-아미노페닐이다.]
보론산(예를 들어, 페닐보론산)은 암 세포에 발현되어 있는 시알산을 선택적으로 인식할 수 있으므로, 종양-표적화 잔기로서 사용될 수 있다. 상기 페닐보론산은 시알산과 복합체를 형성할 수 있으며, 이러한 복합체 형성은 보론의 삼방정계(trigonal) 구조에 의해 가능하며, 종양-표적화 잔기로서 선호되는 이유이다. CSA-DOCA에 페닐보론산이 공유결합되어 형성된 CSA-DOCA-AMPB는 암 세포 표면에 있는 시알산과 상호작용하여 보론산염 에스테르를 형성할 수 있다.
보론산 및 시알산의 복합체는 B-O 결합을 통한 분자내 안정화에 기반하는 것으로 알려져 있다. 보론산이 풍부한 NP는 3차원으로 배양한 다세포 원주체(MCS) 모델에서 개선된 DOX 침투 효율을 나타내는 것으로 알려져 있다. 보론산 및 시알산 복합체의 형성은 종양의 주변부에서 중간부로, 궁극적으로는 괴사성 코어 부위로의 NP의 이동에 원동력으로 작용할 수 있다. 약물 및 고분자의 종양내 균일한 분포는 효과적인 암 치료에 있어서 필수적 요건이지만, 종양에서의 상승된 세포간 압력에 의해서 제한된다. 보론산 및 시알산 간의 상호작용은 이러한 세포간 압력을 극복하여 약물 및 NP의 보다 균질한 분포를 달성할 수 있다. 종양 조직 내부로 항암제가 포함된 NP를 침투시키는 것은 효과적으로 종양의 성장을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 보론산기 포함 화합물은 바람직하게는 1 내지 5 중량%, 더욱 바람직하게는 2 내지 3 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생체고분자 화합물은 (a) CSA의 카르복실산 기에 DOCA을 결합시켜 CSA-DOCA 공유결합체를 제조하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 CSA-DOCA 공유결합체의 카르복실산 기에 보론산기 포함 화합물을 결합시켜 CSA-DOCA-보론산기 포함 화합물 공유결합체를 제조하는 단계를 포함하는 생체고분자 화합물의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 단계(a)는 CSA에 DOCA를 공유결합시킴으로써 CSA-DOCA 공유결합체를 제조하는 단계이다(도 1(A) 참조). CSA의 카르복실산 기와 반응할 수 있는, 통상적으로 사용되는 기능기를 이용하여 CSA에 DOCA를 공유결합시킬 수 있다. 예를 들어, 아민기를 이용한 아미드 결합 또는 에스터 결합을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 에틸렌디아민을 이용한 아미드 결합 형성을 통하여 CSA에 DOCA를 공유결합시킬 수 있다. 즉, DOCA에 에틸렌디아민을 결합시키기 위하여, 우선 DOCA의 카르복실산 기를 메틸 에스테르로 변환시켜 메틸데옥시콜산(DOCA-OMe)을 제조한 후, 친핵성 치환(nucleophilic substitution)을 통하여 메톡시 기(methoxy group)를 에틸렌디아민 링커로 교체하여 에틸렌디아민-수식된 DOCA(EtDOCA)를 제조할 수 있다. 얻어진 생성물인 EtDOCA를 EDC 및 NHS-매개 커플링 반응을 이용하여 CSA에 공유결합시켜 CSA-DOCA 공유결합체를 제조할 수 있다.
상기 단계(b)는 단계(a)에서 얻어진 CSA-DOCA 공유결합체의 카르복실산 기에 보론산기 포함 화합물을 공유결합시킴으로써 CSA-DOCA-보론산기 포함 화합물 공유결합체를 제조하는 단계이다(도 1(A) 참조). 단계(a)에서 얻어진 CSA-DOCA 공유결합체의 카르복실산 기와 반응할 수 있는, 통상적으로 사용되는 기능기를 이용하여 CSA-DOCA 공유결합체에 보론산기 포함 화합물을 공유결합시킬 수 있다. 예를 들어, 아미드 결합 또는 에스터 결합을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 보론산기 및 아민기 포함 화합물을 이용한 아미드 결합 형성을 통하여 CSA-DOCA 공유결합체에 보론산기 포함 화합물을 공유결합시킬 수 있다. 즉, 1차 아민 기를 가지는 염화 (3-아미노메틸페닐)보론산(3-aminomethylphenyl)boronic acid hydrochloride, AMPB)를 EDC 및 NHS-매개 커플링 반응을 이용하여 CSA-DOCA 공유결합체에 추가로 공유결합시켜 CSA-DOCA-AMPB 공유결합체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 태양에 따라, 상기의 생체고분자 화합물을 포함하는 종양-표적화 및 침투력 증진을 위한 생체고분자 나노입자가 제공된다.
상기의 생체고분자 화합물은 수성 환경에서 임계회합농도(critical aggregation concentration) 이상에서 NP을 형성할 수 있다.
