KR101689514B1 - 천산룡 약재의 감별방법 - Google Patents

천산룡 약재의 감별방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101689514B1
KR101689514B1 KR1020150043393A KR20150043393A KR101689514B1 KR 101689514 B1 KR101689514 B1 KR 101689514B1 KR 1020150043393 A KR1020150043393 A KR 1020150043393A KR 20150043393 A KR20150043393 A KR 20150043393A KR 101689514 B1 KR101689514 B1 KR 101689514B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fan
sample
leaves
tissue
foliage
Prior art date
Application number
KR1020150043393A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160115517A (ko
Inventor
강영민
김동선
최고야
양선규
김호경
Original Assignee
한국 한의학 연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국 한의학 연구원 filed Critical 한국 한의학 연구원
Priority to KR1020150043393A priority Critical patent/KR101689514B1/ko
Priority to CN201510549389.XA priority patent/CN106018570A/zh
Publication of KR20160115517A publication Critical patent/KR20160115517A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101689514B1 publication Critical patent/KR101689514B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/025—Fruits or vegetables
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • G01N1/20—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state for flowing or falling materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/29—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using visual detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 (a) 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료의 내부조직을 염색하거나 디오스신(dioscin)의 함량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 염색된 조직으로부터 주피(periderm)가 붉은색으로 염색되며, 코르크층(phellem)만으로 이루어진 것은 단풍마로 판별하고, 주피가 푸른색으로 염색되고, 코르크층(phellem), 코르크형성층(phellogen) 및 코르크피층(phelloderm)으로 이루어진 것은 부채마로 판별하거나 상기 시료의 건조중량(g)을 기준으로 측정된 디오스신의 함량(mg)에 따라 부채마 또는 단풍마로 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별방법에 관한 것이다.
천산룡의 기원 식물은 부채마지만, 근연종인 단풍마도 구별 없이 천상룡으로 유통되고 있는 실정으로, 도 4 및 5에 개시한 바와 같이, 부채마와 단풍마의 외형은 거의 유사하다. 특히, 천산룡은 절단하여 건조된 것이 유통되므로 이들을 유관으로 구별하는 것은 매우 어려운 일이다(도 6).
따라서 본 발명은 유통과정에서 육안으로 식별이 어려운 천산룡 약재인 부채마와 단풍마를 감별하는 방법으로, 사프라닌과 패스트 그린 염색 시약을 이용한 이중염색법 또는 고속액체크로마토그래피법으로 손쉽고 빠르게 구별하는 방법을 제시하였다.

