KR101674920B1 - 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물 및 진단방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물 및 근위축성측색경화증 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성을 억제하거나 MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성을 증가 또는 MFN2 단백질의 분해를 억제하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물과 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 측정하여 근위축성 측색경화증을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, ALS의 조기진단이 가능할 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 ALS의 예방 또는 치료용 조성물을 이용할 경우, ALS의 증상이 악화되기 전에 운동신경세포의 미토콘드리아 기능을 보호함으로써 운동신경세포의 손상을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다.

Description

근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물 및 진단방법{Composition for Preventing or Treating Amyotrophic Lateral Sclerosis and Method for Diagnosing}
본 발명은 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물 및 근위축성측색경화증 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성을 억제하거나 MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성을 증가 또는 MFN2 단백질의 분해를 억제하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물과 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 측정하여 근위축성 측색경화증을 진단하는 방법에 관한 것이다.
루게릭병이라 불리는 근위축성 측색경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS)은 운동신경세포만 선택적으로 사멸하는 대표적인 신경퇴행성질환으로 사지의 쇠약 및 위축 증상이 서서히 진행되다가 호흡근 마비로 수년 내에 사망에 이르게 되는 치명적인 질환이다.
ALS의 발병 원인에 대해서는 여러가지 가설이 존재하지만, 세포질에 존재하는 SOD(superoxide dismutase)1의 돌연변이로 인해 미토콘드리아의 형태적 변형을 동반하는 미토콘드리아의 기능 손실(M.T. Carri et al., J Bioenerg . Biomembr . 43:593-599, 2011)과 저산소(hypoxia) 스트레스에 의한 운동신경세포의 선택적 사멸(D.W. Cleveland et al., Neuroscience 2:806-819, 2001)이 ALS 발병에 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 미토콘드리아 융합 단백질인 MFN2의 돌연변이가 ALS의 발병과 관련이 있다는 연구가 보고된 바 있고(Marchesi C et al., Neuromuscul Disord . 21(2):129-31, 2011), HDACs(Histone deacetylases)의 클래스 IIb 패밀리 멤버인 HDAC6가 자가포식작용(autophagy)을 조절하여 ALS의 진행을 막는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Chen S et al., Neurosci Bull. 2015 Jul 11). 그러나, 현재까지 ALS의 효과적인 치료법은 알려져 있지 않으며, 증상이 두드러지게 나타나는 후기에나 진단이 가능하여 치료시기를 놓치게 되는 문제점이 있다.
한편, MITOL이라고도 불리는 MARCH5 미토콘드리아 유비퀴틴 리가아제(줄여서 MARCH5)는 막 연관 RING-CH(Membrane Associated Ring-CH) E3 유비퀴틴 리가아제(MARCH) 패밀리에 속하며, 미토콘드리아 다이나믹스(mitochondrial dynamics)의 조절자(regulator)로 알려져 있다. MARCH5는 미토콘드리아의 융합(mitochondrial fusion)에 관여하는 단백질인 MFN1, MFN2 또는 미토콘드리아의 분열(mitochondrial fission)에 관여하는 단백질인 Fis1, Drp1에 결합하여 유비퀴틴화(ubiquitination)시킴으로써 미토콘드리아의 융합 또는 분열을 억제하는 것으로 알려져 있다(N. Nakamura et al., EMBO Rep. 7:1019-1022, 2006).
