KR101662397B1

KR101662397B1 - Control of protein degradation by n-terminal methionine

Info

Publication number: KR101662397B1
Application number: KR1020140137805A
Authority: KR
Inventors: 황철상; 김정목
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2014-10-13
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2016-10-04
Also published as: KR20160043429A

Abstract

본 발명은 단백질의 합성 개시 신호인 메티오닌 다음에 소수성 잔기가 위치하는 Met-Φ 단백질이 N-말단 아세틸화 여부에 따라 두 N-말단 규칙 경로를 선택적으로 이용해 분해될 수 있음에 대한 것으로서, 구체적으로는, N-말단 메티오닌 다음에 긴 곁사슬의 소수성 아미노산인 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판이 위치하는 Met-Φ 단백질의 경우 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙경로를 선택적으로 이용하며, N-말단의 메티오닌 다음 위치에 소수성이 아니며 양전하를 띈 염기성 아미노산인 라이신 등의 잔기가 위치할 경우 상기 두 N-말단 규칙 경로 모두에 의해 분해되지 않음을 규명하고, 이를 이용하여 단백질 분해를 조절하는 방법 등을 제공하는 기술에 관한 것이다. 세포 내에서 단백질 분해의 이상은 각종 암을 비롯하여, 감염, 면역질환, 퇴행성 신경질환, 노화 등으로 이어질 수 있는 기저 원인으로서, 본 발명은 이와 같은 여러 질병들의 기저 원인을 검색하는 한 방법으로 Met-Φ 단백질군의 분해 양상 분석 및 해석 기술을 제공할 수 있고, 이러한 기술은 역으로 해당 질병들의 치료제 제작 및 검색의 정량적 분석으로 응용될 수 있다. 또한, 유전체 돌연변이에 의한 질병들에서, 해당 유전자의 돌연변이로 인한 Met-Φ 단백질군의 생성 여부를 통해 기저 원인의 기본적 탐색법으로 이용될 수 있고, 단백질 분해 양상 분석으로 해당 돌연변이의 세포 내 실제적 영향에 대한 분석의 근간으로 이용될 수 있다. 호르몬 제제와 같은 단백질의 대량 생산에 있어서도, 메티오닌 다음에 소수성이 아니며 양전하를 띈 염기성 아미노산인 라이신 등의 잔기가 위치해 두 N-말단 경로 모두에 의해 분해되지 않는 단백질을 이용하여 현저한 생산량 증가와 비용 절감을 가져올 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to the fact that a Met-Φ protein in which a hydrophobic residue is located after methionine as a signal for synthesizing a protein can be selectively degraded using two N-terminal conformational pathways depending on whether it is N-terminal acetylation, specifically In the case of the Met-Φ protein in which the hydrophobic amino acid of the long side chain, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, or tryptophan, is located next to the N-terminal methionine, the arginyl N-terminal regulatory pathway and the acetylated N- Terminal end of the N-terminal methionine. When a residue such as a lysine, which is a non-hydrophobic and positively charged basic amino acid, is located at the position following the N-terminal methionine, A method for controlling protein degradation, and the like. The present invention relates to a method for detecting the underlying cause of diseases such as cancer, metastasis, immune diseases, degenerative neurological diseases, and the like. The analysis of degradation patterns and analysis techniques of the Φ protein group can be provided, and this technology can be applied as a quantitative analysis of the production and retrieval of therapeutic agents for the diseases. In addition, in the diseases caused by genetic mutation, it can be used as a basic search method of the underlying cause through the generation of the Met-Φ protein group due to the mutation of the corresponding gene, Can be used as the basis of the analysis. In the mass production of proteins such as hormone preparations, methionine is followed by a non-hydrophobic, positively charged basic amino acid residues such as lysine, which are not degraded by both the N-terminal pathway, resulting in remarkable production increase and cost reduction It is possible to obtain the effect.

Description

[0001] CONTROL OF PROTEIN DEGRADATION BY N-TERMINAL METHIONINE [0002]

본 발명은 N-말단 메티오닌 다음으로 위치하는 두 번째 서열의 아미노산에 의해 조절되는 단백질 분해 등에 관한 것이다.
The present invention relates to protein degradation regulated by the amino acid of the second sequence located next to the N-terminal methionine.

생명현상을 유지하기 위한 거의 모든 일들을 담당하는 단백질은 우리 몸에 있는 세포 하나당 약 만 여종, 백억 개 정도가 있다. 세포 내 단백질들은 끊임없이 혹은 필요에 따라 분해되는데, 어떤 단백질들은 굉장히 빨리 몇 분 안에 분해되는 반면, 다른 단백질들은 몇 달 동안 분해되지 않고 안정한 상태로 존재한다. 세포 내 단백질 분해는 주로 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해서 일어난다. 유비퀴틴은 효모에서 휴먼까지 진화적으로 보존된 76개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질로, 수명이 다한 기질 단백질들에 유비퀴틸화 반응을 통해서 공유결합으로 부착된다. 단백질 유비퀴틸화는 유비퀴틴 활성화효소 (E1), 유비퀴틴 결합효소 (E2), 그리고 유비퀴틴 리가아제 (E3)의 일련의 연속적인 반응을 통해 일어나는데, 이 유비퀴틸화 과정이 반복되면 폴리유비퀴틸화된 기질 단백질들이 만들어진다. 이때 생성된 폴리유비퀴틸화된 기질들은 26S 프로테아좀이라는 거대 단백질 복합체에 의해서 선택적으로 분해된다.There are about 10 million proteins per cell in our body, accounting for nearly all the things that keep life phenomena. Intracellular proteins are constantly or degraded as needed. Some proteins degrade very quickly in a few minutes, while others remain stable for several months. Intracellular proteolysis occurs mainly by the ubiquitin-proteasome system. Ubiquitin is a small protein consisting of 76 amino acids that is evolutionarily conserved from yeast to human. It is attached to covalent bonds through ubiquitilization reactions to end - of - life substrate proteins. Protein ubiquitilization occurs through a series of successive reactions of ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin-binding enzyme (E2), and ubiquitin ligase (E3). When this ubiquitination process is repeated, the polyubiquitinated substrate Proteins are made. The resulting polyubiquitinated substrates are selectively degraded by a large protein complex called 26S proteasome.