Description

천산룡 약재의 감별방법{Method for discriminating between Dioscorea nipponica Makino and Dioscorea quinquelobata Thunb}
본 발명은 천산룡으로 유통되는 부채마와 단풍마의 감별방법에 관한 것으로, 상세하게는 천산룡 유통품의 형태학적 감별 및 이화학적 감별을 통해 부채마와 단풍마를 감별하는 방법에 관한 것이다.
부채마(Dioscorea nipponica Makino)는 산지에서 자라는 덩굴성 여러해살이 풀로서, 줄기는 길게 옆으로 뻗으며, 성글게 가지를 치는 약용식물이다. 뿌리줄기는 둥근 통 모양이며, 많은 뿌리를 내는 것이 특징이다. 잎은 어긋나며, 넓은 난형 또는 심장형으로 길이 7-15cm, 폭 4-12cm, 끝은 길게 뾰족하며, 밑은 심장형이다. 잎은 보통 손바닥 모양으로 갈라지나 드물게 갈라지지 않는 것도 있다. 잎자루는 길며, 잎겨드랑이에 살눈이 없다. 꽃은 7-8월에 암수 딴 포기로 핀다. 수꽃차례는 곧추서며, 때로는 가지를 치고 암꽃차례는 밑으로 처진다. 열매는 삭과, 넓은 타원형으로 3개의 날개가 있다. 우리나라 전역에 자생하고, 일본, 중국에 분포하는 것으로 뿌리줄기를 약용한다.
한편, 단풍마(Dioscorea quinquelobata Thunb.)는 여러해살이 덩굴풀이며, 굵고 단단한 뿌리줄기가 있고, 질긴 줄기는 길게 뻗어나가며 다른 물체로 기어오르는 특징이 있다. 잎은 서로 어긋나게 자리하는데 전체적으로 심장 꼴인 잎 몸은 5~9 갈래로 중간 정도까지 갈라지고, 갈라진 조각의 끝은 뾰족하며 가장자리는 밋밋하다. 잎의 길이는 6~12cm이고, 암꽃과 수꽃이 각기 다른 포기에 핀다. 꽃은 모두 잎겨드랑이로부터 자라나는 긴 꽃대에 이삭 모양으로 달려 아래로 처진다. 수꽃 이삭은 여러 갈래로 갈라지는데 암꽃 이삭은 갈라지지 않는다. 대롱 모양인 꽃은 여섯 갈래로 끝이 갈라진다. 꽃의 지름은 4mm 안팎이고 빛깔은 초록빛이다.
부채마(Dioscorea nipponica Makino)의 뿌리 줄기를 말린 것을 천산룡(천상용; Dioscoreae Nipponicae Rhizoma)이라고 하며, 한의학적으로 풍한습비, 관절의 굴신장애, 타박상, 가래, 기침, 만성기관지염 뿐만 아니라 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis; RA)에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 심혈관에 작용하여 콜레스테롤과 혈압을 내려주고 심장박동을 늦춰 관상동맥의 순환을 개선하는 효능이 알려져 있다. 현재 천산룡은 중국과 북한의 약전에 수재 되어 있으며, 공정서상 천산룡의 기원 식물은 부채마이지만, 국내뿐만 아니라 중국 등에서 천산룡의 정품인 부채마 뿐만 아니라 동속근연종인 단풍마(Dioscorea quinquelobata Thunb.)도 천산룡으로 구분없이 사용되고 있다. 이와 같이 근연종 간의 구별 없이 사용되는 것은 감별 기준이 마련되어 있지 않기 때문이며, 부채마의 외형과 단풍마의 외형적 차이는 있지만, 건조하여 절단된 상태로 유통되므로 유통과정에서 외형적 차이로는 실질적인 구별이 어려운 실정이다.
따라서 부채마와 단풍마의 감별방법을 마련해야 정확한 한약재 사용이 이루어질 수 있는 것이지만 아직까지는 이들 간의 정확한 감별기준이 마련되지 않은 상황이다. 즉, 상기한 바와 같이 약용식물의 근연종 간의 차이를 판별하는 구별방법인 부채마와 단풍마의 감별방법이 절실히 필요하지만 아직까지는 미흡한 실정이다.
부채마와 단풍마에 대한 종래 기술의 일례로는 중국공개특허 제101791366호에 산지 및 약재에 대한 부채마(Discorea nipponica Makino)의 품질검사 방법에 관해 개시되어 있고, 한국등록특허 제0854621호에 마과 식물의 추출물 및 이를 포함하는 말초신경병증의 예방 또는 치료용 조성물에 관하여 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0684434호에 항산화, 지질과산화 억제에 따른 항노화, 항염증 및 거담 활성을 갖는 단풍마 추출물을 함유하는 조성물에 관해 개시되어 있고, 한국등록특허 제1332360호에 천산용 추출물과 미생물 균주를 포함하는 과실 저장병 방제용 조성물에 관한 것이 개시되어 있으나, 부채마와 단풍마를 간편하게 구별할 수 있는 감별방법에 관한 기술은 보고된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 부채마와 단풍마의 감별방법에 관한 것으로, 구체적으로 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료의 내부조직을 염색하여 수행하는 형태학적인 분석을 하였고, 고속액체크로마토그래피법(HPLC)을 이용하여 시료 내에 함유된 