하지만, 아직까지 MARCH5가 ALS의 발병에 관련이 있다는 연구에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 ALS를 조기에 진단하고 효과적인 ALS 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, ALS의 모델 마우스에서 MARCH5 유전자의 발현을 억제하거나 MFN2 단백질의 분해를 억제할 경우, 운동신경세포의 미토콘드리아 기능이 보호함으로써 ALS의 진행이 저해되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 ALS의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성 증가제 또는 MFN2 단백질의 분해 억제제를 유효성분으로 포함하는 ALS의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적은 MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제제; 및 MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성 증가제 또는 MFN2 단백질의 분해 억제제를 유효성분으로 포함하는 ALS의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 ALS의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 ALS의 조기진단 또는 진행단계의 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 ALS의 진단방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성 증가제 또는 MFN2 단백질의 분해 억제제를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제제; 및 MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성 증가제 또는 MFN2 단백질의 분해 억제제를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) MARCH5를 발현하는 세포에 MARCH5 유전자의 발현 억제 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제 후보물질을 처리하여, MARCH5 유전자의 발현양 또는 MARCH5 단백질의 활성을 측정하는 단계; (b) 상기 MARCH5 유전자의 발현 억제 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제 후보물질 처리군의 MFN2 유전자의 발현양 또는 MFN2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성은 억제되고, MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성이 증가된 후보물질을 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 분리된 생물학적 시료로부터 신경세포에서 발현된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 근위축성 측색경화증의 조기진단 또는 진행단계의 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 분리된 생물학적 시료로부터 신경세포에서 발현된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 근위축성 측색경화증의 진단방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, ALS의 조기진단이 가능할 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 ALS의 예방 또는 치료용 조성물을 이용할 경우, ALS의 증상이 악화되기 전에 운동신경세포의 미토콘드리아 기능을 보호함으로써 운동신경세포의 손상을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다.
도 1은 HDAC6를 발현하는 마우스(WT)와 발현하지 않는 마우스(KO)에서 미토콘드리아의 형태적 변화를 관찰한 결과(A) 및 정량분석한 결과(B)이다.
도 2는 HDAC6와 MFN2의 상호작용을 확인하는 면역침강법(immunoprecipitation) 및 웨스턴 블로팅(western blotting)의 결과이다.
도 3은 MARCH5가 MFN2에 특이적인 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)임을 보여주는 면역침강법 및 웨스턴 블로팅의 결과이다.
도 4는 MARCH5 siRNA를 처리한 후 미토콘드리아의 형태적 변화를 관찰한 결과(A) 및 정량분석한 결과(B)와 ALS 질병 모델에서 MARCH5의 발현을 확인한 결과(C)이다.
본 발명에서는 근위축성 측색경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS)을 치료하기 위해, ALS 모델 마우스에서 MARCH5 siRNA로 MARCH5 유전자의 발현을 억제하거나 HDAC6로 MFN2 단백질의 분해를 억제한 결과, ALS의 진행이 저해되는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, HDAC6 결핍 세포에서 저산소 스트레스에 의해 유도된 MARCH5의 MFN2 분해 활성을 확인하기 위해 MARCH5 siRNA를 HDAC6 결핍세포에 형질주입하고 저산소 처리한 결과, MARCH5 단백질의 발현이 감소되면서 MFN2 단백질의 발현이 정상 수준으로 회복하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제제는 MARCH5 siRNA로, MARCH5 mRNA와 완전히 상보적 결합을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음) 또는 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 화학적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는, HDAC6의 결핍이 MFN2 단백질의 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 야생형 세포와 HDAC6 결핍세포에 저산소 처리를 하고 MFN2에 대한 항체를 처리하여 관찰한 결과, 야생형 세포에서는 MFN2 단백질의 발현수준이 유지된 반면, HDAC6 결핍 세포에서는 MFN2 단백질의 발현이 감소한 것을 관찰하였다.
