KR101701619B1 - Combination comprising Temozolomide and Vitamin-D for the treatment of Glioblastoma - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뇌교종 치료용 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 테모졸로마이드의 알킬화제 및 비타민 D를 유효성분으로 하는 뇌교종 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for treating brain glioma, and more particularly, to a composition for treating brain glioma comprising an alkylating agent of temozolomide and vitamin D as an active ingredient.

Description

뇌교종 세포 치료를 위한 테모졸로마이드와 비타민 D가 포함된 조성물{Combination comprising Temozolomide and Vitamin-D for the treatment of Glioblastoma}[0001] The present invention relates to a composition containing temozolomide and vitamin D for the treatment of brain glioma cells.

본 발명은 뇌교종 세포 치료용 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 테모졸로마이드와 비타민 D를 포함하는 교모세포종 치료제에 한한 것이다. The present invention relates to a composition for treating brain glioma cells, and more particularly to a therapeutic agent for glioblastoma including temozolomide and vitamin D.

신경교종(glioma)은 원발성 뇌종양(primary brain tumor)의 60%를 차지하는 종양으로서, 발생빈도가 높고 치료가 어려워, 현재까지도 방사선 치료 외엔 특별한 치료법이 없는 악성 종양이다. 그중에서도 가장 악성으로 분류되고 있는 교모세포종(glioblastoma, GBM)의 경우, 다른 암과 비교하였을때 방사선 및 항암제 치료에 대한 저항성이 매우 높아 일단 진단되면 기대 생존기간이 단 1년에 불과하다. 또한 이와 같은 뇌종양의 경우, 뇌혈관 장벽이 있어 치료를 위한 약물의 전달이 쉽지 않다. 특히 상대적으로 뇌신경 생물학에 대한 이해가 부족하여 그에 대한 치료제 개발이 더디게 진행되고 있다. 더욱이, 교모세포종은 다른 뇌종양과 비교해볼 때 공격적 변이(aggressive variant)를 나타내어, 이를 빠른 시일 내에 치료하지 않으면 몇 주 이내에 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 따라서 교모세포종의 치료에는 외과적 처치 이외에 방사선 치료 및 화학약물 치료가 함께 수행되고 있다. 그러나, 이러한 화학약물 치료는 내성 변이주의 발생, 종양줄기세포에 의한 재발 등의 원인으로 인하여 한계에 다다른 상황이므로, 새로운 치료법을 개발하여야 할 필요성이 요구되고 있는 실정이다.Glioma is a malignant tumor that accounts for 60% of primary brain tumors and has a high incidence and is difficult to treat. Among them, glioblastoma (GBM), which is the most malignant, is highly resistant to radiation and chemotherapy compared with other cancers, and once diagnosed, life expectancy is only one year. In addition, in the case of such a brain tumor, the delivery of the drug for treatment is not easy due to the presence of a cerebrovascular barrier. In particular, there is a lack of understanding of brain neurobiology and the development of therapies for it is progressing slowly. Furthermore, glioblastomas present an aggressive variant when compared to other brain tumors, which can result in catastrophic results within weeks if not treated quickly. Therefore, the treatment of glioblastomas is performed with radiotherapy and chemotherapy in addition to surgical treatment. However, these chemotherapeutic treatments are different from each other due to the occurrence of resistant mutant strains, recurrence by tumor stem cells, and the like, and thus there is a need to develop new therapeutic methods.

최근 시스템 생물학(systems biology) 및 생물정보학 기법(bioinformatics tools)의 비약적 발전에 따라 교모세포종의 발생과 병증의 진행과 관련된 것으로 여겨지는 의미있는 유전적 결함 및 유전자 발현 패턴들이 연구되고 있다. 그러나, 임상 성과를 대표할 수 있는 고분자 마커(molecular marker)들의 발굴 성과는 전무한 실정이다. 특히, 유전자 발현 분석이 전사체(trascriptome) 수준에 머물러 있어 실제 암 조직에서의 단백질 발현 정도를 대변하지 못하는 한계가 있다. Recent advances in systems biology and bioinformatics tools have led to the study of meaningful genetic defects and gene expression patterns that are thought to be related to the development of glioblastomas and the progression of pathology. However, the molecular markers that can represent clinical performance have not been found. In particular, the gene expression analysis remains at the level of the truncationome, which limits the expression level of the protein in cancer tissues.