디오스신(dioscin)의 함량을 측정하고, 표준품 디오스신(dioscin)과의 비교를 통해 부채마와 단풍마 내에 함유된 디오스신(dioscin) 함량의 차이를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료의 내부조직을 염색하거나 디오스신(dioscin)의 함량을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 염색된 조직으로부터 주피(periderm)가 붉은색으로 염색되며, 코르크층(phellem)만으로 이루어진 것은 단풍마로 판별하고, 주피가 푸른색으로 염색되고, 코르크층(phellem), 코르크형성층(phellogen) 및 코르크피층(phelloderm)으로 이루어진 것은 부채마로 판별하거나 상기 시료의 건조중량(g)을 기준으로 측정된 디오스신의 함량(mg)에 따라 부채마 또는 단풍마로 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료의 내부조직을 염색하는 단계; 및
(b) 상기 염색된 조직으로부터 주피(periderm)가 붉은색으로 염색되며, 코르크층(phellem)만으로 이루어진 것은 단풍마로 판별하고, 주피가 푸른색으로 염색되고, 코르크층(phellem), 코르크형성층(phellogen) 및 코르크피층(phelloderm)으로 이루어진 것은 부채마로 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료 내에 함유된 디오스신(dioscin)의 함량을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 시료의 건조중량(g)을 기준으로 측정된 디오스신의 함량(mg)에 따라 부채마 또는 단풍마로 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료의 내부조직을 염색하거나 디오스신(dioscin)의 함량을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 염색된 조직으로부터 주피(periderm)가 붉은색으로 염색되며, 코르크층(phellem)만으로 이루어진 것은 단풍마로 판별하고, 주피가 푸른색으로 염색되고, 코르크층(phellem), 코르크형성층(phellogen) 및 코르크피층(phelloderm)으로 이루어진 것은 부채마로 판별하거나 상기 시료의 건조중량(g)을 기준으로 측정된 디오스신의 함량(mg)에 따라 부채마 또는 단풍마로 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별방법에 관한 것으로, 육안으로 구별이 어려운 부채마와 근연종인 단풍마의 구별을 간편할 뿐만 아니라 신속정확하고, 재현성이 있게 구별하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 감별방법을 활용하여 혼용되고 있는 천산룡에 대하여 정확한 품질관리(QC)가 이루어질 수 있는 장점이 있다. 특히, 천산룡을 류마티스관절염(Rheumatoid arthritis, RA) 등의 기능성 식의약품 개발에서 정확하게 품질관리된 원물을 제공하는데 기여할 수 있으며, 본 발명의 감별방법은 유사 근연종 또는 국내산 또는 외래산 등의 산지에 의한 차이를 감별하는 기술에 기여할 수 있다.
도 1은 부채마, 단풍마 및 천산룡 유통품(CM1~CM5)의 지하경 횡단면을 사프라닌(safranine)과 패스트 그린(fast-green)으로 이중 염색한 이미지이다. 1 및 2는 단풍마이고, 3 및 4는 부채마이며, 5 및 10은 CM1(단풍마), 6 및 11은 CM2(부채마), 7, 12: CM3(부채마), 8, 13: CM4(단풍마) 9, 14: CM5(부채마)이며, 1, 3 및 5~9는 주피(periderm)와 피층(cortex)이고, 2, 4 및 10~14는 유관속(vascular bundle)이다. (pr: 주피(periderm), pe: 코르크층(phellem), pg: 코르크형성층(phellogen), pd: 코르크피층(phelloderm), xy: 물관부(xylem), ph: 체관부(phloem), sg: 전분립(starch grain), rc: 침상결정체(raphide crystal), id: 이형세포(idioblasts), Bar= 100㎛)
도 2는 부채마의 고속액체크로마토그래피 분석 결과이다. (A)는 표준품 디오스신(dioscin)이고, (B) 내지 (D)는 동일 조건으로 추출한 천산룡 유통품(부채마) 추출액(20㎕)의 분리 결과이다.
도 3은 단풍마의 고속액체크로마토그래피 분석 결과이다. (A)는 표준품 디오스신(dioscin)이고, (B) 및 (C)는 동일 조건으로 추출한 천산룡 유통품(단풍마) 추출액(20㎕)의 분리 결과이다.
도 4는 천산룡의 기원식물인 부채마의 지상부(A), 지하부(B), 채취후 세척한 지하부(C) 및 뿌리 줄기의 절단품(D)을 나타낸 사진이다. Bar는 5cm를 의미한다.
