KR101676108B1 - Amplification apparatus and method of Single Strand DNA using Microbeads - Google Patents

Amplification apparatus and method of Single Strand DNA using Microbeads Download PDF

Info

Publication number
KR101676108B1
KR101676108B1 KR1020140156293A KR20140156293A KR101676108B1 KR 101676108 B1 KR101676108 B1 KR 101676108B1 KR 1020140156293 A KR1020140156293 A KR 1020140156293A KR 20140156293 A KR20140156293 A KR 20140156293A KR 101676108 B1 KR101676108 B1 KR 101676108B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
microbeads
polyacrylamide
dna
stranded dna
template strand
Prior art date
Application number
KR1020140156293A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20160056195A (en
Inventor
안지영
이세희
김양훈
이상희
정옥찬
이재하
이호원
Original Assignee
충북대학교 산학협력단
인제대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충북대학교 산학협력단, 인제대학교 산학협력단 filed Critical 충북대학교 산학협력단
Priority to KR1020140156293A priority Critical patent/KR101676108B1/en
Publication of KR20160056195A publication Critical patent/KR20160056195A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101676108B1 publication Critical patent/KR101676108B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/36—Apparatus for enzymology or microbiology including condition or time responsive control, e.g. automatically controlled fermentors
    • C12M1/38—Temperature-responsive control
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/04—Heat insulating devices, e.g. jackets for flasks
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology

Abstract

본 발명은 혼성 중합체를 기반으로 하여 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드(Polyacrylamide Microbead)를 생성하고, 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 이용하여 단일 가닥 DNA를 생성시키고 증폭시켜 회수할 수 있도록 하는 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 장치 및 방법에 관한 것으로, TEMED가 함유된 오일을 공급받아 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 노출되어 있는 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 생성하는 마이크로 비드 생성수단; 및 마이크로 비드 생성수단에 의해 생성된 마이크로 비드를 공급받아 주형 가닥 1과 센스 프라이머를 혼합시키고, 중합 효소 반응을 이용하여 혼합용액으로부터 DNA를 증폭시켜 회수하는 단일 가닥 DNA 생성수단을 포함한다. 이에 미세유체 칩에서 생성된 마이크로 비드를 이용하여 단일 가닥 DNA를 생성할 수 있도록 함으로써, 생성된 단일 가닥 DNA를 DNA 셀렉스, 검출 센서, 분자 치료 방법, 바이오 마커의 확인, 리간드 결합, 바이오 이미징 및 센서 등 다양한 분야뿐만 아니라 그 밖의 다른 분야에도 활용할 수 있도록 하는 효과가 있다The present invention relates to a method for producing a polyacrylamide microbead based on a copolymer and a method for producing single-stranded DNA using a micro-bead, which can produce single-stranded DNA using polyacrylamide microbeads, Amplifying apparatus and method, comprising: microbead generating means for generating polyacrylamide microbeads exposed to an oil containing TEMED and exposed to an antisense oligonucleotide; And a single strand DNA generating means for mixing the template strand 1 and the sense primer with the microbeads generated by the microbead generating means and amplifying and recovering the DNA from the mixed solution using the polymerase reaction. Thus, the single stranded DNA can be generated using microbeads generated from the microfluidic chip, and the resulting single stranded DNA can be used as a DNA cellex, a detection sensor, a molecular therapy method, identification of a biomarker, ligand binding, But also to other fields as well as various other fields

Description

마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 장치 및 방법{Amplification apparatus and method of Single Strand DNA using Microbeads}[0001] The present invention relates to a single strand DNA amplification apparatus and method using microbeads,

본 발명은 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 장치 및 방법에 관한 것으로, 특히 혼성 중합체를 기반으로 하여 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드(Polyacrylamide Microbead)를 생성하고, 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 이용하여 단일 가닥 DNA를 생성시키고 증폭시켜 회수할 수 있도록 하는 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 장치 및 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a single-stranded DNA amplification apparatus and method using microbeads, and more particularly, to a method and apparatus for amplifying a single-stranded DNA by using polyacrylamide microbeads to produce polyacrylamide microbeads based on a hybrid polymer, Stranded DNA amplification apparatus and method using a microbead capable of generating and amplifying DNAs.

종래 단일 가닥 DNA는 DNA 셀렉스, 검출 센서, 분자 치료법, 바이오 마커의 확인, 리간드 결합, 바이오 이미징 및 센서 등 이용 분야가 매우 넓은 물질이다. 단일 가닥 DNA를 생성하는 방법으로는 asymmetric PCR, Biotin-streptavidin separations, Lambda exonuclease digestions, Size separations on denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis 등이 이용되고 있다. Conventional single-stranded DNAs are widely used for DNA cel- lex, detection sensor, molecular therapy, identification of biomarkers, ligand binding, bio-imaging and sensors. Asymmetric PCR, Biotin-streptavidin separations, Lambda exonuclease digestions, Size separations on denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis, etc. have been used as methods for producing single-stranded DNA.

이러한 방법들은 단일 가닥 DNA를 만들기 위해 많이 사용되고 있으나 처리 과정이 복잡하고 번거롭다는 단점이 존재한다. 특히 대표적으로 DNA 셀렉스 과정에서 많이 사용되고 있는 Asymmetric PCR의 경우, 증폭이 끝난 후 이중 가닥 DNA가 함께 섞여 있는 수용액 상에서 단일 가닥 DNA만을 얻기 위해 2~3 가지의 실험을 병행해야 한다. 이 방법에서 주로 사용되고 있는 방법으로는 biotin-streptavidin separations이며, 두 단백질의 강한 결합력을 이용한다. 그러나 biotin과 streptavidin의 경우 단백질이기 때문에 높은 열을 주거나 pH의 변화를 주었을 때 변성이 된다는 단점이 존재한다. 그렇기에 번거로운 과정이 없이 단일 가닥 DNA를 생성할 수 있으며 재사용과 반복 사용이 가능한 DNA 생성 방법이 필요한 실정이다.
Although these methods are widely used to produce single-stranded DNA, there are disadvantages that the processing is complicated and troublesome. In Asymmetric PCR, which is typically used in DNA cel- lex processing, two or three experiments must be performed in order to obtain only single-stranded DNA in an aqueous solution containing double-stranded DNA after amplification. Biotin-streptavidin separations are commonly used in this method and utilize the strong binding force of the two proteins. However, since biotin and streptavidin are proteins, there is a disadvantage that they are denatured when given high heat or pH change. Therefore, there is a need for a DNA production method that can produce single stranded DNA without any cumbersome process, and can be reused and used repeatedly.