본 발명은 다른 관점에서, MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성 증가제 또는 MFN2 단백질의 분해 억제제를 유효성분으로 포함하는 근위축성측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성 증가제 또는 MFN2 단백질의 분해 억제제는 HDAC6인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제제 및 MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성 증가제 또는 MFN2 단백질의 분해 억제제를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) MARCH5를 발현하는 세포에 MARCH5 유전자의 발현 억제 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제 후보물질을 처리하여, MARCH5 유전자의 발현양 또는 MARCH5 단백질의 활성을 측정하는 단계; (b) 상기 MARCH5 유전자의 발현 억제 또는 MARCH5 단백질의 활성 억제 후보물질 처리군의 MFN2 유전자의 발현양 또는 MFN2 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, MARCH5 유전자의 발현 또는 MARCH5 단백질의 활성은 억제되고, MFN2 유전자의 발현 또는 MFN2 단백질의 활성이 증가된 후보물질을 근위축성측색경화증의 예방 또는 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 근위축성측색경화증의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 MARCH5를 발현하는 세포로 A549(adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells) 세포, MEF(mouse embryonic fibroblast) 세포 또는 HEK(human embryonic kidney) 293T 세포 또는 일차신경줄기세포(primary neuronal stem cells)를 사용할 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 근위축성 측색경화증 모델 마우스와 대조군 마우스에서 웨스턴 블로팅을 통해 MARCH5 및 MFN2 단백질의 발현양을 비교해본 결과, 대조군 마우스와 달리 근위축성 측색경화증 모델 마우스에서 MARCH5의 단백질 발현양이 증가하고, MFN2 단백질의 발현양이 감소한 것을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 분리된 생물학적 시료로부터 신경세포에서 발현된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 근위축성 측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)의 조기진단 또는 진행단계의 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 분리된 생물학적 시료로부터 신경세포에서 발현된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 근위축성 측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)의 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 MARCH5 유전자의 발현양 또는 MARCH5 단백질의 활성이 증가하고 MFN2 유전자의 발현양 또는 MFN2 단백질의 활성이 감소하는 경우, 근위축성 측색경화증 또는 근위축성 측색경화증의 진행단계로 예측하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
재료 및 방법
1. 세포주 및 플라스미드
A549 세포는 ATCC로부터 구입하였다. 야생형 MEF 세포와 HDAC6 KO MEF 세포는 Y.S. Gao et al., Mol . Cell Biol . 24:8637-8647(2002)에 공지된 방법으로 준비하였다. 야생형과 ring-domain 돌연변이 MARCH5를 발현하는 플라스미드는 Dr. Shigehisa Hirose로부터 제공받았으나, N. Nakamura et al., EMBO Rep. 7:1019-1022(2006)에 공지된 방법으로 준비할 수 있다. 리포펙타민(lipopectamine) LTX(Invitrogen)와 RNAiMax(Invitrogen)는 제조자의 프로토콜에 따라 형질주입에 사용하였다.
2. 항체 및 시약
항-마우스 HDAC6 항체는 아미노산 991에서 1149에 대해 Y.S. Gao et al., Mol. Cell Biol . 24:8637-8647(2002)에 공지된 방법으로 준비하였다. 하기의 항체들을 실험에 사용하였다: MFN2(Millipore, ABC42), Tom20(Santa Cruz, sc11415), GAPDH(Cell Signaling, 2118), MARCH5(Dr. Hirose로부터 제공받음), 아세틸-튜불린(acetyl-tubulin)(Sigma, T7451) 및 mtHsp70(Enzo life science). 하기의 시약들을 실험에 사용하였다: 디퍼옥사민(deferoxamine)(Sigma, D9533), CoCl2(Sigma, C8661) 및 팔로이딘(phalloidin)(Invitrogen).
3. 동물 처리 및 관리(Animal care and husbandry)
마우스들은 Duke University의 동물 시설에서 정기적 유지 프로그램 하에 관리하였다. HDAC5+/- 암컷 마우스(B6SJL genetic background)는 수컷 SOD1G93A 마우스(B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J, Jackson Laboratory)와 교배하였다. 본 연구는 National Institutes of Health의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals의 엄격한 지침에 따라 수행하였다. 프로토콜은 Duke University의 Aminal Research Committee에서 인증하였다(Permit Nubver: A321-09-11). 모든 수술은 펜토바비탈나트륨(sodium pentobarbital)으로 마취한 후 진행하였다.
실시예 1: 저산소 조건에서 HDAC6에 의한 미토콘드리아 융합 확인
HDAC6가 포도당 결핍에 의해 유도된 대사성 스트레스에 반응하여 미토콘드리아의 융합을 촉진한다는 것을 확인한 바 있다(J.Y. Lee et al., J. Cell Sci . 127: 4954-4963, 2014).