상기 NP는 (a) 상기 생체고분자 화합물을 용매에 용해시키는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 용액에서 용매를 휘발시키는 단계를 포함하는 생체고분자 나노입자의 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기와 같이 제조된 생체고분자 나노입자는 바람직하게는 50 ∼ 400 nm의 평균 입자경, 더욱 바람직하게는 100 ∼ 300 nm의 평균 입자경을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
선행문헌(비특허문헌 17, 18, 20)에는 양친매성 히알루론산 올리고머 및 키토산 올리고당에 기반한 자가-회합성(self-assembled) NP는 입자 크기 <200 nm를 가지는 것으로 개시되어 있으며, 종양 표적화를 통한 생체내 항암 효능을 나타내는 것으로 개시하고 있다. 본 발명의 CSA NP 또한 유사한 물리화학적 성질을 나타내는 것으로 확인되었으며(도 2(A) 참조), 이에 따라 종양 표적화 및 항종양 효능을 나타내는 것으로 확인되었다. 이로써 제조된 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP의 입자 크기가 수동적 종양 표적화를 목적으로 하는 EPR 효과를 이용하기에 적합하였음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 생체고분자 나노입자는 좁은 입도분포를 나타냈으며(도 2(B) 참조), 음(-)의 표면 전하를 나타냈고, 약 70 내지 80%의 약물 봉입률을 나타냈다(표 1 참조).
본 발명의 생체고분자 나노입자는 암 또는 종양 치료용 약물을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 태양에 따라, 상기 생체고분자 나노입자를 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 암 또는 종양은 폐암, 유방암, 간암, 뇌종양, 피부암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 생체고분자 나노입자는 시험관내 약물 방출 평가에서 약물 방출이 5일 동안 유지되어, 지속적인 방출 양상을 나타내었다. 지속적인 약물 방출 양상은 비경구 제제에 있어서 바람직한 특징이다. 약물의 용액 제제에 비하여, 나노 크기의 제제는 일반적으로 보다 지속적인 약물 방출 양상을 나타내고, 따라서 감소된 투여 빈도 및 개선된 약리학적 효능을 가능하게 한다.
또한, pH 5.5에서 가장 많은 양의 DOX가 방출되어, 투여 후 5일에 pH 5.5에서 방출된 DOX 양은 pH 7.4에서의 양보다 1.91배 높았다(도 3 참조). 이는 pH 5.5, 6.8, 및 7.4이 각각 엔도좀 및 리소좀, 종양 미세환경(microenvironment), 및 정상 생리학적 조건의 pH에 대응된다는 점을 고려할 때, 항암 약물 전달을 위한 NP의 바람직한 특징으로 해석될 수 있다. 즉, 정상 조직/기관에서보다 암 세포에서 더 높은 약물 방출을 나타낸 것은 항종양 효능의 증진 및 원하지 않는 부작용의 감소로 이어질 수 있다.
본 발명의 생체고분자 나노입자는 CSA-CD44 수용체 상호작용 및 페닐보론산-시알산 상호작용의 조합에 의해 약물 도입 정도를 유의성 있게 상승시켰다(도 4 참조). 또한, 페닐보론산 및 시알산 간의 상호작용이 AMPB로 수식된 NP의 세포내로의 도입에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.
본 발명의 생체고분자 나노입자의 암세포주에서의 항-종양 효능 시험 결과, CSA-DOCA-AMPB NP-처리군에서는 CSA-DOCA NP-처리군에 비하여 종양의 모든 부위에서 약물이 분포하는 것으로 나타났다(도 5(A) 참조). 또한, AMPB로 수식된 NP의 종양 성장 억제 효과도 비수식된 NP 처리군에 비하여 높은 것으로 나타나, AMPB로 수식된 NP의 증가된 종양 침투능과 일치하는 결과를 보임을 확인하였다(도 5(B) 및 5(C) 참조). 이러한 결과는 CSA-CD44 수용체 및 페닐보론산-시알산 상호작용에 의해 가능하게 된 수용체-매개 식세포작용 기전에 의해 설명될 수 있을 것이다.
본 발명의 생체고분자 나노입자의 생체내 종양 표적화 및 침투능을 평가한 결과, AMPB로 수식된 NP는 다른 조직 및 기관에 비교하여 종양 부위로의 이동이 현저히 높았으며, 3차원 기법을 이용한 분석 결과에서도 AMPB로 수식된 NP가 종양 내부로 효율적으로 이동하였음을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조). CSA-DOCA-AMPB NP-처리군의 종양에서의 NP 축적이 CSA-DOCA NP-처리군보다 큰 것으로부터 AMPB 수식은 종양 표적화를 증진시킨다는 것을 알 수 있다. CSA 및 CD44 수용체 사이의 상호작용에 기반한 기본적인 종양 표적화와 함께, 보론산 및 시알산 간의 복합체 형성에 의한 특이적인 종양 표적화가 증가된 것으로 추정된다. EPR 효과를 통한 수동적 종양 표적화(즉, 약 200 nm의 평균 입자경)를 위한 NP의 적합성 또한 종양으로의 선택적 분포에 기여한 것으로 보인다. 이러한 종양에서의 축적 증가 및 다른 조직 및 기관으로의 분포 감소는 치료 효능을 증진시키고 원하지 않는 부작용을 감소시키는 효과를 달성할 수 있다. 고형암에서는 세포간 압력이 높기 때문에 단순히 종양의 표면에 도달하는 것만으로 NP가 치료적 효과를 나타내기에는 충분하지 않고, 종양 크기 증가를 완벽히 억제하기 위하여는 종양괴에서의 NP의 균질한 분포가 필요하다는 점을 고려할 때, A549 세포의 2차원 모델 및 3차원 배양 모델에서 각각 관찰된 AMPB로 수식된 NP의 개선된 세포내로의 도입율 및 종양 침투 효율은 근적외선형광영상촬영의 3차원 분석 결과와 잘 일치한다.