일본 공개특허 제 2009-278865 호Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-278865 일본 공개특허 제 2012-504952 호Japanese Laid-Open Patent Application No. 2012-504952

이와 같은 문제점을 해소시키기 위해 본 발명은 혼성 중합체를 기반으로 하여 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드(Polyacrylamide Microbead)를 생성하고, 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 이용하여 단일 가닥 DNA를 생성시키고 증폭시켜 회수할 수 있도록 하는 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 장치 및 방법을 제공하는데 목적이 있다.In order to solve such a problem, the present invention provides a method for producing a polyacrylamide microbead based on a copolymer and producing a single stranded DNA using polyacrylamide microbeads, Strand DNA amplification apparatus and method using microbeads.

또한, 본 발명은 DNA 셀렉스, 시험관 내에서의 진단, 분자 치료법, 바이오 이미징 및 센서 등에 이용될 수 있는 단일 가닥 DNA를 생성할 수 있도록 하는 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 장치 및 방법을 제공하는데 목적이 있다.
The present invention also provides a single-stranded DNA amplification apparatus and method using microbeads capable of producing single-stranded DNA that can be used for DNA celecoxin, in vitro diagnosis, molecular therapy, biomedicine, and sensors. .

본 발명의 실시예에 따른 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 장치는 TEMED가 함유된 오일을 공급받아 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 노출되어 있는 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 생성하는 마이크로 비드 생성수단; 및 마이크로 비드 생성수단에 의해 생성된 마이크로 비드를 공급받아 주형 가닥 1과 센스 프라이머를 혼합시키고, 중합 효소 반응을 이용하여 혼합용액으로부터 DNA를 증폭시켜 회수하는 단일 가닥 DNA 생성수단을 포함할 수 있다.
The single-stranded DNA amplification apparatus using a microbead according to an embodiment of the present invention includes: microbead generating means for generating polyacrylamide microbeads exposed to an oil containing TEMED and exposed to an antisense oligonucleotide; And single strand DNA generating means for mixing the template strand 1 with the sense primer by receiving the microbeads generated by the microbead generating means and amplifying and recovering the DNA from the mixed solution using the polymerase reaction.

본 발명과 관련된 실시예로서, 마이크로 비드 생성수단은 상기 마이크로 비드를 생성시키는 미세유체칩과, TEMED가 함유된 오일을 보유하고 있으며, 외부로부터 공급되는 에어에 의해 TEMED가 함유된 오일을 외부로 공급시키는 오일공급부와, 오일공급부와 미세유체칩 사이에 구비되어 있으며, 외부로부터의 조작에 응하여 오일공급부로 일정 압력으로 에어를 공급하는 외부 공압 펌프와, 오일공급부로부터 공급되는 오일을 상기 미세유체 칩 내부로 주입시키는 시린지 펌프로 이루어질 수 있다.
In an embodiment related to the present invention, the microbead generating means includes a microfluidic chip for generating the microbead, and oil containing TEMED, and supplies oil containing TEMED to the outside by air supplied from the outside An external pneumatic pump provided between the oil supply unit and the microfluidic chip and supplying air to the oil supply unit at a constant pressure in response to an external operation; And a syringe pump for injecting the syringe pump.

본 발명과 관련된 실시예로서, 단일 가닥 DNA 생성수단은, 고정되어 있는 안티센스 프라이머와 주형 가닥 1을 결합시키고, 안티센스 프라이머를 신장시켜 주형 가닥 2를 생성시키고, 외부로부터 가해지는 열에 의해 주형 가닥 1을 제거시킨 후 신장된 주형 가닥 2에 센스 프라이머를 상보적으로 결합시켜 신장시키고 열에 의해 주형 가닥 2를 제거시켜 단일 가닥 DNA를 생성시키는 단일 가닥 DNA 생성부와, 외부로부터 입력되는 제어신호에 응하여 온 또 는 오프되는 히터와, 히터의 온도를 감지하는 온도센서와, 온도센서에 의해 감지된 히터 온도가 미리 설정된 기준 온도인지의 여부를 체크하고, 히터가 기준 온도를 유지할 수 있도록 히터의 온오프를 제어하는 컨트롤러로 이루어질 수 있다.
As an embodiment related to the present invention, the single-stranded DNA generating means comprises a step of binding the immobilized antisense primer to the template strand 1, elongating the antisense primer to generate the template strand 2, Stranded DNA strand 2, complementary to the stretched template strand 2 by complementary binding and stretching, and removing the template strand 2 by heat to produce single-stranded DNA; A temperature sensor for sensing the temperature of the heater, a controller for checking whether the heater temperature sensed by the temperature sensor is a preset reference temperature, and controlling the heater on / off so that the heater can maintain the reference temperature Lt; / RTI > controller.

본 발명과 관련된 실시예로서, 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드는 아크리다이트 올리고뉴클레오타이드(Acrydite Oligonucleotide)를 포함하고 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드 (Acrylamide/Bis-acrylamide)용액과 과황산암모늄(Ammonium Persulfate) 용액으로 구성될 수 있다.
In an embodiment related to the present invention, the polyacrylamide microbeads include Acrydite Oligonucleotides and are prepared by mixing an acrylamide / bis-acrylamide solution and an ammonium persulfate solution .

본 발명과 관련된 실시예로서, 센스 프라이머의 말단에 화학물질이 부착되어 있을 수 있다.
As an embodiment related to the present invention, a chemical substance may be attached to the end of the sense primer.

본 발명과 관련된 실시예로서, 화학물질은 Dig, 형광 물질, Biotin 중 하나일 수 있다.
As an embodiment related to the present invention, the chemical substance may be one of Dig, a fluorescent substance, and Biotin.

본 발명과 관련된 실시예로서, 형광물질은 Cy3 또는 Cy5 일 수 있다.
As an embodiment related to the present invention, the fluorescent material may be Cy3 or Cy5.