N-말단 규칙 경로 (N-end rule pathway)는 유비퀴틴-프로테아좀 단백질 분해 시스템의 일종으로, 진핵생물에서 불안정화시키는 (destabilizing) N-말단 아미노산 잔기들을 지닌 단백질들을 N-레코그닌 (N-recognin)이라는 E3 유비퀴틴 리가아제가 특이적으로 인식해서 폴리유비퀴틸화시킴으로써 프로테아좀에 의한 단백질 분해를 매개한다. The N-end rule pathway is a type of ubiquitin-proteasome proteolytic system in which proteins with N-terminal amino acid residues destabilizing in eukaryotes are called N-recognin ) E3 ubiquitin ligase is specifically recognized and polyubiquitilized to mediate proteolysis by proteasome.

진핵생물의 N-말단 규칙 경로는 비아세틸화된 N-말단 잔기를 특이적으로 인지하는 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 (Arg/N-end rule pathway)와 아세틸화된 N-말단을 특이적으로 인식하는 아세틸화 N-말단 규칙 경로 (Ac/N-end rule pathway)로 구성되어 있다. 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 경우, 단백질의 N-말단에 아르기닌, 라이신, 히스티딘과 같은 양전하를 띄고 있는 염기성 아미노산들이나 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 이소류신 같은 곁가지 (side chain) 크기가 큰 소수성 아미노산 잔기들이 존재할 때, N-레코그닌이며 E3 유비퀴틴 리가아제인 Ubr1 등이 불안정화시키는 N-말단 잔기들을 특이적으로 인식하여 폴리유비퀴틸화시킨 후 프로테아좀에 의한 단백질 분해를 유도한다. 또한, N-말단 잔기가 아스파라진이나 글루타민인 경우, N-말단 아미다아제 (N-terminal amidase)에 의해 N-말단 탈아미드화 (N-terminal deamidation)를 거쳐 각각 아스팔산과 글루탐산으로 변환되고, 이 N-말단 아스팔산과 글루탐산, 그리고 산화된 시스테인은 아르기닌 트랜스퍼라아제 (Arginyltransferase)에 의해 N-말단 아르기닐화 (N-terminal arginylation)된다. 그 결과 생성된 N-말단 아르기닐화된 기질들을 N-레코그닌들이 인식하여 폴리유비퀴틸화에 의한 단백질 분해를 매개한다. 아르기닐화 N-말단 규칙 경로에 의한 단백질의 분해는 비정상 단백질 제거, 산화질소와 산소의 감지, 세포사멸 (apoptosis) 및 신경퇴행 (neurodegeneration)의 억제, 염색체 수리, 전사, 복제, 결합 및 분리 조절뿐만 아니라, G-단백질 (G-proteins), 자식작용 (autophagy), 펩타이드 유입, 감수분열, 면역, 지방대사, 세포이동, 액틴 필라멘트, 심혈관 발달, 정자형성, 신경조직 발생, 기억력 조절과 식물체의 환경에 대한 적응 및 분화 등 세포 내 다양한 현상과 직·간접적으로 관여하고 있다. The N-terminal conformation pathway of eukaryotes is an Arg-N-end rule pathway (Arg / N-end rule pathway) that specifically recognizes non-acetylated N-terminal residues and an acetylated N- (Ac / N-end rule pathway). In the case of the arginylated N-terminal regulatory pathway, basic amino acids having a positive charge such as arginine, lysine and histidine at the N-terminus of the protein, hydrophobic amino acids such as leucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan and isoleucine, In the presence of amino acid residues, Ubr1, which is N-lectinine and E3 ubiquitin ligase, specifically recognizes N-terminal residues that are destabilized and induces proteolysis by proteasome after polyubiquitination. When the N-terminal residue is asparagine or glutamine, it is converted into aspartic acid and glutamic acid via N-terminal deamidation with an N-terminal amidase, respectively , The N-terminal aspartic acid and glutamic acid, and the oxidized cysteine are N-terminal arginylated by arginyltransferase. The resulting N-terminal arginylated substrates are recognized by N-reptenines and mediate proteolysis by polyubiquitination. The degradation of proteins by the arginylated N-terminal conformation pathway leads to the removal of abnormal proteins, the detection of nitric oxide and oxygen, the inhibition of apoptosis and neurodegeneration, chromosome repair, transcription, replication, In addition, G-proteins, autophagy, peptide entry, meiosis, immunity, fat metabolism, cell migration, actin filament, cardiovascular development, spermatogenesis, neurogenesis, And is involved directly or indirectly with various phenomena within the cell such as adaptation and differentiation to the environment.

한편, 아세틸화 N-말단 규칙 경로는 Ac/N-레코그닌이 기질 단백질의 N-말단 아세틸화 (N-terminal acetylation)된 잔기를 N-말단 분해신호 (N-degron)로 인식한다. 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와의 구분을 위해, N-말단 분해신호를 Ac/N-말단 분해신호 (Ac/N-degron), N-레코그닌인 Doa10와 Not4 등과 같은 E3-유비퀴틴 리가아제를 Ac/N-레코그닌 (Ac/N-recognin)이라 칭한다.On the other hand, the acetylated N-terminal conformational pathway recognizes the N-terminal acetylated residue of the substrate protein as Ac-N-reductin as an N-degron signal. End cleavage signal is divided into Ac / N-terminal decomposition signal (Ac / N-degron), E3-ubiquitin ligase such as Doa10 and Not4 which are N- Quot; Ac / N-recognin ".