또한, 본 발명의 생체고분자 나노입자의 생체내 항-종양 효능을 평가한 결과, AMPB로 수식된 NP-처리군의 종양 부피가 다른 군에서보다 유의성 있게 작게 측정되었으며, 다른 군에 비하여 세포사멸 또한 증가되었음을 확인할 수 있다(도 8 참조). 이와 같은 AMPB로 수식된 NP에 의해 나타난 종양 크기 증가의 억제 효과는 이들의 우수한 종양 표적화 및 침투능으로 설명될 수 있다(도 5 및 도 6 참조).
상기 결과를 요약건대, 보론산을 이용한 종양 표적화는 높은 결합 친화성 및 선택성, 낮은 독성, 낮은 면역원성, 및 경제성과 같은 장점을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. CSA - DOCA - AMPB 공유결합체의 합성 및 확인
(1) 재료
콘드로이친황산 A(chondroitin sulfate A, CSA, 평균 분자량 37 kDa), 데옥시콜산(deoxycholic acid, DOCA), 염화 (3-아미노메틸페닐)보론산(3-aminomethylphenyl)boronic acid hydrochloride, AMPB), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS), 트리에틸아민(triethylamine, TEA), 아가로오스(agarose), 및 중수(deuterium oxide, D2O)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에서; 염화 독소루비신(Doxorubicin HCl, DOX HCl)은 보령제약(Boryung Pharmaceutical Co., Ltd., Seoul, Korea)에서; 근적외선 형광(near-infrared fluorescence, NIRF) 염료, FCR-675(Cy5.5-아민)은 바이오액트(BioActs, DKC Corp., Incheon, Korea)에서; 디메틸술폭시드-d6(dimethyl sulfoxide-d6, DMSO-d6)는 켐브리지 이소토프 레보라토리(Cambridge Isotope Laboratories Inc., Andover, MA, USA)에서; 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)는 대정화금(Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd., Seoul, Korea)에서; 세포배양 배지(RPMI 1640 cell culture medium), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 및 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 집코 라이프 테크놀로지(Gibco Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였으며, 기타 다른 시약은 분석 등급으로 구매하였다.
실시예 및 시험예는 최소 3회 수행하였고, 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 통계적 분석은 양측검정(two-tailed t-test) 또는 분산분석(ANOVA)을 사용하여 수행하였고, p < 0.05을 유의성 있게 상이한 것으로 지칭하였다.
(2) AMPB 로 수식된 CSA - DOCA ( CSA - DOCA - AMPB )의 합성
DOCA-공유결합된 CSA(CSA-DOCA)을 하기와 같이 아미드 결합을 형성하여 합성하였다. DOCA에 에틸렌디아민을 결합시켜 EtDOCA을 형성하고, CSA의 카르복실산 기와 추가적인 반응을 시켰다.
구체적으로, DOCA(1.177 g)를 메탄올(5 mL)에 용해시키고, 여기에 염산(184 μL)을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 섞어주고 60 ℃에서 6시간 동안 환류시킨 다음, 회전증발기(rotary evaporator)에서 농축시켜 진공에서 완전히 건조시켰다. 얻어진 흰색 분말을 얼음-냉수로 세척하고 감압동결건조시켜 메틸데옥시콜산(DOCA-OMe)을 얻었다. 이후, DOCA-OMe을 에틸렌디아민에 용해시켜, 얻어진 용액을 120 ℃에서 환류하면서 8시간 교반한 후, 실온으로 냉각시켰다. 얻어진 혼합물을 물로 침전시켜 여과하였다. 여과물인 EtDOCA를 과량의 물로 추가로 3회 세척한 후 동결건조시켰다.
이후, CSA를 EtDOCA로 수식하여 양친매성 CSA-DOCA를 제조하였다. 즉, CSA(100 mg)를 80 ℃에서 포름아미드(20 mL)에 용해시킨 후 실온으로 냉각시킨 다음, 제조된 용액에 EDC 36.8 mg 및 NHS 61.3 mg을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하여 CSA의 카르복실산 기를 활성화시켰다. 이후, 디메틸포름아미드(DMF, 20 mL)에 용해되어 있는 EtDOCA(34.8 mg)를 천천히 CSA 용액에 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하고, 물 및 메탄올 혼합물(25 ∼ 100%, v/v)에서 3일 동안 투석시킨 후, 감압동결건조시켰다. 얻어진 흰색 분말인 CSA-DOCA를 2 ∼ 8 ℃에 보관하였고, 이후 시험에 사용하였다.
CSA-DOCA-AMPB는 CSA-DOCA에 AMPB를 결합시킴으로써 합성하였다. CSA-DOCA(100 mg)를 DMSO 및 물 혼합물(20 mL, 3:1, v/v)에 용해시키고, EDC(23.0 mg) 및 NHS(13.8 mg)를 가한 후, 얻어진 혼합물을 20분 동안 교반하여 CSA-DOCA의 카르복실산 기를 활성화시켰다. 한편, AMPB(7.5 mg)을 DMSO 및 물 혼합물(20 mL, 3:1, v/v)에 용해시키고, 활성화된 CSA-DOCA 용액에 천천히 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하고 물에서 2일간 투석시킨 후, 감압동결건조시켰다. 얻어진 흰색 분말인 CSA-DOCA-AMPB을 2 ∼ 8 ℃에 보관하였고, 이후 시험에 사용하였다.
