KR101665565B1 - Screening Method for Therapeutic Agent Capable of Treating Cancer Having Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor Blocking Agent - Google Patents
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Abstract
본 발명은 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달 경로 활성화 차단제를 유효성분으로 포함하는 항암제, 상기 항암제를 스크리닝하는 방법, 상기 항암제 스크리닝용 조성물, 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 차단 치료제에 대한 반응성 여부 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 및 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 차단 치료제에 대한 반응성 여부 판단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 EGFR 차단 치료제에 대해 반응성을 보이지 않는 암에 대한 항암제 후보물질을 효과적으로 선별할 수 있으며, 본 발명의 상기 항암제 후보물질은 EGFR 차단 치료제에 의해서도 항암효과를 얻지 못하는 암환자군의 치료에 항암 보조제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, EGFR 차단 치료제를 사용할 것인지 여부와 EGFR 차단 치료제에 의한 치료 예후를 판단하는데 있어서 중요하고 필요한 정보를 제공할 수 있다. The present invention relates to an anticancer agent comprising a KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis signaling pathway activation block as an active ingredient, a method for screening the anticancer agent, a composition for screening the anticancer agent, a therapeutic agent for inhibiting EGFR A method for providing information necessary for determining the reactivity to an epithelial growth factor receptor (EGFR) receptor, and a kit for determining the reactivity against an epithelial growth factor receptor (EGFR) blocking agent. According to the present invention, it is possible to effectively screen candidates for anticancer drugs against cancer that do not show reactivity with the EGFR blocking agent, and the anticancer drug candidates of the present invention can be used for the treatment of cancer patients who do not have anti- It can be used as an adjuvant. In addition, according to the present invention, it is possible to provide important and necessary information for determining whether to use the EGFR blocking agent and the therapeutic prognosis of the EGFR blocking agent.
Description
본 발명은 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달 경로 활성화 차단제를 유효성분으로 포함하는 항암제, 상기 항암제를 스크리닝하는 방법, 상기 항암제 스크리닝용 조성물, EGFR 차단 치료제에 대한 반응성 여부 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 및 EGFR 차단 치료제에 대한 반응성 여부 판단용 키트에 관한 것이다.
The present invention relates to an anticancer agent comprising a KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis signaling pathway activation blocker as an active ingredient, a method for screening the anticancer agent, a composition for screening the anticancer agent, And a kit for determining the reactivity against an EGFR blocking agent.
상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 종양 관련 미세환경으로부터 측분비신호전달을 통해 분비되고 전이촉진에서 중요한 역할을 한다. EGF 수용체(EGFR, ErbB1)는 EGF-패밀리 일원에 대한 세포 표면 수용체이고, ErbB 패밀리는 ErbB 리간드에 결합한 후 활성화되는 4개의 상이한 티로신 키나아제(ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4)를 포함한다. ErbB 티로신 키나아제는 궁극적으로 종양 발달 증가를 가져올 수 있는 종양세포들과 이들의 미세환경 사이의 복잡한 상호작용을 매개하는데, 이에 따라 ErbB는 몇몇의 인간 암에서 치료적 중재를 위한 흥미로운 타겟이 되고 있다(1, 2). EGFR이 대장암(CRC, colorectal cancer) 조직내에서 과발현되고 있지만, 다른 임상현장에서 효과가 입증된 EGFR 키나아제 억제자들이 종종 CRC의 전이성 재발을 차단하는데 실패하고 있다(3, 4). 이렇게 반응을 보이지 않는 이유는 CRC의 불균질성 때문이다. 종전의 연구에서는 KRAS, BRAF, PIK3CA 및 PTEN 유전자들에서 종양적 변화가 없는 CRC들(소위 “quadruple negative” 종양들)이 항-EGFR 치료 반응성에서 가장 높은 치료 가능성을 갖는 것으로 나타났다(5, 6). 그러나, 항-EGFR 타겟 치료에 대해 반응을 보이지 않는 약 20%의 전이성 CRC 환자들은 KRAS, BRAF, 및 PIK3CA에서 변이를 가지고 있지 않거나 PTEN 발현 상실이 없다(7). 이러한 CRC 환자에게서 그렇게 낮은 반응성이 나타남에 따라 연구자들은 종양 성장을 지지할 수 있는 키나아제-독립적 EGFR 기능을 광범위하게 이해하려는 연구를 시작하였다. 그러한 하나의 연구에서, EGFR은 이의 키나아제 활성에 무관하게 세포내 글루코오스 기저 수준을 유지시킴으로써, EGFR 키나아제 억제제가 존재한다고 하여도 세포가 자가탐식으로 진행되는 것을 방지하고, 종양 세포 생존이 증가한다고 보고되었다(8). 따라서, EGFR을 포함하지 않는 EGF의 신규한 다운 스트림 신호들을 규명하는 것은 매우 중요한데, 이는 그러한 신호들이 CRC 세포로 하여금 항-EGFR 치료에 대한 친생존성 반응을 부여하기 때문이다. 그럼에도 불구하고 이러한 신호들은 아직까지 확인되지 않고 있다. 이전의 연구에서, 본 발명자들은 KITENIN(KAI1 C-terminal interacting tetraspanin)이 대장암세포(11, 12), 편평암세포(13-15), 위암세포(16) 및 간암세포(17)의 분산에 관여한다는 것을 확인하였다. KITENIN 단백질의 발현은 대응되는 정상 점막 조직이나 초기 암조직 보다, 인간 대장암 조직(11, 12), 후두암 조직(14), 구강편평상피암 조직(15), 위암 조직(16) 및 간암 조직(17)에서 현저히 높게 나타났다. KITENIN과 Dvl(Dishevelled)/PKCδ과의 상호작용은 ERK/AP-1 활성화를 통한 CRC 세포 침윤을 조절하는데 있어서 중요하고(11), KITENIN 발현이 림프절 전이 및 CRC의 낮은 생존율과 상당히 관련되어 있다(12). 그러나, 어떻게 증가된 KITENIN이 CRC 발달을 유도하고 종양과 관련된 미세환경으로부터 EGF 또는 HGF와 같은 외부 신호가 종양성 KITENIN의 다운스트림 신호경로를 조절하여 대장암 종양형성에 기여할 수 있는지에 대해서 알려져 있지 않았다.
Epidermal Growth Factor (EGF) is secreted from the tumor-associated microenvironment by secretory signaling and plays an important role in promoting metastasis. The EGF receptor (EGFR, ErbB1) is a cell surface receptor for the EGF-family member, and the ErbB family includes four different tyrosine kinases (ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4) that are activated after binding to the ErbB ligand. ErbB tyrosine kinase mediates complex interactions between tumor cells and their microenvironment, which can ultimately lead to increased tumor development, and ErbB has thus become an interesting target for therapeutic intervention in some
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 세포외 신호가 대장암(CRC, colorectal cancer) 세포의 침윤에서 향상된 KITENIN-유도된 증가에 영향을 미치고, 상피세포 성장인자(EGF)와 같은 KITENIN에 대한 세포외 신호들의 작용이 전이성 CRC 환자에서 항-EGFR 치료의 실패에 연관되어 있는지를 규명하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 KITENIN 및 ErbB4의 공동발현하에서 작동하는 신규한 EGFR-독립적 종양성 EGF 신호경로인 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축(axis)을 확인하였으며, 상기 독립적 신호경로의 EGF에 의한 활성화에 의해 대장암의 세포 침윤이 증가되고, 상기 경로의 활성화가 대장암에서 EGFR와는 관계없이 EGFR 차단 치료제에 대한 새로운 저항성 습득 기작으로 작용한다는 점을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다. We have found that the extracellular signal affects an enhanced KITENIN-induced increase in CRC (colorectal cancer) cell infiltration and that the action of extracellular signals on KITENIN, such as epithelial growth factor (EGF) The aim of this study was to investigate whether patients were associated with failure of anti-EGFR therapy. As a result, we have identified the novel EGFR-independent teratogenic EGF signaling pathway, KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis, which operates under the coexpression of KITENIN and ErbB4, , And that activation of the pathway serves as a new mechanism for acquiring resistance to EGFR blocking agents regardless of EGFR in colorectal cancer. Thus, the present invention has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달 경로 활성화 차단제를 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공하는 데 있다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide an anticancer agent comprising as an active ingredient a signaling pathway activating block agent of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis.
본 발명의 다른 목적은 상기 항암제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a method for screening the anticancer agent candidate substance.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항암제 후보물질 스크리닝용 조성물을 제공하는 데 있다. It is still another object of the present invention to provide a composition for screening the anticancer drug candidate.
본 발명의 또 다른 목적은 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 차단 치료제에 대한 반응성 여부 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다. It is yet another object of the present invention to provide a method for providing information necessary for judging whether or not a therapeutic agent for blocking epithelial cell growth factor receptor (EGFR) is reactive.
본 발명의 또 다른 목적은 EGFR 차단 치료제에 대한 반응성 여부 판단용 키트를 제공하는 데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a kit for determining the reactivity to an EGFR blocking agent.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
The objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 항암제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다: According to one aspect of the present invention, there is provided a method of screening an anticancer drug candidate comprising the steps of:
(a) KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축(axis)의 신호전달경로를 갖는 세포에 상피세포 성장인자(EGF, Epidermal Growth Factor)의 처리와 함께 후보물질을 처리하거나 후보물질을 처리하지 않는 단계; (a) treatment of candidate substances with the treatment of epidermal growth factor (EGF) with cells having a signaling pathway of KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis, step;
(b) 상기 처리한 세포에서 상기 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달경로의 활성화 정도를 측정하는 단계; 및 (b) measuring the degree of activation of the signal transduction pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis in the treated cells; And
(c) 상기 후보물질을 처리하지 않은 세포에 비해 상기 후보물질을 처리한 세포에서 상기 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달경로의 활성화가 더욱 억제되는 경우 상기 후보물질을 항암제 후보물질로 판단하는 단계. (c) When activation of the signaling pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis is further inhibited in the cells treated with the candidate substance compared to the cells not treated with the candidate substance, the candidate substance is selected as an anticancer drug candidate Judging step.
상피세포 성장인자(EFG, Epidermal growth factor)가 상피세포 성장인자 수용체(EGFR, Epidermal growth factor receptor)와 결합하여 암세포의 침윤을 증가시키고 이를 통해 암의 진행을 촉진시킨다. 이를 기반으로 EGFR - 키나아제 억제제나 EGFR에 대한 단클론성 항체를 대장암의 치료에 사용하고 있다. 그러나, 전이성 대장암의 치료에 EGFR 차단 치료제, 예를 들어 EGFR에 대한 단클론 항체로서, 세툭시맙(Cetuximab) 또는 어비툭스(Erbitux)와 같은 치료제를 투여하는 경우에도 20%에 이르는 환자군에서는 치료효과가 나타나지 않는 저항성(비반응성)이 보고되고 있다. Epidermal growth factor (EFG) binds to the epidermal growth factor receptor (EGFR) to increase the invasion of cancer cells, thereby promoting cancer progression. Based on this, monoclonal antibodies against EGFR - kinase inhibitor or EGFR are used for the treatment of colorectal cancer. However, even when a therapeutic agent such as Cetuximab or Erbitux is administered as an EGFR blocking agent, for example, as a monoclonal antibody against EGFR in the treatment of metastatic colorectal cancer, the treatment effect in 20% (Non-reactivity) is reported.
본 발명자들은 EGF가 EGFR에 의한 신호경로와는 독립적으로 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신규 신호전달 경로를 활성화시켜 이를 통해 대장암 세포의 침윤을 더욱 증가시킨다는 것을 최초로 규명하였다. 본 발명의 하기 구체적인 실시예의 실험 결과에 따르면, EGFR에 대한 단클론성 항체를 투여 받았던 제4기의 전이성 대장암 환자 군에서 초기 치료 반응이 좋은 환자에서는 초기 치료 반응이 좋지 않았던 환자와 비교하여 KITENIN 염색이 유의하게 낮았다. 이러한 결과는 EGF에 의한 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축 활성화가 대장암에서 EGFR와는 관계없이 독립적으로 EGFR 차단 치료요법에 대한 새로운 저항성 습득 기작으로 작용한다는 것을 시사한다. The inventors have for the first time established that EGF activates the novel signaling pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis independently of the signal pathway by EGFR, thereby further increasing the invasion of colon cancer cells. According to the experimental results of the following specific examples of the present invention, in patients with
본 발명의 일 실시예에서 입증된 사실에 기초하면, EGF에 의해 유도되는 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축 신호전달 경로 활성화를 차단하는 활성물질을 탐색하면 EGFR 차단 치료제에 대해 반응성을 보이지 않는 암에 대해 효과적인 새로운 항암제 후보물질을 선별할 수 있다. Based on the facts proven in one embodiment of the present invention, searching for an active substance that blocks EGF-induced KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis signaling pathway activation, New anticancer drug candidates effective against cancer can be selected.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암제 후보물질 스크리닝 방법에서 치료 대상 암은 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 차단 치료제에 대해 반응성을 보이지 않는 암이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the cancer to be treated in the anticancer drug candidate screening method is a cancer which shows no reactivity with the epithelial growth factor receptor (EGFR) blocking agent.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 치료제 선별 대상 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암이며, 보다 더 바람직하게는 대장암 또는 폐암이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the cancer to be screened is a breast cancer, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or ocular melanoma, uterine sarcoma, ovarian cancer, Cancer, prostate cancer, bronchial cancer, or bone marrow cancer, and more preferably, the cancer is cancer, colon cancer, fallopian tube cancer, endometrial cancer, cervical cancer, small bowel cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, pituitary cancer, kidney cancer, soft tissue tumor, Colon cancer or lung cancer.
본 발명에서 상기 항암제 후보물질은 상기 신호전달 경로를 구성하는 단백질의 발현을 억제하는 물질로서, 예컨대 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 RNAi (RNA interference) 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 또는 miRNA를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. In the present invention, the anticancer drug candidate is a substance that inhibits the expression of a protein that constitutes the signal transduction pathway. For example, RNAi (RNA interference) molecules, antisense oligonucleotides, siRNA, shRNA, Or miRNA. ≪ / RTI >
본 발명에서 상기 항암제 후보물질은 상기 신호전달 경로를 구성하는 단백질에 결합하여 이의 활성 또는 다른 단백질과의 상호작용을 억제하는 물질로서, 예를 들어 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, PNA(Peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 저분자 또는 고분자 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. In the present invention, the anticancer drug candidate is a substance that binds to a protein constituting the signal transduction pathway and inhibits its activity or its interaction with other proteins. For example, an oligopeptide, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, But are not limited to, a chimeric antibody, a humanized antibody, a peptide nucleic acid (PNA), an aptamer, a low molecular weight or a high molecular compound.
본 발명에서 후보물질로 사용될 수 있는 화합물은 합성 화합물 또는 천연물 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며, 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 또한, 화합물은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. Compounds that can be used as candidates in the present invention can be obtained from libraries of synthetic or natural product compounds and synthetic compound libraries are available from Maybridge Chemical Co. (UK), Comgenex (USA), Brandon Associates (USA), Microsource (USA) And Sigma-Aldrich (USA), and libraries of natural compounds are commercially available from Pan Laboratories (USA) and MycoSearch (USA). In addition, the compounds may be obtained by various combinatorial library methods known in the art.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 상기 단계 (c)에서 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달경로의 활성화의 억제는 (i) KITENIN과 ErbB4와의 결합의 억제, (ⅱ) KITENIN과 결합된 Dvl2 분해 촉진의 억제, (ⅲ) c-Jun 단백질량 증가의 억제, 또는 (ⅳ) AP-1 전사인자 활성화의 억제이다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the inhibition of activation of the signal transduction pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis in step (c) of the present invention is (i) inhibition of binding of KITENIN to ErbB4, Ii) inhibition of Dvl2 degradation in combination with KITENIN, (iii) inhibition of increased c-Jun protein content, or (iv) inhibition of AP-1 transcription factor activation.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상피세포성장인자(EGF); 및 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달경로를 갖는 세포를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다. According to another aspect of the invention, epithelial growth factor (EGF); And KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 항암제 스크리닝용 조성물에서 상기 대상 암은 EGFR 차단 치료제에 대해 반응성을 보이지 않는 암이다. According to a preferred embodiment of the present invention, in the composition for screening an anticancer agent, the subject cancer is a cancer which shows no reactivity to an EGFR blocking agent.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암제의 치료 대상 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암이며, 보다 더 바람직하게는 대장암 또는 폐암이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the cancer to be treated of the anticancer agent is selected from breast cancer, lung cancer, gastric cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or ocular melanoma, uterine sarcoma, Cancer of the endometrium, cancer of the cervix, cancer of the endometrium, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, renal cancer, soft tissue tumor, urethral cancer, prostate cancer, bronchus cancer or bone cancer, Is colon cancer or lung cancer.