테모졸로마이드(Temozolomide, TMZ)는 항암 약물의 일종으로서, 마우스 종양 연구에 있어서 넓은 범위의 생물활성의 항암 작용을 구비하고 있다. 테모졸로마이드는 임상 항암 작용 연구를 통해 악성 흑색종, 균상 식육종(mycosis fungoides) 및 진행 신경 아교종(advanced glioma)에 대하여 효과를 나타내는 것이 증명되었다. 또한, 테모졸로마이드는 마우스에 이종 이식된 뇌종양 및 폐종양의 피하 치료에 효과가 있다. 시험관 내 항종양 시험을 통해, 테모졸로마이드는, 뇌종양, 난소암, 흑색종과, 다카바진(dacarbazine), 카르머스틴(carmustine), 시스플라틴(cisplatin), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로라실(5-fluorouracil), 에토포시드(etoposide) 및 빈블라스틴(vinblastine)과 같은 종래 약물을 사용한 화학요법에 내성이 있는 종양 등 광범위한 종양에 대하여 항-종양 활성을 구비하고 있음이 증명되었다.Temozolomide (TMZ) is a kind of anticancer drug that has a wide range of biologically active anticancer activities in mouse tumor studies. Temozolomide has been shown to be effective against malignant melanoma, mycosis fungoides, and advanced glioma in clinical cancer studies. In addition, temozolomide is effective in the subcutaneous treatment of brain tumor xenografts and lung tumors. Through in vitro antitumor testing, temozolomide can be used to treat brain tumors, ovarian cancer, melanoma, dacarbazine, carmustine, cisplatin, doxorubicin, 5-fluorouracil Tumor activity against a wide range of tumors, including chemotherapy-resistant tumors using conventional drugs such as 5-fluorouracil, etoposide and vinblastine.

종래의 교모세포종 치료에 관한 기술로, 대한민국 공개특허 제 10-2013-0118981호(2013.10.30.)은 악성 뇌교종, 특히 다형 교모세포종의 치료에서 테모졸로마이드 또는 파클리탁셀 등의 세포독성 치료제, 방사선용법 또는 세포독성 치료제 및 방사선요법 모두와 조합된 마시텐탄의 용도에 관한 것이다. 하지만, 세포독성 및 자가포식작용 등에 대한 실험적 내용이 기재되어져 있지 않다. Korean Patent Laid-Open No. 10-2013-0118981 (Oct. 30, 2013) discloses a therapeutic agent for cytotoxic agents such as temozolomide or paclitaxel in the treatment of malignant brain glioma, particularly, polymorphous glioblastoma, Lt; RTI ID = 0.0 > cytotoxic < / RTI > therapy and radiotherapy. However, there is no experimental content on cytotoxicity and autophagy.

본 발명에서는 교모세포종의 세포독성 등의 실험적 내용 및 세포독성 치료제로 사용되는 테모졸로마이드외 비타민 D를 혼합하여 시너지 효과를 얻을 수 있다. In the present invention, synergistic effects can be obtained by mixing experimental substances such as cytotoxicity of glioblastoma and vitamin D other than temozolomide used as a cytotoxic agent.

공개특허 제 10-2013-0118981(2013.10.30.)Published Patent No. 10-2013-0118981 (Oct. 30, 2013)

본 발명의 목적은 알칼화제인 테모졸로마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 뇌교종 치료용 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a composition for treating brain glioma containing temozolomide or its pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient, which is an alkalizing agent.

본 발명의 또 다른 목적은 테모졸로마이드 및 비타민 D 를 함유하는 교모세포종 치료용 조성물을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a composition for treating a glioblastoma containing temozolomide and vitamin D.