N-말단 아세틸화는, 단백질 내부에 있는 라이신 잔기의 아세틸화/비아세틸화 (acetylation/deacetylation)와 달리, 주로 리보솜에 결합되어 있는 N-말단 아세틸라아제에 의해 단백질 합성과 동시에 일어나는 비가역적 반응이며, 이는 N-말단 아세틸화에 의해 단백질의 수명이 합성과 동시에 정해짐을 의미한다. 실제로, 휴먼 단백질의 약 90%가 N-말단 아세틸화가 일어나는 것으로 알려져 있어, 아세틸화 N-말단 규칙 경로에 의한 단백질 분해의 중요성은 더욱 부각되고 있다.N-terminal acetylation, unlike acetylation / deacetylation of lysine residues within proteins, is a nonreversible reaction that occurs simultaneously with protein synthesis by N-terminal acetylases that are primarily bound to ribosomes , Which means that the lifetime of the protein is determined at the same time as the synthesis by N-terminal acetylation. In fact, it is known that about 90% of the human proteins are N-terminal acetylated, and the importance of protein degradation by the acetylated N-terminal conformation pathway is becoming more important.

실제 세포 내에서 상당수의 단백질들은 부분적으로 N-말단 아세틸화 되어 있는 상태, 즉 N-말단 아세틸화 단백질과 비아세틸화 단백질이 혼재해 있는 상태로 존재한다. 이는 N-말단 아세틸화가 일어나는 것으로 알려진 단백질들의 분해가 더욱 복잡한 조절을 통해 일어날 가능성을 제기하지만, 이에 대한 구체적인 연구는 이루어지지 않았다. 또한, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로는 칼페인 (calpain), 카스파제 (caspase), 세크레타아제 (secretase) 등의 프로테아제에 의한 기질 단백질의 절단 및 N-말단 분해 신호의 노출이 전제되어 있기 때문에, 상당히 한정된 수의 기질들만이 아르기닐화 N-말단 규칙 경로로 분해된다.Many of the proteins in actual cells are partially N-terminally acetylated, that is, N-terminal acetylated proteins and non-acetylated proteins are present in a mixed state. This raises the possibility that degradation of proteins known to occur at the N-terminal acetylation occurs through more complex regulation, but no specific studies have been conducted. In addition, the arginyl N-terminal conformation pathway is presumed to be a cleavage of the substrate protein by a protease such as calpain, caspase, secretase or the like and exposure of the N-terminal decomposition signal Thus, only a fairly limited number of substrates are degraded into arginylated N-terminal conformational pathways.

세포 내 모든 단백질은, 리보솜이 mRNA의 AUG를 개시코돈으로 인지하여, 메티오닌을 첫 번째 잔기로 가지며 합성된다. 단백질의 두 번째 잔기가 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 발린과 같이 충분히 작을 경우, 메티오닌 아미노펩티다아제 (Methionine aminopeptidase)에 의해 단백질의 첫 번째 잔기인 메티오닌이 제거된다. 두 번째 잔기가 발린보다 큰 류신, 페닐알라닌, 히스티딘, 라이신과 같은 아미노산이 존재 할 경우 메티오닌 아미노펩티다아제들이 N-말단 메티오닌을 자르지 못하기 때문에 N-말단 메티오닌을 가진 단백질들이 만들어 진다. 또한 이미 합성된 단백질들의 경우에도 세포 내에 존재하는 케스파제 (caspase)나 칼페인 (calpain) 등과 같은 다양한 엔도펩티다아제 (endopeptidase) 등에 의해 분해되어 다양한 N-말단을 가진 단백질들이 만들어진다.All proteins in the cell are synthesized with the ribosome recognizing the AUG of the mRNA as the initiation codon, with methionine as the first residue. When the second residue of the protein is small enough, such as glycine, alanine, serine, threonine, cysteine, proline and valine, the first residue of the protein, methionine, is removed by methionine aminopeptidase. Proteins with N-terminal methionine are produced when methionine aminopeptidases do not cleave N-terminal methionine when amino acids such as leucine, phenylalanine, histidine, and lysine are present in the second residue greater than valine. Also, in the case of already synthesized proteins, various N-terminal proteins are produced by decomposition by various endopeptidases such as caspase or calpain present in the cells.

N-말단 메티오닌뿐만 아니라 N-말단 프롤린을 제외한 N-말단의 알라닌, 세린, 트레오닌, 발린 등은 N-말단 아세틸라아제에 의해 N-말단 아세틸화된다. 세포 내에서 단백질의 N-말단 아세틸화는 부분적으로 일어날 수 있기 때문에, N-말단 아세틸화된 단백질과 비아세틸화된 단백질들이 세포 내에 혼재돼 있다. 특히, 단백질 합성 개시 신호인 메티오닌의 경우, N-말단 아세틸화되면 아세틸화/N-말단 규칙에 의해서 분해되지만, 아세틸화되지 않은 N-말단 메티오닌을 가진 단백질이 어떻게 분해되는 지에 대한 연구는 전무한 상태이다.
N-terminal alanine, serine, threonine, valine, etc., except N-terminal methionine and N-terminal proline, are N-terminally acetylated by N-terminal acetylase. Since N-terminal acetylation of proteins in cells can occur in part, N-terminal acetylated proteins and non-acetylated proteins are mixed in cells. In particular, in the case of methionine, which is a signal for initiating protein synthesis, there is no study on how a protein having N-terminal methionine decomposed without being acetylated is degraded by acetylation / N-terminal rule when N-terminal acetylation is performed .

이에 본 발명자들은 큰 곁사슬 (side-chain)을 가지는 소수성 (hydrophobic) 아미노산인 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 또는 이소류신이 단백질의 두 번째 잔기인 Met-Φ 단백질이 N-말단 아세틸화 여부에 따라 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 (Arg/N-end rule pathway) 또는 아세틸화 N-말단 규칙 경로 (Ac/N-end rule pathway)를 선택적으로 이용하여 분해되며, 이에 따라 단백질의 합성 개시 신호인 메티오닌이 단백질 분해신호 (Met^Φ/N degron 또는 Met^Φ/N-말단 분해신호)로 작용함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have found that Met-Φ protein, which is a hydrophobic amino acid having a large side chain and is a second residue of leucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or isoleucine protein, is a N-terminal acetylated N-end rule pathway or an acetylated N-end rule pathway is selectively used as a signal for initiating protein synthesis, (Met ^Φ / N degron or Met ^Φ / N terminal cleavage signal), thus completing the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 비아세틸화된 (unacetylated) N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치한 기질들을 인식하는 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 (Arg/N-end rule pathway)에 의해 분해되는 단백질들을 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide a method for producing a protein which is degraded by an arginyl N-end rule pathway (Arg / N-end rule pathway) which recognizes substrates with hydrophobic residues next to unacetylated N-terminal methionine .

