KR101665193B1 - 탄소나노튜브를 포함하는 줄기세포 증식 및 분화촉진용 수화겔 - Google Patents

탄소나노튜브를 포함하는 줄기세포 증식 및 분화촉진용 수화겔 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄소나노튜브와 콜라겐을 포함하는 줄기세포 증식 및 분화촉진용 수화겔, 상기 수화겔의 제조방법, 상기 수화겔을 사용하여 신경세포를 생산하는 방법 및 상기 생산된 신경세포를 포함하는 신경세포 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 탄소나노튜브를 포함하는 수화겔을 사용하면, 신경분화를 유도하는 성분이 포함되지 않더라도 줄기세포를 신경세포로 분화시킬 수 있으므로, 손상된 신경세포의 회복 또는 재생에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

탄소나노튜브를 포함하는 줄기세포 증식 및 분화촉진용 수화겔{Hydrogel for proliferation and differentiation of stem cell comprising carbon nantotubes}
본 발명은 탄소나노튜브를 포함하는 줄기세포 증식 및 분화촉진용 수화겔에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 탄소나노튜브와 콜라겐을 포함하는 줄기세포 증식 및 분화촉진용 수화겔, 상기 수화겔의 제조방법 및 상기 수화겔을 사용하여 신경세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
포유동물은 외인성 손상, 상처 등의 원인으로 인하여 신경이 직접적으로 손상되거나 또는 유전적인 원인으로 인하여 신경세포의 퇴행성 손상이 수반되는 뇌신경계 질환이 발병될 경우에 신경세포가 손상될 수 있는데, 상기 신경세포가 손상되면 더 이상 재생되지 않으며, 외인성 손상에 의하여 신경세포가 손상될 경우에도 그의 후유증으로 뇌졸중, 파킨슨병 또는 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)이 추가로 발생할 수 있기 때문에 신경세포 사멸에 따른 질환을 치료할 수 있는 치료법 개발은 오랫동안 전 세계적으로 활발히 연구되고 있지만, 아직까지 좋은 치료법이 개발되지 못하고 있는 상태이다.
최근에는, 다양한 세포로 분화될 수 있는 만능세포인 줄기세포(stem cells)를 신경세포로 분화시켜 손상된 신경세포를 치료하는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 줄기세포는 다양한 세포로 분화될 수 있기 때문에, 조직손상을 유발하는 질환을 치료하는 근본적인 방법이 될 수 있으나, 줄기세포를 수득하기가 용이하지 않고, 줄기세포를 목적하는 세포로 분화시키기가 용이하지 않으며, 줄기세포 자체가 환자의 면역체계에 의해 거부되지 않아야 한다는 문제점으로 인하여, 아직까지는 보편적으로 사용되지 못하고 있다. 그러나, 신경세포의 손상이 수반되는 뇌신경계 질환의 경우에는, 다른 어느 질병보다 줄기세포를 이용한 치료에 가장 합당한 대상이라 여겨지는데, 이는 뇌신경계 조직이 다른 조직과는 달리 면역거부반응이 거의 없어, 외부로부터 세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있기 때문이다.
이에, 뇌졸중, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 탈수초질환(demyelinating disease) 및 척추손상(spinal cord injury) 등의 질환 치료에 줄기세포를 적용하는 방법을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 국제특허공개 WO 2005/003320호에는 줄기세포에 염기성 섬유아세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자 8과 SHH(Sonic Hedgehog) 및 뇌-유래 신경영양 인자를 순차적으로 가하여 배양하고, 마지막으로 신경교 성상세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제495532호에는 중간엽 줄기세포를 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor)와 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 아직까지는 줄기세포를 신경세포로 분화시킬 경우에 신경분화 성공율이 낮아서, 줄기세포를 이용하여 보다 효과적으로 신경세포로 분화시키는 방법에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 특히 수화겔을 사용하여 줄기세포를 3차원 배양함으로써, 보다 효과적으로 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 연구가 다각적으로 진행되고 있다. 예를 들어, 미국특허공개 제2008-0038814호에는 탄소나노튜브 매트위에 하이드로겔 시트를 적층시키고, 상기 적층된 하이드로겔 시트위에서 신경세포를 증식시키는 방법이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2013-0091818호에는 온도감응성 하이드로젤을 사용하여 MSCs로부터 신경세포를 분화시키는 방법이 개시되어 있으며, 미국특허공개 제2014-0081297호에는 신경전구세포, 캡슐화된 신경성장인자 및 나노 섬유 메쉬를 포함하는 하이드로겔을 신경이 손상된 부위에 투여하는 단계를 포함하는 손상된 신경을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 이와 같이, 줄기세포를 3차원 배양하여 신경세포로 분화시킬 경우에는, 증식율이 낮아서 배양시간이 길어진다는 단점이 있었으나, 이러한 단점을 해결하는 방안은 아직까지 보고되지 않고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 효과적으로 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 탄소나노튜브를 내재적으로 포함하는 수화겔을 사용하여 중간엽줄기세포를 배양할 경우, 중간엽줄기세포의 증식율이 증가할 뿐만 아니라 추가적인 분화유도제를 처리하지 않고서도 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 탄소나노튜브와 콜라겐을 포함하는 줄기세포 증식 및 분화촉진용 수화겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 수화겔의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 수화겔을 사용하여 신경세포를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 탄소나노튜브(carbon nantotubes: CNTs)에 주목하게 되었다. 상기 CNTs는 1991년에 발견된 이후에 계속적으로 그 용도와 특징 기능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 지금까지 알려진 바에 의하면, 기계적으로 높은 강도를 갖고, 유동적으로 전기전도체로서 작용할 수 있으며, 기본적으로 불용성을 나타내지만 표면처리에 의하여 친수성을 나타낼 수 있고, 생체에서 약물송달 시스템의 구성요소로 사용될 수 있다고 알려져 있다. 본 발명자들은 이러한 CNTs의 생물학적 특성에 착안하여, 줄기세포의 3차원 배양에 사용되는 콜라겐 수화겔에 상기 CNTs를 부가하여 줄기세포의 배양효율 및 분화효율을 향상시키고자 하였다. 이에, CNTs를 표면처리하여 친수성을 갖도록 가공한 다음, 이를 콜라겐과 혼합하여, 다양한 함량의 CNTs를 포함하는 콜라겐 수화겔을 제작하고, 이를 이용하여 줄기세포를 배양한 결과, 일정 함량의 CNTs를 포함하는 수화겔을 사용하여 줄기세포를 배양하면 줄기세포 증식능이 현저하게 향상되고, 신경마커 및 신경영양인자가 발현되어 신경세포로 분화됨을 확인할 수 있었다.
