KR101662940B1 - Method for decomposition or regrowth in axial direction of amyloid fibrils by ultrasonication - Google Patents
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Abstract
본 발명은 초음파를 이용하여 아밀로이드 단백질 섬유를 축(axial) 방향으로 분해하는 방법 및 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법 관한 것으로, 비정상적으로 접힌 아밀로이드 단량체가 섬유화 현상이 일어나 만들어진 아밀로이드 섬유가 심장, 신장 등 장기에 쌓이는 아밀로이드증을 연구하는데 도움을 줄 수 있으며, 구체적으로 질환과 관련된 아밀로이드 섬유의 특성 및 아밀로이드 관련 질환의 초음파 치료 연구에 기여할 수 있다. The present invention relates to a method for decomposing amyloid protein fibers in the axial direction using ultrasonic waves and a method for regrowing the degraded amyloid protein fibers. The present invention relates to a method for regenerating degraded amyloid protein fibers in which an amyloid fiber formed by an abnormally folded amyloid monomer, And can contribute to studying the characteristics of amyloid fibrils associated with diseases and ultrasound therapy of amyloid-related diseases.
Description
본 발명은 초음파를 이용하여 아밀로이드 단백질 섬유를 축(axial) 방향으로 분해 및 재성장 시키는 방법에 관한 것으로서, 초음파 조사 시간이 길어질수록 아밀로이드 섬유는 더 짧게 작은 조각으로 분해되고, 초음파에 의해 분해된 아밀로이드 섬유는 고농도의 단백질 단량체 첨가에 의해 일부 재성장되며 이와 같이 재성장한 아밀로이드 섬유는 초음파 처리에 의해 분해되기 전 아밀로이드 섬유의 표면 전위(surface potential) 밀도와 유사한 값을 갖는다.
The present invention relates to a method for decomposing and regrowing amyloid protein fibers in the axial direction by using ultrasonic waves. As the ultrasonic irradiation time becomes longer, the amyloid fibers are decomposed into smaller fragments shorter and the amyloid fibers decomposed by ultrasonic waves Is partially regenerated by the addition of a high concentration of protein monomer and the regrowth of the amyloid fiber has a value similar to the surface potential density of the amyloid fiber before decomposition by ultrasonic treatment.
생체 내에서 단백질은 각종 화학반응의 효소 역할을 하며 항체를 형성하고 면역을 담당하는 등 중요한 역할을 수행한다. 이러한 생체 내 단백질이 특정한 생리적 작용을 통해 변성되어 비정상적으로 접히면서 커다란 응집체를 형성하는데 이러한 현상을 아밀로이드 섬유화라 한다. 이렇게 만들어진 아밀로이드 섬유가 심장, 신장 등 장기에 쌓이게 되면 아밀로이드증이 생겨 질병을 일으킨다. 특히 아밀로이드 섬유가 플라크(plaque)가 되어 뇌에 쌓이면 알츠하이머와 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환이 생기게 된다. 최근에 다양한 퇴행성 질환과 관련된 단백질 섬유의 특성에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. In vivo, proteins act as enzymes for various chemical reactions and play important roles, such as forming antibodies and taking immunity. These in vivo proteins are denatured through specific physiological actions and fold abnormally to form large aggregates. This phenomenon is called amyloid fibrosis. When the amyloid fibers are accumulated in the heart, kidney and other organs, amyloidosis occurs and causes diseases. In particular, when amyloid fibers become plaques and accumulate in the brain, degenerative brain diseases such as Alzheimer's and Parkinson's disease are developed. Recently, studies on the characteristics of protein fibers related to various degenerative diseases have been actively carried out.
초음파 처리를 통한 최소 크기의 아밀로이드 섬유의 생산, 분해 방법에 관한 기술이 존재한다. 이 문헌에는, 초음파 처리를 통해 합성된 단백질 섬유를 작은 섬유로 분해하는 방법 및 분해된 단백질 섬유가 단백질 섬유와 관련된 질병을 연구하는데 도움이 될 것이라는 점이 개시되어 있다(Eri Chatani et al., 2009). 그러나 이 문헌에는 초음파에너지를 펄스인가방법을 이용해 반복적으로 에너지를 인가한 반면 본 발명에서는 초음파에너지를 연속적으로 인가하는 방식을 사용하였다. 또한 이 문헌에는 초음파에너지로 인하여 분해된 아밀로이드 섬유의 실제적인 길이를 측정한 데이터가 나타나 있지 않으며 아밀로이드 섬유 생산 및 분해 방법에 대해서만 개시되어 있을 뿐이다.Techniques exist for methods of producing and degrading minimal sized amyloid fibers through ultrasonic treatment. This document discloses a method of degrading protein fibers synthesized through ultrasound treatment into small fibers, and that degraded protein fibers may be helpful in studying diseases associated with protein fibers (Eri Chatani et al., 2009) . However, in this document, energy is repeatedly applied using a pulse application method of ultrasonic energy, while a method of applying ultrasonic energy continuously is used in the present invention. In addition, this document does not disclose data measuring the actual length of amyloid fibers degraded by ultrasonic energy, and only the methods for producing and degrading amyloid fibers are disclosed.