이에 본 실시예에서는 HDAC6가 다른 형태의 미토콘드리아 스트레스에 관여하는지 확인하기 위해 야생형 MEF 세포와 HDAC6가 녹아웃(knockout)된 HDAC6 KO MEF 세포에 저산소 처리함으로써 미토콘드리아의 형태적 변화양상을 확인하였다. 세포는 슬라이드 글라스에서 10% 소태아혈청(FBS)을 함유하는 DMEM(Invitrogen 11995)으로 유지하였다. 저산소 스트레스 처리를 위해, 70% 컨플루언트(confluent) 세포를 95% N2, 5% CO2, 37℃의 저산소 챔버에서 배양한 후, 인산 완충 식염수(PBS)로 세 번 세척하고 24시간동안 200 ㎛ DFO를 처리한 후 10% FBS DMEM에서 배양하였다. 미토콘드리아의 형태적 변화를 관찰하기 위해 항-mtHsp70 항체(녹색)로 세포를 면역염색(C. Hubbert et al., Nature 417:455-458, 2002)하였다. 이미지는 Leica SP5 공초점 현미경(Leica DMI6000C)을 통해 확인하였다.
그 결과, DFO 처리되지 않은 정상 성장 배지에서는 야생형과 HDAC6 KO MEF 모두 유사한 미토콘드리아의 형태를 보였으나, DFO가 처리된 저산소 스트레스 하에서 야생형 세포는 아무런 변화가 일어나지 않은 반면, HDAC6 KO MEF에서는 미토콘드리아의 분열을 확인할 수 있었다(도 1의 A). 미토콘드리아의 형태적 변화를 정량분석한 결과, 야생형 세포는 DFO 처리 후에 과융합된(hyperfuged) 미토콘드리아의 양이 급격히 증가한 반면, HDAC6 KO 세포에서는 DFO 처리 후에 분열된(fragmented) 미토콘드리아의 양이 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 1의 B). 이를 통해, HDAC6는 세포가 저산소 스트레스에 노출되었을 때 미토콘드리아를 융합시킴으로써 미토콘드리아의 연결성(mitochondrial connectivity)을 유지하는 것을 확인하였다.
실시예 2: 저산소 조건에서 HDAC6와 MFN2의 상호작용 확인
2-1: HDAC6와 MFN2의 결합 확인
저산소 조건 하에서 HDAC6가 MFN2에 결합하는지 확인하기 위해, 세포는 NETN 버퍼(0.5% NP40, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM Tris)와 프로테아제 저해제 칵테일 및 1 mM DTT로 용해(lysed)하였다. 세포 용해물에 실시예1과 동일한 방법으로 하루 동안 DFO와 200 ㎛ CoCl2로 저산소 스트레스 처리를 하고, 동일하게 저산소 처리를 한 다른 세포 용해물은 일차 항체와 함께 배양한 후 단백질 A, G 비드 및 항-MFN2항체로 면역침강(immunoprecipitation)하였다. 침강된 샘플은 98℃에서 5분동안 1X 웨스턴 샘플 버퍼에서 배양하였다. 샘플은 SDS-PAGE 겔로 로딩하고 항-MFN2와 항-HDAC6 항체로 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 진행하였다.
그 결과, HDAC6가 MFN2에 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 A). 이를 통해, HDAC6는 저산소 조건에서 MFN2와의 특이적인 상호작용을 통해 미토콘드리아의 연결성(mitochondrial connectivity)을 유지하는 역할을 하는 것을 확인하였다.
2-2: HDAC6의 결핍에 의한 MFN2 발현 양상 확인
아울러, HDAC6의 결핍이 MFN2 단백질 수준에 영향을 미치는지 확인하기 위해, MFN2의 발현양을 측정하였다. 추가로, 저산소 조건에서 미토콘드리아의 질량손실에 의한 MFN2의 발현이 감소하는 가능성을 배제하기 위해, 미토콘드리아 단백질인 Tom20의 발현양을 함께 측정하였다. 야생형 세포와 HDAC6 KO MEF를 하루동안 normoxic(20% O2) 및 anoxic(0% O2) 조건하에서 배양하고, 각각의 세포 용해물은 항-MFN2 항체, 항-Tom20 항체, 항-HDAC6 항체 및 항-GAPDH 항체로 면역블로팅(immunoblotting)하였다.
그 결과, normoxic 조건에서 두 세포는 MFN2가 유사한 수준으로 발현되었지만, anoxic 조건에서는 야생형 세포의 MFN2의 발현수준은 유지된 반면, HDAC6 KO 세포에서 MFN2는 발현하지 않았다. 또한, 모든 조건에서 Tom20의 발현수준은 변하지 않았다(도 2의 B). 이를 통해, HDAC6는 저산소 조건에서 MFN2와의 상호작용을 통해 MFN2를 보호함으로써 미토콘드리아의 연결성(mitochondrial connectivity)을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.