본 발명은 알킬화제 및 비타민 D를 유효성분으로 하는 뇌교종 치료용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for treating brain glioma comprising an alkylating agent and vitamin D as an active ingredient.

일 실시예로, 알킬화제는 테모졸로마이드일 수 있다. In one embodiment, the alkylating agent may be temozolomide.

일 실시예로, 알킬화제와 비타민 D는 몰비로 1:0.0001 내지 1:0.001일 수 있다. In one embodiment, the alkylating agent and vitamin D may be in a molar ratio of 1: 0.0001 to 1: 0.001.

일 실시예로 뇌교종은 교모세포종일 수 있다. In one embodiment, the brain glioma may be a glioblastoma.

본 발명에 따른 테모졸로마이드 및 비타민 D는 뇌종양의 일종인 교모세포종의 증식을 효과적으로 억제함으로써, 교모세포종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용할 수 있다. Temozolomide and vitamin D according to the present invention effectively inhibit the proliferation of glioblastoma, a type of brain tumor, and thus may be useful as an effective ingredient of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of glioblastoma.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포내 뇌교종 치료 유효성분이 배양 후 현미경 사진 및 세포 생존율을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포집락형성능 측정에 결과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 상처 치유분석 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포사멸 분석 결과를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역형광염색과 전자현미경에 의해 분석된 결과를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 유세포 분석결과를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨스턴블롯 결과를 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 종양의 자기공명영상(MRI) 결과를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 쥐의 생존률을 분석한 결과를 도시한 것이다. FIG. 1 is a micrograph and cell viability after culturing of an intracellular brain glioma effective ingredient according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 2 shows the results of measurement of cell colonization ability according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 shows a result of a wound healing analysis according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 shows the results of cell death analysis according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 shows the results of immunofluorescence staining and electron microscopic analysis according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 shows flow cytometry results according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 shows a Western blot result according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 shows MRI results of a tumor according to an embodiment of the present invention.
FIG. 9 shows the results of analysis of the survival rate of rats according to an embodiment of the present invention.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있는 바람직한 실시 예를 포함한 발명의 구성을 상세히 설명한다. 본 발명의 각 도면에 있어서, 구조물들의 사이즈나 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하거나 축소하여 도시한 것이고, 특징적 구성이 드러나도록 공지의 구성들은 생략하여 도시하였으므로 도면으로 한정하지는 아니한다. 본 발명의 바람직한 실시 예에 대한 원리를 상세하게 설명함에 있어 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, which illustrate preferred embodiments in which the present invention can be readily practiced by those skilled in the art. In the drawings of the present invention, the sizes and dimensions of the structures are enlarged or reduced from the actual size in order to clarify the present invention, and the known structures are omitted so as to reveal the characteristic features, and the present invention is not limited to the drawings . DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. In the following description, well-known functions or constructions are not described in detail to avoid obscuring the subject matter of the present invention.

본 발명은 알킬화제 및 비타민 D를 유효성분으로 하는 뇌교종 치료용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for treating brain glioma comprising an alkylating agent and vitamin D as an active ingredient.

상기 알킬화제는 테모졸로마이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으며, 보다 바람직하게는 테모졸로마이드일 수 있다. The alkylating agent may be temozolomide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, more preferably temozolomide.

또한, 본 발명에서 상기 알킬화제와 비타민 D는 몰비로 1:0.0001 내지 1:0.001로 혼합되어 세포에 배양될 수 있다. In the present invention, the alkylating agent and vitamin D may be mixed in a molar ratio of 1: 0.0001 to 1: 0.001 and cultured in cells.

본 발명에서 상기 뇌교종은 바람직하게는 교모세포종일 수 있다. In the present invention, the brain glioma is preferably a glioblastoma.