초음파 처리를 통해 야기되는 아밀로이드 섬유형성에 관한 기술이 존재한다. 이 문헌에는 아밀로이드 단량체가 초음파 처리를 통해 아밀로이드 섬유를 형성할 수 있다는 점이 개시되어 있다(Yuji Goto, 2012). 그러나 이 문헌에는 초음파 처리를 통해 아밀로이드 섬유가 형성될 수 있다는 점이 개시되어 있을 뿐이다.There is a description of amyloid fiber formation caused by ultrasonic treatment. This document discloses that amyloid monomers can form amyloid fibers through ultrasonic treatment (Yuji Goto, 2012). However, this document only discloses that amyloid fibers can be formed through ultrasonic treatment.
한국공개특허 2011-0138917호는 초음파 분해를 이용한 생분해성 고분자의 분자량 조절 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생분해성 고분자를 용매에 녹인 후, 0~48시간 동안 0~10 ℃에서 저온 보관하는 단계; 및 0~4 ℃의 온도 하에서 초음파의 인가 전압 세기 및 인가 시간을 조절하여 상기 생분해성 고분자의 분자량을 감소시키는 단계를 포함하는 생분해성 고분자의 분자량을 조절하는 방법 및 상기 방법으로 분자량이 조절된 생분해성 고분자에 대해 개시되어 있다. 다만 여기에서는 고분자의 분해 방법에 대해 개시되어 있을 뿐, 상대적으로 불안정한 아밀로이드 섬유에도 적용되는지 여부에 대하여는 전혀 개시하고 있지 않다.Korean Patent Publication No. 2011-0138917 discloses a method for controlling the molecular weight of a biodegradable polymer using ultrasonic degradation. More specifically, the biodegradable polymer is dissolved in a solvent and then stored at 0 to 10 ° C for 0 to 48 hours at a low temperature ; And controlling the applied voltage intensity and the application time of the ultrasound under a temperature of 0 to 4 ° C to reduce the molecular weight of the biodegradable polymer, and a method of controlling the molecular weight of the biodegradable polymer, And the like. However, here, the method of decomposing the polymer is disclosed, and it is not disclosed at all whether the method is applied to relatively unstable amyloid fibers.
본 발명은 초음파 처리에 의해 아밀로이드 섬유가 직경의 변화 없이 분해되며, 초음파 처리 시간에 의존적으로 길이가 짧아지고 형상이 균일해지고, 초음파 처리에 의해 분해된 아밀로이드 섬유는 주형이 되어 고농도의 단량체 첨가에 의해 일부 재생되며, 재생된 아밀로이드 섬유는 분해 전 아밀로이드 섬유와 매우 유사한 값의 표면 전위 밀도를 나타낸다는 것을 규명한데 기술적 의의를 갖는다.
According to the present invention, the amyloid fiber is decomposed by the ultrasonic treatment without change in the diameter, the length is shortened depending on the ultrasonic treatment time, the shape becomes uniform, the amyloid fiber decomposed by the ultrasonic treatment becomes the template, It is technically significant to note that some regenerated amyloid fibers exhibit very similar surface dislocation densities to pre-degradation amyloid fibers.
발명은 초음파를 아밀로이드 단백질 섬유에 조사하여 축(axial) 방향으로 분해하는 기술 및 이를 다시 재성장 시키는 기술을 제공하고자 한다.
The invention seeks to provide a technique for irradiating an ultrasound to an amyloid protein fiber and breaking it in an axial direction, and a technique for regrowing it again.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 긴 시간 동안 초음파를 아밀로이드 단백질 섬유에 조사하여 섬유의 결합 구조를 끊어 길게 합성된 아밀로이드 단백질 섬유를 축 방향으로 분해하는 아밀로이드 단백질 섬유의 분해 방법을 제공하며, 상기 방법에 의해 분해된 아밀로이드 단백질 섬유에 고농도의 아밀로이드 단량체를 첨가하여 재성장 시키는 방법 및 이를 통해 초음파 처리에 의한 분해 전 아밀로이드 섬유와 유사한 표면 전위 밀도를 갖는 재성장된 아밀로이드 단백질 섬유를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for decomposing amyloid protein fibers axially decomposing a long synthesized amyloid protein fiber by irradiating ultrasonic waves to amyloid protein fibers for a long time to break the binding structure of the fibers, And a regenerated amyloid protein fiber having a surface dislocation density similar to that of the pre-decomposed amyloid fiber by ultrasonic treatment. The present invention also provides a method for regenerating amyloid protein fibers.
본 발명은 또한, 알츠하이머와 파킨슨병과 같은 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성 연구에 도움을 주거나, 아밀로이드 관련 질환에 대한 초음파 치료를 위한 조건을 제시할 수 있으며, 초음파 조사에 의하여 분해되거나 분해된 것으로부터 재성장한 아밀로이드 단백질 섬유를 각종 소재로 제공할 수 있다.
The present invention may also be used to aid in the characterization of amyloid protein fibers associated with degenerative diseases such as Alzheimer ' s and Parkinson ' s disease, to suggest conditions for ultrasonic therapy for amyloid related diseases, and to degradation or degradation by ultrasonic irradiation The regenerated amyloid protein fiber can be provided as various materials.