실시예 3: HDAC6 결핍 세포에서 저산소 조건에 의해 유도되는 MARCH5의 MFN2 분해 활성 확인
MARCH5는 MFN2의 특이적 결합 파트너인 것으로 알려져 있다(N. Nakamura et al., EMBO Rep 7:1019-1022, 2006).
이에 본 실시예에서는 HDAC6 결핍 세포에서 저산소 스트레스에 의해 유도된 MARCH5 세포가 MFN2의 분열(proteasomal degradation)에 관여하는지 확인하였다.
3-1: 저산소 조건의 HDAC6 결핍세포에서 MARCH5 발현 양상 확인
야생형 세포와 HDAC6 KO MEF 세포에서 MARCH5의 단백질 수준을 확인하기위해, 실시예 1과 동일한 방법으로 200 ㎛ DFO를 하루동안 처리한 세포군과 이틀동안 처리한 세포군을 준비하고, 항-HDAC6 항체, 항-MFN2 항체, 항-MARCH5 항체, 항-아세틸 튜불린(acetyl tubulin) 항체 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 면역블로팅 분석을 진행하였다.
그 결과, DFO 비처리군에서 HDAC6 KO MEF의 MARCH5 발현이 약간 증가하였다. DFO에 하루동안 노출된 HDAC6 KO MEF 세포에서는 MARCH5의 발현이 증가하였고 동시에 MFN2의 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 야생형 세포에서는 MARCH5의 발현이 미미하게 증가하는 수준에 그쳤고, MFN2는 비교적 잘 보존되었다. 또한, HDAC6의 발현은 세포가 저산소 조건에 노출되었을 때 증가하였다(도 3의 A). 이를 통해, MARCH5는 저산소 조건 하의 HDAC6 결핍세포에서 과발현되는 것을 확인할 수 있었다.
3-2: MARCH5 siRNA 형질주입을 통한 MFN2 발현 양상 확인
이어서, HDAC6 결핍 세포에서 저산소 스트레스에 의해 유도된 MARCH5가 MFN2의 분해에 관여하는지 확인하기 위해, HDAC6 KO MEF에 MARCH5 siRNA를 형질주입하고 실시예 1과 동일한 방법으로 200 ㎛ DFO를 하루동안 처리한 후, 실시예 2와 동일한 방법으로 항-MFN2 항체, 항-MARCH5 항체 및 항-GAPDH 항체를 웨스턴 블로팅하였다.
그 결과, DFO 처리된 HDAC6 KO 세포에서 MFN2의 발현이 감소한 반면, siRNA에 의해 MARCH5가 녹다운된 세포에서는 MFN2의 발현 수준이 정상 수준으로 회복된 것을 확인하였다(도 3의 B).
3-3: MARCH5의 MFN2-특이적 유비퀴틴 리가아제 활성 확인
추가로, MARCH5가 MFN2의 특이적인 유비퀴틴 리가아제인지 확인하기 위해, 293T 세포에 MFN2-flag, 유비퀴틴-HA, 야생형 및 ring domain 돌연변이 MARCH5 발현 플라스미드를 형질주입하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 세포 용해물은 항-MFN2 항체로 면역침강하였고, 유비퀴틴화된 MFN2를 확인하기 위해 항-HA 항체로 블로팅하였다.
그 결과, 야생형 MARCH5가 발현된 샘플에서는 유비퀴틴화된 MFN2를 확인할 수 있었지만, 돌연변이된 MARCH5가 발현된 샘플에서는 유비퀴틴화된 MFN2를 확인할 수 없었다(도 3의 C). 이를 통해, MARCH5는 MFN2에 특이적인 유비퀴틴 리가아제인 것을 확인하였다.
3-4: 저산소 조건의 HDAC6 결핍세포에서 MARCH5의 미토콘드리아 연결성 관여 확인
최종적으로, MARCH5가 저산소 조건의 HDAC6 KO에서 미토콘드리아의 연결성 손실에 관여하는지 확인하기 위해, 실시예 1과 동일한 방법으로 DFO를 하루동안 처리하고 MARCH5 siRNA를 형질주입한 세포에 실시예 2와 동일한 방법으로 항-미토콘드리아 Hsp70 항체로 면역염색하고 미토콘드리아를 관찰하였다.