따라서, CNTs를 포함하는 수화겔은 줄기세포의 배양 및 분화를 촉진시키기 위한 매개체로서 사용될 수 있음을 알 수 있었는데, 탄소나노튜브를 포함하는 수화겔을 사용하여 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법은 종래에 알려져 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 탄소나노튜브와 콜라겐을 내재적으로 포함하는 줄기세포 증식 및 분화촉진용 수화겔을 제공한다.
본 발명의 용어 "탄소나노튜브(carbon nantotube: CNTs)"란, 탄소-케이쥐(carbon-cage) 분자 집단의 일종으로서, 광범위하게는 플러렌, 탄소버키볼 및 탄소나노튜브를 포괄하는 화합물을 의미하고, 협소하게는 튜브의 형태를 가지는 탄소-케이쥐(carbon-cage) 분자 집단을 의미한다. 상기 CNTs는 응집수준에 따라 탄소나노파이버(carbon nanofiber)와 탄소나노입자(carbon nanoparticles)로 구별될 수 있다. 한편, 탄소나노튜브는 밀폐된 원형 다중층 껍질, 다층벽 나노튜브 (multi-wall nanotobe) 또는 단일벽 나노튜브 (single-wall nanotube)로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 탄소나노튜브는 다층벽 나노튜브이다. 본 발명에서 이용되는 탄소나노튜브의 탄소수는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 C20-C150 이다. 본 발명에서 이용되는 탄소나노튜브는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5,753,088 호,제 5,641,466 호, 제 5,292,813 호 및 제 5,558,903 호).
본 발명에 있어서, 상기 CNTs는 콜라겐 수화겔에 균일하게 분포되도록 포함되어, 중간엽줄기세포의 증식 및 분화를 촉진하는 유효성분으로 사용될 수 있는데, 바람직하게는 콜라겐 수화겔에 균일하게 분포되기 위하여 표면처리된 형태의 CNTs가 될 수 있다. 상기 표면처리된 CNTs는 수용성 기능단에 대한 반응성을 향상시켜서, 상기 CNTs가 수용성 환경에서도 상호응집되지 않고, 수용성 분자와 반응하여 균일하게 분산될 수 있게 한다. 상기 표면처리는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 산처리후 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)를 처리함에 의하여 수행될 수 있는데, 상기 산처리는 특별히 이에 제한되지 않으나 황산, 질산 또는 황산과 질산의 혼합물을 처리하는 방식으로 수행함이 바람직하다.
본 발명의 용어 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있고, 줄기세포의 유래조직에 따라 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 역분화줄기세포로 분류할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 본 발명에서 제공하는 나노구조가 형성된 배양지지체에 접종되어 분화될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 성체로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 골수, 지방조직, 치아, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 태아로부터 유래한 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간의 지방조직 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 용어 "수화겔(hydrogel)"이란, 물을 분산매로 사용하여 형성되는 겔을 의미한다. 상기 수화겔은 겔화성분을 포함하는 액상졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하는 등의 원인으로 인하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 전해질 고분자의 하이드로겔은 고흡수성을 나타내는 것이 많으며 흡수성 고분자로서 다방면에 실용화되어 있고, 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수화겔은 겔화성분으로 콜라겐을 사용하고, 부가성분으로서 CNTs를 포함하는 수화겔을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 수화겔에 포함된 CNTs의 함량은 줄기세포의 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 0.1 내지 2.0%(w/w)의 함량으로 수화겔에 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1.0%(w/w)의 함량으로 수화겔에 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1.0%(w/w)의 함량으로 수화겔에 포함될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 표면처리된 탄소나노튜브를 콜라겐 수용액과 혼합하여 혼합물을 수득하고, 이를 겔화시키는 단계를 포함하는 줄기세포 증식 및 분화촉진용 수화겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 수화겔의 제조방법에 있어서, 표면처리된 탄소나노튜브는 상술한 바와 같이 산처리후 EDC를 처리하여 수득할 수 있는데, 이때 산처리는 황산, 질산 또는 황산과 질산의 혼합물을 처리하는 방식으로 수행할 수 있고, EDC는 EDC를 포함하는 EDA(Ethylenediamine) 용액을 탄소나노튜브에 처리하여 수행할 수 있다.
예를 들어, 상기 표면처리된 탄소나노튜브의 제조방법은 (a) 다중웰 탄소나노튜브에 황산과 질산을 포함하는 혼합산을 처리하고 환류반응시켜서 산처리된 탄소나노튜브를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 산처리된 탄소나노튜브에 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)를 포함하는 EDA(Ethylenediamine) 용액을 가하여 반응물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 반응물을 약산성화시키는 단계를 포함한다. 이때, (a) 단계에서 사용된 혼합산은 황산과 질산을 1:1(v/v)로 혼합된 것이 될 수 있고, 상기 환류반응은 60 내지 100℃에서 1 내지 3일 동안 수행될 수 있으며, (c) 단계의 약산성화는 (b) 단계에서 수득한 반응물에 산을 가하여 pH 4.0 내지 6.0이 되도록 적정하여 수행할 수 있다. 아울러, (c) 단계가 종료된 후 증류수 및 에탄올로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 수화겔의 제조방법에 있어서, 표면처리된 탄소나노튜브는 상술한 바와 같이 0.1 내지 2.0%(w/w)의 함량으로 콜라겐 수용액에 가하여 혼합할 수 있다.
상기 겔화는 표면처리된 탄소나노튜브를 포함하는 콜라겐 수화겔을 제조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 표면처리된 탄소나노튜브를 포함하는 콜라겐 수용액을 30 내지 40℃에서 1 내지 10분동안 반응시켜서 수행할 수 있다.