이하, 본 발명을 실시 예를 통해 자세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

(실시예)(Example)

실시예 1. 세포주 배양Example 1. Cell line culture

신경교세포인 C6 세포주는 미국(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양받아 사용했다. 사용하는 배지는 DMEM medium에 10% fetal bovine serum(FBS), 4 mM glutamine, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin를 첨가하여 사용하고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2, incubator에서 배양한다. 세포가 85% 범위로 배양되며 트립신 처리한다.C6 cell line, which is a glial cell line, was used in USA (ATCC, Rockville, MD, USA). The culture media used were DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 4 mM glutamine, 100 U / mL penicillin, 100 mg / mL streptomycin and maintained at 95% 2 , Incubate in an incubator. Cells are cultured to 85% range and trypsinized.

실시예 2. TMZ+VD 결합된 C6 rat glioblastoma cell 라인의 체내효과 관측Example 2. In vivo effects of TMZ + VD-conjugated C6 rat glioblastoma cell lines

2-1. 세포독성 실험(MTT assay)2-1. Cytotoxicity test (MTT assay)

96-well plate에 well 당 세포(C6: 5×103)를 접종하여 5% CO2, 37℃에서 24시간 배양하여 세포단층을 도포한 후, 1 mM TMZ, 100 nM Vitamin D(VD), 1 mM TMZ와 100 nM의 VD 혼합물(TMZ+VD)을 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.Cells (C6: 5 × 10 3 ) were inoculated into a 96-well plate and cultured at 37 ° C for 24 hours at 37 ° C. Cell monolayers were coated with 1 mM TMZ, 100 nM Vitamin D (VD) mM TMZ and 100 nM VD mixture (TMZ + VD), respectively, and cultured for 24 hours.

배양 후, MTT 용액을 각각의 well에 추가한 후 37℃에서 4시간 동안 배양 후, 배양액을 제거하며, DMSO(dimethyl sulfoxide)를 추가하여 30분간 상온에서 혼합한다. 이후, 세포 생존율을 확인하기 위해, 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. After incubation, add MTT solution to each well, incubate at 37 ° C for 4 hours, remove the culture medium, add DMSO (dimethyl sulfoxide) and mix at room temperature for 30 minutes. Then, the absorbance at 492 nm was measured to confirm cell viability.

본 발명의 도 1 (a)는 DMSO, TMZ(1 mM), VD(100 nM), TMZ(1 mM)+VD(100 nM) 혼합물 접종 후 24시간 동안 배양 후 현미경 사진이며, 도 1 (b)는 DMSO, TMZ(1 mM), VD(100 nM), TMZ(1 mM)+VD(100 nM) 처리 후, 생존하는 세포율을 나타낸 것이다. 결과적으로 TMZ+VD 혼합물이 처리된 경우 교모세포종에 독성을 가하게 됨으로써, 교모세포종이 사멸되는 것으로 사료된다. 1 (a) of the present invention is a photomicrograph after 24 hours of inoculation with a mixture of DMSO, TMZ (1 mM), VD (100 nM), TMZ (1 mM) ) Shows cell viability after treatment with DMSO, TMZ (1 mM), VD (100 nM) and TMZ (1 mM) + VD (100 nM). As a result, when the TMZ + VD mixture is treated, the glioblastoma is toxic and the glioblastoma is killed.

2-2. 세포집락형성능의 측정(clonogenic assay)2-2. Clonogenic assay of cell colonization ability

plating 전, 세포 배양액을 제거하고, PBS(phosphate buffered saline) 로 2회 세포를 세척한다. 또한, 부착성 세포(adherent cell)는 PBS로 세척한 후 트립신 처리 및 세포의 수를 측정한다. Before plating, the cell culture medium is removed and the cells are washed twice with PBS (phosphate buffered saline). In addition, adherent cells are washed with PBS and trypsinized and the number of cells is measured.