그 결과, MARCH5가 녹다운된 세포에서 미토콘드리아의 연결성이 회복된 것을 확인할 수 있었다(도 4의 A). 또한, 미토콘드리아의 형태적 변화를 정량분석한 결과, 대조군에 비해 MARCH5가 녹다운된 세포에서 정상수준(Normal)으로 융합된 세포수가 증가하였고 분열된(Fragmented) 세포가 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 4의 B). 이를 통해, 저산소 조건에서 HDAC6 결핍은 MARCH5의 과발현을 야기하고, MARCH5가 미토콘드리아의 연결성에 관여하는 MFN2의 분해를 일으키는 것을 확인하였다.
실시예 4: HDAC6가 결핍된 ALS 질병 모델 마우스에서 MARCH5에 의한 MFN2의 분해 활성 확인
SOD1G93A 유전자가 주입된 ALS 마우스 모델에서 HDAC6의 유전적 결핍이 MFN2의 발현에 영향을 주는지 확인하기 위해, HDAC6 이형접합 암컷 마우스와 SOD1G93A 수컷 마우스를 교배하고, HDAC6WT, HDAC6KO, HDAC6WT/SOD1G93A 및 HDAC6KO/SOD1G93A 자손을 생산하였다. 자손이 태어난 지 16주에 이르러 ALS 전조 증상이 나타날 때, 척수 용해물에서 항-MARCH5항체, 항-MFN2 항체, 항-GAPDH 항체, 항-Tom20 항체, 항-HDAC6 항체 및 항-hSOD1 항체를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 진행하였다.
그 결과, HDAC6WT/SOD1G93A 와 HDAC6KO/SOD1G93A 척수에서 SOD1G93A 돌연변이 발현에 의해 MARCH5 단백질의 발현이 증가하였다(도 4의 C의 화살표). 또한, HDAC6WT/SOD1G93A 척수에서 MFN2의 단백질 발현은 변함이 없었던 반면에, HDAC6KO/SOD1G93A 척수에서 MFN2의 단백질 발현은 감소하였다. 이를 통해, ALS-유도 저산소 스트레스가 MARCH5의 단백질 발현을 향상시키고, MARCH5 특이적 분해로부터 HDAC6가 MFN2를 보호한다는 것을 보여준다(도 4의 C).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. MARCH5 유전자의 발현 억제제인 MARCH5 siRNA를 유효성분으로 포함하는 근위축성 측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. MFN2 단백질의 분해 억제제인 HDAC6 단백질을 유효성분으로 포함하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. MARCH5 유전자의 발현 억제제인 MARCH5 siRNA 및 MFN2 단백질의 분해 억제제인 HDAC6 단백질을 유효성분으로 포함하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 다음의 단계를 포함하는 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법:
    (a) MARCH5를 발현하는 세포에 MARCH5 유전자의 발현 억제 후보물질을 처리하여, MARCH5 유전자의 발현양을 측정하는 단계;
    (b) 상기 MARCH5 유전자의 발현 억제 후보물질 처리군의 MFN2 단백질의 발현을 측정하는 단계; 및
    (c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여, MARCH5 유전자의 발현은 억제되고, MFN2 단백질의 발현이 증가된 후보물질을 근위축성 측색경화증의 예방 또는 치료제로 선별하는 단계.
  7. 다음의 단계를 포함하는 근위축성 측색경화증의 조기진단 또는 진행단계의 예측을 위한 정보제공 방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료로부터 신경세포에서 발현된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 MARCH5 및 MFN2 유전자의 발현양 또는 단백질의 활성을 대조군 시료와 비교하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 (b)단계는 대조군에 비해 MARCH5 유전자의 발현양 또는 MARCH5 단백질의 활성이 증가하고 MFN2 유전자의 발현양 또는 MFN2 단백질의 활성이 감소하는 경우, 근위축성 측색경화증 또는 근위축성 측색경화증의 진행단계로 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2014006114A1 (en) * 2012-07-05 2014-01-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research New treatment for neurodegenerative diseases

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