아울러, 본 발명에서 제공하는 수화겔은 줄기세포를 배양하여 증식 및 분화시키는데 사용할 수 있으므로, 이를 위하여 상기 수화겔의 제조시 콜라겐 수용액에 줄기세포 배양에 필요한 보조성분(예를 들어, FBS 등)과 배양배지(예를 들어, a-MEM 배지 등)을 추가한 다음 겔화시켜서 제조할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 탄소나노튜브(Carbon nanotube, CNTs)에 황산과 질산의 혼합물을 처리한 다음, EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)를 처리하여 표면처리된 CNTs를 제조하고(도 1a), 이의 표면조성을 분석한 결과 산소피크와 질소피크가 나타남을 확인하였으며(도 1b), 이의 화학결합을 분석한 결과 C=O 밴드, C-O 밴드 및 N-H 밴드가 추가되어 수용성 용액에서도 용이하게 분산되는 특징을 나타냄을 확인하였다(도 1c). 상기 표면처리된 CNTs를 콜라겐 용액에 분산시켜서, 다양한 함량의 CNTs를 포함하는 수화겔을 제작하고, 이의 특성을 분석한 결과, CNTs의 함량이 증가될 수록 수화겔의 색이 검게 변하고(도 2a), 수화겔의 화학결합을 분석한 결과, 콜라겐과 연관된 밴드(아미드 I, II 및 III)가 포함되어 있고, 상기 각 밴드의 수준은 CNTs의 함량이 증가할 수록 감소됨을 확인하였으며(도 2b), 수화겔의 미세구조를 분석한 결과, 콜라겐 섬유구조의 중간에 CNTs가 결합된 미세구조를 나타냄을 확인하였고(도 2c), 수화겔의 전기저항율은 CNTs의 함량이 증가할 수록 낮은값을 나타내었으며(도 2d), 수화겔의 탄성계수는 CNTs의 부가에 의하여 영향받지 않음을 확인하였다(표 1).
상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 상기 수화겔을 사용하여 신경세포를 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 신경세포 생산방법은 (a) 표면처리된 탄소나노튜브, 콜라겐 수용액 및 줄기세포를 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계; (b) 상기 혼합물을 겔화시켜서 줄기세포를 포함하는 수화겔을 수득하는 단계; 및. (c) 상기 줄기세포를 포함하는 수화겔을 배양하여 신경세포를 수득하는 단계를 포함한다. 이때, (a) 단계의 표면처리된 탄소나노튜브의 함량 및 (b) 단계의 겔화방법은 상술한 바와 동일하고, 상기 (a) 단계의 혼합물에는 줄기세포 배양에 필요한 보조성분(예를 들어, FBS 등)과 배양배지(예를 들어, a-MEM 배지 등)을 추가로 포함시킬 수 있으며, (c) 단계의 배양시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 3 내지 20일, 보다 바람직하게는 6 내지 18일, 가장 바람직하게는 12 내지 15일동안 배양할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 제작된 수화겔을 이용하여 MSCs를 배양하고, 상기 MSCs의 증식능을 분석한 결과 0 내지 1.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 콜라겐 수화겔에서 9일동안 배양한 경우에 MSCs의 증식수준이 급격하게 증가하였고, 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 콜라겐 수화겔에서 가장 높은 값을 나타내었으며(도 3a), 배양된 MSCs의 형태를 분석한 결과 한방향으로 길게 신장되는 형태로 성장하였으나, CNTs의 함량에 따른 차이는 나타나지 않음을 확인하였다(도 3b 및 3c). 상기 수화겔에서 배양된 MSCs에서 발현되는 신경마커의 수준을 분석한 결과, 수화겔에서 배양된 MSCs는 신경마커(GAP43(growth associate protein 43) 또는 βⅢ 튜불린)를 발현시킬 수 있고(도 4a), 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs는 신경마커(GAP43 또는 시냅스 I(synapse I))의 발현수준이 급격히 증가함을 확인하였다(도 4b 및 4c). 상기 수화겔에서 배양된 MSCs에서 발현되는 신경영양인자(NGF(nerve growth factor), BDNF(brain derived neurotrophic factor), CNTF(ciliary neurotrophic factor), NT3(neurotrophin-3) 및 NT4(neurotrophin-4))의 수준을 분석한 결과, NGF와 BDNF가 대량으로 발현되었고(도 5a), 상기 NGF의 발현수준을 배양시간별로 분석한 결과, 배양시간이 경과함에 따라 NGF의 발현량이 증가하는 양상을 나타내었으나, 배양시간에 따라 NGF의 발현수준을 최적화하기 위한 CNTs의 함량이 변화되며, 0.1%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 12일 동안 배양된 MSCs에서 가장 높은 수준으로 NGF가 발현됨을 확인하였고(도 5b), 단백질수준에서 분석한 결과, CNTs의 함량이 증가할 수록 NGF 또는 BDNF의 단백질 수준이 증가하며, BDNF 보다는 NGF의 단백질 수준이 더욱 높은 수준임을 확인하였다(도 5c). 상기 수화겔에서 배양된 MSCs에서 발현되는 신경영양인자가 정상적인 기능을 수행하는지를 확인한 결과(도 6a), CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs에서 발현된 신경영양인자는 PC12 세포에 작용하여 신경돌기를 생성하였고(도 6b), 상기 PC12 세포에서 유발되는 신경돌기의 생성수준을 구체적으로 분석한 결과, CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs에서 발현된 신경영양인자가 신경돌기가 생성되는 세포의 수(도 6c), 세포당 신경돌기의 수(도 6d), 신경돌기의 총길이(도 6e) 및 신경돌기의 평균 길이(도 6f)의 측면에서, 평면배양 또는 CNTs를 포함하지 않는 수화겔에서 배양된 MSCs에서 발현된 신경영양인자보다도 가장 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 수화겔에서 줄기세포를 배양하여 생산된 신경세포를 포함하는 신경 회복 또는 재생 촉진용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 줄기세포를 포함하는 수화겔은 줄기세포의 분화를 유도하는 성분이 전혀 포함되어 있지 않은 상태에서도 줄기세포를 신경세포로 분화시킬 수 있는 특성을 나타내므로, 손상된 신경의 회복 또는 재생에 사용될 수 있는 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 이식제 및 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 이식제 또는 외용제의 형태로 제형화될 때, 사용되는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 10 내지 90 중량%, 보다 바람직하게는 30 내지 85 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물의 환부에 손상부위를 회복시킬 수 있는 수준으로 이식되거나 또는 투여될 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 신경 손상이 발생된 개체에 이식 또는 투여하는 단계를 포함하는 신경 손상을 회복 또는 재생하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 신경 손상이 발생된 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 신경 손상을 회복 또는 재생시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "완화"란, 본 발명에 따른 조성물의 투여로 신경 손상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 이식 또는 주사방법 등의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 탄소나노튜브를 포함하는 수화겔을 사용하면, 신경분화를 유도하는 성분이 포함되지 않더라도 줄기세포를 신경세포로 분화시킬 수 있으므로, 손상된 신경세포의 회복 또는 재생에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 표면처리된 CNTs의 형태를 저배율 및 고배율에서 촬영한 TEM 사진이다.