본 발명의 다른 양태에 따르면, KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달 경로의 활성화 차단제를 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided an anticancer agent comprising, as an active ingredient, an activating blocking agent for the signal transduction pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis.
상기 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달 경로의 활성화 차단제는 상기 신호전달 경로의 구성 요소 단백질의 발현이나 활성을 억제하는 물질이 될 수 있다. The activator of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis signaling pathway may be a substance that inhibits the expression or activity of the component protein of the signal transduction pathway.
본 발명에서 상기 활성화 차단제는 상기 신호전달 경로를 구성하는 단백질의 발현을 억제하는 물질로서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 RNAi (RNA interference) 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, 또는 miRNA를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. In the present invention, the activation blocking agent is a substance that inhibits the expression of a protein constituting the signal transduction pathway. The RNAi (RNA interference) molecule, the antisense oligonucleotide, the siRNA, the shRNA, or the miRNA But is not limited thereto.
본 발명에서 상기 활성화 차단제는 상기 신호전달 경로를 구성하는 단백질에 결합하여 이의 활성 또는 다른 단백질과의 상호작용을 억제하는 물질로서, 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, PNA(Peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 저분자 또는 고분자 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. In the present invention, the activating blocking agent is a substance which binds to the protein constituting the signal transduction pathway and inhibits its activity or interaction with other proteins, and includes oligopeptides, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, But are not limited to, humanized antibodies, peptide nucleic acids (PNA), aptamers, low molecular weight or high molecular compounds.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달 경로의 활성화 차단제는 예를 들어 (i) KITENIN과 ErbB4와의 결합의 억제, (ⅱ) KITENIN과 결합된 Dvl2 분해 촉진의 억제, (ⅲ) c-Jun 단백질량 증가의 억제, 또는 (ⅳ) AP-1 전사인자 활성화의 억제의 활성을 갖는 물질을 포함한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the activating block of the signaling pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis includes (i) inhibition of binding of KITENIN to ErbB4, (ii) (Iii) inhibition of an increase in the amount of c-Jun protein, or (iv) inhibition of AP-1 transcription factor activation.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 활성화 차단제는 상기 KITENIN 또는 ErbB4 단백질에 특이적으로 결합하여 이들 두 단백질의 결합을 저해하는 물질이 될 수 있다. According to a more preferred embodiment of the present invention, the activation blocking agent may be a substance that specifically binds to the KITENIN or ErbB4 protein to inhibit binding of the two proteins.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암제의 치료 대상 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암이며, 보다 더 바람직하게는 대장암 또는 폐암이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the cancer to be treated of the anticancer agent is selected from breast cancer, lung cancer, gastric cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or ocular melanoma, uterine sarcoma, Cancer of the endometrium, cancer of the cervix, cancer of the endometrium, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, renal cancer, soft tissue tumor, urethral cancer, prostate cancer, bronchus cancer or bone cancer, Is colon cancer or lung cancer.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암제의 치료 대상 암은 EGFR 차단 치료제에 대해 반응성을 보이지 않는 암이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the cancer to be treated of the anticancer agent is a cancer showing no reactivity to the EGFR blocking agent.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 암의 조직 또는 세포에서 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달 경로의 활성화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 EGFR 차단 치료제에 대한 반응성 여부 판단 또는 EGFR 차단 치료제의 치료 예후 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for determining the reactivity of an EGFR blocking agent or an EGFR blocking agent comprising measuring the activation level of a signal transduction pathway of KITENIN / ErbB4-Dvl2-c- And provides a method for providing information necessary for judging the prognosis of treatment.
암 환자에서 EGFR 차단 치료제를 사용하기 전에 적출된 환자의 암 조직을 대상으로 K-Ras나 B-Raf와 같은 유전자의 돌연변이 여부를 조사하여, 이 유전자가 정상인 경우에만 EGFR 차단 치료제를 투여한다. 대부분의 환자에서 초기 치료효과가 관찰되는데 비해, 일부 환자에게서는 K-Ras나 B-Raf 유전자가 정상임에도 불구하고 초기 치료 효과가 나타나지 않는다. In cancer patients, EGFR blocking agents are administered only when the gene is normal, by examining the mutation of genes such as K-Ras and B-Raf in cancer tissues of patients who have been excised before using EGFR blocking agents. Although the initial treatment effect is observed in most patients, the initial treatment effect does not appear in some patients even though the K-Ras or B-Raf gene is normal.
따라서, 암으로 판명된 후 환자에게서 EGFR 차단 치료제를 사용할 것인지의 여부를 결정하는 추가적인 마커가 필요하다. Therefore, additional markers are needed to determine whether to use EGFR blocking agents in patients after they are identified as cancer.
본 발명에서 제시된 연구결과에 의하면 암세포에서 EGFR과는 독립적인 별개의 신호전달경로로서 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달 경로의 활성화가 EGFR 차단 치료제에 대한 비반응성과 높은 상관관계가 확인된다. 따라서, 전이성 암 환자에게서 EGFR 차단 치료제를 사용하기 전에 적출된 암 조직을 대상으로 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달 경로의 활성화 여부를 측정하면, EGFR 차단 치료제의 적용 여부 및 EGFR 차단 치료제의 치료 예후를 판단하는데 매우 중요하고 필요한 정보를 제공할 수 있다. According to the results of the present invention, activation of the signaling pathway of KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis as a distinct signal transduction pathway independent of EGFR in cancer cells is highly correlated with non-reactivity to EGFR blocking agents do. Therefore, the activation of the signaling pathway of KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis was examined in cancer tissues extracted before using EGFR blocking agent in metastatic cancer patients, And to provide information that is very important and necessary to determine the prognosis of the disease.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달경로의 활성화 정도의 측정은 KITENIN 단백질 양을 측정하는 단계를 포함한다. According to a preferred embodiment of the present invention, measuring the degree of activation of the signaling pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis comprises measuring the amount of KITENIN protein.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법에서 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or ocular melanoma, uterine sarcoma, ovarian cancer, Cancer, endometrial cancer, endometrial cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, pituitary cancer, kidney cancer, soft tissue tumor, urethral cancer, prostate cancer, bronchial cancer, or bone cancer.
본 발명의 다른 양태에 따르면, KITENIN 단백질 검출 시약을 포함하는 암의 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 차단 치료제에 대한 반응성 여부 판단용 키트를 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for determining the reactivity of a cancer containing a KITENIN protein detection reagent to an epithelial growth factor receptor (EGFR) blocking agent.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the cancer in the kit is selected from the group consisting of breast cancer, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or ocular melanoma, uterine sarcoma, Cancer, endometrial cancer, endometrial cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, pituitary cancer, kidney cancer, soft tissue tumor, urethral cancer, prostate cancer, bronchial cancer, or bone cancer.
본 발명의 특징 및 이점을 정리하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(i) 본 발명에 의하면 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달경로의 활성화를 차단하는 물질을 스크리닝함으로써 EGFR 차단 치료제에 대해 반응성을 보이지 않는 암에 대한 항암제 후보물질을 효과적으로 선별할 수 있다. (i) According to the present invention, screening for a substance blocking activation of the signal transduction pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis can effectively screen candidate anticancer agents against cancer that does not show reactivity with the EGFR blocking agent .
(ⅱ) 본 발명의 상기 항암제 후보물질은 EGFR 차단 치료제에 의해서도 항암효과를 얻지 못하는 암환자군의 치료에 항암 보조제로 사용될 수 있다. (Ii) The anticancer drug candidate of the present invention can be used as an anti-cancer adjuvant in the treatment of cancer patients who do not have anticancer effect by the EGFR blocking agent.
(ⅲ) 전이성 암 환자에서 EGFR 차단 치료제를 사용하기 전에 적출된 환자 암 조직을 대상으로 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달경로의 활성화 여부를 측정하면, EGFR 차단 치료제를 사용할 것인지 여부와 EGFR 차단 치료제에 의한 치료 예후를 판단하는데 있어서 중요하고 필요한 정보를 제공할 수 있다.
(Iii) In patients with metastatic cancer, activation of the signaling pathway of KITENIN / ErbB4 - Dvl2 - c - Jun axis was investigated in cancer tissues extracted before using EGFR blocking agent. Whether to use EGFR blocking agent And may provide important and necessary information in determining the prognosis of treatment with EGFR blocking agents.
도 1은 KITENIN-트랜스펙션된 세포에서 EGF가 AP-1을 상향조절하고 세포이동능을 향상시킨다는 것을 보여준다.
도 1의 패널 A는 KITENIN-트랜스펙션하에서 AP-1 활성에 미치는 성장인자의 효과를 보여준다. 293T 세포를 AP-1 리포터로 KITENIN과 함께 또는 KITENIN 없이 또는 KITENIN siRNA로 공동-트랜스펙션하고, EGF(100 ng/ml), HGF(40 ng/ml), 또는 10% FBS으로 12 시간 동안 처리하였다. 각 막대는 3개의 샘플에 대한 평균±SEM을 나타낸다. si-scr, 비-특이적으로 스크램블된 siRNA (음성 대조군). @, 각 그룹간 유의한 차이점(@P<0.05).
도 1의 패널 B는 EGF 처리 후에 Caco2 세포에서 침윤 분석을 행한 결과이다. KITENIN(Caco2/KITENIN)으로 안정적으로 트랜스펙션된 Caco2/벡터 또는 Caco2 세포들은 EGF (100 ng/ml)으로 12시간 동안 처리한 후 침윤 분석을 행하였다. 도면은 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. 히스토그램은 5개의 선택된 영역에서 계수한 침윤성 세포를 나타내고, 막대 그래프로 나타내었다(평균 ± SEM, n=3). 별표(* or @)는 상이한 그룹간의 유의한 차이를 나타낸다(***P<0.001, @@P<0.01, @@@P<0.001).
도 1의 패널 C는 EGF 처리 후의 Caco2 세포에서 세포성장 분석을 행한 결과이다. Caco2/벡터 또는 Caco2/KITENIN 세포를 앵커리지 독립적인 세포 성장 분석을 행하였다. EGF(100 ng/ml)를 12 시간 동안 처리하였다. 나타낸 그림은 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. 염색된 세포의 영역을 측정하고 막대 그래프로 표시하였다(mean ± SEM, n=3).
도 2A - 도 2D는 EGF가 EGFR 독립적인 방식으로 향상된 KITENIN 조건하에서 상승적 AP-1 활성화 및 향상된 CRC 세포 이동능을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 2A는 AP-1 시너지 및 EGF에 의한 증가된 세포 침윤에 미치는 EGFR-녹다운의 영향을 측정한 결과이다. EGF로 12시간 동안 처리된 Caco2/벡터 또는 Caco2/KITENIN 세포를 AP-1 리포터 분석(왼쪽 패널) 및 침윤 분석(오른쪽 패널)을 행하였다. NS, 그룹간의 유의한 차이 없음.
도 2B는 EGF에 의한 세포 침윤 증가에 미치는 EGFR의 화학적 차단의 영향을 보여준다. Caco2/벡터 또는 Caco2/KITENIN 세포를 EGF 및/또는 AG1478(1μM)으로 12 시간 동안 처리하였다.
도 2C 및 도 2D는 EGFR을 발현하지 않는 MEF 및 SW-620 세포에서 EGF의 작용을 보여준다. 도 2C는 EGFR-야생형(윗쪽 패널) 및 EGFR-녹아웃(아래쪽 패널) MEF 세포를 KITENIN으로 트랜스펙션하고, EGF으로 1시간 동안 처리한 결과이다. 도 2D는 SW-620/벡터 또는 KITENIN으로 안정적으로 트랜스펙션된 SW-620 세포(SW-620/KITENIN)를 EGF으로 12시간 동안 처리하고, 앵커리지-독립적인 세포 성장 분석을 행하였다. Caco2/벡터 또는 Caco2/KITENIN 세포를 EGF 및/또는 AG1478(1μM)를 12시간 동안 처리하였다.
도 3A - 도 3E는 KITENIN-결합된 phospho-Dvl2의 하향조절 및 c-Jun의 상향조절 뿐만 아니라 세포질 소포체에서 KITENIN이 Dvl2와의 상호작용의 증가를 유도한다는 것을 보여준다.
도 3A는 KITENIN-트랜스펙션된 세포에서 PMA가 c-Jun 및 Dvl2에 미치는 영향을 보여준다. KITENIN으로 트랜스펙션되거나 트랜스펙션되지 않은 293T 세포에서 4시간 동안 PMA(100 nM) 처리한 후에 면역반응성 Dvl2/c-Jun을 검사하고, 3회 실험결과를 밀도분석기로 측정하였다. Phospho-Dvl2은 Dvl2-특이 항체를 사용하여 인산화-의존적 이동능 시프트에 의해 검출하였다. 화살표와 화살촉은 각각 phospho-Dvl2 및 unphospho-Dvl2을 지시한다.
도 3B는 CRC 세포내에서 c-Jun 및 Dvl2(윗쪽 패널) 및 KITENIN-결합된 phospho-Dvl2(아래쪽 패널)에 미치는 EGF의 영향을 측정한 결과이다. 혈청 고갈된 HCT116 세포를 지정된 시점에서 EGF로 처리하였다. 총 세포 용해물(500μg)을 람다 포스파타아제(lambda phosphatase, λ Ppase)와 함께 또는 이것 없이 처리하고, 면역블롯(윗쪽 패널) 또는 면역침전(아래쪽 패널)으로 분석하였다. 화살표 및 화살촉은 각각 phospho-Dvl2 및 unphospho-Dvl2을 지시한다. 위쪽 밴드는 포스파타아제 처리후에 사라졌다.
도 3C는 증가된 KITENIN 조건하에서 Dvl2 또는 DN-c-Jun으로 트랜스펙션하는 것이 EGF-유도된 AP-1 시너지에 미치는 영향을 측정한 결과이다. 293T 세포를 AP-1 리포터 및 KITENIN와 함께 또는 KITENIN 없이 Dvl2 또는 DN-c-Jun으로 공동 트랜스펙션하였고, 12시간 동안 EGF 또는 PMA(20 nM)으로 처리하였다.
도 3D는 세포질 소포체내에서 Dvl2와 KITENIN의 공동 존재에 미치는 EGF의 영향을 측정한 결과이다. 293T 세포(윗쪽 패널)은 Dvl2-GFP 및 KITENIN-HA 컨스트럭트로 일시적으로 트랜스펙션하였고, HCT116 세포(아래쪽 패널)은 Dvl2-GFP으로 36시간 동안 일시적으로 트랜스펙션하였다. 세포는 30분간 EGF로 처리한 후에 형광 공초점 현미경으로 시각화하였다. 대표예는 다음과 같다: 통합된 패널에서 노란색은 Dvl2와 KITENIN과의 공동-존재를 지시한다.