오천개의 세포가 담긴 60mm 조직배양접시에 각각 배양액을 함유하는 DMSO, TMZ(1 mM), VD(100 nM), TMZ(1 mM)+VD(100 nM) 혼합물을 각각 접종하고, 72 시간 후 콜로니(colonies, 군락수)가 형성되는 것을 확인할 수 있다. 세포 배양액을 제거한 후, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 이후 콜로니는 30 분 동안 100 % 메탄올로 고정하고, 15 분 동안 쿠마시블루로 염색하여, 콜로니 수를 측정하였다. A mixture of DMSO, TMZ (1 mM), VD (100 nM) and TMZ (1 mM) + VD (100 nM) containing the culture medium was inoculated into a 60 mm tissue culture dish containing 5,000 cells, (colonies, number of colonies) are formed. After removing the cell culture medium, the cells were washed twice with PBS. The colonies were then fixed with 100% methanol for 30 minutes, stained with Coomassie blue for 15 minutes, and colonies counted.

본 발명에서 도 2 (A)는 C6 세포에 DMSO, TMZ(1 mM), VD(100 nM), TMZ(1 mM)+VD(100 nM) 혼합물 배양 72시간 후 측정된 사진으로, TMZ+VD 혼합물로 처리된 세포에서 콜로니가 현저하게 적은 것을 확인할 수 있고, 도 2 (B)는 이를 수치화한 것으로 TMZ+VD 혼합물의 수치가 현저히 낮은 것을 확인 할 수 있다. 결과적으로 TMZ+VD 혼합물을 처리한 경우 교모세포종의 사멸률이 높기 때문에 콜로니의 수가 적은 것으로 사료된다. FIG. 2 (A) is a photograph of cells measured 72 hours after DMSO, TMZ (1 mM), VD (100 nM) and TMZ (1 mM) It can be confirmed that the cells treated with the mixture had significantly fewer colonies, and Fig. 2 (B) shows that the TMZ + VD mixture was significantly lowered by quantifying the results. As a result, it is considered that the number of colonies is low because of the high killing rate of glioblastoma when treated with TMZ + VD mixture.

2-3. 상처 치유 분석(Wound healing assay)2-3. Wound healing assay

세포를 60mm 조직배양접시에 도포한 후, 포화상태로 성장시킨 후, DMSO, TMZ(1 mM), VD(100 nM), TMZ(1 mM)+VD(100 nM) 혼합물을 처리하였다. 그런 다음, 피펫 팁을 사용하여 세포를 긁어 상처를 주었다. 0 내지 24시간 동안 관찰하였으며, 세포의 증식을 확인하였다. Cells were plated on a 60 mm tissue culture dish and grown to saturation and treated with a mixture of DMSO, TMZ (1 mM), VD (100 nM) and TMZ (1 mM) + VD (100 nM). Then, the cells were scratched by using a pipette tip. Observed for 0 to 24 hours to confirm cell proliferation.

본 발명의 도 3 (A)에서 각각의 샘플에서 상처난 부분을 관찰한 결과, TMZ+VD 혼합물의 증식한 세포수가 가정 적은 것을 육안으로 확인할 수 있으며, 도 3 (B)는 시간 경과에 따른 세포의 증식에 따른 간격을 타나낸 것이다. 결과적으로, TMZ+VD 혼합물의 경우 세포의 증식성이 가장 낮은 것을 확인할 수 있으며, 이는 교모세포종의 운동성을 저하시켜 세포의 전이를 억제하는 것으로 사료된다. 3 (A) of the present invention, the number of cells proliferated by the TMZ + VD mixture can be visually confirmed, and FIG. 3 (B) And the distance between them. As a result, it is confirmed that the TMZ + VD mixture has the lowest cell proliferation, which is thought to inhibit cell metastasis by decreasing the motility of the glioblastoma.