(3) CSA - DOCA - AMPB 의 규명
CSA-DOCA-AMPB 중 AMPB 함량을 평가하기 위하여, CSA-DOCA, AMPB, 및 CSA-DOCA-AMPB을 DMSO-d6 및 D2O(3:1, v/v)의 혼합물에 용해시켜 1H-NMR(Varian FT-500 MHz, Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 1H-NMR 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 1(B)에 나타내었다.
도 1(B)에 나타난 바와 같이, 최종 생성물(CSA-DOCA-AMPB)의 1H-NMR 스펙트럼에서 EtDOCA의 특징적인 피크들(0.6 ppm [DOCA의 C18 메틸 기]; 2.5-3.0 ppm [에틸렌 기]; 7.8-8.0 ppm [아민 기])이 나타남으로써 CSA-DOCA의 합성이 성공적으로 수행되었음을 확인하였다. EtDOCA 기의 CSA로의 치환 정도(8.92%)는 피크 'a'(1.8 ppm; CSA의 N-아세틸 기) 및 피크 'b'(0.6 ppm; DOCA의 C18 메틸 기)의 적분값을 비교함으로써 계산하였다.
또한, CSA-DOCA의 카르복실산 기와 반응할 수 있는 1차 아민 기를 가지는 AMPB를 EDC/NHS-매개 아미드 결합 형성을 통하여 CSA-DOCA에 결합시킨 결과, AMPB-CSA-DOCA의 1H-NMR 스펙트럼에서 알 수 있는 바와 같이(도 1B), AMPB의 방향족 양성자(d 및 e, 7.3-7.4 ppm; c 및 f, 7.6-7.7 ppm)를 나타내는 신호가 존재하는 것으로써 CSA-DOCA에 페닐보론산 기가 성공적으로 도입되었음을 알 수 있다.
AMPB 함량을 계산하기 위하여, AMPB/CSA-DOCA 혼합물의 1H-NMR 스펙트럼들에 대하여 단순 선형회귀법(linear regression method)을 사용하였다. AMPB(c: 7.6-7.7 ppm, 페닐 환의 2 및 5 위치에서의 2H) 및 CSA-DOCA(b: 0.6 ppm, DOCA의 C18 메틸 기 유래 3H)의 대표적인 피크를 사용하여 회귀선을 얻었고, 1H-NMR 데이터에 따라 계산한 결과, CSA-DOCA-AMPB에 도입된 AMPB의 함량은 2.35%(w/w)였다.
실시예 2. DOX -포함된 NP 의 제조 및 규명
(1) DOX -포함된 NP 의 제조
DOX 염기를 소수성 모델 약물로 사용하였고, 선행문헌(비특허문헌17)에 기재된 대로 제조하였다. 즉, DOX HCl(100 mg)을 TEA(0.12 mL)와 함께 DMSO(10 mL)에 녹여 DOX 염기를 제조하였고, 얻어진 용액을 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 감압동결건조로 건조시켰다.
CSA-DOCA 또는 CSA-DOCA-AMPB에 기반한 NP를 선행문헌(비특허문헌17)에 기재된 용매증발법에 따라 하기와 같이 제조하였다. DOX(1 mg) 및 각 고분자(7.5 mg)를 DMSO 및 물 혼합물(1 mL, 1:1, v/v)에 용해시킨 후, 70 ℃에서 5시간 동안 N2 기류 하에서 용매를 증발시켰다. 약물 및 고분자 복합체 필름을 증류수(DW, 1 mL)에 재현탁시켜 시린지 필터(0.45 μm pore size)를 통과시켜 여과하였다.
(2) DOX -포함된 NP 의 규명
DOX의 봉입률을 측정하기 위하여, NP 분산체를 DMSO(50배 부피)로 희석시킨 후 약물 함량을 고속 액체 크로마토그래피 시스템(high-performance liquid chromatography, HPLC, Waters Co., Milford, MA, USA)을 사용하여 분석하였다. 시스템은 역상 C18 컬럼(Xbridge RP18, 250 × 4.6 mm, 5 μm; Waters Co.), 분리 모듈(separation module, Waters e2695), 및 형광검출기(fluorescence detector, Waters 2475)로 구성되었다. 이동상은 10 mM 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer, pH 2.5, 인산으로 조정함) 및 0.1% TEA 포함 아세토니트릴 혼합액(71:29, v/v)이고, 유속은 1.0 mL/min으로 맞추었다. 주입 부피는 20 μL이고, 용리액은 여기(excitation) 파장 470 nm 및 방출(emission) 파장 565 nm에서 검출하였다.
NP의 입자 크기, 다분산성 지수(polydispersity index), 및 제타 전위(zeta potential)을 제조사의 프로토콜에 따라 전기영동 광산란법(electrophoretic light scattering, ELS-Z; Otsuka Electronics, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1 및 도 2(A)에 나타내었다(고분자 및 약물 간의 중량비는 7.5:1; 데이터는 평균±표준편차(n = 3)로 기재함).