도 1b는 표면처리 단계에 따른 CNTs의 표면조성을 XPS를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 표면처리 단계에 따른 CNTs의 화학결합 구조를 FT-IR을 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 콜라겐과 서로 다른 함량의 표면처리된 CNTs를 포함하는 수화겔의 색변화를 나타내는 사진이다.
도 2b는 다양한 함량의 표면처리된 CNTs를 포함하는 수화겔의 화학결합 구조를 FT-IR을 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 0 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔의 미세구조를 FE-SEM을 사용하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2d는 다양한 함량의 표면처리된 CNTs를 포함하는 수화겔의 전기저항율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 수화겔에 포함된 표면처리된 CNTs의 함량에 따른 MSCs의 증식수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 0 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs의 형태를 나타내는 현미경사진이다.
도 3c는 0 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs의 세포골격의 형태를 나타내는 SEM 사진이다.
도 4a는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs를 대상으로 신경마커를 면역염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4b는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs를 대상으로 신경마커인 GAP43의 발현수준의 변화를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs를 대상으로 신경마커인 시냅스 I의 발현수준의 변화를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs를 대상으로 다양한 신경영양인자(NGF, BDNF, CNTF, NT3 또는 NT4)의 발현수준 변화를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 0, 0.1, 0.25, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일, 6일, 9일 또는 12일 동안 배양된 MSCs를 대상으로 NGF의 발현수준 변화를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 동안 배양된 MSCs에서 발현된 NGF 또는 BDNF의 단백질 수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6a는 MSCs에서 발현되는 신경영양인자의 효과를 분석하기 위한 실험방법을 나타내는 개략도이다.
도 6b는 MSCs와 함께 배양된 PC12 세포의 배양시간의 경과에 따른 세포형태변화를 나타내는 사진이다.
도 6c는 MSCs와 3일 및 6일 동안 공동배양된 PC12 세포 중에서 신경돌기가 생성되는 세포의 수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6d는 MSCs와 3일 및 6일 동안 공동배양되어 신경돌기가 생성되는 PC12 세포당 신경돌기의 수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6e는 MSCs와 3일 및 6일 동안 공동배양된 PC12 세포에서 생성된 신경돌기의 총길이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6f는 MSCs와 3일 및 6일 동안 공동배양된 PC12 세포에서 생성된 신경돌기의 평균길이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 표면처리된 CNTs 의 제작
다중웰 탄소나노튜브(Carbon nanotube, CNTs)(순도 95%이상, 길이 10-20㎛, EM-Power Co. Ltd, Korea) 0.5g에 25㎖ 혼합산(H2SO4/HNO3, 1:1(v/v))을 가하고, 80 ℃에서 2일 동안 환류반응을 수행하였다. 반응이 종료된 후, 산처리된 CNTs 300 mg에 100㎖ 증류수를 가하여 현탁액을 수득하고, 상기 현탁액에 1.45 mg의 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)를 포함하는 EDA(Ethylenediamine) 용액 1㎖을 실온에서 1시간 동안 적가하면서 반응시킨 다음, 반응액의 pH가 pH 5.0가 될 때까지 1 N HCl을 가하고 하룻밤동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 여과하여 CNTs를 회수하고, 이에 증류수를 가하여 pH 7.0이 될 때까지 세척한 다음, 75% 에탄올을 가하여 하룻밤동안 세척하고, 건조시켜서 표면처리된 CNTs를 제작하였다.
상기 제작된 표면처리된 CNTs를 대상으로 HR-TEM(high-resolution transmission electron microscopy) 사진을 촬영하였다(도 1a).
도 1a는 표면처리된 CNTs의 형태를 저배율 및 고배율에서 촬영한 TEM 사진이다. 도 1a에서 보듯이, 표면처리된 CNTs는 30 nm의 폭과 수 마이크로미터의 길이를 갖고 다층벽을 갖는 구조를 나타냄을 확인하였다.
또한, 상기 제작된 표면처리된 CNTs의 표면조성을 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy)를 사용하여 분석하였다(도 1b).
도 1b는 표면처리 단계에 따른 CNTs의 표면조성을 XPS를 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 광범위영역 스캔시에는 530 eV에서의 산소피크(O1s)가 개질후에 현저하게 증가하였는데, 이는 H2SO4/NHO3로 산화시킨 CNTs에서도 공통적으로 나타나는 특징이다. CNTs에 EDA를 처리한 후에는, 매우 작은 질소피크(N1s)가 400 eV에서 추가로 나타났다. 좁은범위 스캔시에는, 질소피크(N1s)가 더욱 명확하게 나타났다. 상기 N1s 영역은 두개의 피크(399.8 및 401.7 eV) 사이에 나타남을 추가로 확인하였다.
아울러, 상기 제작된 표면처리된 CNTs의 화학결합 구조를 FT-IR(Fourier transformed infrared spectroscopy)을 사용하여 분석하였다(도 1c).
도 1c는 표면처리 단계에 따른 CNTs의 화학결합 구조를 FT-IR을 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1c에서 보듯이, 산처리된 CNTs는 C=O (1634/cm) 밴드 및 C-O (1000-1050/cm) 밴드가 추가되고, EDA 처리된 CNTs에서는 620/cm 영역에서 N-H 밴드가 추가됨을 확인하였다. 따라서, 상기 표면처리된 CNTs는 수용성 용액에서도 용이하게 분산될 수 있을 것으로 예상되었다.
실시예 2: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔의 제작 및 특성분석
실시예 2-1: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔의 제작
랫트를 희생시키고, 이로부터 꼬리부분을 적출한 다음, 적출된 꼬리의 피부를 제거하고, 증류수에 침지한 상태에서 해부하여 힘줄섬유를 수득하였다. 상기 수득한 힘줄섬유를 건조시키고, 이에 70% 에탄올을 가하여 2 ㎎/㎖의 농도로 적정한 다음 하룻밤동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 2차 증류수로 세척하고, 0.01%로 희석된 아세트산에 침지한 다음, 4℃에서 72 시간 동안 반응시켜서 콜라겐이 추출된 용액을 수득하였다. 상기 콜라겐이 추출된 용액을 원심분리(15,000 rpm, 30분)하여, 상층액인 콜라겐 용액을 수득하였다.