도 3E는 c-Jun(왼쪽 패널) 및 EGF에 의한 AP-1 시너지(오른쪽 패널)에 미치는 Dvl2 인산화 조절의 영향을 보여준다. 293T 세포를 Dvl 인산화를 차단하기 위해서 카제인 키나아제 I 억제자인 D4476 (100μM)으로 4시간 동안 처리하였고, 이후에 Dvl2, c-Jun, 및 c-Fos 수준을 측정하였다(왼쪽 패널). 다음으로, 세포를 KITENIN과 함께 또는 KITENIN 없이 AP-1 리포터 및 카제인 키나아제 Iε으로 공동 트랜스펙션하고, 이어서 EGF 또는 PMA(20 nM)으로 12시간 동안 처리하였다(오른쪽 패널).
도 4는 ErbB4가 증가된 KITENIN 조건하에서 EGF에 의한 AP-1 시너지에 필요하다는 것을 보여준다.
도 4의 패널 A는 KITENIN에 의해 증가된 세포침윤에 미치는 RON-녹다운 또는 ErbB4-녹다운의 영향을 보여준다. Caco2/벡터 또는 Caco2/KITENIN 세포를 si-scr, si-RON, 또는 si-ErbB4으로 48시간 동안 트랜스펙션하고 침윤 분석을 행하였다.
도 4의 패널 B는 EGF가 KITENIN가 ErbB4와의 상호작용을 증가시키는 것을 보여준다. Caco2/KITENIN 세포를 EGF로 12시간 동안 처리하고, 항-ErbB4 항체로 면역침전을 행한 후에 면역반응성 KITENIN과 ErbB4를 검사하였다.
도 4의 패널 C는 ErbB4 EGFKITENIN - AP-1 신호전달에 필요하다는 것을 보여준다. 293T 세포를 ErbB4-siRNA 처리 또는 이러한 처리 없이 KITENIN 및 AP-1 리포터로 공동 트랜스펙션하고, 이어서 EGF로 12 시간 동안 처리하였다.
도 4의 패널 D는 ErbB4-녹다운에 의해 KITENIN과 Dvl2와의 상호작용이 감소하였다는 것(윗쪽 패널)과, 증가된 KITENIN 조건하에서 EGF 작용을 회복시켰다는 것(아래쪽 패널)을 보여준다. Caco2/KITENIN 세포를 Dvl2로 트랜스펙션하였고, ErbB4-siRNA으로 36시간 동안 처리하였다. 면역반응성 Dvl2 또는 KITENIN을 각각 항-KITENIN 또는 항-Dvl2 항체로 면역침전시킨 후 검사하였다(위쪽 패널). Caco2/KITENIN 세포를 ErbB1-siRNA 또는 ErbB4-siRNA으로 36시간 동안 처리하였다. 면역반응성 Dvl2 및 c-Jun를 EGF 처리 후에 검사하였다(아래쪽 패널).
도 5A - 도 5D는 EGF-KITENIN/ErbB4-c-Jun 축이 CRC 세포 침윤을 상향조절한다는 것을 보여준다.
도 5A는 EGFKITENIN/ErbB4-c-Jun 축이 CHO 세포에서 작동한다는 것을 보여준다. CHO-K1 세포를 ErbB4 JM-a/CYT-2(a2)와 함께 또는 ErbB4 JM-a/CYT-2(a2) 없이 KITENIN으로 48 시간 동안 공동트랜스펙션하고, 12시간 동안 EGF로 처리하였다.
도 5B는 KITENIN-녹다운과 함께 또는 KITENIN-녹다운 없이 EGF 처리 후에 ErbB4-트랜스펙션된 HCT116 세포에서 침윤 분석을 행한 결과이다. HCT116 세포를 ErbB4 이소폼(a2)으로 트랜스펙션시키거나 또는 si-KITENIN/ErbB4 이소폼(a2)으로 공동트랜스펙션시켰다. 모세포 또는 트랜스펙션된 HCT116 세포를 EGF로 12시간 동안 처리하고 침윤 분석을 수행하였다.
도 5C는 KITENIN/ErbB4 조건하에서 EGF에 의한 증가된 세포 침윤에 미치는 ErbB 키나아제-차단제가 미치는 영향을 보여준다. Caco2/ErbB4(a2) 또는 Caco2/KITENIN/ErbB4(a2) 세포를 EGF 및/또는 AG1478(1μM)으로 12 시간 동안 처리하고, 침윤분석을 수행하였다.
도 5D는 종양성 EGF의 신규한 다운스트림 신호전달을 도식적으로 보여준다: EGF에 의해 KITENIN/ErbB4-Dvl2-c-Jun 축을 자극하면 c-Jun이 상향조절되고 CRC 세포 침윤에 이르게 된다. 확인되지 않은 경로는 점선으로 표시하였다.
도 6은 세툭시맙 치료에 대해 좋지 않은 반응성을 보이는 전이성 CRC 환자로부터 얻은 종양 조직에서 KITENIN/ErbB4가 높은 수준으로 공동발현된다는 것을 보여준다. 도 6의 패널 A는 세툭시맙으로 치료하였고 야생형 KRAS를 갖는 전이성 CRC 환자로부터 얻은 대장조직의 연속적 박편에서 KITENIN과 ErbB4의 발현을 면역조직화학에 의해 조사한 결과(어두운 갈색)를 보여준다. 대표적 예는 다음과 같다: #1, #2, 및 #3는 세툭시맙 치료 후 2개월 시점에서 PR을 나타내는 단계 IV의 CRC 환자이다. #4 및 #5는 동일한 기간 동안 PD를 나타낸 환자이다. 눈금 막대: 50 μm.
도 6의 패널 B는KITENIN 발현 스코어와 세툭시맙 치료후 초기 단계에서 세툭시맙에 대한 좋지 않은 반응성 사이의 양성적 상관관계를 보여준다. KITENIN과 ErbB4의 면역조직화학적 수준을 평가하기 위해, 스코어를 산출하고 PR 및 PD 그룹간의 유의성을 테스트하였다. NS, 유의성을 갖지 않음.
도 7은 EGF가 EGFR- 및 EGFR-키나아제 독립적 방식으로 증가된 KITENIN하에서 상승적 AP-1 활성을 유도하는 것을 보여준다. 도 7의 패널 A는 EGF에 의해 AP-1에 미치는 EGFR-녹다운의 영향을 보여준다. 도 7의 패널 B는 EGF에 의해 AP-1에 미치는 EGFR의 화학적 차단제의 영향을 보여준다.
도 8은 EGF에 의해 증가된 세포 침윤에 미치는 항-EGFR 단클론 항체 처리를 통한 EGFR의 기능적 차단의 효과를 보여준다. 도 8의 패널 A에서 Caco2 세포는 EGF (100 ng/ml) 및 세툭시맙의 증가된 용량(1, 3, 10μg/ml)으로 12시간 동안 처리하였다. 도 8의 패널 B에서 Caco2/벡터 또는 Caco2/KITENIN 세포는 EGF 및/또는 세툭시맙(10 μg/ml)으로 12시간 동안 처리하고 침윤 분석을 행하였다.
도 9는 증가된 KITENIN 조건하에서 EGF-유도된 AP-1 시너지가 활성화된 JNK를 요구하지 않는다는 것을 보여준다. 도 9의 패널 A는 phospho-/총-JNK 및 phospho/총-c-Jun에 미치는 EGF의 영향을 보여준다. 도 9의 패널 B는 증가된 KITENIN 조건하에서 EGF 작용에 미치는 JNK 차단제의 효과를 보여준다.
도 10은 KITENIN 트랜스펙션된 세포에서 c-Jun에 미치는 Dvl2-녹다운의 효과 및 c-Jun/Dvl2 수준에 미치는 EGF의 효과를 보여준다. 도 10의 패널 A에서 293T 세포를 Dvl2 또는 Dvl2 siRNA의 양을 증가시키면서 48시간 동안 트랜스펙션시키고, AP-1 또는 TOPflash 리포터 활성 및 c-Jun 수준을 측정하였다. 도 10의 패널 B - C에서 면역반응성 Dvl2 및 c-Jun를 KITENIN으로 트랜스펙션시키거나 트랜스펙션시키지 않고 293T 세포(도 10의 패널 B) 및 Caco2 세포(도 10의 패널 C)에서 8시간 동안 EGF 처리후에 검사하고 밀도계로 측정하였다. 실험은 3회 반복하였다.
도 11은 Dvl2-녹다운이 c-Jun의 전사를 증가시키지 않고, Dvl2는 c-Jun과 상호작용하지 않는다는 것을 보여준다. 도 11의 패널 A는 Dvl2 녹다운이 c-Jun 프로모터 활성에 미치는 영향을 보여준다. 도 11의 패널 B는 Dvl2가 c-Jun과 직접적으로 상호작용하지 않는다는 것을 보여준다.
도 12는 KITENIN-과발현된 Caco2 또는 KITENIN-녹다운 HCT116 CRC 세포에서 다중 RTK들의 조절을 보여준다. 도 12의 패널 A는 ErbB4 및 RON가 KITENIN에 의해 양성적으로 조절된다는 것을 보여준다. 도 12의 패널 B는 phospho-ErbB4 및 phospho-RON들이 KITENIN에 의해 조절된다는 것을 보여준다. 도 12의 패널 C는 KITENIN이 ErbB4와 상호작용한다는 것을 보여준다.
도 13은 KITENIN 및 ErbB4의 공동 트랜스펙션이 EGF 처리 후에 AP-1 활성이 더욱 증가되도록 유도한다는 것을 보여준다.
도 14는 KITENIN 고발현이 세툭시맙의 항증식효과에 대한 CRC 세포의 생존율에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 도 14의 패널 A는 세툭시맙에 대한 다양한 CRC 세포의 민감도를 보여준다. 도 14의 패널 B는 KITENIN의 발현수준과 KRAS/BRAF 야생형인 Caco2 CRC 세포의 세툭시맙에 대한 생존율을 보여준다. 도 14의 패널 C는 KITENIN의 발현수준과 KRAS/BRAF 변이세포주인 DLD1 및 HCT116 CRC 세포의 세툭시맙에 대한 생존율을 보여준다. Figure 1 shows that in KITENIN-transfected cells, EGF upregulates AP-1 and enhances cell migration potential.
Panel A of Figure 1 shows the effect of growth factors on AP-1 activity under KITENIN-transfection. 293T cells were co-transfected with KITENIN as an AP-1 reporter or without KITENIN or with KITENIN siRNA and treated with EGF (100 ng / ml), HGF (40 ng / ml), or 10% FBS for 12 hours Respectively. Each bar represents the mean ± SEM for three samples. si-scr, non-specifically scrambled siRNA (negative control). @, Significant difference between groups (@ P <0.05).
Panel B of Fig. 1 shows the results of infiltration analysis in Caco2 cells after EGF treatment. Caco2 / vector or Caco2 cells stably transfected with KITENIN (Caco2 / KITENIN) were subjected to infiltration analysis after treatment with EGF (100 ng / ml) for 12 hours. The figure shows three independent experiments. The histogram represents infiltrating cells counted in five selected areas and is shown as a bar graph (mean ± SEM, n = 3). An asterisk (* or @) represents a significant difference between the different groups (*** P <0.001, @@ P <0.01, @@@ P <0.001).
Panel C in Fig. 1 shows the results of cell growth analysis in Caco2 cells after EGF treatment. Anchorage independent cell growth assays were performed on Caco2 / vector or Caco2 / KITENIN cells. EGF (100 ng / ml) was treated for 12 hours. The figure shows three independent experiments. The area of stained cells was measured and displayed as a bar graph (mean ± SEM, n = 3).
Figures 2A-2D show that EGF exhibits synergistic AP-1 activation and enhanced CRC cell migration capability under enhanced KITENIN conditions in an EGFR independent manner.
FIG. 2A shows the results of measuring the effect of EGFR-knockdown on AP-1 synergy and increased cell infiltration by EGF. Caco2 / vector or Caco2 / KITENIN cells treated with EGF for 12 hours were subjected to AP-1 reporter analysis (left panel) and infiltration analysis (right panel). NS, no significant difference between groups.
Figure 2B shows the effect of chemical blockade of EGFR on increased cellular infiltration by EGF. Caco2 / vector or Caco2 / KITENIN cells were treated with EGF and / or AG1478 (1 [mu] M) for 12 hours.
Figures 2C and 2D show the action of EGF in MEF and SW-620 cells that do not express EGFR. Figure 2C shows the results of transfection of EGFR-wild type (upper panel) and EGFR-knockout (lower panel) MEF cells with KITENIN and treatment with EGF for 1 hour. 2D, SW-620 cells (SW-620 / KITENIN) stably transfected with SW-620 / vector or KITENIN were treated with EGF for 12 hours and subjected to anchorage-independent cell growth analysis. Caco2 / vector or Caco2 / KITENIN cells were treated with EGF and / or AG1478 (1 [mu] M) for 12 hours.
Figures 3A-3E show that KITENIN induces an increase in the interaction with Dvl2 in the cytoplasmic ER as well as downregulation of KITENIN-coupled phospho-Dvl2 and upregulation of c-Jun.
Figure 3A shows the effect of PMA on c-Jun and Dvl2 in KITENIN-transfected cells. Immunoreactive Dvl2 / c-Jun was detected after treatment with PMA (100 nM) for 4 hours in 293T cells transfected or not transfected with KITENIN and the results of three experiments were measured with a density analyzer. Phospho-Dvl2 was detected by phosphorylation-dependent mobility shift using Dvl2-specific antibodies. Arrows and arrowheads indicate phospho-Dvl2 and unphospho-Dvl2, respectively.
Figure 3B shows the results of measuring the effect of EGF on c-Jun and Dvl2 (upper panel) and KITENIN-bound phospho-Dvl2 (lower panel) in CRC cells. Serum depleted HCT116 cells were treated with EGF at designated time points. Total cell lysates (500 μg) were treated with or without lambda phosphatase (lambda Ppase) and analyzed by immunoblot (upper panel) or immunoprecipitation (lower panel). Arrows and arrowheads indicate phospho-Dvl2 and unphospho-Dvl2, respectively. The upper band disappeared after the phosphatase treatment.
Figure 3C shows the effect of transfection with Dvl2 or DN-c-Jun on increased KITENIN conditions on EGF-induced AP-1 synergy. 293T cells were co-transfected with Dvl2 or DN-c-Jun with AP-1 reporter and KITENIN or without KITENIN and treated with EGF or PMA (20 nM) for 12 hours.
FIG. 3D is the result of measuring the effect of EGF on the coexistence of Dvl2 and KITENIN in cytoplasmic ER. 293T cells (upper panel) were transiently transfected with Dvl2-GFP and KITENIN-HA constructs, and HCT116 cells (lower panel) were transiently transfected with Dvl2-GFP for 36 hours. Cells were visualized with a fluorescent confocal microscope after treatment with EGF for 30 min. A representative example is as follows: In an integrated panel, yellow indicates co-existence of Dvl2 with KITENIN.
Figure 3E shows the effect of dvl2 phosphorylation regulation on c-Jun (left panel) and AP-1 synergy (right panel) by EGF. 293T cells were treated with casein kinase I inhibitor D4476 (100 [mu] M) for 4 hours to block Dvl phosphorylation, after which Dvl2, c-Jun, and c-Fos levels were measured (left panel). Next, cells were co-transfected with AP-I reporter and casein kinase I e with or without KITENIN and then treated with EGF or PMA (20 nM) for 12 h (right panel).
Figure 4 shows that ErbB4 is required for AP-1 synergy by EGF under increased KITENIN conditions.
Panel A of FIG. 4 shows the effect of RON-knockdown or ErbB4-knockdown on increased cell infiltration by KITENIN. Caco2 / vector or Caco2 / KITENIN cells were transfected with si-scr, si-RON, or si-ErbB4 for 48 hours and infiltration analysis was performed.
Panel B of FIG. 4 shows that EGF increases KITENIN's interaction with ErbB4. Caco2 / KITENIN cells were treated with EGF for 12 hours and immunoreactive with KITENIN and ErbB4 were immunoprecipitated with anti-ErbB4 antibody.