본 발명의 다른 목적은 아세틸화된 (acetylated) N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 기질들을 인식하는 아세틸화 N-말단 규칙 경로 (Ac/N-end rule pathway)에 의해 분해되는 단백질들을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for the production of proteins which are degraded by an acetylated N-terminal rule pathway which recognizes substrates with hydrophobic residues following acetylated N-terminal methionine .

본 발명의 또 다른 목적은 N-말단의 메티오닌 다음에 소수성이 아닌 라이신 등과 같은 양전하를 띄는 염기성 아미노산 잔기가 위치됨으로써, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 (Arg/N-end rule pathway)와 아세틸화 N-말단 규칙 경로 (Ac/N-end rule pathway) 모두에 의해 분해되지 않는 안정화된 단백질들을 제공하는 것이다.It is a further object of the present invention to provide a method for the production of N-terminal N-terminal pathways and acetylated N-terminal pathways by placing a positively basic amino acid residue such as lysine, And to provide stabilized proteins that are not degraded by all of the Ac / N-end rule pathway.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질에 있어서, 비아세틸화된 또는 아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 경우 단백질이 분해됨을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.It is yet another object of the present invention to provide a method for predicting the degradation of a protein when a hydrophobic residue is located next to non-acetylated or acetylated N-terminal methionine in the protein.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질에 있어서, N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성이 아닌 라이신 등과 같은 양전하를 띄는 염기성 아미노산 잔기를 위치하는 경우 단백질의 분해가 저해됨을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.It is a further object of the present invention to provide a method for predicting the inhibition of protein degradation when a positively charged basic amino acid residue such as lysine which is not hydrophobic next to N-terminal methionine is located in the protein.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질에 있어서, 비아세틸화된 또는 아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기를 위치시킴으로써 단백질 분해를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.It is yet another object of the present invention to provide a method for inducing proteolysis in a protein by placing hydrophobic residues next to non-acetylated or acetylated N-terminal methionine.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질에 있어서, N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성이 아닌 라이신 등과 같은 양전하를 띄는 염기성 아미노산 잔기를 위치시킴으로써 단백질 분해를 저해하여 단백질 생산량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.It is a further object of the present invention to provide a method for increasing protein yield by inhibiting protein degradation by locating a positively charged basic amino acid residue such as lysine which is not hydrophobic next to N-terminal methionine in the protein.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 비아세틸화 (unacetylated)된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 것을 특징으로 하는, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 (Arg/N-end rule pathway)에 의해 분해되는 단백질을 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention as described above, the present invention provides an arginylated N-terminal conformational pathway (Arg / N-terminal) which is characterized in that a hydrophobic residue is located next to the unacetylated N-terminal methionine. N-end rule pathway).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소수성 잔기는 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 및 이소류신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the hydrophobic residue may be selected from the group consisting of leucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, and isoleucine.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 단백질은 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌 (N-recognin)인 Ubr1을 포함하는 E3 유비퀴틴 리가아제에 의해 폴리유비퀴틸화 되어 분해되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the protein may be one that is polyubiquitinated by E3 ubiquitin ligase, including Ubr1, which is N-recognin in the arginyl N-terminal conformation pathway have.

또한, 본 발명은 아세틸화 (acetylated)된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 것을 특징으로 하는, 아세틸화 N-말단 규칙 경로 (Ac/N-end rule pathway)에 의해 분해되는 단백질을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing a protein which is degraded by an acetylated N-terminal rule pathway, characterized in that a hydrophobic residue is located next to the acetylated N-terminal methionine. to provide.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 단백질은 N-말단 아세틸라아제에 의해 N-말단 아세틸화되거나, 또는 아세틸화 N-말단 규칙 경로의 Ac/N-레코그닌 (Ac/N-recognin)인 Doa10을 포함하는 E3 유비퀴틴 리가아제에 의해 폴리유비퀴틸화 되어 분해되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the protein is N-terminally acetylated by N-terminal acetylase or an Ac / N-recognin of the acetylated N-terminal conformation pathway Or by E3 ubiquitin ligase comprising Doa10.

또한, 본 발명은 N-말단의 메티오닌 다음에 위치하는 소수성 잔기가 아니며 양전하를 띄는 염기성 아미노산 잔기가 위치된 것을 특징으로 하는, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 (Arg/N-end rule pathway) 또는 아세틸화 N-말단 규칙 경로 (Ac/N-end rule pathway)에 의한 분해가 저해된 단백질을 제공하는 것이다.The present invention also relates to an arginyl N-end rule pathway or an arginylated N-terminal pathway pathway, characterized in that a positively charged basic amino acid residue is located rather than a hydrophobic residue located at the N-terminal methionine Lt; RTI ID = 0.0 > Ac / N-end < / RTI > rule pathway.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 양전하를 띄는 염기성 아미노산 잔기는 라이신일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the positively charged basic amino acid residue may be lysine.

또한, 본 발명은 단백질에 있어서, 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 경우 단백질이 분해됨을 예측하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for predicting the degradation of a protein in a protein when a hydrophobic residue is located next to the non-acetylated N-terminal methionine.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질은 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 (Arg/N-end rule pathway)에 의해 분해되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the protein may be degraded by an arginyl N-end rule pathway.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 소수성 잔기는 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 및 이소류신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the hydrophobic residue may be selected from the group consisting of leucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, and isoleucine.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 단백질은 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌 (N-recognin)인 Ubr1을 포함하는 E3 유비퀴틴 리가아제에 의해 폴리유비퀴틸화 되어 분해되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the protein is poly-ubiquitinated by E3 ubiquitin ligase comprising Ubr1, which is N-recognin in the arginyl N-terminal conformation pathway .