도 5는 천산룡으로 유통되는 단풍마의 지상부(A), 잎(B-1), 지하부 채취흔적(B-2), 지하부(B-3), 지하부 건조품(C) 및 뿌리줄기의 절단품(D)을 나타낸 사진이다. Bar는 5cm를 의미한다.
도 6은 천산룡 유통품의 사진이다.
본 발명은 (a) 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료의 내부조직을 염색하거나 디오스신(dioscin)의 함량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 염색된 조직으로부터 주피(periderm)가 붉은색으로 염색되며, 코르크층(phellem)만으로 이루어진 것은 단풍마로 판별하고, 주피가 푸른색으로 염색되고, 코르크층(phellem), 코르크형성층(phellogen) 및 코르크피층(phelloderm)으로 이루어진 것은 부채마로 판별하거나 상기 시료의 건조중량(g)을 기준으로 측정된 디오스신의 함량(mg)에 따라 부채마 또는 단풍마로 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 (a) 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료의 내부조직을 염색하는 단계; 및 (b) 상기 염색된 조직으로부터 주피(periderm)가 붉은색으로 염색되며, 코르크층(phellem)만으로 이루어진 것은 단풍마로 판별하고, 주피가 푸른색으로 염색되고, 코르크층(phellem), 코르크형성층(phellogen) 및 코르크피층(phelloderm)으로 이루어진 것은 부채마로 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별방법에 관한 것이다.
상기 주피는 외피라고도 부르며, 외피의 발달 유무에 따라 염색정도가 달라진다. 즉, 외피가 발달된 부채마의 경우, 사프라닌의 염색이 잘 이루어지지 않아서 붉은색이 거의 없고, 반대로 단풍마는 외피가 발달되어 있지 않으므로, 붉은색 염색이 잘되어 쉽게 유관으로 붉은색으로 염색된 것을 확인할 수 있다. 이와 같이 염색을 통해 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료의 형태학적인 감별방법은 신속하고 정확하다는 특징이 있다.
상기 염색은 사프라닌(safranine)과 패스트 그린(fast-green)의 염색약으로 이중염색하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다.
상기 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료는 염색하기 전에 (a) 건조하여 절단한 후, 끓는 물에 8 내지 15분간 전처리하는 단계; (b) 상기 단계 (a) 이후에, 10%, 20%, 35%, 50%, 75% 및 100%의 TBA(tert-Butyl alcohol)를 순차적으로 처리하여 조직을 탈수하는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 탈수된 조직에 파라핀을 포매하는 단계; (d) 상기 포매한 조직을 10~20㎛의 두께로 절단하고 알부민 용액을 이용하여 슬라이드에 접착하는 단계; 및 (e) 상기 슬라이드에 접착된 조직을 자일렌과 알코올에 순차적으로 침지하여 파라핀을 제거하는 단계;를 포함하여 제조한 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료 내에 함유된 디오스신(dioscin)의 함량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 시료의 건조중량(g)을 기준으로 측정된 디오스신의 함량(mg)에 따라 부채마 또는 단풍마로 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별방법에 관한 것이다.
상기 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료는 건조하여 절단된 시료일 수 있다. 건조하여 절단된 시료는 그 형태를 알 수 없어 부채마인지 단풍마인지 알기가 어렵기 때문이다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료는
(1) 부채마 또는 단풍마를 세척하여 40~50℃에서 5~10일 동안 1차 건조하는 단계;
(2) 상기 1차 건조된 시료를 2.5~5.0cm로 절단하고, 40~50℃에서 5~10일 동안 2차 건조하는 단계; 및