Panel C of Figure 4 shows that ErbB4 is required for EGFKITENIN-AP-1 signaling. 293T cells were co-transfected with ErbB4-siRNA treatment or KITENIN and AP-1 reporter without this treatment, and then treated with EGF for 12 hours.
Panel D of FIG. 4 shows that the interaction between KITENIN and Dvl2 was reduced by ErbB4-knockdown (upper panel) and restored EGF action under increased KITENIN conditions (lower panel). Caco2 / KITENIN cells were transfected with Dvl2 and treated with ErbB4-siRNA for 36 hours. Immunoreactive Dvl2 or KITENIN was tested after immunoprecipitation with an anti-KITENIN or anti-Dvl2 antibody, respectively (top panel). Caco2 / KITENIN cells were treated with ErbB1-siRNA or ErbB4-siRNA for 36 hours. Immunoreactive Dvl2 and c-Jun were examined after EGF treatment (bottom panel).
Figures 5A-5D show that the EGF-KITENIN / ErbB4-c-Jun axis upregulates CRC cell infiltration.
Figure 5A shows that the EGFKITENIN / ErbB4-c-Jun axis works in CHO cells. CHO-K1 cells were co-transfected with ErbB4 JM-a / CYT-2 (a2) or KITENIN without ErbB4 JM-a / CYT-2 (a2) for 48 hours and treated with EGF for 12 hours.
FIG. 5B shows the results of infiltration analysis in ErbB4-transfected HCT116 cells after EGF treatment with or without KITENIN-knockdown. HCT116 cells were transfected with ErbB4 isoform (a2) or co-transfected with si-KITENIN / ErbB4 isoform (a2). Cells or transfected HCT116 cells were treated with EGF for 12 hours and infiltration assays were performed.
Figure 5C shows the effect of ErbB kinase-blocking agents on increased cellular infiltration by EGF under KITENIN / ErbB4 conditions. Caco2 / ErbB4 (a2) or Caco2 / KITENIN / ErbB4 (a2) cells were treated with EGF and / or AG1478 (1 μM) for 12 hours and infiltration assays were performed.
Figure 5D schematically illustrates a novel downstream signaling pathway of apoptotic EGF: stimulating the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis by EGF upregulates c-Jun and leads to CRC cell infiltration. Unidentified routes are indicated by dashed lines.
Figure 6 shows that KITENIN / ErbB4 is coexpressed at high levels in tumor tissue from metastatic CRC patients with poor response to cetuximab treatment. Panel A of FIG. 6 shows the results of immunohistochemistry (dark brown) of the expression of KITENIN and ErbB4 in a continuous flap of colon tissue obtained from metastatic CRC patients with wild-type KRAS treated with cetuximab. Representative examples are: # 1, # 2, and # 3 are CRC patients with stage IV at 2 months post-treatment with
Panel B of FIG. 6 shows a positive correlation between the KITENIN expression score and poor response to cetuximab in the early stages after cetuximab treatment. To assess the immunohistochemical levels of KITENIN and ErbB4, the scores were calculated and the significance between PR and PD groups tested. NS, not significant.
Figure 7 shows that EGF induces synergistic AP-1 activity under increased KITENIN in an EGFR- and EGFR-kinase independent manner. Panel A of Figure 7 shows the effect of EGFR-knockdown on AP-1 by EGF. Panel B of Figure 7 shows the effect of chemical blockers of EGFR on AP-1 by EGF.
Figure 8 shows the effect of functional blockade of EGFR through anti-EGFR monoclonal antibody treatment on increased cell infiltration by EGF. In panel A of FIG. 8, Caco2 cells were treated with EGF (100 ng / ml) and an increased dose of cetuximab (1, 3, 10 μg / ml) for 12 hours. In panel B of FIG. 8, Caco2 / vector or Caco2 / KITENIN cells were treated with EGF and / or cetuximab (10 μg / ml) for 12 hours and infiltration analysis was performed.
Figure 9 shows that under increased KITENIN conditions, EGF-induced AP-1 synergy does not require activated JNK. Panel A of Figure 9 shows the effect of EGF on phospho- / total-JNK and phospho / total-c-Jun. Panel B of Figure 9 shows the effect of JNK blockers on EGF action under increased KITENIN conditions.
Figure 10 shows the effect of Dvl2-knockdown on c-Jun and the effect of EGF on c-Jun / Dvl2 levels in KITENIN transfected cells. In panel A of FIG. 10, 293T cells were transfected for 48 hours with increasing amounts of Dvl2 or Dvl2 siRNA, and AP-1 or TOPflash reporter activity and c-Jun levels were measured. (Panel B in Figure 10) and Caco2 cells (Panel C in Figure 10) without transfection or transfection of immunoreactive Dvl2 and c-Jun with KITENIN in Panel B-C of Figure 10 for 8 hours Were examined after EGF treatment and measured by density meter. The experiment was repeated 3 times.
Figure 11 shows that Dvl2-knockdown does not increase transcription of c-Jun and Dvl2 does not interact with c-Jun. Panel A of FIG. 11 shows the effect of Dvl2 knockdown on c-Jun promoter activity. Panel B in Figure 11 shows that Dvl2 does not interact directly with c-Jun.
Figure 12 shows the modulation of multiple RTKs in KITENIN-overexpressed Caco2 or KITENIN-knockdown HCT116 CRC cells. Panel A of Figure 12 shows that ErbB4 and RON are positively regulated by KITENIN. Panel B of FIG. 12 shows that phospho-ErbB4 and phospho-RON are regulated by KITENIN. Panel C of Figure 12 shows that KITENIN interacts with ErbB4.
Figure 13 shows that cotransfection of KITENIN and ErbB4 induces further increased AP-1 activity after EGF treatment.
Figure 14 shows that KITENIN high-affinity affects the survival rate of CRC cells on the antiproliferative effect of cetuximab. Panel A of Figure 14 shows the sensitivity of various CRC cells to cetuximab. Panel B of Figure 14 shows the expression level of KITENIN and the survival rate for Cetuximab of KRAS / BRAF wild type Caco2 CRC cells. Panel C of FIG. 14 shows the expression level of KITENIN and the survival rate of corteximab of the KRAS / BRAF mutant cell lines DLD1 and HCT116 CRC cells.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예 Example
1. 실험방법 및 재료 1. Experimental methods and materials
플라스미드 및 세포주 Plasmids and cell lines
HA- 또는 V5-태깅 KITENIN, GST-태깅 KITENIN 절단 변이체, HA-태깅 ErbB4 절단 변이체, EGFR, HA-태깅 Dvl2, DN-cjun 및 Nrdp1의 발현 컨스트럭트는 PCR-기반 방법으로 제작하였다. 모든 컨스트럭트들은 염기서열분석으로 확인하였다. ErbB4 cDNA는 K. Elenius (University of Turku, Finland)에 의해 제공받았다. 인간 CRC 세포주(Caco2, DLD-1, HCT116, HT29, SW-480 및 SW-620), CHO-K1 세포, 및 인간 배아 신장(293T) 세포는 American Type Culture Collection으로부터 구입하여 종래 기술된 방법에 따라 배양하였다(11). EGFR 양생형 및 녹아웃 MEF는 Z. Dong (University of Minnesota, USA)으로부터 제공받았다. 컨스트럭트 및 si-RNA는 각각 FuGENE6 및 RNAiMax를 사용하여 세포안으로 트랜스펙션하였다(11). EGF가 CRC 세포내에서 종양성 KITENIN의 다운스트림 신호전달경로를 조절하는지에 대해서 세포배양, 면역블로팅 및 면역침전, siRNA 간섭 및 RT-PCR 분석, 리포터 및 침윤 분석, 면역형광 및 면역조직화학 방법을 통해 분석하였다.
The expression constructs of HA- or V5-tagging KITENIN, GST-tagging KITENIN truncation mutants, HA-tagging ErbB4 truncation mutants, EGFR, HA-tagging Dvl2, DN-cjun and Nrdp1 were constructed by PCR-based methods. All constructs were identified by sequencing. ErbB4 cDNA was provided by K. Elenius (University of Turku, Finland). Human CRC cell lines (Caco2, DLD-1, HCT116, HT29, SW-480 and SW-620), CHO-K1 cells and human embryonic kidney (293T) cells were purchased from the American Type Culture Collection, And cultured (11). The EGFR curing type and knockout MEF were obtained from Z. Dong (University of Minnesota, USA). Construct and si-RNA were transfected into cells using FuGENE6 and RNAiMax, respectively (11). Immunoblotting and immunoprecipitation, siRNA interference and RT-PCR analysis, reporter and infiltration assays, immunofluorescence and immunohistochemistry methods for whether EGF regulates the downstream signaling pathway of tumor positive KITENIN in CRC cells Respectively.
성장인자 (Growth Factors) Growth Factors
인간 재조합 EGF (R&D systems) 및 HGF (Invitrogen)는 40 - 100 ng/ml의 농도로 사용하였다. 모든 실험에서, 세포를 밤샘 혈청고갈 조건에 두고 1% 혈청 배지에서 적합한 성장인자로 자극하였다.
Human recombinant EGF (R & D systems) and HGF (Invitrogen) were used at a concentration of 40 - 100 ng / ml. In all experiments, cells were placed on overnight serum deprivation conditions and stimulated with appropriate growth factors in 1% serum medium.
리포터 분석 (Reporter assay) Reporter assay
리포터 분석을 위해, 293T 세포를 트랜스펙션하기 전 5 x 104 세포/웰의 농도로 24h 시점에서 플레이팅하고, 이어서, 50 ng의 리포터(TOPFLASH, AP-1-luc, 및 c-Jun-luc 프로모터), 1 ng의 phRL-CMV, 및 이펙터 컨스트럭트(50 - 200 ng)를 FuGENE6을 사용하여 일시적 트랜스펙션을 행하였다. 공벡터 DNA를 첨가하여 DNA의 총량을 동등하게 하였다. 24시간 또는 48시간 배양 후, 루시퍼라아제 활성을 측정하고 트랜스펙션 효율성을 위해 Renilla 활성에 대해 정규화시켰다(11). 모든 데이터는 3회 반복 샘플에 대한 평균±SEM으로 표시하였다.
For reporter analysis, 293T cells were plated at a concentration of 5 x 10 4 cells / well at 24 h prior to transfection, followed by the addition of 50 ng of reporter (TOPFLASH, AP-1-luc, and c- luc promoter), 1 ng of phRL-CMV, and an effect construct (50-200 ng) were transiently transfected using FuGENE6. Blank vector DNA was added to make the total amount of DNA equal. After 24 hours or 48 hours of incubation, luciferase activity was measured and normalized for Renilla activity for transfection efficiency (11). All data were expressed as mean ± SEM for three replicate samples.
항체 및 면역침전 Antibodies and Immunoprecipitation
ErbB1, ErbB4, c-Met, RON, 및 Nrdp1에 대한 항체 (Santa Cruz Biotech); c-Jun, c-fos, p-JNK, total-JNK, p-ERK, p-ErbB4, Dvl2, 및 베타-카테닌에 대한 항체 (Cell Signaling Technol); 항-V5 및 항-myc 항체 (MBL); 항-HA 및 항-액틴 항체 (Sigma); 및 래빗 KITENIN (9) 또는 Vangl1 (Atlas)에 대한 항체를 적합한 2차 항체(Amersham biosciences)와 함께 사용하였다. 일시적 트랜스펙션 분석을 위해, 293T 세포를 다양한 플라스미드로 트랜스펙션하고 트랜스펙션 후 36시간 시점에서 면역블로팅 분석을 위해 회수하였다. 안정된 세포주를 사용한 대부분의 분석에서 클로날 변이를 배제하기 위해 혼합된 폴리클로날 세포를 사용하였다. 세포단백질을 분리하고, 이전시키고, 면역블로팅을 행하였다(9). 블롯은 로딩을 조절하기 위해 항-액틴 항체로 재탐침하였다. 293T, Caco2, 및 HCT116 세포로부터의 세포 용해물을 면역침전실험을 위해 사용하였다(11).
ErbB1, ErbB4, c-Met, RON, and Nrdp1 (Santa Cruz Biotech); antibodies to c-Jun, c-fos, p-JNK, total-JNK, p-ERK, p-ErbB4, Dvl2, and beta -catenin; Anti-V5 and anti-myc antibodies (MBL); Anti-HA and anti-actin antibodies (Sigma); And rabbit KITENIN (9) or Vangl1 (Atlas) were used with a suitable secondary antibody (Amersham biosciences). For transient transfection analysis, 293T cells were transfected with various plasmids and recovered for immunoblot analysis at 36 hours post transfection. In most assays using stable cell lines, mixed polyclonal cells were used to exclude clonal mutations. Cell proteins were isolated, transferred, and immunoblotted (9). The blot was re-probed with anti-actin antibody to control loading. Cell lysates from 293T, Caco2, and HCT116 cells were used for immunoprecipitation experiments (11).
세포 침윤 분석 (Cell invasion assay) Cell invasion assay
세포 침윤 분석은 트랜스웰 이동 기구(Transwell migration apparatus)를 사용하여 측정하였다(10). 간략히 설명하면, siRNA로 48시간 처리한 배양된 세포 또는 안정하게 과발현하는 세포를 24-웰 침윤 챔버 분석 플레이트(Costar) 상부에 로딩하였다. 화학유인물질로서 20 μg/ml의 피브로넥틴(Calbiochem)을 포함하는 조절된 DMEM 배지를 하부 챔버에 가하였다. 24시간 인큐베이션한 후 세포를 염색하였다. 필터의 상부 표면에 있는 세포들을 면볼로 닦아내고, 하부 표면상의 이동된 세포를 Cell infiltration analysis was performed using a Transwell migration apparatus (10). Briefly, cultured cells or stably overexpressing cells treated with siRNA for 48 hours were loaded on top of a 24-well infiltrated chamber assay plate (Costar). Modified DMEM medium containing 20 μg / ml of fibronectin (Calbiochem) as a chemoattractant was added to the lower chamber. After incubation for 24 hours, cells were stained. The cells on the upper surface of the filter are wiped off with cotton balls and the transferred cells on the lower surface
각 필터당 6개의 0.5 mm x 0.5 mm의 무작위 정사각형에서 그 세포수를 측정하였다. 실험결과는 최소 3회의 독립적인 실험에 대해 필드당 세포수의 평균±SEM으로 표시하였다.
The number of cells was measured in six 0.5 mm x 0.5 mm random squares per filter. Experimental results were expressed as mean ± SEM of cells per field for at least 3 independent experiments.
소프트 한천 콜로니 형성 분석 Analysis of soft agar colony formation
Caco2 (1 x 105) 및 SW-620 (1 x 105) 세포를 1.5 ml의 소프트 한천(DMEM 완전 배지내에서 0.35% 아가로스)에 현탁시키고, 6-웰 플레이트의 1.5 ml의 고체화한 한천(DMEM 완전 배지내에서 0.6% 아가로스)상으로 플레이팅하고, 각각 3주 및 2주간 배양하였다. 세포에 EGF를 포함하거나 EGF를 포함하지 않는 세포배양 배지를 1주당 2회 공급하였다. 콜로니 영역의 픽셀 강도는 각 플레이트에 대해 랜덤 현미경 뷰로부터 IMT iSolution software (IMT i-Solution Inc)를 사용하여 측정하였다. 콜로니의 % 영역을 측정하기 위해, 콜로니 영역의 픽셀 수를 주어진 픽셀*픽셀 직사각형에 의해 정규화하였다. 데이터는 3회 실험의 평균으로 표시하였다.