본 발명의 실시예에 따른 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 방법은, 단일 가닥 DNA를 생성하는 방법에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 노출되어 있는 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드와 주형 가닥 1과 센스 프라이머를 혼합시키는 단계; 혼합 용액을 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 DNA를 증폭시키는 단계; 및 상층액을 회수한 후 정제하여 증폭된 단일 가닥 DNA를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
The single stranded DNA amplification method using microbeads according to an embodiment of the present invention is a method for producing single strand DNA by mixing a polyacrylamide microbead in which an antisense oligonucleotide is exposed with a template strand 1 and a sense primer step; Amplifying DNA by using a polymerase chain reaction in a mixed solution; And recovering the supernatant and purifying the amplified single-stranded DNA.

본 발명과 관련된 실시예로서, 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드는 아크리다이트 올리고뉴클레오타이드(Acrydite Oligonucleotide)를 포함하고 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드 (Acrylamide/Bis-acrylamide)용액과 과황산암모늄(Ammonium Persulfate) 용액으로 구성될 수 있다.
In an embodiment related to the present invention, the polyacrylamide microbeads include Acrydite Oligonucleotides and are prepared by mixing an acrylamide / bis-acrylamide solution and an ammonium persulfate solution .

본 발명과 관련된 실시예로서, 센스 프라이머의 말단에 화학물질이 부착되어 있을 수 있다.
As an embodiment related to the present invention, a chemical substance may be attached to the end of the sense primer.

본 발명과 관련된 실시예로서, 화학물질은 Dig, 형광 물질, Biotin 중 하나일 수 있다.
As an embodiment related to the present invention, the chemical substance may be one of Dig, a fluorescent substance, and Biotin.

본 발명과 관련된 실시예로서, 형광물질은 Cy3 또는 Cy5 일 수 있다.
As an embodiment related to the present invention, the fluorescent material may be Cy3 or Cy5.

본 발명은 미세유체 칩에서 생성된 마이크로 비드를 이용하여 단일 가닥 DNA를 생성할 수 있도록 함으로써, 생성된 단일 가닥 DNA를 DNA 셀렉스, 검출 센서, 분자 치료 방법, 바이오 마커의 확인, 리간드 결합, 바이오 이미징 및 센서 등 다양한 분야뿐만 아니라 그 밖의 다른 분야에도 활용할 수 있도록 하는 효과가 있다.The present invention relates to a method for producing single-stranded DNA by using a microbead produced from a microfluidic chip, thereby allowing the generated single-stranded DNA to be used as a DNA cel- lix, a detection sensor, a molecular therapy method, a biomarker identification, a ligand binding, And sensors, as well as other fields.

또한, 본 발명은 일정한 크기의 마이크로 비드를 미세유체 칩을 통해 대량으로 생산할 수 있도록 하여, 보다 신속하고 경제적으로 단일 가닥 DNA를 생성할 수 있도록 하는 효과가 있다.In addition, the present invention is capable of mass-producing microbeads of a certain size through a microfluidic chip, so that single strand DNA can be produced more quickly and economically.

또한, 본 발명은 특정한 물질이 말단에 부착되어 있는 단일 가닥 DNA도 손쉽게 생성할 수 있도록 하고, 이렇게 생성된 단일 가닥 DNA를 여러 분야에서 응용할 수 있도록 하는 효과가 있다.
In addition, the present invention is capable of easily producing single-stranded DNA having a specific substance attached to its end, and is capable of applying the single-stranded DNA thus generated to various fields.

도 1은 본 발명에 따른 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭장치의 구성을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA를 생성방법을 설명하기 위한 동작흐름도이다.
도 3은 본 발명에 따른 미세 유체 칩을 이용하여 생성된 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 이용하여 단일 가닥 DNA를 생성방법을 단계적으로 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명이 적용된 미세 유체 칩을 이용하여 생성된 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드 표면에 노출되어 있는 프라이머를 이용하여 단일 가닥 DNA를 생성하는 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 5는 도 1에 적용된 마이크로 비드 생성수단을 구체적으로 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명이 적용된 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 생성하는 미세 유체 칩의 개략적인 모식도와 칩의 구성도이다.
도 7은 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 생성하는 미세 유체 칩의 제작 결과를 도시한 도면이다.
도 8은 본 발명이 적용된 미세 유세 칩 내부에서 관찰된 비드의 생성 및 혼합, 경화 공정을 나타낸다.
도 9는 본 발명이 적용된 마이크로 비드 표면에 안티센스 프라이머가 노출된 상태를 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 본 발명이 적용된 마이크로 비드를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행한 결과를 설명하기 위한 도면이다.FIG. 1 is a view for explaining the structure of a single-stranded DNA amplification apparatus using microbeads according to the present invention.
FIG. 2 is a flowchart illustrating a method of generating single stranded DNA using microbeads according to the present invention.
FIG. 3 is a view for explaining a stepwise method of producing a single stranded DNA using polyacrylamide microbeads produced using a microfluidic chip according to the present invention.
FIG. 4 is a schematic view illustrating a process of generating a single-stranded DNA using a primer exposed on the surface of a polyacrylamide microbead produced using a microfluidic chip to which the present invention is applied.
FIG. 5 is a view showing the microbead generating means applied to FIG. 1 in detail.
6 is a schematic diagram and a schematic diagram of a microfluidic chip for producing polyacrylamide microbeads to which the present invention is applied.
7 is a view showing the result of producing a microfluidic chip for producing polyacrylamide microbeads.
FIG. 8 shows the production, mixing, and curing processes of beads observed in the micro-fluidized chip to which the present invention is applied.
9 is a view for explaining a state in which the antisense primer is exposed to the surface of a microbead to which the present invention is applied.
FIG. 10 is a view for explaining a result of performing a polymerase chain reaction using microbeads to which the present invention is applied.

본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 유의해야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 본 발명에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적인 의미로 해석되거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적인 용어가 본 발명의 사상을 정확하게 표현하지 못하는 잘못된 기술적 용어일 때에는, 당업자가 올바르게 이해할 수 있는 기술적 용어로 대체되어 이해되어야 할 것이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 일반적인 용어는 사전에 정의되어 있는 바에 따라, 또는 전후 문맥상에 따라 해석되어야 하며, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다.It is noted that the technical terms used in the present invention are used only to describe specific embodiments and are not intended to limit the present invention. In addition, the technical terms used in the present invention should be construed in a sense generally understood by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs, unless otherwise defined in the present invention, Should not be construed to mean, or be interpreted in an excessively reduced sense. In addition, when a technical term used in the present invention is an erroneous technical term that does not accurately express the concept of the present invention, it should be understood that technical terms can be understood by those skilled in the art. In addition, the general terms used in the present invention should be interpreted according to a predefined or prior context, and should not be construed as being excessively reduced.