(3) 상기 2차 건조된 시료를 50~80℃에서 2~5시간 동안 알코올 추출하는 단계;를 통하여 추출한 시료인 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 (3)에서 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 메탄올이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 부채마 또는 단풍마의 시료 내 함유된 디오스신(dioscin) 함량을 측정하는 것은 고속액체크로마토그래피법(HPLC)을 이용하는 것이 바람직하지만, 시료 내 디오스신의 함량을 비교분석할 수 있는 분석법은 배제하지 않고 사용할 수 있는 것이다. 즉, 분석법에는 특별히 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 측정된 시료의 건조중량(g) 1g에 대하여, 15 내지 40mg의 디오스신(dioscin)을 포함하는 경우 부채마로 판별하며, 3 내지 10mg의 디오스신(dioscin)을 포함하는 경우 단풍마로 판별할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 부채마 시료 내에 함유된 디오스신(dioscin)의 함량(mg)이 단풍마 시료 내에 함유된 디오스신(dioscin)의 함량(mg)의 3 내지 8배 더 포함되어 있음을 알 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 부채마와 단풍마의 형태학적 분석
본 실시예 1에서는 부채마와 단풍마의 채집품과 유통품을 이용하여 내부구조의 형태학적 분석을 실시하였다.
완전히 건조된 약재를 약 3mm의 두께로 자르고, 건조조직의 복원 및 연화를 위해 100℃의 끓는 물에서 10분간 전처리하였다. 이후 조직의 탈수를 위하여, 10%, 20%, 35%, 50%, 75%의 TBA(tert-Butyl alcohol)를 각 단계에서 4시간씩 처리하였고, 마지막으로 100%의 TBA(tert-Butyl alcohol)를 4시간씩 두 번 더 처리하였다. 탈수가 완료된 조직을 60℃의 온도 조건 하에서 100% 파라핀(paraffin, 녹는점 56-58℃)으로 4시간씩 2회 처리 후 포매(embedding)하였다. 상기 포매한 조직은 Leica SM 2010R을 이용하여 10~20㎛의 두께로 절단하였으며 1%의 알부민(albumin) 용액을 이용하여 조직 절편을 슬라이드글라스에 접착하였다. 자일렌(Xylene)-알코올(alcohol)을 순차적으로 처리하여 조직 내의 파라핀(paraffin)을 제거한 후, 2%의 사프라닌(safranine)과 1%의 패스트 그린(fast-green)의 염색약으로 이중염색을 하였다. 슬라이드는 피셔과학(Fisher Scientific)의 수지용액(Permount)을 사용하여 영구 프레파라트(preparat)로 제작하였으며, Nikon 현미경으로 관찰한 후에 디지털카메라로 이미지를 촬영하였다.
결과는 도 1에 개시한 바와 같이, 부채마와 단풍마의 내부 형태학적 조직의 차이를 확인할 수 있었다.
부채마(D. nipponica Makino)와 단풍마(D. quinqueloba Thunb.)는 마속(Dioscorea L.)에 속하는 덩굴성 다년초로서 굵게 비후된 지하경(rhizome)을 갖는데, 지하경의 내부는 주피(periderm), 피층(cortex), 유관속(vascular bundle)으로 구성되고, 주피(periderm) 안쪽의 피층(cortex)은 침상결정체(raphide crystal)를 포함하기도 한다. 표피(epidermis)는 흔히 탈락하고, 표피가 탈락되면, 주피가 보호기능을 수행한다. 피층은 모두 유조직(parenchyma)으로 이루어져 있고 유조직 내에는 다량의 전분립(starch grain)과 점액질(mucigel)을 가지고 있는 것이 특징이다.
상세하게는 부채마와 단풍마의 지하경 주피의 구조에서 뚜렷한 차이를 확인하였는데, 단풍마의 주피는 오직 코르크층(phellem)으로만 구성된 5~7층의 구조를 보이는 반면, 부채마에서는 코르크층(phellem), 코르크형성층(phellogen), 코르크피층(phelloderm)의 구조를 보였다.
특히 부채마의 코르크층(phellem)은 1~3층으로 단풍마에 비하여 발달이 미약하고, 지하경을 덮어 보호하기도 하지만(도 1의 빨간색 화살표) 일부는 탈락하여(도 1의 파란색 화살표) 코르크피층이 보호기능을 수행하기도 한다.
본 실시예 1에서는 현재 유통되고 있는 5개의 천산룡 유통품의 내부구조를 검토한 결과로부터 알 수 있듯이, 유통되고 있는 천산룡은 부채마와 단풍마 두 분류군이 혼용되어 유통되고 있는 것으로 확인되었다.
CM1과 CM4의 주피는 코르크층으로만 구성된 5~7층의 구조를 보여 단풍마의 유통품이고, CM2, CM3, CM5의 주피는 코르크층, 코르크형성층, 코르크피층의 구조를 보이는 부채마의 유통품인 것으로 명확하게 구분되었다(도 1).
실시예 2. 부채마와 단풍마의 추출