Caco2 (1 x 10 5 ) and SW-620 (1 x 10 5 ) cells were suspended in 1.5 ml of soft agar (0.35% agarose in DMEM complete medium) and 1.5 ml of solidified agar (0.6% agarose in DMEM complete medium), and cultured for 3 and 2 weeks, respectively. Cells were fed with cell culture medium containing EGF or no EGF twice per week. The pixel intensity of the colony region was measured using IMT iSolution software (IMT i-Solution Inc) from a random microscope view for each plate. To measure the% area of the colony, the number of pixels in the colony area was normalized by the given pixel * pixel rectangle. Data were expressed as the mean of three experiments.
세포 생존능 분석 Cell viability assay
CRC 세포의 성장 및 생존 측정하기 위한 방법은 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 분석의 비색 정량에 기초하여 행하였다. 간략히 설명하면, CRC 세포는 96-웰 플레이트(5 x 103 세포/웰)에 플레이팅하고 배양하였다. 세포를 상이한 농도의 세툭시맙(0, 10, 30, 100 μg/ml)으로 96시간 동안 처리하였다. 배양 후, 기존에 기술된 방법에 따라 분석을 수행하였다(9).
The method for measuring the growth and survival of CRC cells was performed based on the colorimetric determination of MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay. Briefly, CRC cells were plated in 96-well plates (5 x 10 3 cells / well) and cultured. Cells were treated with different concentrations of cetuximab (0, 10, 30, 100 μg / ml) for 96 h. After incubation, analysis was performed according to the previously described method (9).
면역형광 Immunofluorescence
세포를 피브로넥틴으로 코팅한 세포 배양 슬라이드(Becton Dickinson)상에 접종하였다. 293T 세포를 Dvl-GFP 및 HA-태그 KITENIN을 코딩하는 발현 벡터로 트랜스펙션시키고, HCT116 세포는 Dvl-GFP를 코딩하는 발현 벡터로 트랜스펙션 하였다. 24시간 후에, 세포를 혈청고갈 조건하에서 EGF(100 ng/ml)으로 30분간 처리하였다. 인큐베이션 후에, 단일층 세포를 세척하고, 고정하고, 투과화시키고, 적색형광 표지된 Alexa-fluor 568 2차 항체에 커플링된 단클론성 항-HA 항체로 염색하거나 DAPI로 청색 형광 핵 염색을 행하였다. 세포는 Laser Scanning Confocal Microscope(Leica)으로 검사하였다(11).
Cells were inoculated on a cell culture slide (Becton Dickinson) coated with fibronectin. 293T cells were transfected with an expression vector encoding Dvl-GFP and HA-tagged KITENIN and HCT116 cells transfected with an expression vector encoding Dvl-GFP. After 24 hours, the cells were treated with EGF (100 ng / ml) for 30 minutes under serum depletion conditions. After incubation, monolayer cells were washed, fixed, permeabilized, stained with monoclonal anti-HA antibody coupled to red fluorescently labeled Alexa-fluor 568 secondary antibody, or blue fluorescent nuclei stained with DAPI . Cells were examined with a Laser Scanning Confocal Microscope (Leica) (11).
RT-PCR 및 RNA 간섭 RT-PCR and RNA interference
RNA 준비 및 역전사는 이미 기술된 방법에 따라 수행하였다(11). GeneAmp PCR system(Eppendorf)상에서 동일한 반응으로부터 행한 다양한 cDNA의 정량적 비교를 가능하게 하기 위해 RT-PCR 대수기는 30사이클로 맞추었다. siRNA 간섭 실험을 위해, 인간 KITENIN, Dvl2, ErbB1, ErbB4, 및 RON에 대해 특이적인 siRNA를 디자인하였다. 비특이적 scrambled siRNA (si-scr)를 위해서, All Stars Negative Control siRNA(Qiagen)를 사용하였다. siRNA 이중가닥을 준비하고 LipofectamineTM RNAiMAX에 의해 제공된 프로토콜에 따라 트랜스펙션을 행하였다. 최대 녹다운을 위해 세포를 48-72시간 처리하고, RT-PCR을 행한 후에 웨스턴 블로팅 분석 또는 침윤 분석에 사용하였다. PCR 프라이머 및 siRNA 서열은 하기 표 1에 기재하였다. RNA preparation and reverse transcription were performed according to previously described methods (11). The RT-PCR logarithm was adjusted to 30 cycles to allow quantitative comparisons of various cDNAs from the same reaction on the GeneAmp PCR system (Eppendorf). For siRNA interference experiments, siRNAs specific for human KITENIN, Dvl2, ErbB1, ErbB4, and RON were designed. For nonspecific scrambled siRNA (si-scr), All Stars Negative Control siRNA (Qiagen) was used. Prepare the double-stranded siRNA transfection and was performed according to the protocol provided by Lipofectamine TM RNAiMAX. Cells were treated for 48-72 hours for maximal knockdown and used for Western blotting analysis or infiltration analysis after RT-PCR. PCR primers and siRNA sequences are listed in Table 1 below.
Reverse: 5’-AGCCTCATCACTGACAAGCC-3’(서열번호 2) Forward: 5'-CTACAATGTAGATGGCCCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
Reverse: 5'-AGCCTCATCACTGACAAGCC-3 '(SEQ ID NO: 2)
Reverse: 5’-TTGCTGAGAAAGTCACTGCT-3’(서열번호 4)Forward: 5'-TGGAAAACCTGCAGATCATC-3 '(SEQ ID NO: 3)
Reverse: 5'-TTGCTGAGAAAGTCACTGCT-3 '(SEQ ID NO: 4)
Reverse: 5’-GCACGTTTCTTTTTGATGCTCTTTCTTCTG-3’(서열번호 6) Forward: 5'-CAGTGTGAGAAAATGGAAGATGGACTCCTC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Reverse: 5'-GCACGTTTCTTTTTGATGCTCTTTCTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 6)
Reverse: 5’-GGACCGCTGGAAGCACTGTGATA-3’(서열번호 8)Forward: 5'-AAGAATGGCTAGAGACCCTCA-3 '(SEQ ID NO: 7)
Reverse: 5'-GGACCGCTGGAAGCACTGTGATA-3 '(SEQ ID NO: 8)
환자 및 면역조직화학 Patient and Immunohistochemistry
2011년 12월에서 2007년 1월까지 전남대학교 화순병원과 연세대학교 병원에서 제1라인 제제로서 세툭시맙 + 이리노테칸, 플루오로우라실 및 류코보린(FOLFIRI), 또는 세툭시맙 + 옥살리플라틴, 플루오로우라실, 및 류코보린(FOLFOX-4) 화학요법으로 치료한, 절제 불가능한 재발성 또는 전이성 대장암 환자 55명의 케이스를 검토하였다. 진단에 사용된 파라핀 왁스-봉매된 종양 조직은 모든 포함된 케이스에 대해 접근이 가능하였다. 환자들은 임상적으로 지시되었을 때 대장내시경, 흉부와 복부의 CT 스캔(computed tomographic scans) 및 양전자방출 단층촬영술의 뼈 스캔을 조합하여 암의 진행 단계를 구분하였다. 환자 인구통계자료, 화학치료요법 계획, 화학치료에 대한 반응성, PFS(progression-free survival), 및 OS(overall survival)에 관한 데이터는 의학기록을 통해 수득하였다. 조직 박편은 파라핀을 제거하고, 재수화하고, 세척하고, KITENIN 및 ErbB4으로 염색하고, 이미 공지된 내용(9)에 따라 검사를 수행하였다.
From December 2011 to January 2007, the first line formulations at Chonnam National University Hwasun Hospital and Yonsei University Hospital were treated with cetuximab plus irinotecan, fluorouracil and leucovorin (FOLFIRI), or cetuximab plus oxaliplatin, fluorouracil , And 55 cases of unresectable recurrent or metastatic colorectal cancer treated with leukopherin (FOLFOX-4) chemotherapy. The paraffin wax-sulphated tumor tissue used for diagnosis was accessible for all included cases. Patients were divided into colon cancer stages by combining colonoscopy, computed tomographic scans of chest and abdomen, and bone scan of positron emission tomography when clinically indicated. Data on patient demographics, chemotherapy regimens, chemotherapy response, progression-free survival (PFS), and overall survival (OS) were obtained through medical records. The tissue flakes were paraffin-free, rehydrated, washed, stained with KITENIN and ErbB4, and tested according to the already known content (9).
CRC 시료에서 KITENIN 및 ErbB4 염색의 평가 Evaluation of KITENIN and ErbB4 staining in CRC samples
면역조직화학적 KITENIN 및 ErbB4 발현을 반정량하기 위해서, 이미 기술된 방법에 따라 염색강도를 양성적으로 염색된 영역의 크기와 곱하여 스코어를 산출하였다(11). 어두운 갈색의 세포 염색 강도는 다음과 같이 등급을 나누었다: 0, 염색 없음; 1+, 약한 염색; 2+, 중간 염색; 3+, 뚜렷한 염색. 염색 영역은 다음 기준으로 평가하였다: 0, < 세포의 5% 양성 염색; 1+, 5% - 25% 양성 염색; 2+, 25% - 50% 양성 염색; 3+, > 50% 양성 염색. 조합된 스코어의 최대치는 9이고 최소치는 0이었다. 일반적으로, 스코어 >4의 시료는 후보단백질 발현에 대해 양성으로 간주하였으나, 이러한 기준은 본 연구에서는 사용되지 않았다.
To quantify the immunohistochemical KITENIN and ErbB4 expression, the intensity of the staining intensity was multiplied by the size of the positively stained region according to the previously described method to yield a score (11). Dark brown cell staining intensity was graded as follows: 0, no staining; 1+, weak staining; 2+, intermediate staining; 3+, distinct staining. The staining area was evaluated according to the following criteria: 0, 5% positive staining of cells; 1+, 5% - 25% positive staining; 2+, 25% - 50% positive staining; 3+, > 50% positive staining. The combined score had a maximum of 9 and a minimum of 0. In general, samples with a score> 4 were considered positive for candidate protein expression, but these criteria were not used in this study.
화학치료 (Chemotherapy) Chemotherapy
총 31명의 환자들은 세툭시맙-FOLFIRI 화학치료를 받았으며, 21명의 환자는 세툭시맙-FOLFOX-4 화학치료를 받았다. FOLFIRI 그룹에 있는 환자들은 1일동안 180 mg/m2의 용량으로 30- 내지 90-분간 이리노테칸 주입, 200 mg/m2의 용량으로 120분간의 류코보린 주입에 이어서 400 mg/m2의 용량으로 보루스 주입과, 1일 및 2일 동안에 2400 mg/m2의 용량으로 연속 주입하였다. FOLFOX-4 그룹의 환자들은 1일에 85 mg/m2 용량에서 옥살리플라틴(oxaliplatin)의 120분 주입, 200 mg/m2 용량에서 류코보린 120분간의 주입에 이어서, 400 mg/m2의 볼루스내에 플루오로우라실과 1일과 2일에 22시간 동안 600 mg/m2 주입을 행하였다. 세툭시맙은 1일에 400 mg/m2의 120분간의 초기 주입에 이어서 1주일에 한 번씩, 250 mg/m2,의 용량으로 세툭시맙의 60분간의 주입을 행하였다. FOLFIRI 또는 FOLFOX은 각 기간 동안 1일에 세툭시맙 주입을 행한 후 주어졌다. 각 치료 요법은 매 2주마다 반복하였다. 치료 스케줄은 질병 발달, 임상적 혜택의 부족, 받아들일 수 없는 독성 또는 환자의 거부 때 까지 반복하였다. 혈액학 및 비혈액학적 불리한 상황을 평가하였다. 불리한 상황의 관리와 화학치료제의 축소는 통상적인 방법으로 행하였다. A total of 31 patients received cetuximab-FOLFIRI chemotherapy and 21 patients received cetuximab-FOLFOX-4 chemotherapy. Patients in the FOLFIRI group received irinotecan injection for 30- to 90-minute doses at a dose of 180 mg / m 2 for 1 day followed by 120 minutes of leucovorin injection at a dose of 200 mg / m 2 and a dose of 400 mg / m 2 Borus infusion was continuously injected at a dose of 2400 mg / m < 2 > for 1 day and 2 days. FOLFOX-4 group of patients 120 minutes of oxaliplatin (oxaliplatin) in the 85 mg / m 2 dose in a day injection, 200 mg / m 2 to the injection of leucovorin 120 minutes in a capacity and then, 400 mg / m 2 of a bolus in uracil and were subjected to 1 and 600 mg / m 2 infusion for 22 hours in two days fluoro. Cetuximab was infused for 60 minutes with cetuximab at a dose of 250 mg / m 2 , once per week followed by a 120-minute initial infusion of 400 mg / m 2 per day. FOLFIRI or FOLFOX was given after cetuximab infusion on
반응 평가 (Response evaluation) Response evaluation
임상적 종양 반응성은 Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (ver. 1.0) (37)에 따라 8주 마다 CT에 의한 방사선학적으로 평가하였다. PFS는 화학치료의 시점으로부터 질병 발달 또는 어떤 원인에 의해서든 죽음에 이르기까지의 기간으로 정의하였다. 최종 기록까지 어떠한 상황도 발생하지 않았다면, 환자는 그 시점에 삭제되었다. OS는 화학치료의 시점으로부터 어떠한 이유에서든 죽음에 이르기 까지로 계산되었다.
Clinical tumor reactivity was assessed radiographically by CT every 8 weeks according to Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (ver. 1.0) (37). PFS is defined as the period from the time of chemotherapy to the development of the disease or from any cause to death. If no circumstances occurred until the final record, the patient was removed at that time. OS was calculated from the point of chemotherapy to death for any reason.
통계학적 분석 Statistical analysis
실험적 차이는 ANOVA 및 Tukey HSD post hoc test 또는 Student’s t test를 사용하여 ?v계적 유의성을 테스트하였다. 모든 통계학적 테스트 2-측면적으로 행하였고, 0.05 미만의 P-값을 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다. 통계학적 분석은 PASW Statistics 20 (SPSS, an IBM Company, Chicago, IL) software를 사용하여 행하였다.
Experimental differences were tested using ANOVA and Tukey HSD post hoc test or Student's t test. All statistical tests were performed on a two-sided basis and P-values less than 0.05 were considered statistically significant. Statistical analysis was performed using PASW Statistics 20 (SPSS, an IBM Company, Chicago, IL) software.
2. 실험결과 2. Experimental results
EGF는 KITENIN 트랜스펙션된 세포에서 EGFR 또는 활성화된 JNK가 없이 상승적인 AP-1 활성화 및 향상된 세포이동능을 유도하였다. EGF induced synergistic AP-1 activation and enhanced cell migration ability without EGFR or activated JNK in KITENIN transfected cells.