또한, 본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서, "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 발명에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계를 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.
Furthermore, the singular expressions used in the present invention include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In the present invention, terms such as "comprising" or "comprising" and the like should not be construed as encompassing various elements or stages of the invention, Or may further include additional components or steps.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시 예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.Hereinafter, exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, wherein like reference numerals refer to like or similar elements throughout the several views, and redundant description thereof will be omitted.

또한, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. In the following description, well-known functions or constructions are not described in detail since they would obscure the invention in unnecessary detail.

또한, 첨부된 도면은 본 발명의 사상을 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 발명의 사상이 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 됨을 유의해야 한다.
It is to be noted that the accompanying drawings are only for the purpose of facilitating understanding of the present invention, and should not be construed as limiting the scope of the present invention with reference to the accompanying drawings.

도 1은 본 발명에 따른 단일 가닥 DNA 증폭장치의 구성을 설명하기 위한 도면이다. 도 4는 본 발명이 적용된 미세 유체 칩을 이용하여 생성된 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드 표면에 노출되어 있는 프라이머를 이용하여 단일 가닥 DNA를 생성하는 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다. 도 5는 도 1에 적용된 마이크로 비드 생성수단을 구체적으로 도시한 도면이다. 도 6은 본 발명이 적용된 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 생성하는 미세 유체 칩의 개략적인 모식도와 칩의 구성도이다. 도 7은 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 생성하는 미세 유체 칩의 제작 결과를 도시한 도면이다. 도 8은 본 발명이 적용된 미세 유세 칩 내부에서 관찰된 비드의 생성 및 혼합, 경화 공정을 나타낸다. 도 9는 본 발명이 적용된 마이크로 비드 표면에 안티센스 프라이머가 노출된 상태를 설명하기 위한 도면이다. 도 10은 본 발명이 적용된 마이크로 비드를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행한 결과를 설명하기 위한 도면이다.
1 is a view for explaining a configuration of a single-stranded DNA amplification apparatus according to the present invention. FIG. 4 is a schematic view illustrating a process of generating a single-stranded DNA using a primer exposed on the surface of a polyacrylamide microbead produced using a microfluidic chip to which the present invention is applied. FIG. 5 is a view showing the microbead generating means applied to FIG. 1 in detail. 6 is a schematic diagram and a schematic diagram of a microfluidic chip for producing polyacrylamide microbeads to which the present invention is applied. 7 is a view showing the result of producing a microfluidic chip for producing polyacrylamide microbeads. FIG. 8 shows the production, mixing, and curing processes of beads observed in the micro-fluidized chip to which the present invention is applied. 9 is a view for explaining a state in which the antisense primer is exposed to the surface of a microbead to which the present invention is applied. FIG. 10 is a view for explaining a result of performing a polymerase chain reaction using microbeads to which the present invention is applied.

도 1에 도시된 바와 같이 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 장치는 TEMED가 함유된 오일을 공급받아 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 노출되어 있는 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 생성하는 마이크로 비드 생성수단(100)과, 마이크로 비드 생성수단(100)에 의해 생성된 마이크로 비드를 공급받아 주형 가닥 1과 센스 프라이머를 혼합시키고, 중합 효소 반응을 이용하여 혼합용액으로부터 DNA를 증폭시켜 회수하는 단일 가닥 DNA 생성수단(200)으로 이루어진다.
As shown in FIG. 1, a single-stranded DNA amplification apparatus using a microbead includes a microbead generating means 100 for generating polyacrylamide microbeads exposed to an oil containing TEMED and exposed to an antisense oligonucleotide, A single strand DNA generating means 200 that receives the microbeads generated by the bead generating means 100, mixes the template strand 1 and the sense primer, amplifies the DNA from the mixed solution by using a polymerase reaction, .

마이크로 비드 생성수단(100)은 도 1에 도시된 바와 같이 마이크로 비드를 생성시키는 미세 유체 칩(110)과, TEMED가 함유된 오일을 보유하고 있으며, 외부로부터 공급되는 에어에 의해 TEMED가 함유된 오일을 외부로 공급시키는 오일공급부(120)와, 오일공급부(120)와 미세 유체 칩(110) 사이에 구비되어 있으며, 외부로부터의 조작에 응하여 오일공급부(120)로 일정 압력으로 에어를 공급하는 외부 공압 펌프(130)와, 오일공급부(120)로부터 공급되는 오일을 미세 유체 칩(110) 내부로 주입시키는 시린지 펌프(140)로 이루어진다. 도 5은 도 1의 마이크로 비드 생성수단(100)을 구체화시킨 도면으로서, 마이크로 비드를 생성하기 위한 실험 장치의 구성도면이다.As shown in FIG. 1, the microbead generating means 100 includes a microfluidic chip 110 for generating microbeads, oil containing TEMED, and an oil containing TEMED by air supplied from the outside. An oil supply portion 120 for supplying oil to the oil supply portion 120 and an oil supply portion 120 for supplying air to the oil supply portion 120 at a constant pressure in response to an operation from the outside, A pneumatic pump 130 and a syringe pump 140 for injecting oil supplied from the oil supply unit 120 into the microfluidic chip 110. Fig. 5 is a view showing the micro-bead generating means 100 of Fig. 1, which is a configuration diagram of an experimental apparatus for generating micro-beads.

이때 미세 유체 칩(110)은 Polydimethylsiloxane (PDMS)를 활용한 replica molding 기법을 통하여 채널 구조를 형성시킨다. At this time, the microfluid chip 110 forms a channel structure through a replica molding technique using polydimethylsiloxane (PDMS).

폴리아크릴아마이드 마이크로 비드는 아크리다이트 올리고뉴클레오타이드(Acrydite Oligonucleotide)를 포함하고 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드 (Acrylamide/Bis-acrylamide)용액과 과황산암모늄(Ammonium Persulfate) 용액으로 구성된다.The polyacrylamide microbeads contain Acrydite Oligonucleotide and consist of acrylamide / bis-acrylamide solution and ammonium persulfate solution.