또한, 본 발명은 단백질에 있어서, 아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 경우 단백질이 분해됨을 예측하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for predicting the degradation of a protein in a protein when a hydrophobic residue is located next to the acetylated N-terminal methionine.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질은 아세틸화 N-말단 규칙 경로 (Ac/N-end rule pathway)에 의해 분해되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the protein may be degraded by an acetylated N-end rule pathway.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 단백질은 N-말단 아세틸라아제에 의해 N-말단 아세틸화되거나, 또는 아세틸화 N-말단 규칙 경로의 Ac/N-레코그닌 (Ac/N-recognin)인 Doa10을 포함하는 E3 유비퀴틴 리가아제에 의해 폴리유비퀴틸화 되어 분해되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the protein is N-terminal acetylated by N-terminal acetylase or Ac / N-recognin of the acetylated N- Lt; RTI ID = 0.0 > E3 < / RTI > ubiquitin ligase, including < RTI ID = 0.0 > Doa10.

또한, 본 발명은 N-말단의 메티오닌 다음에 위치하는 소수성 잔기가 아니며 양전하를 띄는 염기성 아미노산 잔기가 위치하는 경우, 단백질 분해가 저해됨을 예측하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for predicting the inhibition of protein degradation when a basic amino acid residue having a positive charge, rather than a hydrophobic residue located at the N-terminal methionine, is located.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 잔기는 라이신일 수 있다.In one embodiment of the invention, the moiety may be lysine.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 단백질은 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 (Arg/N-end rule pathway) 또는 아세틸화 N-말단 규칙 경로 (Ac/N-end rule pathway)에 의해 분해되지 않는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the protein is degraded by an arginyl N-end rule pathway or an acetylated N-end rule pathway It may not be.

또한, 본 발명은 단백질에 있어서, 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기를 위치시킴으로써 단백질 분해를 유도하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for inducing proteolysis in a protein by placing a hydrophobic residue next to the non-acetylated N-terminal methionine.

이에 더하여, 본 발명은 단백질에 있어서, 아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기를 위치시킴으로써 단백질 분해를 유도하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for inducing proteolysis in a protein by placing a hydrophobic residue next to the acetylated N-terminal methionine.

나아가 본 발명은 단백질에 있어서, N-말단의 메티오닌 다음에 위치하는 소수성 잔기가 아닌 양전하를 띄는 염기성 아미노산 잔기를 위치시킴으로써 단백질 분해를 저해하는 방법을 제공한다.Further, the present invention provides a method for inhibiting protein degradation in a protein by positioning a positively charged basic amino acid residue that is not a hydrophobic residue located at the N-terminal methionine.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 단백질은 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 (Arg/N-end rule pathway) 또는 아세틸화 N-말단 규칙 경로 (Ac/N-end rule pathway)에 의해 분해되지 않는 것일 수 있다.
In another embodiment of the present invention, the protein is degraded by an arginyl N-end rule pathway or an acetylated N-end rule pathway It may not be.

본 발명에 따르면 Met-Φ 단백질군의 분해 경로를 제공함으로써 세포 내에서 보이는 해당 단백질군의 분해 양상에 대한 해석과 예측이 가능하다. 예를 들어, 특정 질병들에 의해 야기될 수 있는 세포 내 Met-Φ 단백질군의 비정상적인 분해 양상은 N-말단 규칙 경로에서 그 기저 원인을 쉽게 찾아낼 수 있다. 이에 더하여, 해당 질병의 치료제 제작 및 검색에 있어서도 후보 물질이 처리된 실험군의 Met-Φ 단백질군에서 보이는 분해 양상을 대조군과 비교하여 그 효과를 정량적으로 분석할 수 있다.According to the present invention, by providing a degradation pathway of the Met-phi protein group, interpretation and prediction of the degradation pattern of the corresponding protein group in the cell are possible. For example, an abnormal degradation pattern of the intracellular Met-Φ protein group, which can be caused by certain diseases, can easily identify its underlying cause in the N-terminal conformational pathway. In addition, it is possible to quantitatively analyze the effect of the degradation pattern observed in the Met-Φ protein group of the experimental group treated with the candidate substance compared to the control group, in the production and retrieval of the therapeutic agent for the disease.

또한, 유전체 돌연변이에 의한 질병들의 경우, 해당 유전자의 돌연변이가 N-말단 메티오닌 다음의 잔기를 치환하여 Met-Φ 단백질을 생성하는지 아니면 비 Met-Φ 단백질을 생성하는지 역시 해당 질병들의 기저 원인을 쉽게 빠르게 추정하는 검색 조건으로 이용할 수 있다. 뿐만 아니라 이러한 단백질의 생성에 의한 세포 내 영향 역시 단백질의 분해 양상 분석과 해석이 기본적인 접근법이 될 수 있다.In the case of diseases caused by genetic mutation, whether a mutation of the gene produces a Met-Φ protein or a non-Met-Φ protein by substituting a residue after N-terminal methionine can also cause the underlying cause of the disease to be easily And can be used as an estimation search condition. In addition, the intracellular effect of the production of these proteins can also be a fundamental approach to the analysis and interpretation of protein degradation patterns.

이에 더하여, N-말단 메티오닌 다음의 위치에 소수성이 아니며 양전하를 띈 염기성 아미노산인 라이신 등의 잔기가 위치할 경우, 해당 단백질은 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로 모두에 의해 분해되지 않아 상당한 수준으로 단백질을 안정화할 수 있고, 이는 단백질 대량 생산에 있어 비용 대비 생산량에 있어 현저한 상승을 가져오는 기술로 이용될 수 있다. 특히, 고비용의 호르몬 제제 생산에 있어 막대한 비용 절감을 가져올 것으로 예측된다.
In addition, if residues such as lysine, which is a non-hydrophobic and positively charged basic amino acid, are located at the site following the N-terminal methionine, the protein will bind to both the arginyl N-terminal conformational pathway and the acetylated N-terminal conformational pathway Can stabilize the protein to a considerable level, which can be used as a technology to bring about a significant increase in the cost-to-production in mass production of the protein. In particular, it is expected that it will bring about enormous cost reduction in production of high cost hormone preparations.