상기 수득한 콜라겐 용액과 상기 실시예 1에서 제작된 표면처리된 CNTs를 혼합하여 수화겔을 제작하였다. 구체적으로, 상기 수득한 콜라겐 용액에 최종농도가 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 또는 2.0%(w/v)가 되도록 표면처리된 CNTs를 가하고, 교반하여 콜라겐 용액에 CNTs를 분산시켰다. 이어, 상기 CNTs가 분산된 콜라겐 용액에 FBS와 3배 농축된 a-MEM 배지를 가하여 혼합한 다음, 37 ℃에서 5분동안 반응시켜서 각각의 수화겔을 제작하였다.
실시예 2-2: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔의 색도분석
상기 실시예 2-1에서 제작된 각각의 수화겔의 색변화를 분석하였다(도 2a).
도 2a는 콜라겐과 서로 다른 함량의 표면처리된 CNTs를 포함하는 수화겔의 색변화를 나타내는 사진이다. 도 2a에서 보듯이, CNTs의 함량이 증가할 수록, 수화겔이 검게 변하고, 2.0%의 CNTs를 포함하는 수화겔은 현저하게 검은색을 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-3: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔의 FT - IR 분석
상기 실시예 2-1에서 제작된 각각의 수화겔을 동결건조시키고, 동결건조된 각 수화겔을 대상으로 FT-IR을 사용하여, 상기 각 수화겔에 포함된 화학결합 구조를 분석하였다(도 2b).
도 2b는 다양한 함량의 표면처리된 CNTs를 포함하는 수화겔의 화학결합 구조를 FT-IR을 사용하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2b에서 보듯이, 각 수화겔에는 콜라겐과 연관된 밴드(아미드 I, II 및 III)가 포함되어 있고, 상기 각 밴드의 수준은 CNTs의 함량이 증가할 수록 감소됨을 확인하였다.
실시예 2-4: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔의 FE - SEM 분석
상기 실시예 2-1에서 제작된 수화겔 중에서, 0 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔을 동결 및 해동시킨 후, FE-SEM(ultrahigh-resolution scanning electron microscopy)에 적용하여, 상기 수화겔의 미세구조를 분석하였다(도 2c).
도 2c는 0 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔의 미세구조를 FE-SEM을 사용하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 도 2c에서 보듯이, 상기 제작된 수화겔은 콜라겐 섬유구조의 중간에 CNTs(적색 화살표)가 결합된 미세구조를 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-5: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔의 전기저항율( Electrical resistivity) 분석
상기 실시예 2-1에서 제작된 각각의 수화겔을 동결건조시키고, model 6050A(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하여, 36℃에서 10분동안 10 V 전압에 대한 각 수화겔의 저항값을 측정하여, 수화겔의 전기저항율을 분석하였다(도 2d).
도 2d는 다양한 함량의 표면처리된 CNTs를 포함하는 수화겔의 전기저항율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2d에서 보듯이, CNTs의 함량이 증가할수록 전기저항값이 감소됨을 확인하였다. 구체적으로, CNTs를 포함하지 않는 수화겔은 약 1013 Ω 수준의 전기저항값을 나타낸 반면, 0.1 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔은 약 1010 Ω 수준의 전기저항값을 나타내고, 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔은 약 109 Ω 수준의 전기저항값을 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-6: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔의 탄성계수 분석
상기 실시예 2-1에서 제작된 각각의 수화겔의 기계적 특성을 분석하기 위하여, 탄성계수를 측정하고, 비교하였다.
구체적으로, 상기 각각의 수화겔을 동일부피를 갖는 관형 테플론 주형(12 mm 직경 x 6mm 길이)에 적층시키고, 37 ℃에서 0.5 내지 10Hz의 주파수 범위 및 점탄성 선형 영역에 존재하는 5 % 변형 진폭을 갖는 동적 주파수 스위프(dynamic frequency sweep), 0.001 N 내지 0.2 N의 구배를 갖는 힘 및 최대 허용변형 10%의 조건하에서, DMA(dynamic mechanical analyzer)를 사용하여 상기 각 수화겔의 탄성계수를 측정하였다(표 1).
다양한 주파수(0.5 내지 10 Hz)에서 측정된 탄성계수를 나타내는 CNT-콜라겐 수화겔의 동력학적 기계적 분석결과
CNTs 함량
0% 0.1% 0.5% 1% 2%
탄성계수
(kPa)		 2.57±0.84 1.50±0.67 1.74±0.81 1.68±0.70 1.91±0.69
상기 표 1에서 보듯이, 약 1.5 내지 2.5 kPa 범위의 탄성계수가 측정됨을 확인하였고, CNTs의 함량이 증가할 수록 탄성계수 역시 증가하는 경향을 나타내었으나, CNTs를 포함하지 않을 경우에 최대 탄성계수를 나타내었으므로, 수화겔의 탄성계수에 대하여는 CNTs의 부가가 어떠한 영향도 나타내지 않음을 시사하는 것으로 분석되었다.
실시예 3: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔을 이용한 줄기세포( MSCs )의 배양
실시예 3-1: 랫트 MSCs 의 수득
수컷 Sprague-Dawley 랫트(4-5 주령, 180-200 g)의 골수로부터 랫트의 중간엽 줄기세포(Rat mesenchymal stem cells, rMSCs)를 분리하였다. 상기 분리된 rMSCs를 10% FBS, 100 units/㎖ 페니실린, 100 mg/㎖ 스트렙토마이신 및 0.25 mg/㎖ 암포테리신 B를 포함하는 α-MEM 배지에 접종하고, 5% CO2 및 37 ℃ 조건에서 배양하였다. 배양이 종료된 세포에 0.25% 트립신-EDTA를 5분 동안 처리하여 배양된 세포를 회수하고, 이를 다시 계대배양하는 방식을 3회 반복하여, 계대배양된 rMSCs를 수득하였다.
실시예 3-2: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔을 이용한 MSCs 의 배양
상기 실시예 2-1에서 제작된 각각의 수화겔의 제조과정 중에서, FBS와 3배 농축된 a-MEM 배지를 가하여 혼합할 때, 상기 실시예 3-1에서 수득한 랫트의 MSCs를 1 X 106 세포수/㎖의 농도로 접종하여, MSCs를 포함하는 각각의 수화겔을 제작하고, 상기 제작된 수화겔에 10% FBS 및 P/S을 포함하는 a-MEM 배지를 가하여 12일동안 배양하였다. 이때, 상기 배지는 2일에 한번씩 교체하였다.