센스 프라이머의 말단에 화학물질이 부착되어 있으며, 화학물질은 Dig, 형광 물질, Biotin 등으로 이루어지며, 형광물질은 Cy3, Cy5 등으로 이루어진다.A chemical substance is attached to the end of the sense primer, and the chemical substance is Dig, a fluorescent substance, and Biotin, and the fluorescent substance is Cy3, Cy5, or the like.

그리고 도 7에서 미세 유체 칩(110)은 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 생성하는 미세 유체 칩의 제작 결과이며, 오른쪽은 X-junction 확대 이미지이다.In FIG. 7, the microfluidic chip 110 is a result of producing a microfluidic chip that generates polyacrylamide microbeads, and the right side is an X-junction enlarged image.

도 8은 칩 내부에서 관찰된 비드의 생성 및 혼합, 경화 공정을 나타내는 도면으로서, (a)는 X-junction 채널로, oil의 전단력에 의해 용액이 일정한 양으로 나뉘어지고, (b)는 마이크로 비드를 이루는 용액들이 상호 혼합되는 채널이며 (c)는 경화 채널으로서, 마이크로 칩을 이용하여 생성해낸 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드의 직경은 매우 일정하며, 표면에 안티센스 프라이머가 노출되어 있다.(A) is an X-junction channel in which the solution is divided into a certain amount by the shear force of oil, (b) is a microbead (C) is a hardened channel. The diameters of the polyacrylamide microbeads produced using the microchip are very constant, and the antisense primer is exposed on the surface.

도 9는 마이크로 비드 표면에 안티센스 프라이머가 노출되어 있다는 것을 확인하기 위해 안티센스 프라이머와 상보적인 서열을 지니며 5‘-말단에 형광 물질이 부착되어있는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 실험한 다음 공초점 현미경으로 관찰한 결과로서, 표면에 안티센스 프라이머가 노출되어 있으므로 형광 물질이 비드 표면에 관찰되고 있다.FIG. 9 shows the results of experiments using an oligonucleotide having a complementary sequence to an antisense primer and having a fluorescent substance attached at its 5'-end to confirm that the antisense primer is exposed on the surface of the microbead, As a result, the fluorescent material is observed on the bead surface because the antisense primer is exposed on the surface.

도 10은 마이크로 비드를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응을 수행한 결과로서, 레인 C는FIG. 10 shows the result of performing a polymerase chain reaction using microbeads, wherein lanes C

대조군으로 이중 가닥 DNA이며, 레인 1은 단일 가닥 DNA, 레인 2는 단일 가닥 DNA에 S1 nuclease를 처리한 결과이다.Lane 1 is single strand DNA and lane 2 is single strand DNA treated with S1 nuclease.

단일 가닥 DNA 생성수단(200)은 고정되어 있는 안티센스 프라이머와 주형 가닥 1을 결합시키고, 안티센스 프라이머를 신장시켜 주형 가닥 2를 생성시키고, 외부로부터 가해지는 열에 의해 주형 가닥 1을 제거시킨 후 신장된 주형 가닥 2에 센스 프라이머를 상보적으로 결합시켜 신장시키고 열에 의해 주형 가닥 2를 제거시켜 단일 가닥 DNA를 생성시키는 단일 가닥 DNA 생성부(210)와, 외부로부터 입력되는 제어신호에 응하여 온 또 는 오프되는 히터(220)와, 히터(220)의 온도를 감지하는 온도센서(230)와, 온도센서(230)에 의해 감지된 히터 온도가 미리 설정된 기준 온도인지의 여부를 체크하고, 히터가 기준 온도를 유지할 수 있도록 히터(220)의 온오프를 제어하는 컨트롤러(240)로 이루어진다.The single-stranded DNA generating means 200 combines the immobilized antisense primer with the template strand 1, elongates the antisense primer to generate template strand 2, removes the template strand 1 from the externally applied heat, A single stranded DNA generating unit 210 for complementarily binding and extending the sense primer to the strand 2 and removing the template strand 2 by heat to generate a single stranded DNA, A heater 220, a temperature sensor 230 for sensing the temperature of the heater 220, and a controller 230 for checking whether the heater temperature sensed by the temperature sensor 230 is a preset reference temperature, And a controller 240 for controlling on / off of the heater 220 so that the heater 220 can be maintained.

상기와 같이 구성된 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 방법에 대해서 설명하면 다음과 같다.A single-stranded DNA amplification method using the microbeads constructed as above will be described as follows.

도 2는 본 발명에 따른 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA를 생성방법을 설명하기 위한 동작흐름도이다. 도 3은 본 발명에 따른 미세 유체 칩을 이용하여 생성된 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 이용하여 단일 가닥 DNA를 생성방법을 단계적으로 설명하기 위한 도면이다.FIG. 2 is a flowchart illustrating a method of generating single stranded DNA using microbeads according to the present invention. FIG. 3 is a view for explaining a stepwise method of producing a single stranded DNA using polyacrylamide microbeads produced using a microfluidic chip according to the present invention.

도 2에 도시된 바와 같이 마이크로 비드를 이용한 단일 가닥 DNA 증폭 방법은 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 노출되어 있는 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드와 주형 가닥 1과 센스 프라이머를 혼합시킨다(S110).As shown in FIG. 2, a single-stranded DNA amplification method using a microbead mixes a polyacrylamide microbead exposed with an antisense oligonucleotide, Template Strand 1 and a sense primer (S110).

그리고 S110 단계에서 혼합된 용액을 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 DNA를 증폭(S120)시키고, 상층액을 회수한 후 정제하여 증폭된 단일 가닥 DNA를 회수(S130)한다.In step S110, the mixed solution is amplified using a polymerase chain reaction (S120). The supernatant is recovered and purified to recover the amplified single-stranded DNA (S130).