도 1은 (A) 펩타이드 SPOT array를 이용한효모의 ^fUbr1 단백질과 Met-Z-e^k ^(3-10) 펩타이드(MZGSGAWLLP) 사이의 결합 분석 결과 (Z =알라닌, 시스테인, 아스팔산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글라이신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 티로신); (B) 효모의 ^fUbr1 (Sc^fUbr1), 쥐의 ^fUbr1 (Mm^fUbr1)와 ^fUbr2 (MmfUbr2) 등과 Met-Z-e^K ^(3-10) (Z = 류신, 라이신) 펩타이드 사이의 결합 확인; (C) 각각의 효모 균주 [WT (lanes 1-4), ubr1 Δ (lanes 5-8), naa30 Δ (lanes 9-12), naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 13-16)]에서 ML-Ura3 모델 단백질의 싸이클로헥사마이드 (cycloheximide, 이하 CHX) chases 실험 결과; (D) 각각의 효모 균주 [naa30Δ (lanes 1-4) and naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 5-8)]에서 MY-Ura3 모델 단백질의 CHX chases 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 (A) 각각의 효모 균주 [naa30 Δ (lanes 1-4), naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 5-8)]에서 MI-Ura3의 CHX chases 분석 결과; (B) naa30 Δ 효모 균주에서 ML-Ura3 (lanes 1-4)와 MKUra3 (lanes 5-8) 모델 단백질의 CHX chases 실험 결과; (C) (A)의 CHX chases 정량분석 결과; (D) (B)의 CHX chases 정량분석 결과; (E) 정제된 Ubr1-Rad6 Ub 리가아제에 의한 ML-GST의 in vitro 폴리유비퀴틸화 실험 결과 [Lane 1, Ubr1 결핍. Lane 2, Ubr1 포함. Lane 3, Lane 2와 동일하나, 아르기닌-알라닌 디펩타이드 (di-peptide) 첨가 (1 mM). Lane 4, Lane 2와 동일하나, 류신-알라닌 디펩타이드 첨가 (1 mM). Lane 5, Lane 2와 동일하나, 아르기닌-알라닌과 류신-알라닌 디펩타이드 동시첨가]; (F) 효모 Ubr1의 구조; (G, H) ML-GST 와 Ubr1 조각 사이의 GST-pull-down 분석 결과; (I) 정제된 ML-GST의 SDS-PAGE 분석 결과 (lane 2)를 나타낸 것이다.
도 3은 (A) MI-ΔssC²² ^-519Leu2_myc 단백질의 각 효모 균주 내 CHX chases 실험 결과 [WT (lanes 1-4), ubr1 Δ (lanes 5-8), naa30 Δ (lanes 9-12), naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 13-16)]; (B) MI-ΔssC²² ^-58Ura3_ha 단백질의 각 효모 균주 내 CHX chases 실험 결과 [WT (lanes 1-4), ubr1 Δ (lanes 5-8)]; (C) Wild Type 효모 내 MI-ΔssC²² ^-58Ura3_ha(lanes1-4) 와 MK-ΔssC²² ^-58Ura3_ha(lanes 5-8) 단백질들의 CHX chases 실험 결과; (D) (A)의 CHX chases 정량분석 결과; (E) (B)의 CHX chases 정량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 (A) ML-Msn4_ha 단백질의 각 효모 균주 내 CHX chases 실험 결과 [WT (lanes 1-3), ubr1 Δ (lanes 4-6), naa30 Δ (lanes 7-9), naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 10-12)]; (B) (A)의 CHX chases 정량분석 결과; (C) naa30Δ 효모 균주 내 ML-Msn4_ha (lanes 1-3)와 MK-Msn4_ha (lanes 4-6) 단백질의 CHX chases 실험 결과; (D) (C)의 CHX chases 정량분석 결과; (E) naa30Δ 효모 균주 내 MF-Arl3_ha2 (lanes 1-3)와 MK-Arl3_ha2 (lanes 4-6) 단백질의 CHX chases 실험결과를 나타낸 것이다.
도 5는 (A) 각 효모 균주 [WT (lanes 1-3), ubr1 Δ (lanes 4-6), naa30 Δ (lanes 7-9), naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 10-12)]에서 MF-Pre5_ha 단백질의 CHX chases 실험 결과 ; (B) MF-Pre5 단백질이 과량발현된 효모 균주 [WT, naa30 Δ 및 naa30 Δ ubr Δ] 각각의 성장속도; (C) naa30 Δ 효모 균주에서 MI-Sry1_ha (lanes 1-3) 및 MK-Sry1_ha (lanes 4-6) 단백질의 CHX chases 실험 결과; (D) 각 효모 균주에서 내생적으로 발현된 MI-Sry1_ha 단백질의 CHX chases 실험 결과 [WT (lanes 1-3), ubr1 Δ (lanes 4-6), naa30Δ (lanes 7-9), naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 10-12)]를 나타낸 것이다.
도 6은 (A) 효모 균주 naa30 Δ (lane 1-4)와 naa30 Δ ubr1 Δ (lane 5-8)에서 유비퀴틴 (Ub)이 결합된 Ub-ML-eK-ha-URA3 (Ub-ML-URA3) 단백질의 ³⁵S-pulse-chases 결과; (B) (A)의 ³⁵S-pulse-chases 정량 분석 결과; (C) (A)와 동일한 효모 균주들에서 유비퀴틴이 결합되지 않은 ML-eK-ha-URA3의 ³⁵S-pulse-chases 결과; (D) (C)의 ³⁵S-pulse-chases 정량 분석 결과; (E) 효모 균주 naa30 Δ (lane 1-4)와 naa30 Δ ubr1 Δ (lane 5-8)에서 외생적으로 발현된 MI-Sry1_ha 단백질의 CHX-chases 결과; (F) 효모 균주 naa30 Δ (lane 1-4)와 naa30 Δ ubr1 Δ (lane 5-8)에서 외생적으로 발현된 MI-Sry1_ha 단백질의 ³⁵S-pulse-chases 결과; (G) (F)의 ³⁵S-pulse-chases 정량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 (A) 효모 균주 naa30 Δ (lane 1-4)와 naa30 Δ ubr1 Δ (lane 5-8)에서 발현된 MF-Pre5_ha 단백질의 ³⁵S-pulse-chases 결과; (B) (A)의 ³⁵S-pulse-chases 정량 분석 결과; 효모 균주 naa30 Δ (lane 1)와 naa30 Δ ubr1 Δ (lane 2)에서 (C) ML - Ura3 (Ub-ML-eK-ha-URA3)와 ACT1의 mRNA 발현량, (D) 외생적으로 발현된 MI - SRY1과 ACT1의 mRNA 발현량, (E) 내생적으로 발현된 MI - SRY1과 ACT1의 mRNA 발현량, (F) MF-PRE5와 ACT1의 mRNA 발현량의 RT-PCR 분석결과; (G) naa30 Δ및 naa30 Δ ubr1Δ 효모 균주가 여러 스트레스에서 보여주는 과민성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 (A) 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로 사이의 상호보완성을 나타내는 모식도; (B) (A)에 나타낸 N-말단 규칙 경로 간의 상호보완성 단순화; (C) Met-Φ 단백질을 새로운 기질로 하는 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 확장을 모식도로 나타낸 것이다.
도 9는 (A) 단백질 복합체 형성을 통한 Ac/N-분해신호의 조건부 작용 (Conditionality)과 (B) Ac/N-분해신호의 조건부 작용에 의해 단위체인 Met-Φ 단백질이 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로를 통해 단백질 복합체에서 리모델링됨을 보여주는 모식도이다.FIG. 1 shows (A) a peptide SPOT array Between the yeast ^f Ubr1 protein and Met-Ze ^k ^(3-10) peptide (MZGSGAWLLP) binding analysis (Z = alanine, cysteine, asbestos palsan, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, asparagine, proline, Glutamine, serine, threonine, valine, tryptophan, tyrosine); (B) between the Ubr1 ^f (Sc Ubr1 ^f) of yeast, rat ^f Ubr1 (Mm Ubr1 ^f) and ^f Ubr2 (MmfUbr2) as ^{^{Met-Ze K (3-10) (}} Z = leucine, lysine) peptide binding OK ; (C) each yeast strain ML-Ura3 model in [WT (lanes 1-4), ubr1 Δ (lanes 5-8), naa30 Δ (lanes 9-12), naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 13-16)] Cycloheximide (CHX) chases of proteins; (D) shows the respective yeast strains [naa30Δ (lanes 1-4) and naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 5-8)] MY-Ura3 CHX chases experiments of model protein in the results.