발명에서는 초음파를 이용하여 아밀로이드 단백질 섬유를 축(axial) 방향으로 분해 및 재성장 시키는 방법을 제공함으로써, 비정상적으로 접힌 아밀로이드 단량체가 섬유화 현상이 일어나 만들어진 아밀로이드가 심장, 신장 등 장기에 쌓이는 아밀로이드증을 연구하는데 도움을 줄 수 있으며, 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성 및 아밀로이드 관련 질환의 초음파 치료 연구에 도움을 줄 수 있다. The present invention provides a method of decomposing and regrowing amyloid protein fibers in an axial direction by using ultrasonic waves, thereby helping amyloid accumulation in organs such as the heart, kidney, and the like in an amyloid formed by the fibrosis phenomenon of an abnormally folded amyloid monomer And can help to study the characteristics of amyloid protein fibers related to the disease and ultrasound treatment of amyloid related diseases.
본 발명의 방법에 따라 재성장한 아밀로이드 단백질 섬유는 분해 전 아밀로이드 단백질 섬유와 표면 전위 밀도가 유사하므로 각종 소재로 널리 사용될 수 있다.
The regrown amyloid protein fibers according to the method of the present invention can be widely used as various materials because they have similar surface dislocation densities to amyloid protein fibers before degradation.
도 1은 초음파가 아밀로이드 유사 섬유에 조사되는 시간에 따라 분해되는 아밀로이드 유사 섬유의 AFM 이미지(a~f) 및 분해된 아밀로이드 유사 섬유의 길이에 대한 히스토그램(g)이다.
도 2는 초음파가 조사되는 시간에 따라 분해되는 아밀로이드 유사 섬유의 ThT 형광분석 결과를 나타낸 것으로 도 2 (a)는 초음파가 조사되는 시간에 의해 분해된 아밀로이드 유사 섬유의 형광 스펙트럼을 나타내고, 도 2 (b)는 힐 공식(Hill equation, k=167.14, n=1.35)에 의해 초음파가 조사되는 시간 따른 ThT 처리된 분해된 아밀로이드 유사 섬유의 정규화된 형광 강도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 단백질 단량체의 첨가량에 따른 재생되는 아밀로이드 유사 섬유의 AFM 이미지(a~c), 재생된 재생 아밀로이드 유사 섬유의 길이에 대한 히스토그램(d), 및 재생 아밀로이드 유사 섬유의 ThT 결합 분석 결과(e)를 나타낸 것이다.
도 4는 아밀로이드 유사 섬유의 분해와 재생 관정을 도시화한 것이다.
도 5는 분해 전 원래의 아밀로이드 유사 섬유와 초음파 처리에 의해 분해된 후 1 중량% 단량체 첨가로 재생된 재생 아밀로이드 유사 섬유의 전기적 성질에 대한 켈빈 탐침력 현미경(KPFM) 전위 맵으로, 위상(a, e)과 표면 전위(b, f) 이미지, 라인 스캔으로부터 획득한 단면의 위상(c, g)과 표면 전위(d, h)의 프로파일을 나타낸다.
도 6은 초음파 처리에 의해 분해된 아밀로이드 유사 섬유의 재생이 분절된 섬유로부터 형성된 것인지 첨가된 단량체 단백질로부터 형성된 것인지 확인하기 위한 실험의 모식도(a) 및 ThT 분석과 AFM 분석 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 is AFM images (a-f) of amyloid-like fibers that degrade with time when the ultrasound waves are irradiated to amyloid-like fibers and histograms (g) of lengths of degraded amyloid-like fibers.
Fig. 2 shows the result of ThT fluorescence analysis of amyloid-like fiber decomposed with time of irradiation with ultrasound. Fig. 2 (a) shows the fluorescence spectrum of the amyloid-like fiber decomposed at the time when the ultrasonic wave is irradiated, b) is a graphical representation of the normalized fluorescence intensities of ThT-treated degraded amyloid-like fibers over time during which the ultrasound is irradiated by the Hill equation (Hill equation, k = 167.14, n = 1.35).
FIG. 3 shows AFM images (a to c) of the amyloid-like fiber to be regenerated according to the addition amount of the protein monomer, histogram (d) to the length of the regenerated amyloid- ).
Figure 4 illustrates the degradation and regeneration of amyloid-like fibers.
5 is a Kelvin probe microscope (KPFM) potential map for the electrical properties of the original amyloid-like fiber before degradation and the regenerated amyloid-like fiber regenerated by addition of 1 wt% monomer after degradation by sonication; (c, g) and the surface potential (d, h) obtained from the surface potential (b, f) image and line scan.
FIG. 6 is a schematic view (a) of the experiment to confirm whether the regeneration of the amyloid-like fiber degraded by the ultrasonic treatment is formed from the segmented fibers or the added monomer protein, and the results of the ThT analysis and the AFM analysis are shown.
본 발명은 20 내지 60 kHz의 초음파를 아밀로이드 단백질 섬유에 조사하여, 아밀로이드 단백질 섬유를 축(axial) 방향으로 분해하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for irradiating amyloid protein fibers with an ultrasonic wave of 20 to 60 kHz to decompose amyloid protein fibers in an axial direction.