부채마와 단풍마는 경남 산청군 왕산에서 채집한 채집품과 유통품(CM1 내지CM5)을 이용하였으며, 상기 채집품의 경우, 한국한의학 연구원 한약자원그룹에서 동정하여 약채표본 및 식물압착 표본을 제작하여 보관하였다. 물질분석을 위해서 부채마와 단풍마의 뿌리를 흐르는 물에 세척하고, 증류수를 이용해 3번 재세척하여 건조기 45℃에서 1주일간 건조 후 절단(2.5~5.0cm) 하였다. 절단한 후, 다시 1주일 더 건조하고 Jin 등의 방법(Integrative Medicine Research 2013;2:70-75)을 응용하여 건조중량 10g에 100㎖의 메탄올을 가하고 65℃에서 3시간 동안 환류추출한 후, 0.45μm의 PTFE 실린지 필터로 여과하여 HPLC용 분석 시료를 얻었다.
실시예 3. 부채마와 단풍마의 고속액체 크로마토그래피 분석
상기 실시예 2에서 획득한 부채마 및 단풍마 추출액으로 고속액체크로마토그래피 분석을 실시하였다.
HPLC 분석용 시약(증류수, 아세토나이트릴(acetonitril) 등)은 모두 HPLC 등급을 사용하였으며, 광 다이오드 어레이 검출기(2996 photodiode array detector)와 Phenomenex Luna C18 컬럼(250mm×4.6mm; 입자크기 5μm)가 장착된 HPLC(waters Alliance 2695 system)를 이용하여 254nm에서 분석하였다.
이동상은 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 수용액(A)과 아세토나이트릴(acetonitrile)(B)로 하여 10분 동안은 90%(A):10%(B) 비율로 하고, 10분에서 60분까지는 40%(A):60%(B)의 비율로 gradient를 변화시켰으며, 온도는 40℃로 유지하고, 유속은 1.0㎖/min, 시료의 주입량은 20㎕로 하여 분석하였다.
분석결과, 부채마는 34분대 및 58분대에서 차별적인 피크가 나타났다. 표준품 디오스신과 머무름 시간(Retention time)과 UV 스펙트럼을 비교한 결과, 58분대의 피크는 디오스신(dioscin)으로 확인되었고, 34분대에서 나타난 미지의 피크는 210nm에서 독특하게 큰 한 개의 피크를 확인할 수 있는 반면, 단풍마는 34분과 35분에 2개의 작은 피크로 나타남을 확인할 수 있다(도 2 및 도 3).
따라서 부채마는 33~35분 사이에 주변의 피크 면적 대비 최소 10배 이상 높은 독특한 피크를 나타내는 것을 특징으로 구별할 수 있다.
210 nm에서 디오스신 표준품의 UV 흡수면적과 부채마와 단풍마 시료 내의 디오스신(dioscin) 피크들로부터의 흡수 면적들을 비교하여, 부채마 내의 디오스신의 함량이 단풍마 내의 디오스신의 함량보다 3 내지 8배 높은 것을 확인할 수 있었다.
상세히 설명하면, 건조 중량 1g의 부채마 시료에 함유된 디오스신의 양은 24.37 내지 28.88 mg인 것을 알 수 있으며, 건조 중량 1g의 단풍마 시료에 함유된 디오스신의 양은 4.0 내지 7.5 mg 것을 알 수 있다 (표 1).
부채마와 단풍마 시료의 HPLC 분석에서 머무름 시간(retention time)이 58분대에서의 피크(디오스신) 면적 및 디오스신의 함량
시료 시료농도(mg/㎖) 면적(area) 함량(%) 함량(mg/g)
대조구(표준품) 4.0 12,351,538
(A) 부채마(CM2) 100.0 7,524,204 2.44 24.37
(B) 부채마(CM3) 100.0 8,917,899 2.89 28.88
(C) 부채마(CM5) 100.0 8,448,692 2.74 27.36
(A) 단풍마(CM1) 100.0 1,234,200 0.40 4.00
(B) 단풍마(CM4) 100.0 2,314,864 0.75 7.50
또한 부채마는 34분대에서 독특한 한 개의 피크를 관찰할 수 있는 반면, 단풍마는 바로 인접하여 2개의 피크가 관찰되는 것을 확인 할 수 있다.
건조 중량 1g의 부채마 시료에 대하여, 34분대에서 나타나는 미지 성분은 디오스신(dioscin) 표준품의 UV 흡수면적을 기준으로 계산할 경우, 14.18 내지 18.44 mg인 것을 알 수 있으며, 반면에 단풍마의 시료는 건조중량 1g 당 5.93 내지 6.46 mg으로 상대적으로 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (표 2).
부채마와 단풍마 시료의 HPLC 분석에서 머무름 시간(retention time)이 34분대에서의 피크(미지성분) 면적 및 미지성분의 함량
시료 시료농도(mg/㎖) 면적(area) 함량(%) 함량(mg/g)
대조구(표준품) 4.0 12,351,538
(A) 부채마(CM2) 100.0 5,693,147 1.84 18.44
(B) 부채마(CM3) 100.0 5,602,698 1.81 18.14
(C) 부채마(CM5) 100.0 4,378,988 1.42 14.18
(A) 단풍마(CM1) 100.0 1,830,982 0.59 5.93
(B) 단풍마(CM4) 100.0 1,994,600 0.65 6.46