실시예 3-3: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs 의 증식능 분석
상기 실시예 3-2의 배양시에, 배양시작 시점으로부터 3일, 6일, 9일 및 12일이 경과된 시점에서의 MSCs의 증식수준을 MTS 분석법으로 측정하였다. 구체적으로, 상기 각 시점에서 수화겔의 일부를 분취하고, 분취된 각 수화겔에 2 mg/㎖의 제1형 콜라겐분해효소를 가하여 분해시켰으며, 상기 효소처리된 수화겔을 원심분리하여 MScs를 회수하였다. 상기 회수된 MScs를 대상으로 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 분석법을 적용하여, 490 nm의 흡광도를 측정함으로써 상기 회수된 MScs의 증식수준을 측정하였다(도 3a).
도 3a는 수화겔에 포함된 표면처리된 CNTs의 함량에 따른 MSCs의 증식수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3a에서 보듯이, 배양후 9일이 경과한 시점에서 MSCs의 증식수준이 급격하게 증가하였고, 이러한 현상은 0 내지 1.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 콜라겐 수화겔에서 유사한 양상으로 나타났으며, 상기 MSCs의 증식수준은 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 콜라겐 수화겔에서 가장 높은 값을 나타냄을 확인하였다.
한편, 2.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 콜라겐 수화겔에서는 MSCs의 증식수준이 현저하게 감소되었는데, 이는 CNTs에 의한 세포독성 때문인것으로 분석되었다.
실시예 3-4: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs 의 형태분석
상기 실시예 3-2에서 배양된 MSCs 중에서, 0 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs를 대상으로 형태변화를 분석하였다.
구체적으로, 상기 0 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs를 실시예 3-3의 방법으로 회수한 다음, PBS로 세척하고, 2.5% 글루타르알데히드로 고정시켰으며, 에탄올을 사용하여 탈수시키고, -80 ℃에서 동결건조시켰으며, 동결건조된 MSCs를 광학현미경하에서 관찰하거나(도 3b) 또는 상기 동결건조된 MSCs를 금입자 코팅하고, 15-20 kV의 조건에서 SEM 사진을 촬영하였다(도 3c).
도 3b는 0 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs의 형태를 나타내는 현미경사진이고, 도 3c는 0 또는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs의 세포골격의 형태를 나타내는 SEM 사진이다. 도 3b 및 3c에서 보듯이, 수화겔에서 배양된 MSCs는 한방향으로 길게 신장되는 형태로 성장하였으나, CNTs의 함량에 따른 차이는 나타내지 않음을 확인하였다.
실시예 3-5: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs 에서의 신경마커 분석
실시예 3-5-1: 면역염색 분석
상기 실시예 3-2에서 배양된 MSCs 중에서, 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs를 대상으로 신경마커에 대한 면역염색을 수행하였다.
구체적으로, 상기 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs를 실시예 3-3의 방법으로 회수한 다음, 4% 포르말린으로 고정시켰으며, 0.5% Triton X-100을 10분 동안 처리하여 세포막을 천공하였다. 이어, 상기 각 MSCs에 10% 염소 혈청을 가하여 비특이적 결합을 방지한 다음, 신경마커(GAP43(growth associate protein 43) 또는 βⅢ 튜불린)에 대한 각각의 1차 항체를 가하여 4 ℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, PBS로 3회 세척하고, 2차 항체를 가한 다음, 실온에서 1시간 동안 반응시켜서 연역염색을 수행하였다. 또한, 핵은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 면역염색하였다. 상기 면역염색이 완료된 MSCs를 M700 apparatus (Carl Zeiss, Jena, Germany)를 포함하는 공초점 현미경(confocal laser scanning microscopy)으로 촬영하였다(도 4a).
도 4a는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 또는 6일 동안 배양된 MSCs를 대상으로 신경마커를 면역염색한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4a에서 보듯이, 모든 종류의 수화겔에서 배양된 MSCs는 신경마커를 발현시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-5-2: RT - PCR 분석
상기 실시예 3-2에서 배양된 MSCs 중에서, 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 동안 배양된 MSCs를 대상으로 신경마커에 대한 RT-PCR 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 동안 배양된 MSCs를 실시예 3-3의 방법으로 회수한 다음, 상기 회수된 각 MSCs를 RNeasy mini kit 74104 (Qiagen, Valencia, CA)에 적용하여 각각의 총 RNA를 수득하였다. 상기 수득한 총 RNA를 Quantitect RT kit (Qiagen)에 적용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 각각의 cDNA와 신경마커(GAP43 또는 시냅스 I(synapse I))를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 하기 프라이머를 이용한 PCR을 수행하고, 이를 분석하여 각 신경마커의 발현수준의 변화를 비교하였다(도 4b 및 4c). 이때, PCR 반응은 95 ℃ 30초, 58 ℃ 30초 및 75 ℃ 60초의 조건을 35 사이클 수행하였고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였으며, 데이터 분석은 Gene tools ver. 4.01 software를 사용하였다.
GAP43(f): 5'-TGCTGTGCTGTATGAGAAGAACC-3'(서열번호 1)
GAP43(r): 5'-GGCAACGTGGAAAGCCGTTTCTTTAAAGT-3'(서열번호 2)
synapase I(f): 5'-CCGCCAGCTGCCTTC-3'(서열번호 3)
synapase I(r): 5'-TGCAGCCCAATGACCAAA-3'(서열번호 4)
GAPDH(f): 5-GTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'(서열번호 5)
GAPDH(r): 5'-GGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3'(서열번호 6)
도 4b는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs를 대상으로 신경마커인 GAP43의 발현수준의 변화를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4c는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs를 대상으로 신경마커인 시냅스 I의 발현수준의 변화를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4b 및 4c에서 보듯이, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs는 신경마커의 발현수준이 급격히 증가함을 확인하였다
실시예 3-6: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs 에서 발현되는 신경영양인자 분석
실시예 3-6-1: RT - PCR 분석
상기 실시예 3-2에서 배양된 MSCs 중에서, 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 동안 배양된 MSCs를 대상으로 신경영양인자인 NGF(nerve growth factor), BDNF(brain derived neurotrophic factor), CNTF(ciliary neurotrophic factor), NT3(neurotrophin-3) 및 NT4(neurotrophin-4)에 대한 RT-PCR 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3-5-2에서 합성된 각각의 cDNA와 각 신경영양인자를 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 하기 프라이머를 이용한 PCR을 수행하고, 이를 분석하여 각 신경영양인자의 발현수준의 변화를 비교하였다(도 5a). 이때, PCR 반응조건, 내부대조군 및 데이터분석방법은 상기 실시예 3-5-2와 동일하게 수행하였고, 대조군으로는 수화겔이 아닌 평면배양된 MSCs(2D)를 사용하였다.