본 발명의 일 양태에서, 초음파는 20 내지 60 kHz로, 보다 구체적으로 30 내지 50 kHz, 보다 더 구체적으로 35 내지 45 kHz로 조사될 수 있다.In one aspect of the invention, the ultrasonic waves may be irradiated at 20 to 60 kHz, more specifically 30 to 50 kHz, and more particularly 35 to 45 kHz.
본 발명의 일 양태에서, 상기 아밀로이드 단백질 섬유는 β-아밀로이드 또는 β-락토글로불린 일 수 있다.In one aspect of the invention, the amyloid protein fiber may be? -Amyloid or? -Lactoglobulin.
본 발명의 일 양태에서, 초음파는 30 내지 1200분, 보다 구체적으로 30 내지 180분 동안 조사될 수 있다. 실험결과 180분이 경과한 이후에는 분해가 미비한 것으로 나타났다.In one aspect of the invention, the ultrasonic waves may be irradiated for 30 to 1200 minutes, more particularly 30 to 180 minutes. Experimental results showed that the decomposition was insufficient after 180 minutes.
본 발명의 일 양태에서, 상기 아밀로이드 단백질 섬유는 지름(radial) 방향으로는 분해되지 않는다.In one embodiment of the invention, the amyloid protein fibers are not degraded in the radial direction.
본 발명의 일 양태에서, 아밀로이드 단백질 섬유는 아밀로이드증, 치매, 알츠하이머병, 전신성 아밀로이드병, 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 및 덧치(Dutch)형 아밀로이드증을 갖는 개체에 존재하는 아밀로이드 단백질일 수 있다.
In one aspect of the invention, the amyloid protein fiber is an amyloid protein present in a subject having amyloidosis, dementia, Alzheimer's disease, systemic amyloid disease, Down's syndrome, amyloid angiopathy, cerebral amyloid angiopathy, and Dutch amyloidosis. .
본 발명은 상설한 방법으로 분해된 아밀로이드 단백질 섬유에, 0.01 wt%를 초과하는 양의 단량체 단백질(monomeric protein)을 첨가하여 60℃ 이상 100 ℃ 미만의 온도로 가열함으로써 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장(regrowth)시키는 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법에 관한 것이다.The amyloid protein fiber is regrowthed by heating the amyloid protein fiber decomposed by the permanent method in an amount of more than 0.01 wt% and a monomeric protein at a temperature of 60 ° C or more and less than 100 ° C, To regenerate degraded amyloid protein fibers.
본 발명의 일 양태에서, 단량체 단백질(monomeric protein)을 0.1 wt% 이상 첨가할 수 있다.In one embodiment of the present invention, 0.1 wt% or more of a monomeric protein may be added.
본 발명의 일 양태에서, 단량체 단백질(monomeric protein)을 1 wt% 이상 첨가할 수 있다.In one embodiment of the present invention, monomeric protein may be added in an amount of 1 wt% or more.
본 발명의 일 양태에서, 상기 재성장된 아밀로이드 단백질 섬유의 표면 전위 밀도값은 초음파 처리에 의해 분해되기 전의 아밀로이드 단백질 섬유의 표면 전위(surface potential) 밀도값의 0.6 내지 1.4배의 범위 내에 존재하는 것일 수 있다.
In one embodiment of the present invention, the surface dislocation density value of the regrown amyloid protein fiber may be in the range of 0.6 to 1.4 times the surface potential density value of the amyloid protein fiber before being degraded by ultrasonic treatment have.
본 발명에서 아밀로이드 단백질 섬유란 아밀로이드 섬유를 의미하고, 아밀로이드 유사 섬유는 아밀로이드 섬유와 비슷한 특성을 나타내는 아밀로이드 섬유를 의미한다.
In the present invention, the amyloid protein fiber means amyloid fiber, and the amyloid-like fiber means amyloid fiber showing properties similar to amyloid fiber.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1. 아밀로이드 섬유 합성Example 1. Amyloid fiber synthesis
아밀로이드 섬유의 분해 및 재성장 성향을 확인하기 위하여 베타 락토글로불린(β-lactoglobulin) 아밀로이드 유사 섬유를 합성 하였다. 베타 락토글로불린 단백질 파우더(Sigma Aldrich (USA))를 pH 2의 강한 산성 용액에 녹인 후 원심분리기에 20,000 rpm으로 약 15분간 원심 분리하였다. 원심분리한 용액에서 상층액 부분만 얻어 필터에 필터링을 하여 용액을 수득하였다. 상기 필터링한 용액을 밀봉한 후 오일 배스(oil bath)에서 90 ℃ 온도로 10시간 동안 열을 인가한 다음 3분 동안 얼음물에 식혀 다양한 형상의 베타 락토글로불린 아밀로이드 유사 섬유를 합성하였다.