Claims (11)

  1. 삭제
  2. (a) 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료의 내부조직을 사프라닌(safranine)과 패스트 그린(fast-green)의 염색약으로 이중염색하는 단계; 및
    (b) 상기 염색된 조직으로부터 주피(periderm)가 사프라닌(safranine) 염색약에 의해 붉은색으로 염색되며, 코르크층(phellem)만으로 이루어진 것은 단풍마로 판별하고, 주피가 패스트 그린(fast-green) 염색약에 의해 푸른색으로 염색되고, 코르크층(phellem), 코르크형성층(phellogen) 및 코르크피층(phelloderm)으로 이루어진 것은 부채마로 판별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별방법.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 부채마 또는 단풍마로 의심되는 시료는 사프라닌(safranine)과 패스트 그린(fast-green)의 염색약으로 이중염색하기 전에
    (a) 건조하여 절단한 후, 끓는 물에 8 내지 15분간 전처리하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a) 이후에, 10%, 20%, 35%, 50%, 75% 및 100%의 TBA(tert-Butyl alcohol)를 순차적으로 처리하여 조직을 탈수하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 탈수된 조직에 파라핀을 포매하는 단계;
    (d) 상기 포매한 조직을 10~20㎛의 두께로 절단하고 알부민 용액을 이용하여 슬라이드에 접착하는 단계; 및
    (e) 상기 슬라이드에 접착된 조직을 자일렌과 알코올에 순차적으로 침지하여 파라핀을 제거하는 단계;를 포함하여 제조한 것을 특징으로 하는 부채마와 단풍마의 감별 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
KR1020150043393A 2015-03-27 2015-03-27 천산룡 약재의 감별방법 KR101689514B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150043393A KR101689514B1 (ko) 2015-03-27 2015-03-27 천산룡 약재의 감별방법
CN201510549389.XA CN106018570A (zh) 2015-03-27 2015-08-31 穿山龙药材的鉴别方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150043393A KR101689514B1 (ko) 2015-03-27 2015-03-27 천산룡 약재의 감별방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160115517A KR20160115517A (ko) 2016-10-06
KR101689514B1 true KR101689514B1 (ko) 2016-12-27