NGF(f) 5'-CTGCTGAACCAATAGCTGCCCG-3'(서열번호 7)
NGF(r) 5'-CGCCTTGACAAAGGTGTGAGTCG-3'(서열번호 8)
BDNF(f) 5'-AGCCTCCTCTGCTCTTTCTGCTGGA-3'(서열번호 9)
BDNF(r) 5'-CTTTTGTCTATGCCCCTGCAGCCTT-3'(서열번호 10)
CNTF(f) 5'-GAATTCAGGGCCCTTTGATTCCACAG-3'(서열번호 11)
CNTF(r) 5'-CTCGAGTTGCCTGATGGAAGTCAC-3'(서열번호 12)
NT3(f) 5'-TGGGAGAGATCAAAACCGGC-3'(서열번호 13)
NT3(r) 5'-CGTTTTGCGCTGAGAGTTCC-3'(서열번호 14)
NT4(f) 5'-GATGGCTCGACTGCTCTACC-3'(서열번호 15)
NT4(r) 5'-CTTGCCAGGGTAAGTCAGGG-3'(서열번호 16)
도 5a는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs를 대상으로 다양한 신경영양인자(NGF, BDNF, CNTF, NT3 또는 NT4)의 발현수준 변화를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5a에서 보듯이, 평면배양된 MSCs(2D)와는 달리 수화겔에서 배양된 MSCs에서는 신경영양인자인 NGF와 BDNF가 대량으로 발현되었고, 이는 모든 수화겔에서 공통됨을 확인하였다. 또한, 상기 NGF는 0.1%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs에서 가장 높은 수준으로 발현되었고, 이후 CNTs의 농도가 증가할수록 감소되는 반면, BDNF는 0.5%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs에서 가장 높은 수준으로 발현되었고, 이후 CNTs의 농도가 증가할수록 감소됨을 확인하여, 각 신경영양인자가 CNTs의 함량에 의하여 발현수준이 변화됨을 알 수 있었다.
실시예 3-6-2: NGF 의 RT - PCR 분석
상기 실시예 3-6-1의 결과로부터, CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs에서 발현되는 신경영양인자 중에서 가장 높은 수준을 나타내는 것은 NGF임을 확인하였으므로, 배양시간에 따른 상기 NGF의 발현수준의 변화를 분석하였다.
구체적으로, 0, 0.1, 0.25, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일, 6일, 9일 또는 12일 동안 배양된 MSCs를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-5-2 및 3-6-1의 방법을 사용하여, NGF의 발현수준의 변화를 배양기간(3일, 6일, 9일 또는 12일)별로 비교하였다(도 5b).
도 5b는 0, 0.1, 0.25, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일, 6일, 9일 또는 12일 동안 배양된 MSCs를 대상으로 NGF의 발현수준 변화를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5b에서 보듯이, 대체로 배양시간이 경과함에 따라 NGF의 발현량이 증가하는 양상을 나타내었으나, 배양시간에 따라 NGF의 발현수준을 최적화하기 위한 CNTs의 함량이 변화됨을 확인하였다. 구체적으로, 3일 또는 6일동안 배양된 MSCs는 0.25%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 가장 높은 수준으로 NGF가 발현되었으나, 9일 또는 12일동안 배양된 MSCs는 0.1%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 가장 높은 수준으로 NGF가 발현됨을 확인하였다. 결과적으로는 0.1%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 12일 동안 배양된 MSCs에서 가장 높은 수준으로 NGF가 발현됨을 확인하였다.
실시예 3-6-3: 웨스턴블럿 분석
상기 실시예 3-2에서 배양된 MSCs 중에서, 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 동안 배양된 MSCs를 대상으로 NGF 또는 BDNF의 단백질 수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 확인하였다(도 5c). 이때, 대조군으로는 수화겔이 아닌 평면배양된 MSCs(2D)를 사용하였다.
도 5c는 0, 0.1, 0.5 또는 1.0%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔에서 3일 동안 배양된 MSCs에서 발현된 NGF 또는 BDNF의 단백질 수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 5c에서 보듯이, 전체적으로 CNTs의 함량이 증가할 수록 NGF 또는 BDNF의 단백질 수준이 증가하고, BDNF 보다는 NGF의 단백질 수준이 더욱 높은 수준임을 확인하였다.
실시예 3-7: 표면처리된 CNTs 를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs 에서 발현되는 신경영양인자의 효과분석
표면처리된 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs에서 발현되는 신경영양인자의 효과를, NGF의 처리에 의하여 신경돌기를 형성할 수 있는 PC12 세포주 모델을 사용하여 검증하였다.
구체적으로, 2 X 106 세포수/㎖의 MSCs와 1%(w/v)의 CNTs를 포함하는 수화겔을 24웰 플레이트의 웰의 일측단에 접종하고, PC12 세포(1 X 104세포수/㎖)를 동일 웰의 다른 일측단에 접종하여 상기 각 세포가 서로 연결되지 않도록 배치한 다음, 1일, 3일 및 6일 동안 공동배양하면서 24시간 별로 PC12 세포의 형태변화를 관찰하면서, 신경돌기가 생성되는 세포의 수, 세포당 신경돌기의 수, 신경돌기의 총길이 및 신경돌기의 평균 길이를 측정하였다(도 6a 내지 6f). 이때, 대조군으로는 평면배양된 MSCs 또는 CNTs를 포함하지 않는 수화겔에서 배양된 MSCs를 사용하였다.
도 6a는 MSCs에서 발현되는 신경영양인자의 효과를 분석하기 위한 실험방법을 나타내는 개략도이고, 도 6b는 MSCs와 함께 배양된 PC12 세포의 배양시간의 경과에 따른 세포형태변화를 나타내는 사진이다.