Β-lactoglobulin amyloid-like fibers were synthesized to confirm the degradation and regrowth of amyloid fibers. Beta-lactoglobulin protein powder (Sigma Aldrich, USA) was dissolved in a strong acidic solution at
실시예 2. 합성된 아밀로이드 섬유를 초음파 처리로 분해하는 방법Example 2. Method for decomposing synthesized amyloid fiber by ultrasonic treatment
상기 실시예1에서 합성한 베타 락토글로불린(β-lactoglobulin) 섬유 용액을 초음파 장비(ultrasonicator, bath type, 40 kHz transducer, 200 W)에 넣어 시간에 따라 꺼내어 일정한 길이의 베타 락토글로불린 섬유 조각으로 분해하였다. 초음파가 조사되는 시간은 30, 60, 180, 360, 1200 분으로 이때 베타 락토글로불린 섬유 용액에 인가된 초음파는 40 kHz에 200 W였다.
The β-lactoglobulin fiber solution synthesized in Example 1 was put into an ultrasonic device (ultrasonic bath type, 40 kHz transducer, 200 W), taken out over time, and decomposed into beta-lactoglobulin fiber pieces of a certain length . The ultrasonic irradiation time was 30, 60, 180, 360, and 1200 minutes. Ultrasonic waves applied to the beta-lactoglobulin fiber solution were 200 W at 40 kHz.
실시예 3. 초음파가 조사되는 시간에 따라 잘려진 베타 락토글로불린 섬유에 대한 AFM 분석Example 3. AFM analysis of beta-lactoglobulin fibers cut at the time of irradiation with ultrasound
실시예2에서 초음파가 조사되는 시간에 따라 잘려진 베타 락토글로불린 섬유를 원자힘현미경(Atomic force microscopy, AFM, Multimode V, Veeco, (USA))으로 이미징하고 이미지 프로그램(i-Solution DT, IMT i-solution, (Canada))을 이용하여 길이를 측정한 결과 30분 동안 초음파를 조사 했을 때 536.7 ± 331.0 nm, 60분 동안 조사 시 499.6 ± 496.7 nm, 180분 동안 조사 시 195.6 ± 129.5 nm, 360분 조사 시 125.5 ± 79.4 nm의 1200분 조사 시 44.8 ± 28.5 nm의 평균 길이를 갖는 섬유 조각으로 각각 분해되었음을 확인하였다(도 1(g)). 단백질 섬유 용액에 가해진 초음파 조사 시간이 길어질수록 평균적으로 더 짧고 더 균일한 형상의 섬유 조각으로 절단되며 초음파 조사 시간을 조절함에 따라 각각의 다른 길이의 섬유 조각으로 분해될 수 있다는 것을 확인하였다(도 1).In Example 2, the cut beta-lactoglobulin fibers were imaged with an atomic force microscope (AFM, Multimode V, Veeco, USA) according to the time of irradiation with ultrasound and imaged with i-Solution DT, IMT i- (Canada)), the results were as follows: 536.7 ± 331.0 nm for 30 minutes, 499.6 ± 496.7 nm for 60 minutes, 195.6 ± 129.5 nm for 180 minutes, 360 minutes for 360 minutes (Fig. 1 (g)). The results are shown in Fig. 1 (g). It was confirmed that as the irradiation time of the ultrasonic wave applied to the protein fiber solution became longer, it was cut into shorter and more uniform shaped fiber pieces on average and decomposed into different lengths of fiber fragments by controlling the irradiation time of the ultrasonic waves ).
한편 베타 락토글로불린 섬유의 직경은 초음파 조사 유무 및 조사 시간에 관계없이 평균적으로 약 2 nm로 일정하게 유지되었다. 따라서 초음파의 영향력이 지름 방향 보다 축 방향으로 이루어진다는 것을 알 수 있었으며 이는 축 방향 보다 지름 방향에서 쌓여진 베타 병풍구조(β-pleated sheet)가 구조적으로 더 안정한 것에 기인한 것으로 사료된다.
On the other hand, the diameter of β-lactoglobulin fiber was kept constant at about 2 nm on average regardless of the presence of ultrasonic irradiation and irradiation time. Therefore, it can be seen that the influence of ultrasonic waves is axial rather than radial, which is attributed to the fact that the β-pleated sheet piled up in the axial direction is more structurally stable.
실시예 4. 초음파가 조사되는 시간에 따라 잘려진 베타 락토글로불린 섬유의 ThT를 이용한 형광분석Example 4. Fluorescence analysis of beta-lactoglobulin fibers cut with time of ultrasound irradiation using ThT
실시예2에서 초음파가 조사되는 시간에 따라 잘려진 각각의 베타 락토글로불린 섬유 용액 30 ㎕에 60 μM ThT 3 mL를 가한 혼합물을 가볍게 흔든 후 형광 분광광도계((LS 55, Perkin Elmer, (USA))를 이용하여 500 nm/min 스캔속도로 맞춰 430 nm ~ 560 nm에서 측정하였다.The fluorescence spectrophotometer (LS 55, Perkin Elmer, USA) was added to 30 μl of each of the cut-off beta-lactoglobulin fiber solutions obtained in Example 2 with 3 ml of 60 μM ThT added thereto, Using a scanning electron microscope at a scanning speed of 500 nm / min.