실시예 3. 교아세포종의 자가포식(autophagy) 작용Example 3. Autophagy Action of Glioblastoma

3-1. 세포 사멸 분석(Hoechst 33258 염색)3-1. Cell death analysis (Hoechst 33258 staining)

C6 세포를 12-well plate용 커버슬립위에 1×106 cells/well의 밀도로 분주하였다. 세포에 DMSO, TMZ(1 mM), VD(100 nM), TMZ(1 mM)+VD(100 nM) 혼합물 처리 후, 37℃, 5% CO2에서 24시간 incubator에서 반응시켰다. 이후, 4% 파라포름알데히드 500 μL을 넣고 세포를 고정시킨 후 5 μL Hoechst 33258 용액을 넣고 실온에서 10분간 반응시킨 세포를 공초점 현미경(LSM-700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다. C6 cells on a cover slip for 12-well plate at a density of 1 × 10 6 cells / well. Cells were treated with DMSO, TMZ (1 mM), VD (100 nM), TMZ (1 mM) + VD (100 nM) and incubated at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 hours. Then, cells were fixed with 500 μL of 4% paraformaldehyde, and 5 μL of Hoechst 33258 solution was added thereto. The cells were incubated at room temperature for 10 minutes, and observed with a confocal microscope (LSM-700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).

본 발명에서 도 4 (A)는 세포사멸에 의한 핵의 수축, 밝기 및 응축을 확인할 수 있으며, 결과적으로 TMZ+VD 혼합물의 경우 핵이 강한 형광을 갖으며, 수축되거나 응축된 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 4 (B)는 핵 사멸율 그래프로 DMSO에 비해 TMZ, TMZ와 VD를 혼합한 경우의 사멸률이 높은 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 세포사멸이 일어남을 확인 할 수 있다. In the present invention, FIG. 4A shows shrinkage, brightness and condensation of the nucleus due to apoptosis. As a result, it can be confirmed that the TMZ + VD mixture has a strong fluorescence and is contracted or condensed. In addition, FIG. 4 (B) shows that the kill rate of TMZ, TMZ and VD is higher than that of DMSO as a nuclear kill rate graph, and cell death is confirmed by this.

3-2. 면역 형광 염색법(3-2. Immunofluorescent staining ImmunofluorescenceImmunofluorescence , IF), IF)

Microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3)은 세포의 자가포식현상 검사에 있어서 바림작한 마커이다. Microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) is a poor marker for cellular self-esteem.

세포(1×106 cells/well)는 멸균 커버 글라스에 부착하여 준비한 후, 1 mM TMZ와 100 nM의 VD 혼합물, DMSO, 1 mM TMZ, 100 nm VD를 24시간 동안 처리한다. 이후, 세포는 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정한 후, 3% normal goat seurm으로 blocking 하였다. 그리고 세포의 막을 뚫기 위해 0.25 % Triton-X100을 넣고 15분간 상온에서 반응시킨다. 그 후, 1차 antibody인 rabbit polyclonal anti-LC3 antibody를 상온에서 2시간 처리한 후, PBS 버퍼로 2회 세척한다. 그리고 fluorescein isothiocyanate(FITC)와 접합된 2차 antibody인 anti-rabbit IgG antibody를 차광 상태에서 1시간 동안 추가적으로 반응시킨 후 PBS 버퍼로 세척한다. 그 후 DAPI 염색을 하고, mounting solution을 이용하여 커버슬립을 고정한다. Cells (1 × 10 6 cells / well) are attached to sterile cover glasses and treated with 1 mM TMZ and 100 nM VD mixture, DMSO, 1 mM TMZ, 100 nm VD for 24 h. Cells were then fixed with 4% paraformaldehyde and blocked with 3% normal goat seurm. Add 0.25% Triton-X100 to the cell membrane and incubate at room temperature for 15 minutes. After that, the primary antibody, rabbit polyclonal anti-LC3 antibody, was treated at room temperature for 2 hours and washed twice with PBS buffer. Then, anti-rabbit IgG antibody, a secondary antibody conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC), is further reacted for 1 hour in the shade state and then washed with PBS buffer. After that, DAPI is stained, and the cover slip is fixed using a mounting solution.

이후, 공초점 현미경으로 이미지를 분석한 후, 세포내 LC3 puncta를 수량화하였다. The images were then analyzed by confocal microscopy and quantified for intracellular LC3 puncta.