구성 평균 입자경
(nm)		 다분산성 지수 제타 전위
(mV)		 봉입률
(%)
CSA-DOCA/DOX NP 228.87±2.02 0.22±0.01 -22.58±1.82 80.87±0.18
CSA-DOCA-AMPB/DOX NP 205.83±8.22 0.21±0.01 -20.97±0.75 71.71±0.24
Figure 112015038121511-pat00004
표 1 및 도 2(A)에 나타난 바와 같이, DOX를 도입시킨 후의 CSA-DOCA NP 및 CSA-DOCA-AMPB NP는 206-229 nm의 평균 입자경으로 좁은 입도분포를 나타냈으며, 음(-)의 표면 전하를 나타냈고, 약 70 내지 80%의 약물 봉입률을 나타냈다.
또한, DOX-포함된 NP의 형태를 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM, JEM 1010; JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 2(B)에 나타내었다. 시료는 2%(w/v) 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid) 용액으로 염색하여 탄소 필름(carbon film)으로 코팅된 구리 그리드(copper grid)에 올려 놓고 실온에서 건조시켰다. 도 2(B)에 나타난 바와 같이, 제조된 NP는 구형 형태로 관찰되었다.
시험예 1. 시험관내 약물 방출 평가
DOX-포함된 CSA-DOCA NP 및 CSA-DOCA-AMPB NP로부터의 DOX 방출 거동을 평가하기 위하여, 하기와 같이 시험하였다. NP 분산액 일정량(150 μL)을 미니-GeBAflex 튜브(mini-GeBAflex tube, 14 kDa molecular weight cut-off; Gene Bio-Application Ltd., Kfar Hanagide, Israel)에 넣었다. 각 투석 튜브를 인산염-완충 식염수(PBS, 10 mL, 인산으로 CSA-DOCA NP에 대하여 pH 7.4; 및 CSA-DOCA-AMPB NP에 대하여 pH 5.5, 6.8 또는 7.4로 조정함)에 담그고 37 ℃에서 50 rpm으로 흔들었다. 정해진 시간(1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96, 및 120 시간)에 일정량(200 μL)의 용출액을 채취하고, 매 채취시마다 동일한 부피의 새로운 용출시험액을 보충하였다. 약물 방출량은 상기 기재한 바의 HPLC법을 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 제조된 NP에서는 약물 방출이 5일 동안 유지되는 지속적인 방출 양상이 관찰되었다. pH 7.4에서는 CSA-DOCA NP 및 CSA-DOCA-AMPB NP로부터 방출되는 약물량에 있어서 유의성 있게 상이하지는 않아서, 정상 생리학적 pH에서는 CSA-DOCA NP의 AMPB 수식이 약물 방출 양상에 유의성 있게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
한편, CSA-DOCA-AMPB NP로부터 방출되는 약물량을 측정한 3개 pH 조건(pH 5.5, 6.8, 및 7.4) 중에서는, pH 5.5에서 가장 높은 양의 DOX가 방출되었고, 투여 후 5일에 pH 5.5에서 방출된 DOX 양은 pH 7.4에서의 양보다 1.91배 높았다(상대적 비율). 이는 DOX 용해도의 상승과 약물 및 NP 구조 간 상호작용의 감소에 기인한 것으로 추정된다. pH 5.5, 6.8, 및 7.4는 각각 엔도좀 및 리소좀, 종양 미세환경(microenvironment), 및 정상 생리학적 조건의 pH에 대응된다. 따라서, 정상 생리학적 pH(pH 7.4)에 비하여, 약산성 pH(pH 5.5 및 6.8)에서의 약물 방출이 증가된 것은 항암 약물 전달을 위한 NP의 바람직한 특징으로 해석될 수 있다. 정상 조직/기관에서보다 암 세포에서 더 높은 약물 방출을 나타낸 것은 항종양 효능의 증진 및 원하지 않는 부작용의 감소로 이어질 수 있다.
시험예 2. 2차원(2D) 세포 배양 모델에서 세포내로의 도입율 평가
A549 세포를 하기 방법으로 배양하고, 공초점 주사 레이져 현미경(CLSM)를 사용하여 DOX의 세포내 분포를 평가하였다. A549 세포를 배양 슬라이드(BD Falcon, Bedford, MA, USA)에 웰 당 1.0 × 105 세포 밀도(웰 당 표면적 1.7 cm2, 4-챔버 슬라이드)로 37 ℃에서 밤새 배양하였다. DOX 용액 또는 DOX-포함된 NP 현탁액(DOX 농도 100 μM에 해당함)을 세포에 첨가하였다.
AMPB 및 시알산 사이의 상호작용을 평가하기 위하여, 시알산(500 μM)을 NP 현탁액과 전-배양한 후에 세포에 첨가하였다. 각 세포를 1시간 동안 배양한 후, PBS(pH 7.4)로 3회 세척하고, 4%(v/v) 포름알데히드 용액으로 10분 동안 고정시켰다. 이후 공기 흐름 하에서 건조시킨 후, 배양 슬라이드에 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI; H-1200, Vector laboratories, Inc. CA, USA)을 포함하는 봉입제(VECTASHIELD mounting medium)를 첨가하였다. 세포는 CLSM(LSM 710, Carl-Zeiss, Thornwood, NY, USA)를 사용하여 관찰하였고, 관찰한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, DOX의 세포내로의 도입율을 표시하는 붉은색 형광 강도는 DOX 용액, CSA-DOCA/DOX NP 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP 순서로 증가하였다. DOX 용액 및 DOX-포함된 NP(CSA-DOCA/DOX NP 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP)는 각각 수동적 확산 및 수용체-매개 식세포작용으로서 서로 상이한 세포내 도입 기전에 따른다. CSA-DOCA-AMPB/DOX NP를 처리한 그룹에서 나타난 바와 같이, CSA-CD44 수용체 상호작용 및 페닐보론산-시알산 상호작용의 조합은 약물 도입율을 유의성 있게 상승시켰다.