즉, 단일 가닥 DNA 생성부(210)은 도 4에 도시된 바와 같이 안티센스 프라이머가 고정되어 있는 마이크로 비드가 포함된 중합효소 연쇄반응 프리믹스를 이용하여 중합효소 연쇄반응 진행 과정을 통해 고정되어 있는 안티센스 프라이머와 주형 가닥 1을 결합시키고, 안티센스 프라이머를 신장시킨 후 또 다른 주형(주형 가닥 2)을 생성시키고 열을 인가시켜 주형 가닥 1이 떨어지도록 한다. 그리고 그 다음 신장된 주형 가닥 2에 센스 프라이머를 상보적으로 결합시켜 신장되도록 하고, 열로 인가시켜 떨어지도록 한다. 이러한 과정이 반복적으로 이루어지도록 단일 가닥 DNA를 생성하게 된다.That is, as shown in FIG. 4, the single-stranded DNA-generating unit 210 may be constructed by using a polymerase chain reaction premix containing a microbead to which an antisense primer is immobilized, And template strand 1 are combined and another template (template strand 2) is generated after the extension of the antisense primer and heat is applied to allow template strand 1 to fall off. Then, the sense primer is complementarily bound to the elongated template strand 2 so as to be elongated, and is applied with heat to fall off. Single-stranded DNA is generated so that this process is repeated.

폴리아크릴아마이드 마이크로 비드는 아크리다이트 올리고뉴클레오타이드(Acrydite Oligonucleotide)를 포함하고 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드 (Acrylamide/Bis-acrylamide)용액과 과황산암모늄(Ammonium Persulfate) 용액으로 구성되어 있다.The polyacrylamide microbeads contain Acrydite Oligonucleotide and consist of acrylamide / bis-acrylamide solution and ammonium persulfate solution.

센스 프라이머의 말단에 화학물질이 부착되어 있으며, 화학물질은 Dig, 형광 물질, Biotin 등으로 이루어지며, 형광물질은 Cy3 또는 Cy5이다.
The chemical is attached to the end of the sense primer. The chemical substance is Dig, a fluorescent substance, Biotin, etc., and the fluorescent substance is Cy3 or Cy5.

전술한 내용은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or essential characteristics thereof. Therefore, the embodiments disclosed in the present invention are intended to illustrate rather than limit the scope of the present invention, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. The scope of protection of the present invention should be construed according to the following claims, and all technical ideas within the scope of equivalents should be construed as falling within the scope of the present invention.

100 : 마이크로비드 생성수단
200 : 단일 가락 DNA 생성수단
210 : 단일 가락 DNA 생성부 220 : 히터
230 : 온도센서 240 : 컨트롤러100: microbead generating means
200: means for producing single-stranded DNA
210: single-stranded DNA generator 220: heater
230: temperature sensor 240: controller

Claims (12)