그 결과 ThT를 갖는 베타 락토글로불린 섬유는 약 490 nm의 특정 파장을 가지며, 초음파 처리 시간이 긴 베타 락토글로불린 섬유일수록 형광 강도가 높은 것으로 나타났다(도 2). ThT는 섬유 말단에 결합하기 때문에 형광 강도가 높다는 것은 섬유 말단이 많이 존재한다, 즉 잘려진 섬유의 분절 수가 많다는 의미이므로 상기와 같은 결과는 베타 락토글로불린 섬유가 초음파에 노출되는 시간이 길수록 더 짧은 길이의 조각으로 더 강하게 분해되고 그 결과 잘려진 섬유 조각의 수가 증가하여 섬유의 말단이 증가했다는 것을 의미한다.As a result, the beta-lactoglobulin fiber having ThT had a specific wavelength of about 490 nm, and the beta-lactoglobulin fiber having a longer ultrasonic treatment time had a higher fluorescence intensity (FIG. 2). Since ThT binds to the end of the fiber, high fluorescence intensity means that there are many fiber ends, that is, a large number of segments of the cut fiber. Thus, the above results show that the longer the time of exposure of the beta lactoglobulin fiber to the ultrasonic waves, Which means that the fibers are more strongly degraded into pieces and as a result, the number of cut pieces of fibers increases and the ends of the fibers increase.
또한 아밀로이드 섬유를 함유하는 용액의 형광 강도는 가해지는 열 에너지가 증가할수록 낮아지고 이는 베타 병풍 구조의 분해에 기인한 것으로 알려져 있으나 본 발명은 이와는 반대로 초음파 처리 시간이 길어질수록 즉 초음파 에너지가 커질수록 형광 강도는 증가했기 때문에 초음파의 처리가 아밀로이드 섬유의 풀림이나 베타 병풍 구조를 분해하는 것은 아니라는 것을 확인하였다.
Also, the fluorescence intensity of the solution containing amyloid fibers is lowered as the applied heat energy is increased, which is known to be caused by decomposition of the beta screen structure. However, contrary to this, in the present invention, as the ultrasonic treatment time becomes longer, It was confirmed that the treatment of the ultrasonic wave did not break down the amyloid fiber and decompose the beta screen structure.
실시예 5. 초음파 처리에 의해 분해된 아밀로이드 섬유를 재성장 시키는 방법Example 5. Method for regrowth of amyloid fibers degraded by ultrasonic treatment
pH 2 HCl에 0, 0.01, 0.1 중량%로 용해된 단량체 단백질 용액을 각각 초음파 처리에 의해 분해된 섬유 용액과 1:1 부피 비로 혼합한 다음 각각의 혼합물 8 mL를 10시간 동안 90 ℃에서 가열하여 재성장을 유도하였다.
The monomer protein solution dissolved at 0, 0.01, and 0.1 wt% in
실시예 6. 초음파 처리에 의해 분해된 아밀로이드 섬유를 재성장 메커니즘 확인 Example 6. Determination of Regrowth Mechanism of Amyloid Fibers Degraded by Ultrasonic Treatment
실시예5에서 초음파 처리에 의해 분해된 베타 락토글로불린 아밀로이드 유사 섬유의 재생이 분절된 섬유로부터 형성된 것인지 첨가된 단량체 단백질로부터 형성된 것인지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.The following experiment was conducted to confirm whether the regeneration of beta-lactoglobulin amyloid-like fiber degraded by ultrasound treatment in Example 5 was formed from the segmented fibers or from the added monomer protein.
용액 A는 베타 락토글로불린 아밀로이드 유사 섬유 섬유에 6시간 동안의 초음파를 조사하여 분절된 베타 락토글로불린 아밀로이드 유사 섬유 포함하는 pH 2 용액과 pH 2에 1 중량%으로 용해된 정제된 단량체 단백질 용액을 1:1로 혼합하여 준비하였다. 용액 B는 분절된 베타 락토글로불린 아밀로이드 유사 섬유를 포함하지 않는 pH 2 용액과 pH 2에 1 중량%으로 용해된 정제된 단량체 단백질 용액을 1:1로 혼합하여 준비하였다. 상기 두 용액 모두 10시간 동안 90 ℃에서 가열하여 재성장을 유도하였다. 재성장 과정 후 용액 A 및 B에 대한 ThT 분석과 AFM을 이용해 분석 결과, 용액 A의 형광 강도는 시간에 따라 급격히 높아지는 반면 용액 B의 형광 강도는 낮은 상태로 유지되는 것으로 나타났다(도 6). 따라서 본 발명 따라 유도한 초음파 처리에 의해 분해된 베타 락토글로불린 아밀로이드 유사 섬유의 재성장이 단량체 단백질이 아닌 분해된 아밀로이드 유사 섬유를 주형으로 이루어진다는 것을 확인하였다.