Figure 2 shows the results of CHX chases analysis of MI-Ura3 in (A) each yeast strain [ naa30 ? ( Lanes 1-4), naa30 ? Ubr1 ? ( Lanes 5-8)]; (B) CHA chases of ML-Ura3 (lanes 1-4) and MKUra3 (lanes 5-8) model proteins in naa30 Δ yeast strains; (C) Quantitative analysis of CHX chases in (A); (D) Quantitative analysis of CHX chases in (B); (E) Purification of ML-GST by purified Ubr1-Rad6 Ub ligase in In vitro polyubiquitination experiments [Lane 1, Ubr1 deficiency. Lane 2, with Ubr1. Lane 3, same as Lane 2 but with arginine-alanine dipeptide (1 mM). Lane 4, same as Lane 2 but with addition of leucine-alanine dipeptide (1 mM). Lane 5, same as Lane 2, but with simultaneous addition of arginine-alanine and leucine-alanine dipeptide]; (F) Structure of yeast Ubr1; (G, H) GST-pull-down analysis between ML-GST and Ubr1 fragment; (I) purified SDS-PAGE analysis (lane 2) of ML-GST.
Figure 3 ^{^{(A) MI-ΔssC 22 -519}} Leu2 myc within CHX chases results of each yeast strain of the protein [WT (lanes 1-4), ubr1 Δ (lanes 5-8), naa30 Δ (lanes 9-12) , naa30 [ Delta] ur1 [ Delta ] 13 (lanes 13-16)]; (B) MI-ΔssC ²² ^-58 Ura ³ _ha The results of CHX chases in each yeast strain of protein [WT (lanes 1-4), ubr1 Δ (lanes 5-8)]; (C) CHX chases of wild-type yeast MI-ΔssC ²² ^-58 Ura3 _ha (lanes 1-4) and MK-ΔssC ²² ^-58 Ura3 _ha (lanes 5-8) proteins; (D) Quantitative analysis of CHX chases in (A); (E) (B).
Figure 4 (A) ML-Msn4 _ha within CHX chases each yeast strain of the protein results [WT (lanes 1-3), ubr1 Δ (lanes 4-6), naa30 Δ (lanes 7-9), naa30 Δ ubr1 ? (Lanes 10-12)]; (B) Quantitative analysis of CHX chases in (A); (C) CHX chases of ML-Msn4 _ha (lanes 1-3) and MK-Msn4 _ha (lanes 4-6) proteins in the naa30Δ yeast strain; (D) Quantitative analysis of CHX chases in (C); The results of CHX chase experiments of MF-Arl3 _ha2 (lanes 1-3) and MK-Arl3 _ha2 (lanes 4-6) protein in (E) naa30Δ yeast strain are shown.
Figure 5 (A) MF- in each yeast strain [WT (lanes 1-3), ubr1 Δ (lanes 4-6), naa30 Δ (lanes 7-9), naa30 Δ ubr1 Δ (lanes 10-12)] Pre5 _ha CHX chase experiment results of protein; (B) Growth rates of yeast strains [WT, naa30 ? And naa30 ? Ubr ? ] Overexpressing MF-Pre5 protein; (C) Results of CHX chases of MI-Sry1 _ha (lanes 1-3) and MK-Sry1 _ha (lanes 4-6) protein in naa30 Δ yeast strain; (D) each CHX chases experimental results of endogenously expressed in yeast strain MI-Sry1 _ha protein [WT (lanes 1-3), ubr1 Δ (lanes 4-6), naa30Δ (lanes 7-9), naa30 Δ ubr1 ? (lanes 10-12)].
Figure 6 (A) Yeast strain naa30 Δ (lane 1-4) and naa30 Δ Δ ubr1 (lane 5-8) is coupled ubiquitin (Ub) at the Ub-ML-eK-ha- URA3 (Ub-ML-URA3 ) ³⁵ S-pulse-chases results of protein; (B) Quantitative analysis of ³⁵ S-pulse-chases in (A); (C) Results of ³⁵ S-pulse-chases of ML-eK-ha-URA3 without ubiquitin binding in the same yeast strains as in (A); (D) Quantitative analysis of ³⁵ S-pulse-chases in (C); (E) CHX-chases results of exogenously expressed MI-Sry1 _ha protein in yeast strains naa30 Δ (lane 1-4) and naa30 Δ ubr1 Δ (lane 5-8); (F) ³⁵ S-pulse-chases results of exogenously expressed MI-Sry1 _ha protein in yeast strains naa30 Δ (lane 1-4) and naa30 Δ ubr1 Δ (lane 5-8); (G) (F). The results of the quantitative analysis of ³⁵ S-pulse-chases are shown in Fig.
Figure 7 shows the results of ³⁵ S-pulse-chases of MF-Pre5 _ha protein expressed in (A) yeast strains naa30 ? (Lane 1-4) and naa30 ? Ubr1 ? (Lane 5-8); (B) Quantitative analysis of ³⁵ S-pulse-chases in (A); Yeast strains naa30 Δ (lane 1) and naa30 Δ ubr1 Δ (lane 2) in (C) ML - Ura3 (Ub -ML-eK-ha-URA3) and mRNA expression level of ACT1, (D) an exogenously expressed MI - SRY1 and mRNA expression level of ACT1, (E) an endogenously expressed MI - mRNA expression level of SRY1 and ACT1, (F) MF-PRE5 and RT-PCR analysis of the mRNA expression level of ACT1; (G) naa30 ? And naa30 ? Ubr1 ? Yeast strains showed the results of measuring the hypersensitivity of various strains.
Figure 8 is a schematic diagram showing (A) the complementarity between the arginylated N-terminal conformation pathway and the acetylated N-terminal conformation pathway; (B) Simplification of mutual complementarity between N-terminal conformational paths shown in (A); (C) a schematic representation of the extension of the arginylated N-terminal conformational pathway using Met-Φ protein as a new substrate.
9 is a graph showing the relationship between the concentration of Met-Φ protein as a unit of arginylated N-acetylated N-acetylated N-acetylglucosamine by the conditional action of Ac / N-decomposition signal through (A) protein complex formation and (B) Is remodeled in the protein complex through the terminal regulatory pathway and the acetylated N-terminal regulatory pathway.