미세 유체 칩을 이용하여 상기 미세 유체 칩의 외부로부터 TEMED가 함유된 오일을 공급받아 상기 미세 유체 칩의 채널을 따라 상기 미세 유체 칩의 상기 외부로부터 일정 온도를 받으면서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표면에 노출되어 있는 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 생성하는 마이크로 비드 생성수단; 및
상기 마이크로 비드 생성수단에 의해 생성된 상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 공급받아 주형 가닥 1과 센스 프라이머를 혼합시키고, 중합 효소 반응을 이용하여 혼합용액으로부터 DNA를 증폭시켜 회수하는 단일 가닥 DNA 생성수단;
을 포함하고,
X-junction 채널에서 상기 일정 온도 하에 상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드의 생성과, 파도 형상의 채널에서 상기 일정 온도 하에 상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드를 이루는 용액들의 혼합과, 편평한 형상의 채널에서 상기 일정 온도 하에 상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드의 경화를 수행하고,
상기 단일 가닥 DNA 생성수단은 상기 혼합용액으로부터 상기 DNA를 증폭시키기 위해 상기 중합 효소 반응 동안에 상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드의 상기 표면으로부터 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 주형 가닥 1의 길이만큼 신장시켜 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드로부터 주형의 역할을 하는 가닥의 일부로 이용하며,
상기 마이크로 비드 생성수단은 상기 마이크로 비드를 생성시키는 미세 유체 칩과,
TEMED가 함유된 오일을 보유하고 있으며, 외부로부터 공급되는 에어에 의해 상기 TEMED가 함유된 오일을 외부로 공급시키는 오일공급부와,
상기 오일공급부와 상기 미세 유체 칩 사이에 구비되어 있으며, 외부로부터의 조작에 응하여 상기 오일공급부로 일정 압력으로 에어를 공급하는 외부 공압 펌프와,
상기 오일공급부로부터 공급되는 오일을 상기 미세유체 칩 내부로 주입시키는 시린지 펌프로 이루어지고,
상기 단일 가닥 DNA 생성수단은,
고정되어 있는 안티센스 프라이머와 주형 가닥 1을 결합시키고, 상기 안티센스 프라이머를 신장시켜 주형 가닥 2를 생성시키고, 외부로부터 가해지는 열에 의해 주형 가닥 1을 제거시킨 후 신장된 주형 가닥 2에 센스 프라이머를 상보적으로 결합시켜 신장시키고 열에 의해 주형 가닥 2를 제거시켜 단일 가닥 DNA를 생성시키는 단일 가닥 DNA 생성부와,
외부로부터 입력되는 제어신호에 응하여 온 또는 오프되는 히터와,
상기 히터의 온도를 감지하는 온도센서와,
상기 온도센서에 의해 감지된 히터 온도가 미리 설정된 기준 온도인지의 여부를 체크하고, 상기 히터가 기준 온도를 유지할 수 있도록 상기 히터의 온오프를 제어하는 컨트롤러로 이루어진 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 증폭장치.
Wherein the microfluid chip is supplied with oil containing TEMED from the outside of the microfluidic chip and is exposed to the surface of the microfluidic chip along the channel of the microfluidic chip to expose the surface of the antisense oligonucleotide Micro-bead generating means for producing polyacrylamide microbeads; And
Single-stranded DNA generating means for supplying the polyacrylamide microbeads generated by the microbead generating means, mixing the template strand 1 and the sense primer, amplifying the DNA from the mixed solution using a polymerase reaction, and recovering the amplified DNA;
/ RTI >
Forming the polyacrylamide microbeads under the constant temperature in an X-junction channel, mixing solutions forming the polyacrylamide microbeads under the constant temperature in a wave-shaped channel, and mixing the solutions in the flat- Performing curing of the polyacrylamide microbeads ,
The single stranded DNA generating means elongates the antisense oligonucleotide from the surface of the polyacrylamide microbead by the length of the template strand 1 during the polymerase reaction to amplify the DNA from the mixed solution to form the antisense oligonucleotide Is used as a part of the strand serving as a template from the polyacrylamide microbeads,
Wherein the microbead generating means comprises a microfluidic chip for generating the microbead,
An oil supply unit for supplying the TEMED-containing oil to the outside by means of air supplied from the outside,
An external pneumatic pump provided between the oil supply unit and the microfluidic chip and supplying air to the oil supply unit at a predetermined pressure in response to an external operation;
And a syringe pump for injecting the oil supplied from the oil supply unit into the microfluidic chip,
The single stranded DNA generating means comprises:
The immobilized antisense primer is bound to the template strand 1, the antisense primer is elongated to generate the template strand 2, the template strand 1 is removed by heat applied from the outside, and the sense primer is extended to the extended template strand 2 Stranded DNA to generate single stranded DNA by elongating it by binding and removing template strand 2 by heat,
A heater that is turned on or off in response to a control signal input from the outside,
A temperature sensor for sensing the temperature of the heater,
And a controller for checking whether the heater temperature sensed by the temperature sensor is a predetermined reference temperature and for controlling the heater on and off so that the heater can maintain the reference temperature. .
삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서,
상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드는 아크리다이트 올리고뉴클레오타이드(Acrydite Oligonucleotide)를 포함하고 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드 (Acrylamide/Bis-acrylamide)용액과 과황산암모늄(Ammonium Persulfate) 용액으로 구성되는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 증폭장치.
The method according to claim 1,
The polyacrylamide microbeads include an Acrydite Oligonucleotide and are composed of an acrylamide / bis-acrylamide solution and an ammonium persulfate solution. Single stranded DNA amplification device.
제 1 항에 있어서,
상기 센스 프라이머의 말단에 화학물질이 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 증폭장치.
The method according to claim 1,
And a chemical substance is attached to the end of the sense primer.
제 5 항에 있어서,
상기 화학물질은 Dig, 형광 물질, Biotin 중 하나인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 증폭장치.
6. The method of claim 5,
Wherein the chemical is one of Dig, a fluorescent substance, and Biotin.
제 6 항에 있어서,
상기 형광물질은 Cy3 또는 Cy5 인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 증폭장치.
The method according to claim 6,
Wherein the fluorescent material is Cy3 or Cy5.
단일 가닥 DNA를 생성하는 방법에 있어서,
미세 유체 칩의 채널을 따라 중합 반응 동안에 상기 미세 유체 칩의 외부로부터 일정 온도를 받으면서 형성되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 표면에 노출되어 있는 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드와 주형 가닥 1과 센스 프라이머를 혼합시키는 단계;
폴리아크릴아마이드 마이크로 비드와 주형 가닥 1과 센스 프라이머를 혼합시킨 혼합 용액을 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 DNA를 증폭시키는 단계; 및
상기 혼합 용액으로부터 상층액을 회수한 후 정제하여 증폭된 단일 가닥 DNA를 회수하는 단계;
를 포함하고,
상기 중합 효소 연쇄 반응은 상기 혼합용액으로부터 상기 DNA를 증폭시키기 위해 상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드의 상기 표면으로부터 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 주형 가닥 1의 길이만큼 신장시켜 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드로부터 돌출하는 주형의 역할을 하는 가닥의 일부로 이용하도록 수행되고,
폴리아크릴아마이드 마이크로 비드와 주형 가닥 1과 센스 프라이머를 혼합시키는 단계와, DNA를 증폭시키는 단계는,
마이크로 비드를 생성시키는 미세 유체 칩과, TEMED가 함유된 오일을 보유하고 있으며, 외부로부터 공급되는 에어에 의해 상기 TEMED가 함유된 오일을 외부로 공급시키는 오일공급부와, 상기 오일공급부와 상기 미세 유체 칩 사이에 구비되어 있으며, 외부로부터의 조작에 응하여 상기 오일공급부로 일정 압력으로 에어를 공급하는 외부 공압 펌프와, 상기 오일공급부로부터 공급되는 오일을 상기 미세유체 칩 내부로 주입시키는 시린지 펌프를 사용하고,
고정되어 있는 안티센스 프라이머와 주형 가닥 1을 결합시키고, 상기 안티센스 프라이머를 신장시켜 주형 가닥 2를 생성시키고, 외부로부터 가해지는 열에 의해 주형 가닥 1을 제거시킨 후 신장된 주형 가닥 2에 센스 프라이머를 상보적으로 결합시켜 신장시키고 열에 의해 주형 가닥 2를 제거시켜 단일 가닥 DNA를 생성시키는 단일 가닥 DNA 생성부와, 외부로부터 입력되는 제어신호에 응하여 온 또는 오프되는 히터와, 상기 히터의 온도를 감지하는 온도센서와, 상기 온도센서에 의해 감지된 히터 온도가 미리 설정된 기준 온도인지의 여부를 체크하고, 상기 히터가 기준 온도를 유지할 수 있도록 상기 히터의 온오프를 제어하는 컨트롤러가 사용되는 단일가닥 DNA 증폭방법.
In a method for producing single stranded DNA,
Mixing the polyacrylamide micro beads with the antisense oligonucleotide formed on the surface of the microfluidic chip while being subjected to a constant temperature from the outside of the microfluidic chip during the polymerization reaction with the template strand 1 and the sense primer;
Amplifying DNA using a polymerase chain reaction with a mixed solution obtained by mixing polyacrylamide microbeads, template strand 1 and sense primer; And
Recovering the supernatant from the mixed solution, and purifying the supernatant to recover the amplified single stranded DNA;
Lt; / RTI >
Wherein said polymerase chain reaction is carried out by extending said antisense oligonucleotide from said surface of said polyacrylamide microbead by a length of said template strand 1 to amplify said DNA from said mixed solution to form said antisense oligonucleotide in said polyacrylamide micro- To be used as a part of the strand acting as a mold projecting from the bead,
Mixing the polyacrylamide microbeads, the template strand 1 and the sense primer, and amplifying the DNA,
A microfluidic chip for generating microbeads; an oil supply unit for supplying the TEMED-containing oil to the outside, the oil supply unit including an oil containing TEMED, An external pneumatic pump that supplies air at a predetermined pressure to the oil supply unit in response to an operation from the outside and a syringe pump that injects the oil supplied from the oil supply unit into the microfluidic chip,
The immobilized antisense primer is bound to the template strand 1, the antisense primer is elongated to generate the template strand 2, the template strand 1 is removed by heat applied from the outside, and the sense primer is extended to the extended template strand 2, A single strand DNA generator for generating strand 2 by heat and generating a single strand DNA, a heater which is turned on or off in response to a control signal inputted from the outside, a temperature sensor And a controller for controlling whether the heater temperature sensed by the temperature sensor is a predetermined reference temperature and controlling the heater to be turned on or off so that the heater can maintain the reference temperature.
제 8 항에 있어서,
상기 폴리아크릴아마이드 마이크로 비드는 아크리다이트 올리고뉴클레오타이드(Acrydite Oligonucleotide)를 포함하고 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드 (Acrylamide/Bis-acrylamide)용액과 과황산암모늄(Ammonium Persulfate) 용액으로 구성되는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 증폭방법.
9. The method of claim 8,
The polyacrylamide microbeads include an Acrydite Oligonucleotide and are composed of an acrylamide / bis-acrylamide solution and an ammonium persulfate solution. Single stranded DNA amplification method.
제 8 항에 있어서,
상기 센스 프라이머의 말단에 화학물질이 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 증폭방법.
9. The method of claim 8,
Wherein the sense primer has a chemical substance attached to the end of the single strand DNA amplification method.
제 10 항에 있어서,
상기 화학물질은 Dig, 형광 물질, Biotin 중 하나인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 증폭방법.
11. The method of claim 10,
Wherein the chemical is one of Dig, a fluorescent substance, and Biotin.
제 11 항에 있어서,
상기 형광물질은 Cy3 또는 Cy5 인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 DNA 증폭방법.
12. The method of claim 11,
Wherein the fluorescent material is Cy3 or Cy5.
KR1020140156293A 2014-11-11 2014-11-11 Amplification apparatus and method of Single Strand DNA using Microbeads KR101676108B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140156293A KR101676108B1 (en) 2014-11-11 2014-11-11 Amplification apparatus and method of Single Strand DNA using Microbeads