Solution A was prepared by dissolving a solution of
실시예 7. 첨가되는 단량체 단백질 함량에 따라 재성장된 베타 락토글로불린 섬유에 대한 AFM 분석 및 ThT를 이용한 형광 분석Example 7. AFM analysis of re-grown beta-lactoglobulin fiber and fluorescence analysis using ThT according to the monomer protein content added
실시예5에서 첨가되는 단량체 단백질의 함량에 따라 재성장된 베타 락토글로불린 섬유를 원자힘현미경(Atomic force microscopy, AFM, Multimode V, Veeco, (USA))으로 이미징하고 각각을 이미지 프로그램(i-Solution DT, IMT i-solution, (Canada))을 이용하여 길이를 측정하였다.Re-grown beta-lactoglobulin fibers were imaged with an atomic force microscope (AFM, Multimode V, Veeco, USA) according to the content of the monomer protein added in Example 5, , IMT i-solution, (Canada)).
그 결과 단량체 단백질을 첨가하지 않은 군과 0.01 중량%의 단량체 단백질을 첨가한 군에서는 거의 재성장이 일어나지 않은 반면 1 중량%의 단량체 단백질을 첨가한 군에서는 길고 성숙한 아밀로이드 섬유로 재성장 이루어졌다는 것을 확인하였다. 또한 재성장한 섬유의 길이는 130 nm에서1.2 μm로 다양한 반면 직경의 경우 평균값이 2.65 ± 0.66 nm로 차이가 거의 없었으며 상기 직경 평균값은 초음파 처리에 의해 분해되기 전 섬유의 평균 직경 값과 약 1.5 배의 차이로 큰 차이를 나타내지 않았다(도 3). 이와 같은 결과는 초음파에 의한 분해 성향과 마찬가로 재성장 역시 축 방향으로 이루어진다는 것을 뒷받침 한다. As a result, it was confirmed that regrowth did not occur in the group to which the monomer protein was added and the group to which 0.01 wt% of the monomer protein was added, whereas the group to which 1 wt% of the monomer protein was added regrowed as the long and mature amyloid fiber. Also, the length of regrowth fibers varied from 130 nm to 1.2 μm, while the mean value of diameters was not significantly different (2.65 ± 0.66 nm), and the diameter average value was about 1.5 times the average diameter value of the fibers before they were degraded by ultrasonic treatment (Fig. 3). These results support that the regrowth also occurs in the axial direction as well as the decomposition tendency by the ultrasonic waves.
한편 상당 부분의 분해된 섬유가 재성장에 참여하지 않은 채 재성장 과정 후 새로 재성장한 섬유와 공존하는 것으로 확인되었으며 이는 초음파에 의해 분해된 섬유의 상당 부분은 초음파 처리에 의해 형태적으로 복구 불가능하게 손상되어 재생능력을 완전히 상실한데 기인한 것으로 사료된다.
On the other hand, it was found that a considerable part of the degraded fiber coexisted with newly regrowthed fibers after regrowth without participating in regrowth, and a considerable part of the fibers decomposed by ultrasonic waves were morphologically irreparably damaged by ultrasonic treatment It is believed that this is due to the complete loss of regenerative capacity.
실시예 8. 재성장된 베타 락토글로불린 섬유와 초음파에 의해 분해되기 전 베타 락토글로불린 섬유에 대한 KPFM 분석Example 8. KPFM assay for regenerated beta-lactoglobulin fiber and beta-lactoglobulin fiber prior to sonication
실리콘 기판에서 초음파에 의한 분해 후 상기 실시예5의 방법으로 1 중량%의 단량체 단백질을 첨가하여 재성장된 베타 락토글로불린 섬유와 초음파에 의해 분해되기 전 베타 락토글로불린 섬유에 대한 켈빈 탐침력 현미경(Kelvin probe force microscopy,KPFM) 분석을 실행하였다. KPFM 이미징은 실온에서 5 nm 높이의 리프트 모드를 사용하여 위상 및 표면 전위 이미지를 확인하였다.After decomposition by ultrasound in a silicon substrate, 1% by weight of monomer protein was added by the method of Example 5, and the regenerated beta-lactoglobulin fiber and a Kelvin probe for beta-lactoglobulin fiber before decomposition by ultrasonic force microscopy, KPFM) analysis. KPFM imaging confirmed phase and surface potential images using a 5 nm height lift mode at room temperature.
그 결과 초음파에 의해 분해되기 전 베타 락토글로불린 섬유의 직경은 1.76 ± 0.54 nm, 표면 전위는 11.38 ± 6.87 mV로 측정되었으며, 초음파 처리 후 재성장된 베타 락토글로불린 섬유의 직경은 2.65 ± 0.66 nm, 표면 전위는 16.76 ± 6.6 mV로 측정되었다(도 5). 초음파에 의해 분해되기 전 베타 락토글로불린 섬유와 초음파 처리 후 재성장된 베타 락토글로불린 섬유의 직경의 표면 전위 밀도(표면 전위(surface potential) 밀도 = 표면 전위(surface potential) / 섬유의 직경)는 각각 약 6.46 mV·nm-1 및 6.32 mV·nm-1로 매우 유사한 것으로 나타났다. 따라서 섬유의 직경과 표면 전위는 재성장으로 약간 커졌음에도 불구하고 초음파에 의해 분해되기 전 베타 락토글로불린 섬유와 초음파 처리 후 재성장된 베타 락토글로불린 섬유의 패킹 밀도(packing density)는 매우 유사한 것으로 확인되었으므로 위상학적 특성상에 약간의 변화가 있을지라도 두 섬유의 전기적 성질이 유사하다는 것을 확인하였다.As a result, the diameter of β-lactoglobulin fiber was 1.76 ± 0.54 nm and the surface potential was 11.38 ± 6.87 mV before ultrasonication. The diameter of regrowed β-lactoglobulin fiber after ultrasonication was 2.65 ± 0.66 nm, Was measured as 16.76 +/- 6.6 mV (Figure 5). The surface dislocation density (surface potential density = surface potential / fiber diameter) of the beta-lactoglobulin fiber and the beta-lactoglobulin fiber regrowth after ultrasonication before degradation by ultrasound is about 6.46 mV · nm -1 and 6.32 mV · nm -1 , respectively. Therefore, although the diameter and the surface potential of the fibers were slightly increased due to regrowth, the packing density of the beta-lactoglobulin fiber and the beta-lactoglobulin fiber regenerated after ultrasonication were found to be very similar The electrical properties of the two fibers are similar even though there is a slight change in the properties of the fibers.