도 6b에서 보듯이, 배양시간에 상관없이 평면배양된 MSCs에 의하여 PC12 세포의 신경돌기 성장이 관찰되지 않았으나, 수화겔에서 배양된 MSCs는 PC12 세포의 신경돌기 성장을 유발시킴을 확인하였고, CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs는 PC12 세포의 신경돌기 성장을 촉진시킴을 확인하였다.
도 6c는 MSCs와 3일 및 6일 동안 공동배양된 PC12 세포 중에서 신경돌기가 생성되는 세포의 수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6c에서 보듯이, 배양기간에 상관없이 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 신경돌기가 생성되는 세포수가 가장 많았고, 그 다음으로 CNTs를 포함하지 않는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 신경돌기가 생성되는 세포수가 많았으며, 평면배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 신경돌기가 생성되는 세포수가 가장 적음을 확인하였다.
도 6d는 MSCs와 3일 및 6일 동안 공동배양되어 신경돌기가 생성되는 PC12 세포당 신경돌기의 수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6d에서 보듯이, 3일간 배양된 PC12 세포에서는 평면배양된 MSCs와 공동배양된 세포가 세포당 신경돌기의 수가 가장 많았고, CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 그 다음으로 많았으며, CNTs를 포함하지 않는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 가장 적었다. 이에 반하여, 6일간 배양된 PC12 세포에서는 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 세포당 신경돌기의 수가 가장 많았고, CNTs를 포함하지 않는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 세포당 신경돌기의 수가 그 다음으로 많았으며, 평면배양된 MSCs와 공동배양된 세포가 세포당 신경돌기의 수가 가장 적음을 확인하였다.
도 6e는 MSCs와 3일 및 6일 동안 공동배양된 PC12 세포에서 생성된 신경돌기의 총길이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6e에서 보듯이, 배양기간에 상관없이 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 신경돌기의 총길이가 가장 길었고, 그 다음으로 CNTs를 포함하지 않는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 신경돌기의 총길이가 길었으며, 평면배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 신경돌기의 총길이가 가장 짧음을 확인하였다.
도 6f는 MSCs와 3일 및 6일 동안 공동배양된 PC12 세포에서 생성된 신경돌기의 평균길이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6f에서 보듯이, 3일간 배양된 PC12 세포에서는 평면배양된 MSCs와 공동배양된 세포가 신경돌기의 평균길이가 가장 길었고, CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 그 다음으로 길었으며, CNTs를 포함하지 않는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 가장 짧았다. 이에 반하여, 6일간 배양된 PC12 세포에서는 CNTs를 포함하는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 신경돌기의 평균길이가 가장 길었고, CNTs를 포함하지 않는 수화겔에서 배양된 MSCs와 공동배양된 PC12 세포가 신경돌기의 평균길이가 그 다음으로 길었으며, 평면배양된 MSCs와 공동배양된 세포가 신경돌기의 평균길이가 가장 짧음을 확인하였다.
상기 실시예 3-1 내지 3-7의 결과를 종합하면, CNTs를 포함하는 수화겔을 이용하여 배양된 MSCs는 신경마커의 발현수준이 증가될 뿐만 아니라, 신경세포에서 발현되는 신경영양인자의 발현수준이 증가하고, 이처럼 발현된 신경영양인자는 정상적인 기능을 수행함을 확인하였다. 따라서, CNTs를 포함하는 수화겔은 MSCs가 신경세포로 분화되는 것을 유도하는 효과를 나타냄을 알 수 있었고, 상기 수화겔에 포함되는 CNTs의 최적 농도는 0.1 내지 1.0%(w/v)임을 알 수 있었다.
<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Hydrogel for proliferation and differentiation of stem cell comprising carbon nantotubes <130> KPA140865-KR <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgctgtgctg tatgagaaga acc 23 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggcaacgtgg aaagccgttt ctttaaagt 29 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccgccagctg ccttc 15 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgcagcccaa tgaccaaa 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtgaaggtcg gtgtgaacg 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggtgaagacg ccagtagact c 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctgctgaacc aatagctgcc cg 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgccttgaca aaggtgtgag tcg 23 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agcctcctct gctctttctg ctgga 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cttttgtcta tgcccctgca gcctt 25 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gaattcaggg ccctttgatt ccacag 26 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctcgagttgc ctgatggaag tcac 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tgggagagat caaaaccggc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cgttttgcgc tgagagttcc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gatggctcga ctgctctacc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cttgccaggg taagtcaggg 20

Claims (9)

  1. 탄소나노튜브(carbon nantotube: CNTs) 및 콜라겐을 내재적으로 포함하는 중간엽 줄기세포로부터의 신경세포로의 분화촉진용 수화겔(hydrogel).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CNTs는 0.1 내지 2.0%(w/v)의 함량으로 포함되는 것인 수화겔.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 수화겔은 신경분화 유도물질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 것인 수화겔.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CNTs는 산과 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)로 표면처리된 CNTs인 것인 수화겔.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 산은 황산, 질산 또는 이들의 혼합산인 것인 수화겔
  6. 표면처리된 탄소나노튜브를 콜라겐 수용액과 혼합하여 혼합물을 수득하고, 이를 겔화시키는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터의 신경세포로의 분화촉진용 수화겔의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    표면처리된 탄소나노튜브를 0.1 내지 2.0%(w/w)의 함량으로 콜라겐 수용액에 혼합하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 혼합물에 줄기세포의 배양에 필요한 성분, 줄기세포 배양용 배지 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
  9. (a) 표면처리된 탄소나노튜브, 콜라겐 수용액 및 중간엽 줄기세포를 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 혼합물을 겔화시켜서 중간엽 줄기세포를 포함하는 수화겔을 수득하는 단계; 및.
    (c) 상기 중간엽 줄기세포를 포함하는 수화겔을 배양하여 신경세포를 수득하는 단계를 포함하는, 신경세포 생산방법.

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Ai et al. Stem cells combined with nano materials–novel therapeutics for central nervous system diseases
Convertino et al. Graphene-based nanomaterials for peripheral nerve regeneration
Ni et al. Three-dimensional nanofibrous sponges with controlled hierarchy regulating neural stem cell fate for spinal cord regeneration
Dubey et al. Nanomaterials, neural stem cells, and the path to neural tissue engineering
Sahin et al. In vitro evaluation of biomaterials for neural tissue engineering

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