본 발명자들은 293T 세포에서 KITENIN을 트랜스펙션시키면 AP-1 활성이 3배 증가되며, 이는 Dvl/PKCδ의 상호작용에 의해 매개된다는 것을 발견하였다(11). 그러나, Dvl이 플라즈마 막으로 이동하는 것이 JNK/AP-1 활성화에 필요함에도 불구하고, 어떻게 Dvl이 AP-1 활성화를 위한 다운스트림 신호를 변환하는지는 확실히 이해하지 못하였다(18). KITENIN-트랜스펙션된 세포에서 세포외신호도 AP-1 활성화에 영향을 미치는지를 조사하기 위해서, 후보물질로서 EGF 및 HGF와 같은 CRC 발달을 양성적으로 조절하는 성장인자를 선택하였다. 293T 세포내에서, EGF, HGF, 및 FBS으로 처리하면 AP-1 활성도가 증가하였다(도 1의 패널A). 흥미롭게도 HGF 또는 FBS가 아닌 EGF를 KITENIN-트랜스펙션된 세포에 처리하였을 때 293T/모세포와 비교하여 AP-1 활성의 현저한 증가가 관찰되었는데, 이는 EGF가 KITENIN-과발현 세포를 특이적으로 민감하게 하여 AP-1 활성의 상승적 촉진을 나타낸다는 것을 시사한다. 그러나, EGF 단독에 의한 AP-1 활성 증가는 KITENIN-녹다운에 의해 약화되었다. Caco2 CRC 세포에서, KITENIN-트랜스펙션된 Caco2 세포에서 EGF 처리를 행한 후에 세포 침윤(도 1의 패널B) 및 앵커리지-독립성 세포 성장(도 1의 패널C)이 Caco2/모세포와 비교하여 현저하게 증가하였다. 따라서, KITENIN 트랜스펙션된 조건하에서 EGF 처리후에 관찰된 AP-1 활성 증가 및 CRC 세포 이동능 증가에 EGFR이 관련되어 있는지 의문이 들었다. EGFR-녹다운은 KITENIN-트랜스펙션된 293T 세포(도 7A) 또는 KITENIN 트랜스펙션된 Caco2 세포(도 2A, 왼쪽 패널)에서 EGF에 의한 AP-1 활성도 증가에 영향을 미치지 않았으며, EGF 처리에 의한 Caco2 세포 침윤 증가에도 영향을 미치지 않았다(도 2A, 오른쪽 패널). 흥미롭게도, EGF 처리후에 phospho-ERK 수준은 모세포와 KITENIN-트랜스펙션된 세포사이에서 거의 동일한 수준인 것으로 관찰되었다. EGF 처리에 의해 phospho-ERK의 증가가 EGFR-녹다운에 의해 영향을 받지 않았지만(도 7A 및 도 2A), 이는 최대 EGF 신호전달은 5%의 수용체 점유만으로도 달성될 수 있다는 보고(19)에 의해 설명될 수 있는데, phospho-ERK는 KITENIN-트랜스펙션하에서 EGF에 의한 AP-1 활성도 증가에 기여하지 않는 것으로 보인다. 또한, ErbB 키나아제 활성 억제자 AG1478(20) 처리를 통해 EGFR을 화학적으로 차단하거나, 항-EGFR 단클론항체 세툭시맙(cetuximab)(4) 처리를 통해 EGRF을 기능적으로 차단한 경우에도, KITENIN 트랜스펙션된 세포에서 EGF 처리에 의해 AP-1 활성(도 7B)이나 세포 침윤(도 2B 및 도 8의 A 및 도 8의 B)이 증가하는 것에 아무런 영향을 주지 않았다. 따라서, phospho-EGFR은 KITENIN-트랜스펙션된 조건하에서 EGR에 의한 AP-1 활성의 증가에 기여하지 않는 것으로 보였다. We have found that transfection of KITENIN in 293T cells results in a 3-fold increase in AP-1 activity, mediated by the interaction of Dvl / PKCδ (11). However, although Dvl is required for JNK / AP-1 activation to move into the plasma membrane, it is not clear how Dvl converts the downstream signal for AP-1 activation (18). In order to investigate whether extracellular signal also affects AP-1 activation in KITENIN-transfected cells, growth factors that positively regulated CRC development such as EGF and HGF as candidate substances were selected. Within 293T cells, treatment with EGF, HGF, and FBS increased AP-1 activity (panel A of FIG. 1). Interestingly, when treated with KITENIN-transfected cells without HGF or FBS, a significant increase in AP-1 activity was observed compared to 293T / parent cells, suggesting that EGF specifically sensitizes KITENIN-overexpressing cells Lt; RTI ID = 0.0 > AP-1 < / RTI > activity. However, the increase in AP-1 activity by EGF alone was attenuated by KITENIN-knockdown. (FIG. 1, panel B) and anchorage-independent cell growth (panel C in FIG. 1) after C-EAC treatment in KITENIN-transfected Caco2 cells in Caco2 CRC cells was significantly Respectively. Thus, it was questioned whether EGFR is associated with increased AP-1 activity and increased CRC cell migration observed after EGF treatment under KITENIN transfected conditions. EGFR-knockdown did not affect the increase in AP-1 activity by EGF in KITENIN-transfected 293T cells (FIG. 7A) or KITENIN transfected Caco2 cells (FIG. 2A, left panel) (Fig. 2A, right panel). ≪ RTI ID = 0.0 > Interestingly, the level of phospho-ERK after EGF treatment was observed to be approximately the same between the parental cells and the KITENIN-transfected cells. Although the increase in phospho-ERK by EGF treatment was not affected by EGFR-knockdown (Fig. 7A and Fig. 2A), it was explained by report 19 that maximal EGF signaling could be achieved with only 5% receptor occupancy Phospho-ERK does not appear to contribute to the increase in AP-1 activity by EGF under KITENIN-transfection. In addition, even when EGFR is chemically blocked through treatment with ErbB kinase activity inhibitor AG1478 (20) or functionally blocked with EGFP by treatment with anti-EGFR monoclonal antibody cetuximab (4), KITENIN trans- (FIG. 7B) or cell infiltration (FIG. 2B and FIG. 8A and FIG. 8B) by EGF treatment in the cultured cells. Thus, phospho-EGFR did not appear to contribute to the increase in AP-1 activity by EGR under KITENIN-transfected conditions.
EGF가 KITENIN-트랜스펙션하에서 EGFR-독립적인 방식으로 AP-1 활성화를 유도하는지를 규명하기 위해서, EGFR-녹아웃 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 및 EGFR-소실된 CRC 세포를 사용하였다. 그러나, AP-1 활성은 EGFR-녹아웃 MEF 세포 및 EGFR-소실된 SW-620 세포에서 거의 검출되지 않았는데, 이는 아마도 AP-1 리포터 발현에서 차이점 때문으로 생각된다; 그래서 EGF 처리 후에 AP-1 대신에 c-Jun을 검사하였다. 양성 대조군으로서, c-Jun은 EGFR-야생형에서 EGF 처리 후에 증가되었으나(124% 밀도측정계에 의한 측정, 도 2C, 위쪽 패널, 2번째 컬럼), EGFR-녹아웃 MEF 세포에서는 증가하지 않았다(100%, 도 2C, 아래쪽 패널, 2번째 컬럼). 또한, c-Jun이 EGF 처리후에 공벡터 트랜스펙션된 세포에서 보다 KITENIN 트랜스펙션된 EGFR-야생형 MEF 세포에서 크게 증가한 것이 관찰되었다(138% vs 124%, 도 2C, 위쪽 패널). 그러나, EGFR 녹아웃 MEF 세포에서, c-Jun은 EGF 처리후에 KITENIN-트랜스펙션된 세포에서만 증가하였다(138% vs 100%, 도 2C, 아래쪽 패널). EGFR-소실 CRC 세포주인 SW-620 세포를 사용하여 EGF 작용을 검사하였다. 다시, 공벡터 트랜스펙션된 세포에서 보다 KITENIN-트랜스펙션된 SW-620 세포에서 EGF 처리후에 c-Jun의 큰 증가가 관찰되었다(도 2D, 위쪽 패널). EGFR을 발현하는 Caco2 및 HCT116 세포와 비교하여, SW-620 세포는 피브로넥틴에 대한 매우 낮은 화학주성반응을 보였으나; KITENIN-트랜스펙션된 SW-620 세포에서 EGF 처리후에 앵커리지 독립성 세포 성장이 증가하였다(도 2D, 아래쪽 패널). EGF가 KITENIN 과발현 CRC 세포에서 EGFR-독립적인 방식으로 c-Jun/AP-1 활성 증가와 세포 이동능 증가를 유도하는 것으로 해석하였다. 다음으로, KITENIN 트랜스펙션하에서 EGF에 의한 AP-1 활성 증가가 JNK 활성으로부터 유도된 것인지를 조사하였다. CRC 세포중에서도 내인성 KITENIN 수준을 가장 높게 발현하는 HCT116 세포(11)에서, EGF 처리후에 phospho-c-Jun의 증가에도 불구하고 phospho-JNK는 실질적인 변화가 없었다(도 9의 패널 A). 또한, KITENIN 트랜스펙션된 293T 세포에서 SP600125의 전처리를 통한 JNK 차단은 EGF에 의한 c-Jun의 증가에 아무런 영향을 미치지 않았다(도 9의 패널 B). 따라서, EGF는 KITENIN 발현하에서 AP-1 활성/세포 이동능 증가를 유도하였는데, 이러한 유도에는 EGFR-키나아제 또는 활성화된 JNK가 요구되지 않는다.
EGFR-knockout mouse embryonic fibroblasts (MEF) and EGFR-deleted CRC cells were used to determine whether EGF induces AP-1 activation in an EGFR-independent manner under KITENIN-transfection. However, AP-1 activity was scarcely detected in EGFR-knockout MEF cells and EGFR-disrupted SW-620 cells, presumably due to differences in AP-1 reporter expression; Thus, c-Jun was tested instead of AP-1 after EGF treatment. As a positive control, c-Jun was increased after EGF treatment in the EGFR-wild type (124% density measurement, Figure 2C, top panel, second column), but not in EGFR- knockout MEF cells (100% 2C, bottom panel, second column). It was also observed that c-Jun was significantly increased in KITENIN-transfected EGFR-wild-type MEF cells (138% vs 124%, FIG. 2C, top panel) than in co-vector transfected cells after EGF treatment. However, in EGFR knockout MEF cells, c-Jun increased only in KITENIN-transfected cells after EGF treatment (138% vs 100%, Fig. 2C, bottom panel). EGFR-deficient CRC cell line SW-620 cells were used to examine EGF action. Again, a large increase in c-Jun was observed after EGF treatment in KITENIN-transfected SW-620 cells than in co-vector transfected cells (Fig. 2D, top panel). Compared with Caco2 and HCT116 cells expressing EGFR, SW-620 cells showed very low chemotactic response to fibronectin; Anchorage-independent cell growth was increased after EGF treatment in KITENIN-transfected SW-620 cells (Fig. 2D, bottom panel). EGF is thought to induce increased c-Jun / AP-1 activity and cell migration in EGFR-independent manner in KITENIN-overexpressing CRC cells. Next, we examined whether the increase of AP-1 activity by EGF was induced from JNK activity under KITENIN transfection. In HCT116 cells (11) expressing the highest level of endogenous KITENIN among CRC cells, there was no substantial change in phospho-JNK despite the increase of phospho-c-Jun after EGF treatment (panel A of FIG. 9). In addition, JNK blockade through pretreatment of SP600125 with KITENIN transfected 293T cells had no effect on the increase of c-Jun by EGF (panel B of FIG. 9). Thus, EGF induced an increase in AP-1 activity / cell migration under KITENIN expression, which does not require EGFR-kinase or activated JNK.
EGF는 KITENIN-결합된 phospho-Dvl2의 하향조절 및 연속되는 c-Jun의 상향조절을 통해 AP-1 상승을 유도한다. EGF induces AP-I elevation through downregulation of KITENIN-coupled phospho-Dvl2 and upregulation of consecutive c-Jun.
다음으로, KITENIN-트랜스펙션하에서 EGF에 의한 AP-1 활성화 (AP-1 시너지)의 기저 메카니즘을 조사하였다. EGF가 EGFR 키나아제- 및 EGFR-독립적 방식으로 AP-1 시너지를 유도하기 때문에, PI3K-mTOR 및 KRAS-RAF-MAPK 경로와 같은 EGFR 다운스트림 신호전달 경로(5, 6)는 가능한 후보에서 제외되었다. PMA가 기능적 KITENIN 복합체에 대해 업스트림 신호로서 작동하는지에 대한 추측(여기에서 KITNEIN은 Dvls/PKCδ과의 상호작용을 통해 ERK/AP-1 활성화를 유도함)(11)에 기반하여, PMA가 KITENIN 과발현 세포에서 AP-1 활성화에 대해 Dvl에 영향을 미치는지를 평가하였다. PMA는 c-Jun의 5배 증가를 유도하였으나, 동시에 KITENIN-트랜스펙션된 293T 세포에서 모세포와 비교하여 총 Dvl2를 70% 감소시켰는데(도 3A), 이는 낮아진 내인성 Dvl2에 의해 c-Jun/AP-1 활성 증가를 초래할 수 있다. Dvl2 수준이 c-Jun/AP-1 활성 증가에 기여할 가능성 조사를 위해, AP-1/TOPflash 리포터 활성 및 c-Jun 수준을 검사하여 293T 세포에서 Dvl2 수준을 조절하였다. Dvl2-녹다운은 AP-1 활성 및 c-Jun 단백질을 증가시킨 반면, 증가된 Dvl2은 TOPflash을 상향조절하였으나, AP-1 활성에서는 상향조절이 나타나지 않았다(도 10의 패널 A). 이어서, EGF도 PMA처럼 CRC 세포에서 c-Jun을 증가시킬 수 있는지를 평가하였다. Phospho-Dvl2-특이적 항체를 입수할 수 없었기 때문에 HCT116 세포를 선택하여 Dvl2의 변화를 포스파타아제 처리 하에서 분석하였다. EGF 처리 후 2시간 시점에서, 밀도측정기에 측정한 결과 c-Jun 수준은 처리 전 보다 3배 크게 증가한 반면, phospho-Dvl2 및 unphospho-Dvl2 수준은 절반으로 감소하였다(도 3B, 위쪽 패널). EGF는 KITENIN-트랜스펙션된 293T 세포에서도 모세포와 비교하여 c-Jun이 3배 증가하였고, 총 Dvl2가 70% 감소하였다(도 10의 패널 B). 또한, KITENIN 트랜스펙션된 Caco2 세포에서 EGF 처리 후에, c-Jun은 120% 증가하였고 총 Dvl2는 80% 감소하였다(도 10의 패널 C). 또한, KITENIN-트랜스펙션된 EGFR-소실 MEF 및 SW-620 세포에서 EGF 처리 후에서 처리 전과 비교하여, c-Jun 증가 및 Dvl2 수준의 감소가 관찰되었다(도 2C 및 도 2D). 감소된 Dvl2 및 증가된 c-Jun이 KITENIN-트랜스펙션하에서 EGF에 의하거나 또는 PMA에 의한 AP-1 시너지에 대한 원인인지를 확인하기 위해, Dvl2 또는 우성음성 c-Jun (DN-c-Jun)의 공동 트랜스펙션을 수행하였다. Next, the underlying mechanism of AP-1 activation (AP-1 synergy) by EGF under KITENIN-transfection was investigated. EGFR downstream signaling pathways (5, 6), such as PI3K-mTOR and KRAS-RAF-MAPK pathways, were excluded from possible candidates since EGF induces AP-I synergy in an EGFR kinase- and EGFR-independent manner. Based on the hypothesis that PMA acts as an upstream signal for the functional KITENIN complex (where KITNEIN induces ERK / AP-1 activation through interaction with Dvls / PKCδ) (11) To affect Dvl on AP-1 activation. PMA induced a 5-fold increase in c-Jun, but at the same time decreased total Dvl2 by 70% compared to maternal cells in KITENIN-transfected 293T cells (Figure 3A), suggesting that c-Jun / Lt; RTI ID = 0.0 > AP-1 < / RTI > To investigate the possibility that Dvl2 levels might contribute to increased c-Jun / AP-1 activity, Dvl2 levels were regulated in 293T cells by examining AP-1 / TOPflash reporter activity and c-Jun levels. Dvl2-knockdown increased AP-1 activity and c-Jun protein, while increased Dvl2 upregulated TOPflash, but did not upregulate AP-1 activity (panel A of FIG. 10). Next, we evaluated whether EGF could increase c-Jun in CRC cells as well as PMA. Since no phospho-Dvl2-specific antibody was available, HCT116 cells were selected and the changes in Dvl2 were analyzed under phosphatase treatment. Two hours after EGF treatment, the density of the phospho-Dvl2 and unphospho-Dvl2 levels was reduced to half (Figure 3B, top panel), while the level of c-Jun increased by three times as much as before treatment. EGF also showed a 3-fold increase in c-Jun and a 70% decrease in total Dvl2 in the KITENIN-transfected 293T cells (panel B in FIG. 10) as compared to the parent cells. In addition, after EGF treatment in KITENIN transfected Caco2 cells, c-Jun increased by 120% and total Dvl2 decreased by 80% (panel C of FIG. 10). In addition, a decrease in c-Jun and Dvl2 levels was observed after EGF treatment in KITENIN-transfected EGFR-deficient MEF and SW-620 cells compared to before treatment (Figs. 2C and 2D). To determine whether reduced Dvl2 and increased c-Jun were responsible for EGF or AP-1 synergy by PMA under KITENIN-transfection, Dvl2 or dominant negative c-Jun (DN-c-Jun ). ≪ / RTI >
트랜스펙션된 Dvl2 또는 DN-c-Jun은 EGF 또는 PMA에 의한 상향조절된 AP-1 활성을 역전시켰는데(도 3C), 이러한 결과는 Dvl2의 하향조절과 c-Jun의 상향조절이 KITENIN-과발현된 세포에서 EGF-유도된 AP-1 시너지에 관련되어 있음을 지시하는 것이다. 다음으로, EGF 처리후에 KITENIN과 Dvl2 사이의 상호작용의 특성을 조사하였다. Phospho-Dvl2만이 KITENIN과 상호작용하였다; 포스파타아제를 처리한 후에는 KITENIN과 Dvl2 사이의 상호작용은 없어졌다(도 3B, 아래쪽 패널). HCT116 세포에서 EGF 처리후 30분 시점에서, KITENIN 결합된 phospho-Dvl2의 수준은 초기에는 증가하였으나, 2시간 후에 감소하였다. 일관되게, 293T 및 HCT116 세포에서 EGF 처리후 30분 시점에서, KITENIN이 세포막으로부터 phospho-Dvl2가 존재하는 세포질 소포체로 이동하는 것이 관찰되었다(도 3D, KITENIN 패널들). 중요하게도 EGF를 처리하면 공동 존재하는 소포체(세포질 점)의 수가 증가하였는데, 이는 막과 연합된 KITENIN이 내재화되고 이후에 phospho-Dvl2와 상호작용을 한다는 것을 지시한다. 따라서, 총 Dvl2이라기 보다는 phospho-Dvl2의 감소가 c-Jun 증가에 원인인지에 대해서 확인하였다. Dvl의 인산화를 카제인 키나아제 I 억제자인 D4476의 처리에 의해 차단하였을때, phospho-c-Jun/총 c-Jun는 상향조절되었으나, c-Fos는 그렇지 않았다(도 3E, 왼쪽 패널). 이와 대조적으로, 카제인 키나아제 I의 공동 트랜스펙션은 KITENIN-트랜스펙션하에서의 EGF에 의한 또는 PMA에 의한 AP-1 시너지를 약화시켰을 뿐만 아니라, KITENIN 트랜스펙션하에서의 EGF 처리후에 또는 PMA 처리후에 관찰되는 증가된 c-Jun 및 감소된 총 Dvl2를 회복시켰다(도 3E, 오른쪽 패널). 우리는 결과를 다음과 같이 해석하였다: EGF는 최초에 KITENIN의 엔도사이토시스를 유도하고 이어서 세포질 소포체내에 KITENIN/phospho-Dvl2 복합체 형성을 활성화시킨다. 이후에 EGF는 KITENIN 결합된 phospho-Dvl2를 하향 조절하고, 이어서 c-Jun/AP-1 활성 증가에 기여한다. 흥미롭게도, Dvl2-녹다운은 c-Jun의 전사를 증가시키지 않았으며, Dvl2는 c-Jun과 직접적으로 상호작용하지 않았다(도 11의 패널 A 및 패널 B). JNK 차단도 KITENIN 트랜스펙션된 세포에서 EGF 작용에 영향을 미치지 않았다(도 9의 패널 B). 이러한 결과들은 EGF 처리후에 phospho-Dvl2의 하향조절이 c-Jun 단백질의 안정화를 통해 AP-1 시너지에 이르게 한다는 것을 시사한다. KITENIN-결합된 phospho-Dvl2의 감소가 어떻게 c-Jun을 안정화시키는지는 현재 알려져 있지 않지만, 이 메카니즘은 JNK에 의한 c-Jun의 N-말단 인산화 또는 MEK/RACO-1 경로와 같은 phospho-c-Jun의 알려진 조절자와는 구분된다(21, 22).