Claims (13)
2) 0.01 wt%를 초과하는 양의 아밀로이드 단량체 단백질(monomeric protein)을 첨가하여 60℃ 이상 100℃ 미만의 온도로 가열함으로써 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장(regrowth)시키는 단계를 포함하는 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
1) irradiating an amyloid protein fiber with an ultrasonic wave of 20 to 60 kHz to decompose the amyloid protein in an axial direction;
2) adding amyloid monomeric protein in an amount greater than 0.01 wt% and regrowing the amyloid protein fiber by heating to a temperature of greater than or equal to 60 ° C and less than 100 ° C; A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information on the properties of the fibers.
초음파는 30 내지 50 kHz로 조사되는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information on the characteristics of amyloid protein fibers associated with degenerative diseases, characterized in that the ultrasound is irradiated at 30 to 50 kHz.
초음파는 35 내지 45 kHz로 조사되는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information about the characteristics of amyloid protein fibers associated with degenerative diseases, characterized in that the ultrasound is irradiated at 35 to 45 kHz.
아밀로이드 단백질은 β-아밀로이드 또는 β-락토글로불린인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information about the characteristics of amyloid protein fibers associated with a degenerative disease, characterized in that the amyloid protein is? -Amyloid or? -Lactoglobulin.
초음파를 30분 이상 조사하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information on the characteristics of amyloid protein fibers associated with degenerative diseases, characterized in that the ultrasound is irradiated for at least 30 minutes.
초음파를 1,200분 이하 조사하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information on the characteristics of amyloid protein fibers associated with degenerative diseases, characterized by irradiating ultrasonic waves for up to 1,200 minutes.
초음파를 30분 이상 180분 이하 조사하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information on the characteristics of amyloid protein fibers associated with degenerative diseases, characterized in that the ultrasound is irradiated for 30 minutes to 180 minutes.
아밀로이드 단백질은 지름(radial) 방향으로는 분해되지 않는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information on the characteristics of amyloid protein fibers associated with a degenerative disease, characterized in that the amyloid protein is not degraded in the radial direction.
아밀로이드 단백질은, 아밀로이드증, 치매, 알츠하이머병, 전신성 아밀로이드병, 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증 및 덧치(Dutch)형 아밀로이드증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 갖는 개체에 존재하는 단백질인 것을 특징으로 하는 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
The amyloid protein is a protein present in an individual having any one selected from the group consisting of amyloidosis, dementia, Alzheimer's disease, systemic amyloid disease, Down's syndrome, amyloid angiopathy, cerebral amyloid angiopathy and Dutch amyloidosis A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information about the characteristics of amyloid protein fibers associated with a degenerative disease.
단량체 단백질(monomeric protein)을 0.1 wt% 이상 첨가하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information on the characteristics of amyloid protein fibers associated with a degenerative disease, characterized in that at least 0.1 wt% of a monomeric protein is added.
단량체 단백질(monomeric protein)을 1 wt% 이상 첨가하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법.
The method according to claim 1,
A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information on the characteristics of amyloid protein fibers associated with a degenerative disease, characterized by adding at least 1 wt% of a monomeric protein.
상기 재성장된 아밀로이드 단백질 섬유의 표면 전위(surface potential) 밀도값은 초음파 처리에 의해 분해되기 전의 아밀로이드 단백질 섬유의 표면 전위(surface potential) 밀도값의 0.6 내지 1.4배의 범위 내에 존재하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 단백질 섬유의 특성의 정보를 제공하기 위한 분해된 아밀로이드 단백질 섬유를 재성장 시키는 방법. The method according to claim 1,
Wherein the surface potential density value of the regrown amyloid protein fibers is in the range of 0.6 to 1.4 times the surface potential density value of the amyloid protein fibers prior to degradation by ultrasonic treatment. A method of regenerating degraded amyloid protein fibers to provide information about the characteristics of amyloid protein fibers associated with degenerative diseases.
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| Acceleration of the depolymerization of amyloid β fibrils, Biochimica et Biophysica Acta 1834 (2013) 2480-2485* |
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