한편, CSA-DOCA/DOX NP 그룹을 유리 시알산으로 처리해도 형광 강도에 있어서 유의성 있는 변화를 나타내지 않았다. 그러나, CSA-DOCA-AMPB/DOX NP 그룹을 유리 시알산으로 처리한 후에는 붉은색 형광 강도가 현저히 감소되었다. NP의 AMPB와 유리 시알산간 복합체 형성이 암 세포에 대한 AMPB로 수식된 NP의 결합을 억제한 것으로 추정된다. 이로써 페닐보론산 및 시알산 간의 상호작용이 AMPB로 수식된 NP의 세포내로의 도입에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.
시험예 3. 3D 스페로이드 모델에서의 종양 침투능 평가
다세포 원주체(multicellular spheroid, MCS)를 제조하기 위하여, A549(human lung adenocarcinoma) 세포를 박층 아가로오스(2% [w/v] in Hank’s balanced salt solution)로 코팅된 둥근-바닥(round-bottomed) 96-웰 플레이트에 웰 당 500 세포의 밀도로 접종(seeding)하고 상기 기재한 바와 동일한 배양 배지에서 배양하였다. 배양 조건은 5% CO2 대기, 95% 상대 습도, 37 ℃, 저속 교반(gentle agitation)이었고, 배양 배지는 격일로 교환하였다. A549 MCS는 지름 500 μm 정도 되는 5-7일에 수확(harvest)하였다.
MCS 내로의 CSA-DOCA NP 및 CSA-DOCA-AMPB NP의 종양 침투능을 평가하기 위하여, NP를 NIRF 염료인 Cy5.5로 표지하고, 이의 MCS 내에서의 분포를 CLSM를 이용하여 관찰하였다. Cy5.5-아민을 CSA 골격의 카르복실산 기에 아미드 결합 형성하여 공유결합시켰다. CSA-DOCA(50 mg) 또는 CSA-DOCA-AMPB(50 mg)를 DW 및 DMSO(25 mL; 1:1, v/v)의 혼합물에 용해시킨 후, EDC(168.1 mg) 및 NHS(20.5 mg)를 첨가하였다. 15분 동안 실온에서 교반한 후, DMSO(0.2 mL)에 용해된 Cy5.5-아민(0.2 mg)을 천천히 첨가하고, 얻어진 용액을 24시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 물에서 2일 동안 투석하고 감압동결건조시켰다.
MCS를 Cy5.5-표지된 CSA-DOCA NP 또는 CSA-DOCA-AMPB NP와 5 μg/mL 농도로 24시간 동안 배양하였다. Cy5.5 농도를 형광분광광도계(fluorescence spectrophotometer, SpectraMax M5 multi-mode microplate reader, Molecular Devices Corp.)를 사용하여 정량 분석하였다. 배양 후, MCS를 PBS(pH 7.4)로 3회 세척하였고, 4%(v/v) 포름알데히드 용액으로 10분간 고정시켰다. 얻어진 MCS를 커버슬립 바텀 디쉬(coverslip bottom dish)에 놓고 CLSM(LSM 710, Carl-Zeiss)를 이용하여 관찰하였고, 2개 NP 군으로 처리한 종양 스페로이드의 중앙의 z-적층 사진을 도 5(A)에 나타내었다.
도 5(A)에 나타난 바와 같이, 종양 스페로이드에 붉은색 형광으로 NP가 존재함을 알 수 있다. 또한, AMPB-공유결합된 NP는 종양 스페로이드의 내부 영역으로 균일하게 침투한 것을 알 수 있다. CSA-DOCA-AMPB NP-처리군에서의 붉은색 형광 강도는 CSA-DOCA NP-처리군에서보다 종양의 경계 및 중앙을 포함한 모든 부위에서 더 강하게 나타났다.
시험예 4. A549 MCS 모델을 이용한 시험관내 항-종양 효능 시험
A549 MCS 모델을 이용하여 NP의 시험관내 항-종양 효능 및 종양 침투능 증진 정도를 평가하였다. 스페로이드 모델은 종양괴(tumor mass)의 특징을 반영하기 위한 것이어서, 2D-배양 세포보다 세포내로의 도입율 및 세포독성을 평가하기 위한 보다 효율적인 모델로 알려져 있다.
A549 MCS를 제조하기 위하여, 세포를 박층 아가로오스(2% [w/v] in Hank’s balanced salt solution)로 코팅된 둥근-바닥 96-웰 플레이트에 웰 당 500 세포의 밀도로 접종하고, 상기 기재된 바와 동일한 배양 배지에서 배양하였다. 배양 조건은 5% CO2 대기, 95% 상대 습도, 37 ℃, 저속 교반이었고, 배양 배지는 격일로 교환하였다.
MCS의 지름이 약 300 μm가 되었을 때, DOX 용액 또는 DOX-포함된 NP(DOX 농도 50 μg/mL에 해당함)를 첨가하고 24시간 배양하였다. 약물 용액 또는 약물-포함된 NP를 제거한 후에 신선한 세포 배양 배지를 첨가하고 격일로 교환하였다. A549 MCS의 형태는 도립형광현미경(inverted fluorescence microscopy, IX70, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 4일간 관찰하였다. 스페로이드의 부피(V, mm3)는 하기 식으로 계산하였다: V = 0.5 × 최대 지름 × (최소 지름)2.