Family

ID=57082565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150043393A KR101689514B1 (ko) 2015-03-27 2015-03-27 천산룡 약재의 감별방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101689514B1 (ko)
CN (1) CN106018570A (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109633024A (zh) * 2019-01-03 2019-04-16 江苏师范大学 一种同时测定不同产地穿山龙药材中四种活性成分含量的方法
CN112798391A (zh) * 2021-01-11 2021-05-14 四川农业大学 一种珠芽石蜡包埋制片的方法
CN114414672B (zh) * 2021-12-15 2023-04-07 山东华信制药集团股份有限公司 一种龙香平喘胶囊中薯蓣皂苷含量测定分析方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100854621B1 (ko) * 2005-10-28 2008-08-27 김선여 마과 식물의 추출물 및 이를 포함하는 말초신경병증의 예방또는 치료용 조성물

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101377474A (zh) * 2007-08-30 2009-03-04 易现峰 一种基于稳定性同位素指纹图谱鉴别道地中药材的方法
CN103194541B (zh) * 2013-04-19 2014-10-22 北京市农林科学院 一种基于基因组rapd分析的紫山药品种分子鉴定方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100854621B1 (ko) * 2005-10-28 2008-08-27 김선여 마과 식물의 추출물 및 이를 포함하는 말초신경병증의 예방또는 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160115517A (ko) 2016-10-06
CN106018570A (zh) 2016-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hagh-Nazari et al. Saffron and various fraud manners in its production and trades
KR101689514B1 (ko) 천산룡 약재의 감별방법
Maitera et al. Investigation of tannin content in Diospyros mespiliformis extract using various extraction solvents
Sawant et al. Phytochemical analysis of bark of Acacia nilotica
Tretiach Porina pseudohibernica sp. nov., an isidiate, epiphytic lichen from central and south-eastern Europe
Seidler-Lozykowska et al. Content of alkaloids and flavonoids in celandine (Chelidonium majus L.) herb at the selected developmental phases
Hanganu et al. Galium species-polyphenolic content and their antioxidant potential
WO2024213003A1 (zh) 一种化合物及其在毛叶茶品种鉴别中的应用
Gaddaguti et al. Pharmacognostic and Preliminary Phytochemical Evaluation of Ocimum basilicum L. var. pilosum (Willd.) Benth. and O. tenuiflorum var. CIM-AYU
Prabhu et al. Pharmacognostic investigation of the leaves and stems of Viburnum erubescens Wall. ex DC
Chaudhary et al. Comparative pharmacognostical studies of three Mahonia species: exploring the possibilities as a substitute of ayurvedic drug “daruharidra”
Sridharan et al. Pharmacognostic standardization and physicochemical analysis of the leaves of Barleria montana Wight & Nees
Shome et al. Pharmacognostic studies on the flower of Mesua ferrea L.
Jamdar et al. Bauhinia racemosa as Natural pH Indicator
KR20160104212A (ko) 누리장나무잎을 활용한 고혈압 개선용 차 및 그의 제조 방법
Madhak et al. Comparative pharmacognostical and phytochemical study of leaves of different species of Mimusops
Basha et al. Pharmacognostical standardization, preliminary phytochemical investigation of root stocks of Ardisia solanacea Roxb
Chintala et al. Pharmacognostic studies on Diospyros melanoxylon
Mallya et al. Identity parameters on traditionally used Antiurolithiatic Herb-Scoparia Dulcis Linn.
Selvakumari Pharmacognostical standardization of Arisaema leschenaultii Blume
Singh et al. Hypolipidemic Activity of Standardized Crude Leaf Extracts of Morus nigra L.
Kavitha et al. PHARMACOGNOSTIC STUDIES ON MILLINGTONIA HORTENSIS L.
MJ et al. Pharmacognostic studies on leaf of Tamilnadia uliginosa (retz.) Tirveng. & Sastre (Rubiaceae)
Hasni Sayyed et al. Pharmacognostical and phytochemical study of fruit peel of Punica granatum Linn.
PALSHIKAR et al. EFFECT OF SEASONAL ENVIRONMENTAL VARIATIONS ON MORPHOLOGICAL AND PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF AEGLE MARMELOS

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20150327

PA0201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20160816

Patent event code: PE09021S01D

PG1501 Laying open of application
E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20161209

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20161220

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20161221

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190926

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20190926

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200923

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220920

Start annual number: 7

End annual number: 7

PC1903 Unpaid annual fee

Termination category: Default of registration fee

Termination date: 20240930