Transfected Dvl2 or DN-c-Jun reversed upregulated AP-1 activity by EGF or PMA (Fig. 3C), suggesting that downregulation of Dvl2 and upregulation of c- Induced < RTI ID = 0.0 > AP-I < / RTI > synergy in overexpressed cells. Next, the nature of the interaction between KITENIN and Dvl2 after EGF treatment was investigated. Only Phospho-Dvl2 interacted with KITENIN; After the phosphatase treatment, the interaction between KITENIN and Dvl2 disappeared (FIG. 3B, bottom panel). At 30 minutes after EGF treatment in HCT116 cells, the level of KITENIN-bound phospho-Dvl2 initially increased but decreased after 2 hours. Consistently, at 30 minutes after EGF treatment in 293T and HCT116 cells, it was observed that KITENIN migrated from the cell membrane to the cytoplasmic ER containing phospho-Dvl2 (FIG. 3D, KITENIN panels). Importantly, treatment of EGF resulted in an increase in the number of co-existing endoplasmic reticulum (cytoplasmic dots), indicating that KITENIN associated with the membrane is internalized and subsequently interacts with phospho-Dvl2. Therefore, it was confirmed that the decrease of phospho-Dvl2 was caused by c-Jun increase rather than total Dvl2. When phosphorylation of Dvl was blocked by treatment with casein kinase I inhibitor D4476, phospho-c-Jun / total c-Jun was upregulated, whereas c-Fos was not (Fig. 3E, left panel). In contrast, co-transfection of casein kinase I not only attenuated AP-1 synergy by EGF under KITENIN-transfection or by PMA, but also after EGF treatment under KITENIN transfection or after PMA treatment Restored increased c-Jun and reduced total Dvl2 (Figure 3E, right panel). We interpreted the results as follows: EGF first induces endocytosis of KITENIN and then activates KITENIN / phospho-Dvl2 complex formation in cytoplasmic ER. EGF then down-regulates the KITENIN-coupled phospho-Dvl2 and then contributes to increased c-Jun / AP-1 activity. Interestingly, Dvl2-knockdown did not increase transcription of c-Jun, and Dvl2 did not interact directly with c-Jun (panel A and panel B of Figure 11). JNK blockade also did not affect EGF action in KITENIN transfected cells (panel B of FIG. 9). These results suggest that down-regulation of phospho-Dvl2 after EGF treatment leads to AP-1 synergy through stabilization of c-Jun protein. It is not currently known how the reduction of the KITENIN-bound phospho-Dvl2 stabilizes c-Jun, but this mechanism has been shown to be involved in N-terminal phosphorylation of c-Jun by JNK or phospho-c- It is distinct from the known regulator of Jun (21, 22).
ErbB4는 EGF-유도된 AP-1 시너지에 필요하다. ErbB4 is required for EGF-induced AP-1 synergy.
EGFR이 EGF-유도된 AP-1 시너지에 필수적인 것이 아니며, KITENIN-결합된 phospho-Dvl2의 하향조절이 이러한 EGF 작용에 원인이라는 것을 확인하였기 때문에, KITENIN이 KITENIN-결합된 Dvl2의 프로세싱에서 보조할 수 있는 공동 조절자로서 다른 수용체 티로신 키나아제(RTKs)들을 불러 모을 수 있는지에 대해서 확인하고자 하였다. KITENIN의 발현수준이 RTK의 활성화에 영향을 미칠 수 있는지를 조사하기 위해서, 모세포와 KITENIN-과발현 CRC 세포 사이에서 및 모세포와 KITENIN-녹다운 CRC 세포 사이에서 다양한 RTKs의 인산화 수준을 비교하였다. KITENIN-과발현 Caco2 세포에서, ErbB4 및 RON을 포함하여 phospho-RTK들은 증가하였으나, phospho-Ephrin1은 감소하였다. 한편, KITENIN 녹다운 HCT116 세포에서 phospho-ErbB4, phospho-RON, 및 phospho-c-Ret는 감소하였다(도 12의 패널 A). Phospho-c-Met는 HCT116 세포에서 일정하게 검출되었다. 따라서, 연구된 phospho-RTK들 중에서, RON 및 ErbB4는 KITENIN에 의해서 영향을 받는 것으로 일관되게 확인되었다. 예상된 바와 같이, 이들의 총 형태가 아닌 phospho-ErbB4 및 phospho-RON 형태가 Caco2/KITENIN 세포에서 증가하였고, HCT116/si-KITENIN 세포에서는 감소하였다(도 12의 패널 B). 흥미롭게도, 모세포와 비교한, 기능획득을 나타내는 Caco2/KITENIN 세포의 침윤 증가는 ErbB4-녹다운에 의해 회복되었으나, RON-녹다운에 의해서는 회복되지 않았다(도 4의 패널 A). 이러한 결과들은 ErbB4가 KITENIN 신호전달에서 필수적인 공동인자이고 CRC 세포 침윤을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 이어서, ErbB4가 KITENIN 신호전달에서 도움을 줄 수 있는 결합 파트너로서 요구되는지를 규명하고자 하였다. KITENIN이 C-말단 세포질 도메인을 통해 ErbB4와 상호작용하고(도 12의 패널 C), KITENIN 및 ErbB4 사이의 상호작용은 EGF 처리에 의해 증가한다는 것을 발견하였다(도 4의 패널B). 중요하게, ErbB4-녹다운이 KITENIN-트랜스펙션된 세포에서 EGF-유도된 AP-1 시너지를 약화시켰는데(도 4의 패널C), 이 결과는 ErbB4가 EGF-유도된 AP-1 시너지에 필요하다는 것을 시사한다. 또한, EGF 처리는 KITENIN/ErbB4-공동-트랜스펙션된 세포에서, EGFR 단독, ErbB4 단독, 또는 KITENIN/EGFR으로 트랜스펙션된 세포와 비교하여, AP-1 활성의 현저한 증가를 유도하였다(도 13). 일관되게, ErbB4-녹다운은 KITENIN 및 Dvl2 사이의 상호작용을 감소시키고(도 4의 패널 D, 위쪽 패널), EGFR-녹다운에 의해서는 영향을 받지 않는 EGF-유도된 c-Jun의 증가와 Dvl2의 감소를 역전시켰다(도 4의 패널D, 아래쪽 패널). 따라서, 본 발명자들은 ErbB4가 EGF 처리후의 KITENIN-Dv12 상호작용을 증가시키고 KITENIN-결합된 Dvl2의 프로세싱을 도와주는데 있어서 필수적이며, 이에 의해, KITENIN-트랜스펙션 조건하에서 EGF 처리후에 c-Jun 증가의 원인이 된다는 것을 확인하였다. 또한, EGF는 KITENIN/ErbB4 복합체의 형성을 촉진하였다.
KITENIN can assist in the processing of KITENIN-coupled Dvl2, since EGFR is not essential for EGF-induced AP-I synergy and it has been confirmed that downregulation of KITENIN-linked phospho-Dvl2 is responsible for this EGF action (RTKs) as co-regulators of other receptor tyrosine kinases (RTKs). To investigate whether expression levels of KITENIN could affect the activation of RTKs, phosphorylation levels of various RTKs were compared between maternal cells and KITENIN-overexpressing CRC cells and between B cells and KITENIN-knockdown CRC cells. In KITENIN-overexpressed Caco2 cells, phospho-RTKs including ErbB4 and RON were increased, while phospho-Ephrin1 was decreased. On the other hand, phospho-ErbB4, phospho-RON, and phospho-c-Ret decreased in KITENIN knockdown HCT116 cells (panel A of FIG. 12). Phospho-c-Met was detected constantly in HCT116 cells. Thus, among the phospho-RTKs studied, RON and ErbB4 were consistently confirmed to be affected by KITENIN. As expected, the phospho-ErbB4 and phospho-RON forms, which are not in their total form, increased in Caco2 / KITENIN cells and decreased in HCT116 / si-KITENIN cells (panel B of FIG. 12). Interestingly, the increase in infiltration of Caco2 / KITENIN cells, indicating functional enhancement, as compared to the parent cells, was restored by ErbB4-knockdown but not by RON-knockdown (panel A of FIG. 4). These results indicate that ErbB4 is an essential cofactor in KITENIN signaling and increases CRC cell infiltration. We then investigated whether ErbB4 is required as a binding partner to aid in KITENIN signaling. KITENIN interacts with ErbB4 through the C-terminal cytoplasmic domain (panel C of FIG. 12), and that the interaction between KITENIN and ErbB4 is increased by EGF treatment (panel B of FIG. 4). Importantly, ErbB4-knockdown attenuated EGF-induced AP-1 synergy in KITENIN-transfected cells (Panel C in FIG. 4), suggesting that ErbB4 is required for EGF-induced AP-1 synergy . In addition, EGF treatment induced a significant increase in AP-1 activity in KITENIN / ErbB4-co-transfected cells compared to cells transfected with EGFR alone, ErbB4 alone, or KITENIN / EGFR 13). Consistently, ErbB4-knockdown reduced the interaction between KITENIN and Dvl2 (panel D, top panel of FIG. 4) and increased EGF-induced c-Jun, unaffected by EGFR- (Panel D, bottom panel of Figure 4). Thus, the present inventors have found that ErbB4 is essential for increasing the KITENIN-Dv12 interaction after EGF treatment and for facilitating the processing of KITENIN-coupled Dvl2, thereby resulting in the increase of c-Jun increase after EGF treatment under KITENIN- It is confirmed that it is the cause. In addition, EGF promoted the formation of the KITENIN / ErbB4 complex.
EGF-KITENIN/ErbB4-c-Jun 축은 CRC 세포 침윤을 상향 조절한다. The EGF-KITENIN / ErbB4-c-Jun axis upregulates CRC cell infiltration.
EGF-KITENIN/ErbB4-c-Jun 축이 EGFR-독립적/ErbB4-의존적 방식으로 작용하는지를 ErbB-소실 세포주인 CHO (Chinese hamster ovary)세포를 사용하여 조사하였다. 모세포나 KITENIN 단독 트랜스펙션된 세포에서 보다 KITENIN/ErbB4-공동 트랜스펙션된 CHO 세포에서, EGF 처리후에 더욱 증가된 c-Jun과 Dvl2 감소를 관찰하였다(도 5A). 이에 의해 EGF의 KITENIN/ErbB4-매개된 다운스트림 신호가 EGFR-독립적 방식으로 c-Jun을 증가시킨다는 것을 더욱 확인하였다. 또한, KITENIN-트랜스펙션된 EGFR-녹아웃 세포(도 2C) 및 EGFR-소실된 SW-620 세포(도 2D) 모두에서 EGF 처리후에 c-Jun이 증가한다는 것과, KITENIN/EGFR-공동트랜스펙션된 세포 및 EGFR-단독-트랜스펙션된 세포 사이에서 EGF 처리후에 AP-1 활성이 거의 동등하다는 것(도 13)이 관찰되었는데, 이는 EGF-KITENIN/ErbB4-c-Jun의 축이 비대칭적 EGFR-ErbB4 헤테로다이머 형성에 의해 조절되지 않는다는 것을 지시한다. Whether the EGF-KITENIN / ErbB4-c-Jun axis acts in an EGFR-independent / ErbB4-dependent manner was investigated using CHO (Chinese hamster ovary) cells, an ErbB-deleted cell line. In the KITENIN / ErbB4-cotransfected CHO cells than in the parental or KITENIN single transfected cells, we observed further increased c-Jun and Dvl2 reduction after EGF treatment (Fig. 5A). This further confirmed that the KITENIN / ErbB4-mediated downstream signal of EGF increases c-Jun in an EGFR-independent manner. In addition, it was shown that c-Jun increases after EGF treatment in both KITENIN-transfected EGFR-knockout cells (Fig. 2C) and EGFR-disappeared SW-620 cells (Fig. 2D), KITENIN / EGFR- (Figure 13) was observed between EGFR-only cells and EGFR-only-transfected cells after EGF treatment, indicating that the axis of EGF-KITENIN / ErbB4-c-Jun was asymmetric EGFR -ErbB4 heterodimer formation. ≪ / RTI >
다음으로, ErbB4/KITENIN 공동 발현이 EGF-KITENIN/ErbB4-c-Jun 축을 강화시키는 결과로써 CRC 세포 침윤을 더욱 향상시킬 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해, 가장 높은 내인성 KITENIN 수준을 가지며 KRAS 변이를 갖는 HCT116 세포를 선택하였다. 세포 침윤은 EGF를 처리한 경우 HCT116/모세포 보다 ErbB4-트랜스펙션된 HCT116 세포에서 더욱 크게 증가되었다(도 5B). 그러나, 이러한 증가 패턴은 HCT116 세포가 여전히 증가된 ErbB4를 발현시키고 있음에도 불구하고 KITENIN-녹다운후에는 사라졌다. 따라서, KITENIN은 EGF-KITENIN/ErbB4-c-Jun 축을 통한 CRC 세포 침윤성을 조절하는데 있어서, ErbB4 보다 더 중요한 성분일 것이다. 또한, KITENIN/ErbB4-공동-트랜스펙션된 Caco2 세포에서 AG1478로 처리한 경우 KITENIN-트랜스펙션된 Caco2 세포에서와 같이(도 2B), 세포 침윤 증가에 미치는 EGF의 작용을 감소시키지 않았다(도 5C). 이러한 결과는 공동발현된 KITENIN/ErbB4 하에서 EGF에 의한 세포 침윤성의 상향조절은 ErbB 키나아제 활성 조절을 요구하지 않는다는 것을 확인시킨다.