본 발명에서 도 5 (A)에서는 1 mM TMZ와 100 nM의 VD 혼합물, DMSO, 1 mM TMZ, 100 nm VD 처리된 세포의 형광 이미지를 확인할 수 있으며, 도 5 (B)를 통해 LC3 puncta를 수량화하여 나타냈다. 결과적으로, DMSO 처리된 세포의 경우 LC3가 핵 주변에 puncta 형태로 분포되어 있는 반면, TMZ+VD 혼합물 처리된 경우, 전체적으로 분산되어져 있는 것을 확인 할 수 있다. In the present invention, fluorescence images of cells treated with 1 mM TMZ and 100 nM VD mixture, DMSO, 1 mM TMZ, and 100 nm VD can be confirmed in the present invention, and LC3 puncta is quantified through FIG. 5 (B) Respectively. As a result, in the case of DMSO-treated cells, LC3 was distributed in the puncta form around the nucleus, whereas when TMZ + VD mixture was treated, it was confirmed that the cells were dispersed as a whole.

또한, 도 5 (C)는 1 mM TMZ와 100 nM의 VD 혼합물, DMSO, 1 mM TMZ, 100 nm VD처리된 세포의 TEM 사진으로 세포내 물질들이 자가포식소체(autophagosome)로 둘러쌓인 것을 확인(사진 내 빨간색 화살표 표시)할 수 있으며, 결과적으로 TMZ 처리한 군 보다 TMZ+VD 혼합물 처리한 군에서 자가포식소체가 크게 증가하여 자가포식현상이 증가한 것을 확인할 수 있다.FIG. 5 (C) is a TEM photograph of cells treated with 1 mM TMZ and 100 nM VD mixture, DMSO, 1 mM TMZ, and 100 nm VD, confirming that the intracellular materials are surrounded by autophagosomes (Red arrows in the photograph). As a result, it was confirmed that the self-feeding phenomenon was increased due to the large increase of the self-feeding body in the TMZ + VD mixture treated group than the TMZ-treated group.

3-3. 3-3. 유세포Flow cell 분석(Flow  Analysis cytometrycytometry , , FACSFACS ))

세포를 PBS로 2회 세척한 후, 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정한 후 10분간 0.25% Triton X-100으로 처리한다. 세포에 1차 항체를 (1:100) 넣은 뒤, 얼음에서 1시간 반응시켰다. 이후 PBS로 2회 세척하고 2차 antibody를 넣은 뒤 1시간 반응시킨다. 그 후 FACS solution을 400ul 넣고, 형광강도를 측정하였다. Cells were washed twice with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min and then treated with 0.25% Triton X-100 for 10 min. Primary antibodies (1: 100) were added to the cells and reacted on ice for 1 hour. After washing with PBS, secondary antibody is added and allowed to react for 1 hour. Then, the fluorescence intensity was measured with 400 ul of FACS solution.

본 발명에서 도 6 (A)는 유세포 분석한 결과로 DMSO 처리한 것과 비교하였을 때, TMZ+VD 혼합물 처리된 경우 LC3의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있으며, 도 6 (B)는 형광 강도를 수치화하여 나타냈다. In the present invention, as shown in FIG. 6 (A), the expression of LC3 is increased when the TMZ + VD mixture is treated as compared with the DMSO treatment as a result of flow cytometry. FIG. 6 (B) .

3-4. 웨스턴블롯(Western blot)3-4. Western blot

30-50 μg 단백질은 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 겔에 전기영동한 후, polyvinylidene difluoride membranes으로 트랜스퍼하여 분석된다. The 30-50 μg protein was analyzed by electrophoresis on a 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel followed by transfer to polyvinylidene difluoride membranes.