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140156293A KR101676108B1 (en) 2014-11-11 2014-11-11 Amplification apparatus and method of Single Strand DNA using Microbeads

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160056195A KR20160056195A (en) 2016-05-19
KR101676108B1 true KR101676108B1 (en) 2016-11-22

Family

ID=56103334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140156293A KR101676108B1 (en) 2014-11-11 2014-11-11 Amplification apparatus and method of Single Strand DNA using Microbeads

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101676108B1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220096494A (en) 2020-12-31 2022-07-07 한국기계연구원 Fast molecular diagnosis apparatus for fast temperature control and method for fast molecular diagnosis using the same

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107619781B (en) * 2016-07-15 2022-01-25 中国检验检疫科学研究院 Single-reaction temperature-control high-throughput micro-fluidic chip nucleic acid amplification device
CN113881662A (en) * 2021-09-09 2022-01-04 杭州师范大学 Method for preparing single-stranded DNA (deoxyribonucleic acid) in solid-phase medium through 5' -terminal acrylamide-amidated PCR (polymerase chain reaction) product

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009278865A (en) 2006-07-31 2009-12-03 Kinki Univ Method for amplification of dna fragment
GB0818609D0 (en) 2008-10-10 2008-11-19 Univ Hull apparatus and method

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomolecular Engineering, Vol. 24, pp. 381-403 (2007.)
Ind. Eng. Chem. Res., Vol. 51, pp. 9016-9022 (2014.06.12.)*
Nucleic Acids Research, Vol. 27, pp. 649-655 (1999.)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220096494A (en) 2020-12-31 2022-07-07 한국기계연구원 Fast molecular diagnosis apparatus for fast temperature control and method for fast molecular diagnosis using the same

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160056195A (en) 2016-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101676108B1 (en) Amplification apparatus and method of Single Strand DNA using Microbeads
EP3274091B1 (en) Universal molecular processor for precision medicine
Kan et al. DNA sequencing and genotyping in miniaturized electrophoresis systems
JP2020072721A (en) Method and device for continuous amplification reaction
CN105925572B (en) DNA coding microsphere and synthetic method thereof
JP2019515674A (en) Immobilization-based systems and methods for genetic analysis and other applications
ATE386822T1 (en) DEVICE THAT CONTROLS THE RELEASE OF NUCLEOTIDES DURING A REACTION
WO2005069886A3 (en) Sparsely cross-linked nanogels: a novel polymer structure for microchannel DNA sequencing
DE602004022253D1 (en) PROCESS FOR THE AMPLIFICATION AND SEQUENCING OF NUCLEIC ACIDS
US20120309002A1 (en) Sample multiplexing
WO2005073410A3 (en) Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion
US20100224494A1 (en) Isotachophoretic Focusing of Nucleic Acids
PT96458A (en) USE OF TRANSCRIPTS OF DNA DEPENDENT POLYMERASE RNA AS REGISTERING MOLECULES FOR SIGNAL AMPLIFICATION IN NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION TESTS
WO2007024798A3 (en) Apparatus, system, and method using immiscible-fluid-discrete-volumes
DK595389D0 (en) METHOD OF REAGENT COMBINATION FOR DETERMINING NUCLEOTIDE SEQUENCES
TW200708734A (en) Microchip electrophoresis method and device
DK2175018T3 (en) Procedure for pure cloning
CN103316723A (en) Microfluidic electrophoresis chip
US20080166770A1 (en) Method and apparatus for amplifying and synthesisizing nucleic acid with denaturant
Chung et al. Microfluidic chip for fast nucleic acid hybridization
EA201491821A1 (en) MODIFIED oligonucleotides, including thiol functional groups, and their use for the detection of nucleic acids
WO2014145138A3 (en) Methods for amplification of nucleic acids utilizing clamp oligonuleotides
JP2011160728A (en) Microchip for nucleic acid amplification reaction and manufacturing method thereof
WO2006025074A3 (en) Twodimensional strandness- and length-dependent separation of nucleic acid fragments
DE50313352D1 (en) MICROARRAY-BASED METHOD FOR THE AMPLIFICATION AND DETECTION OF NUCLEIC ACIDS IN A CONTINUOUS PROCESS

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190814

Year of fee payment: 4