도 5(B) 및 5(C)에 나타난 바와 같이, 대조군(약물 비처리)의 종양괴는 계속 증가하는 반면에, DOX 용액 또는 NP 처리된 MCS 군에서는 종양 크기가 증가되지 않거나 억제된 것으로 관찰되었다. 4일 동안 배양한 후에 각 군에서의 종양 부피는 DOX 용액, CSA-DOCA/DOX NP, 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP 순서로 감소하는 것으로 나타났다(p < 0.05). 대조군의 4일 시점의 종양 부피는 시험 시작시에 비하여 4.34배 증가한 반면에, CSA-DOCA-AMPB/DOX NP-처리군의 4일 시점의 종양 부피는 시험 시작시의 44.7%로 감소되었다. DOX 용액으로 처리한 경우에도 종양 크기 증가 억제 효과가 나타났으나, 4일 시점의 종양 부피는 시험 시작시 보다 10.6% 증가하였다.
상기와 같이, DOX-포함된 NP 처리가 DOX 용액 처리보다 더 높은 종양 크기 증가의 억제 효과를 나타낸 결과는 세포내로의 약물 도입율 시험 결과(도 4)와 일치하였다. CSA-DOCA-AMPB/DOX NP-처리군에서의 종양 부피는 CSA-DOCA/DOX NP-처리군에 비교하여 53.7%였다(p < 0.05).
시험예 5. 실시간 NIRF 이미지 측정
NIRF 이미지 측정 시험을 위하여, 하기와 같이 Cy5.5-공유결합된 CSA-DOCA NP 또는 CSA-DOCA-AMPB NP를 A549 암세포를 이종이식한 마우스에 주입하고, 화상 관찰 시스템(Optix MX3, ART Advanced Research Technologies Inc., Saint-Laurent, Canada)을 사용하여 형광 강도를 스캔하였다.
A549 종양-이종이식된 마우스 모델을 제작하기 위하여, 암컷 BALB/c 누드 마우스(5주령, Charles River, Wilmington, MA, USA)를 사용하였다. 마우스는 22±2 ℃의 온도, 55±5%의 상대습도에서 사육되었다(Animal Center for Pharmaceutical Research, College of Pharmacy, Seoul National University, Korea). A549 세포의 현탁액(0.1 mL 세포 배양 배지 내 2 × 106 세포)을 마우스의 등에 피하주사 하였다. NIRF 영상 촬영은 150-200 mm3의 종양 부피를 가진 마우스에 대하여 수행하였다. 종양 부피(V, mm3)는 하기 식을 사용하여 계산하였다: V = 0.5 × 최대 지름 × (최소 지름)2.
Cy5.5-표지된 CSA-DOCA NP 또는 CSA-DOCA-AMPB NP를 마우스의 꼬리 정맥에 0.12 mg/kg(체중 당 Cy5.5 양) 용량으로 주입하였다. Cy5.5의 여기를 위하여 670 nm 파장의 레이저 다이오드(laser diode)를 사용하였고, 형광 강도는 주입 후 1, 3, 6, 및 24시간에 스캔하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
또한, 종양 조직에서 NP의 침투 및 유지를 비교하기 위하여, 시간-분해 형광 측정(time-resolved fluorescence measurement)으로부터 3차원 공간에서의 형광 강도를 구성할 수 있는 데이터 시스템(OptiView 3D Reconstruction module, version 3.2, ART Advanced Research Technologies Inc.)을 사용하여 부피 측정용 데이터를 계산하였다. 관심영역(region of interest, ROI)[즉, 종양 조직]의 형광 강도를 3차원적으로 재구성하고, 종양 조직으로의 침투는 ROI의 절단면(sliced plane)을 비교함으로써 평가하였다. 2개 NP-처리군에서 종양괴의 z축 기준 형광 강도를 비교하여 도 7에 나타내었다.
도 6(A)에 나타난 바와 같이, CSA-DOCA-AMPB/DOX NP-처리군의 종양 부위에서의 형광 강도는 전 시험 과정에 걸쳐 CSA-DOCA/DOX NP-처리군에서의 형광 강도보다 유의적으로 높았다. 또한, 도 6(B)에 나타난 바와 같이, 시간이 지남에 따라 정상 조직 및 기관에서의 NP는 소실되는 것으로 나타났으나, 24시간 시점에서 종양 부위에서의 NP는 상대적으로 높은 것으로 나타났다. CSA-DOCA-AMPB/DOX NP 처리군에서의 형광 강도는 CSA-DOCA/DOX NP 처리군에서보다 80% 더 높았다. CSA-DOCA-AMPB/DOX NP-처리군의 형광 강도는 다른 조직 및 기관에 비교하여 종양 부위에서 매우 강하였으며, 2개 NP-처리군의 종양 부위 간의 형광 강도는 유의성 있게 차이있는 것으로 나타났다(p < 0.05).