밴드 확인을 위해 1:1000으로 희석된 1차 항체(anti-cleaved caspase3, β-actin, LC3, beclin-1, and p62)와 4℃에서 overnight 반응하고, 이후, 형광물질(horseradish peroxidase)이 부착된 secondary antibody로 2차 항체와 반응시켰다. 단백질은 X-ray 필름에 감광함으로써 감별할 수 있다. After overnight incubation at 4 ° C with primary antibodies (anti-cleaved caspase 3, β-actin, LC3, beclin-1, and p62) diluted 1: 1000 for band identification, the horseradish peroxidase The secondary antibody was reacted with the secondary antibody. Proteins can be differentiated by sensitizing them to X-ray films.

본 발명에서 도 7 (A)는 웨스턴브롯을 실시하여 그 결과를 나타낸 것으로, TMZ+VD 처리 시, LC3 및 Beclin-1의 경우 단백질의 발현이 증가하는 반면, p62는 발현이 감소되는 것을 확인 할 수 있으며, LC3의 경우 TMZ+VD를 처리하지 않은 경우에 비해 발현이 증가되는 것을 알 수 있다. FIG. 7 (A) shows the results of Western blotting in the present invention. In the case of LC3 and Beclin-1, TMZ + VD treatment increased protein expression while p62 decreased expression And the expression of LC3 is increased compared with the case of not treating TMZ + VD.

실시예 4. 동물실험Example 4. Animal experiment

동물실험은 7 내지 9주(250 내지 300g)된 수컷 쥐를 사용하였으며, 낮 12시간, 밤 12시간 및 23℃, 상대 습도 60% 분위기 하에서 사육하였다. Male rats (7-9 weeks old (250-300 g)) were used for the experiment, and they were bred for 12 hours at night, 12 hours at night and 23% relative humidity at 60%.

상기 쥐의 두개골을 천공하여 C6세포를 주입 후, 7일 경과 후(PDO 7), DMSO, 200 μL DMSO에 용해된 TMZ 10 mg/kg/day, 200 μL 생리식염수(saline solution) 및 TMZ에 용해된 VD 0.2 μg/kg/day를 각각 주입하여 비교하였다. After the C6 cells were injected into the rat skull, 7 days later (PDO 7), 10 mg / kg / day of TMZ dissolved in 200 μL DMSO, 200 μL of saline solution dissolved in 200 μL DMSO and dissolved in TMZ And VD 0.2 μg / kg / day, respectively.

본 발명에서 도 8 (A)를 통해 TMZ 처리 시 종양은 580 ± 83 mm3 and 186 ± 52 mm3 으로 Vchicle > TMZ > TMZ+VD 순으로 종양의 부피를 알 수 있으며, 8 (B)는 이를 수치화 한 것이다. 결과적으로, TMZ+VD 처리시 종양 성장을 억제하는 것으로 사료된다. In the present invention, the tumor is 580 ± 83 mm 3 and 186 ± 52 mm 3 in TMZ treatment, and the volume of the tumor can be known in the order of Vchicle>TMZ> TMZ + VD. 8 (B) It is numerical. As a result, it is considered that tumor growth is suppressed by TMZ + VD treatment.

또한, 본 발명의 도 9에 자기공명영상(MRI) 분석 결과를 나타냈으며, C6 세포만 주입된 (PDO 7)과 DMSO, TMZ, TMZ+VD 처리된 후 (PDO 14) 비교를 통해 TMZ+VD가 주입된 경우 생존률이 가장 높은 것으로 확인된다. FIG. 9 shows the result of magnetic resonance imaging (MRI) analysis of the present invention. FIG. 9 is a graph showing the results of magnetic resonance imaging (MRI) analysis of the TMZ + VD The survival rate is the highest.

Claims (4)

알킬화제인 테모졸로마이드 및 비타민 D를 유효성분으로 하되, 상기 알킬화제와 비타민 D는 몰비로 1:0.0001 내지 1:0.001로 혼합되는 것을 특징으로 하는 뇌교종 치료용 조성물.Wherein the alkylating agent and the vitamin D are mixed in a molar ratio of 1: 0.0001 to 1: 0.001, as an alkylating agent, and the alkylating agent is temozolomide and vitamin D as an active ingredient. 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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