Next, we investigated whether the ErbB4 / KITENIN co-expression could further enhance CRC cell infiltration as a result of enhancing the EGF-KITENIN / ErbB4-c-Jun axis. For this, HCT116 cells with the highest endogenous KITENIN levels and KRAS mutations were selected. Cellular infiltration was significantly greater in ErbB4-transfected HCT116 cells than in HCT116 / B cells when treated with EGF (Fig. 5B). However, this increased pattern disappeared after KITENIN-knockdown, although HCT116 cells still expressed increased ErbB4 expression. Thus, KITENIN may be a more important component than ErbB4 in controlling CRC cell invasion through the EGF-KITENIN / ErbB4-c-Jun axis. In addition, treatment with AG1478 in KITENIN / ErbB4-co-transfected Caco2 cells did not reduce the effect of EGF on cellular infiltration as in KITENIN-transfected Caco2 cells (Fig. 2B) 5C). These results confirm that upregulation of cellular invasiveness by EGF under cotransfected KITENIN / ErbB4 does not require the control of ErbB kinase activity.
세툭시맙/화학요법에 대한 반응성이 좋지 않은 전이성 CRC 환자로부터 얻은 종양 조직에서 KITENIN/ErbB4이 고수준으로 공동발현된다. KITENIN / ErbB4 is co-expressed in tumor tissue from metastatic CRC patients with poor response to cetuximab / chemotherapy.
2004년 이후로 전이성 CRC 환자를 치료하기 위해 임상에서는 효과적인 치료제로서 항-EGFR 단클론항체만을 사용하여 왔으나, KRAS 야생형 상태에 있는 환자에 대해서도 반응비율이 20% 미만으로 나타났다(5-7). 따라서, 세툭시맙-저항성 전이 CRC 환자에게서 본 연구에서 밝힌 KITENIN/ErbB4 복합체의 기능적 중요성을 규명하고자 하였다. 이를 위해, 전이성 CRC 환자로부터 얻은 절제된 종양 조직내에서 KITENIN 및 ErbB4의 발현수준을 검사하였다. 이들 환자들은 야생형 KRAS를 나타내었고, 주로 세툭시맙/화학요법으로 치료하였다(표 2). KITENIN/ErbB4의 면역조직화학적 공동발현은 부분적 반응(PR)을 나타내는 환자와 비교하여 세툭시맙으로 치료 후 병의 발달(PD)의 초기 단계(2 개월)를 나타내는 전이성 CRC 환자의 종양 조직에서 더욱 크게 나타났다. 그러나, PR로 나타낸 CRC 환자에게서 ErbB4의 발현수준은 KITENIN의 것과 일치하지 않았다(도 6의 패널 A). 대장 조직에서 KITENIN 및 ErbB4의 면역조직화학적 발현을 정량적으로 평가하기 위해서, 양성적으로 염색되는 부위의 염색 강도와 크기를 사용하여 스코어를 산출하였다. KITENIN 발현 스코어는 PR을 나타낸 환자 보다 PD를 나타낸 환자로부터의 종양 조직에서 유의적으로 높게 나타났다(도 6의 패널 B; 8.05 ± 0.30, n = 22 vs. 4.42 ± 0.33, n = 33; P = 5.9 x 10-10). ErbB4는 ErbB4 스코어에서 유의적 차이가 없이 양쪽 그룹의 종양 조직에서 모두 높게 발현되었다(도 6의 패널 B; 6.05 ± 0.51, n = 22 vs. 6.18 ± 0.41, n = 33; P =0.84). 좋은 초기 반응성을 보인 환자들은 나쁜 반응성을 갖는 환자들 보다 유의적으로 긴 PFS (progression free survival)을 가졌다(표 2, p=0.014). 따라서, 본 발명의 데이터는 KITENIN 고발현 환자에서 세툭시맙에 대한 초기의 화학저항성은 증가된 KITENIN 조건하에서 스위치 온 되는 독특한 EGF 신호의 존재로부터 기인한 것일 수 있다는 점을 시사한다. 본 연구에서 기술된 신규 EGF 신호가 KITENIN 고발현 CRC 세포에게 EGFR-표적화된 치료에 대해 반응하여 증가된 생존율을 부여할 수도 있다. 이러한 가능성을 테스트하기 위해, 최초로 세툭시맙의 용량 증가에 대한 다양한 CRC 세포의 민감성을 검사하였다. 본 발명자들은 내인성 KITENIN을 고수준으로 발현하는 HCT116 및 Caco2 세포는 KITENIN을 보다 낮은 수준으로 발현하는 DLD1 및 SW620 세포 보다 세툭시맙에 대한 저항성이 더욱 높다는 것을 발견하였다(도 14의 패널 A). KITENIN의 고발현 수준이 세툭시맙에 반응하는 CRC 세포의 생존에 영향을 미치는지를 검사하기 위해서, 먼저 KRAS/BRAF 야생형 세포주(23)인 Caco2 CRC 세포를 선택하였는데, 이 세포주가 EGFR 표적화 치료가 사용되는 임상현장에 대한 가장 적합한 모델이 되기 때문이다(5, 6). 공벡터- 및 KITENIN-트랜스펙션된 Caco2 세포 사이에서 세툭시맙에 대한 생존율에서 아무런 차이점이 없었지만, KITENIN-고발현 Caco2 세포는 세툭시맙에 대한 저항성이 있는 반면, KITENIN 녹다운 Caco2 세포는 민감도가 증가하였다(도 14의 패널 B). DLD1 및 HCT116 세포와 같은 변이형 KRAS/BRAF을 갖는 CRC 세포들에서 세툭시맙에 대한 증식율을 비교하였다. KITENIN 고발현 DLD1 세포주는 세툭시맙에 대해 저항성을 나타내는 반면, KITENIN-녹다운 HCT116 세포는 세툭시맙에 대한 민감성을 나타내었다(도 14의 패널 C). 따라서, 이러한 결과들은 KITENIN/ErbB4-c-Jun 축이 KRAS/BRAF 야생형을 갖고 KITENIN이 고발현되는 Caco2 세포내에서 세툭시맙에 대한 저항성을 부여한다는 점을 지시한다. 또한, 이러한 결과들은 이러한 축이 변이형 KRAS/BRAF를 갖는 CRC 세포에서 세툭시맙에 대한 저항성의 초기 획득에 기여할 수 있다는 점을 제시한다. Since 2004, only clinical anti-EGFR mAb has been used clinically to treat patients with metastatic CRC, but the response rate was less than 20% for KRAS wild-type patients (5-7). Therefore, we investigated the functional significance of the KITENIN / ErbB4 complex in this study in patients with cetuximab-resistant metastatic CRC. To this end, expression levels of KITENIN and ErbB4 were examined in resected tumor tissues from metastatic CRC patients. These patients exhibited wild-type KRAS and were treated primarily with cetuximab / chemotherapy (Table 2). Immunohistochemical coexpression of KITENIN / ErbB4 is more frequent in tumor tissues of metastatic CRC patients showing early stage (2 months) of disease development (PD) after treatment with cetuximab compared to patients with partial response (PR) Respectively. However, the expression level of ErbB4 in CRC patients with PR did not match that of KITENIN (panel A of FIG. 6). To quantitatively assess the immunohistochemical expression of KITENIN and ErbB4 in colon tissues, the scores were calculated using the intensity and size of the positively stained sites. KITENIN expression scores were significantly higher in tumor tissues from patients with PD than in patients with PR (8.05 +/- 0.30, n = 22 vs. 4.42 +/- 0.33, n = 33; P = 5.9) x 10 -10 ). ErbB4 was highly expressed in both groups of tumor tissues without significant difference in ErbB4 score (Panel B, Figure 6, 6.05 0.51, n = 22 vs. 6.18 0.41, n = 33; P = 0.84). Patients with good initial reactivity had a significantly longer progression free survival (PFS) than patients with poor response (Table 2, p = 0.014). Thus, the data of the present invention suggests that the initial chemical resistance to cetuximab in patients with high-KITENIN expression may be due to the presence of a unique EGF signal that is switched on under increased KITENIN conditions. The novel EGF signal described in this study may also provide enhanced survival rates in response to EGFR-targeted therapy to KITENIN high-expression CRC cells. To test this possibility, the sensitivity of various CRC cells to the first dose increase of cetuximab was examined. We have found that HCT116 and Caco2 cells expressing high levels of endogenous KITENIN are more resistant to cetuximab than DLD1 and SW620 cells expressing KITENIN at lower levels (panel A of FIG. 14). In order to test whether the high level of KITENIN expression affects the survival of CRC cells responding to cetuximab, Caco2 CRC cells, the KRAS / BRAF wild-type cell line (23), were first selected for use with EGFR targeting treatment (5) and (6), respectively. There was no difference in survival for cetuximab between co-vector and KITENIN-transfected Caco2 cells, whereas KITENIN-expressing Caco2 cells were resistant to cetuximab, whereas KITENIN knockdown Caco2 cells were sensitive (Panel B in Fig. 14). The proliferation rates for cetuximab were compared in CRC cells with mutant KRAS / BRAF such as DLD1 and HCT116 cells. KITENIN High expressing DLD1 cell line showed resistance to cetuximab, while KITENIN-knockdown HCT116 cells showed sensitivity to cetuximab (FIG. 14, panel C). Thus, these results indicate that the KITENIN / ErbB4-c-Jun axis confers resistance to cetuximab in Caco2 cells with KRAS / BRAF wild type and high KITENIN expression. These results also suggest that these axons may contribute to the initial acquisition of resistance to cetuximab in CRC cells with mutant KRAS / BRAF.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Screening Method for Therapeutic Agent Capable of Treating Cancer Having Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor Blocking Agent <130> PN140402 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ctacaatgta gatggcccc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 agcctcatca ctgacaagcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 tggaaaacct gcagatcatc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ttgctgagaa agtcactgct 20 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 cagtgtgaga aaatggaaga tggactcctc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 gcacgtttct ttttgatgct ctttcttctg 30 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 aagaatggct agagaccctc a 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 ggaccgctgg aagcactgtg ata 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 cgacggccac tgctctcaca t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 atgacaactg gggagagacc a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 cagctcctcc ctccacagga 20 <210> 12 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si RNA <400> 12 gcuuggacuu cagccucgua gucaa 25 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si RNA <400> 13 aacuuugaga acaugagcaa c 21 <210> 14 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si RNA <400> 14 ugaucuguca ccacauaauu acggg 25 <210> 15 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si RNA <400> 15 uauagauguu uccugcgcug auuuc 25 <210> 16 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si RNA <400> 16 ugaaagagaa gccucucagc acgga 25 <110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Screening Method for Therapeutic Agent Capable of Treating Cancer Having Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor Blocking Agent <130> PN140402 <160> 16 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ctacaatgta gatggcccc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 agcctcatca ctgacaagcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 tggaaaacct gcagatcatc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ttgctgagaa agtcactgct 20 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 cagtgtgaga aaatggaaga tggactcctc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 gcacgtttct ttttgatgct ctttcttctg 30 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 aagaatggct agagaccctc a 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 ggaccgctgg aagcactgtg ata 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 cgacggccac tgctctcaca t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 atgacaactg gggagagacc a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 cagctcctcc ctccacagga 20 <210> 12 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 12 gcuuggacuu cagccucgua gucaa 25 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 13 aacuuugaga acaugagcaa c 21 <210> 14 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 14 ugaucuguca ccacauaauu acggg 25 <210> 15 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 15 uauagauguu uccugcgcug auuuc 25 <210> 16 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 16 ugaaagagaa gccucucagc acgga 25
Claims (15)
(a) KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축(axis)의 신호전달경로를 갖는 세포에 상피세포 성장인자(EGF, Epidermal Growth Factor)의 처리와 함께 후보물질을 처리하거나 후보물질을 처리하지 않는 단계;
(b) 상기 처리한 세포에서 상기 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달경로의 활성화 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 후보물질을 처리하지 않은 세포에 비해 상기 후보물질을 처리한 세포에서 상기 KITENIN/ErbB4 - Dvl2 - c-Jun 축의 신호전달경로의 활성화가 더욱 억제되는 경우 상기 후보물질을 항암제 후보물질로 판단하는 단계.
A method for screening an anticancer agent candidate comprising the steps of:
(a) treatment of candidate substances with the treatment of epidermal growth factor (EGF) with cells having a signaling pathway of KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis, step;
(b) measuring the degree of activation of the signal transduction pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis in the treated cells; And
(c) When activation of the signaling pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis is further inhibited in the cells treated with the candidate substance compared to the cells not treated with the candidate substance, the candidate substance is selected as an anticancer drug candidate Judging step.
The method according to claim 1, wherein the cancer is cancer that is not responsive to an epidermal growth factor receptor (EGFR) blocking agent.
The method of claim 1, wherein the cancer is gastric cancer, liver cancer, or colon cancer.
The method according to claim 1, wherein the inhibition of the activation of the signaling pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis in step (c) comprises (i) inhibition of binding of KITENIN to ErbB4, (ii) (Iii) inhibition of an increase in the amount of c-Jun protein, or (iv) inhibition of AP-1 transcription factor activation.
Epithelial growth factor (EGF); And KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis.
6. The composition of claim 5, wherein the cancer is a cancer that is not responsive to an epithelial growth factor receptor (EGFR) blocking agent.
6. The composition of claim 5, wherein the cancer is gastric cancer, liver cancer or colon cancer.
(EGFR) blocking agent, which comprises measuring the degree of activation of the signaling pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis in cancer tissues or cells, or determining the reactivity to an EGFR blocking agent How to provide information necessary for prognosis.
12. The method of claim 11, wherein measuring the degree of activation of the signaling pathway of the KITENIN / ErbB4-Dvl2-c-Jun axis comprises measuring the amount of KITENIN protein.
12. The method of claim 11, wherein the cancer is gastric cancer, liver cancer, or colon cancer.
KITENIN kit for determining the reactivity of a cancer containing a protein detection reagent to an epithelial cell growth factor receptor (EGFR) blocking agent.
15. The kit according to claim 14, wherein the cancer is gastric cancer, liver cancer or colon cancer.
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