도 7(A)에 나타난 바와 같이, AMPB로 수식된 NP의 생체내 모델에서의 종양 침투 효율을 3D 분석 포함 NIRF 이미지의 3차원 분석을 통해 평가한 결과, CSA-DOCA-AMPB/DOX NP-처리군에서의 종양의 형광 강도는 CSA-DOCA/DOX NP-처리군에서 보다 3.1배 높았다(p < 0.05). 3차원 분석 기법을 통해 얻어진 종양 부위에서의 형광 강도의 상대적 비율은 2차원 분석 기법에서의 비율보다 높았다. 이로써 AMPB로 수식된 NP가 종양 내부로 균일하게 분포하였음을 알 수 있다. 이러한 영상 결과는 A549 세포 및 MCS에서 각각 관찰된 AMPB로 수식된 NP의 향상된 세포내 도입율 및 종양 침투 효과와 잘 일치하였다.
시험예 6. 동물 모델에서의 항-종양 효능 확인
A549 암을 이종이식한 마우스 모델을 제작하기 위하여, 암컷 BALB/c 누드 마우스(5주령, Charles River)를 사용하였다. 마우스는 22±2 ℃의 온도, 55±5%의 상대습도에서 사육되었다. A549 세포 현탁액(0.1 mL 세포 배양 배지 내 2 × 106 세포)을 마우스의 등에 피하주사 하였다.
종양 부피가 50-100 mm3로 된 후에, 종양 크기 및 체중을 측정하였다. 종양 부피(mm3)는 하기 식을 사용하여 계산하였다: V = 0.5 × 최대 지름 × (최소 지름)2. 시험 그룹은 대조군(control), DOX 용액-처리 군, CSA-DOCA/DOX NP-처리 군, 및 CSA-DOCA-AMPB/DOX NP-처리군이었다. DOX(DOX로서 5 mg/kg 용량)를 12, 14, 16, 18, 및 20일(5회)에 각 마우스에 정맥 주사한 후, 각 마우스의 종양 부피 및 체중을 24일간 측정하여 도 8(A) 및 8(B)에 나타냈다.
이후, 조직학적 염색을 위하여 시험 완료 시점에 종양 및 심장을 절개하였다. 이들 절개된 검체를 4%(v/v) 포름알데히드에서 1일간 고정시킨 후 6-μm 절편을 디파라핀화하고(deparaffinize), 에탄올로 수화시켰다. 종양 및 심장을 표준 절차에 따라 H&E으로 염색하여, 그 결과를 도 8(D)에 나타냈다.
세포사멸 효과는 절개된 종양에 대하여 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이 효소 dUTP 닉 앤드 라벨링(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL) 시험으로 평가하였다. 세포사멸 신호전달체계(apoptotic signaling cascade)에 의해 생성된 DNA 단편화를 검출하기 위하여, 색 발현을 시키기 위하여 크로모젠 디아미노벤젠(Chromogen diaminobenzene, DAB)을 이용하였다.
도 8(A)에 나타난 바와 같이, CSA-DOCA-AMPB/DOX NP-처리군의 종양 부피가 다른 군에서보다 유의성 있게 작게 측정되었다(p < 0.05). DOX 용액-처리군의 체중 평균값은 다른 군에서 보다 약간 낮았으나, NP-처리군 및 대조군 간의 유의성 있는 차이는 없었다(도 8(B)). 이는 DOX 단독 처리와 비교하여 NP의 낮은 생체 독성을 나타낸다.
도 8(D)에 나타난 바와 같이, AMPB로 수식된 NP-처리군에서는 다른 군에 비하여 세포사멸이 증가되었음을 확인할 수 있으며, 심장 독성은 감소되었음을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 아민기 및 데옥시콜산의 아민기가 콘드로이친황산 A의 카르복실기와 공유결합하여 아미드 결합을 형성한 생체고분자 화합물.
    [화학식 1]
    Figure 112016127723283-pat00014

    [상기 식에서 R은 3-아미노메틸페닐, 4-아미노메틸페닐, 3-아미노페닐 또는 4-아미노페닐이다.]
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 R이 3-아미노메틸페닐인 것을 특징으로 하는 생체고분자 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 1 내지 5 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 생체고분자 화합물.
  5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 생체고분자 화합물을 포함하는 종양-표적화 및 침투력 증진을 위한 생체고분자 나노입자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 생체고분자 나노입자가 50 ∼ 400 nm의 평균 입자경을 갖는 것을 특징으로 하는 생체고분자 나노입자.
  7. 제5항에 있어서, 상기 생체고분자 나노입자가 암 또는 종양 치료용 약물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체고분자 나노입자.
  8. 제7항의 생체고분자 나노입자를 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암 또는 종양이 폐암, 유방암, 간암, 뇌종양, 피부암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. (a) 콘드로이친황산 A의 카르복실산 기에 데옥시콜산을 결합시켜 콘드로이친황산 A-데옥시콜산 공유결합체를 제조하는 단계; 및
    (b) 단계(a)에서 얻어진 콘드로이친황산 A-데옥시콜산 공유결합체의 카르복실산 기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 아민기를 공유결합시켜 아미드 결합을 형성한 공유결합체를 제조하는 단계
    를 포함하는 생체고분자 화합물의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure 112016127723283-pat00015

    [상기 식에서 R은 3-아미노메틸페닐, 4-아미노메틸페닐, 3-아미노페닐 또는 4-아미노페닐이다.]
  11. (a) 제1항의 생체고분자 화합물을 용매에 용해시키는 단계; 및
    (b) 단계(a)에서 얻어진 용액에서 용매를 휘발시키는 단계
    를 포함하는 생체고분자 나노입자의 제조방법.
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