본 발명은 N-말단의 메티오닌 다음으로 긴 곁사슬 (side-chain)을 가지는 소수성 잔기인 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 또는 이소류신이 위치함을 특징으로 하며, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로의 상호보완성으로 선택적으로 두 경로에 의해 분해되는 Met-Φ 단백질, 이를 이용한 단백질 분해 예측 방법 및 단백질 분해 유도 방법을 제공한다.The present invention is characterized by the presence of a hydrophobic residue having a long side chain followed by methionine at the N-terminus, such as leucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or isoleucine, wherein the arginyl N- The present invention provides a method for predicting proteolytic degradation using the Met-Φ protein, wherein the Met-Φ protein is selectively degraded by the two pathways, and the protein degradation inducing method is provided.

또한, 본 발명은 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 아닌 양전하를 띄는 염기성 아미노산인 라이신 등의 잔기가 위치함을 특징으로 하며, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로 모두에 의해 분해되지 않는 단백질, 이를 이용한 단백질 분해 저해 예측 방법 및 단백질 분해 저해 방법을 제공한다.In addition, the present invention is characterized in that residues such as lysine, which is a basic amino acid which is positively not hydrophobic, are located next to N-terminal methionine, and arginylated N-terminal regular pathway and acetylated N- A protein that is not degraded by all, a method for predicting protease inhibition using the same, and a method for inhibiting protein degradation.

이와 관련하여, 본 발명의 일실시예에서는 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌 (N-recognin)인 효모의 Ubr1이 비아세틸화 (unacetylated)된 N-말단 메티오닌 다음에 위치하는 아미노산 잔기가 20개의 아미노산 중 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판일 경우만 결합하는 것을 펩타이드 SPOT array 분석을 통해 확인하였다 (도 1A 참조). 단백질의 두 번째 잔기가 알라닌이나 발린일 경우, 실제 세포 내에서는 메티오닌 아미노펩티다아제에 의해 첫 번째 잔기인 메티오닌이 제거된다. 따라서 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판이 메티오닌 다음에 위치한 단백질들이 실제 세포 내에서 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌인 Ubr1과 결합할 것임을 예측하였다. 또한, 효모의 Ubr1과 쥐의 Ubr1, Ubr2 모두 아세틸화 (acetylated)된 N-말단을 가지는 메티오닌-류신 펩타이드와 결합하지 않고, 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌-류신 펩타이드와 결합함을 확인하였으며 (도 1B 참조), 메티오닌-라이신 펩타이드는 N-말단의 아세틸화 여부와 상관없이 효모의 Ubr1과 쥐의 Ubr1, Ubr2 모두와 결합하지 않음을 확인하였다 (도 1B 참조). 그리고 N-말단의 아미노산 서열이 메티오닌-류신으로 시작하는 리포터 단백질 (ML-Ura3)이 아르기닐화 N-단말 규칙 경로의 N-레코그닌인 Ubr1이 제거된 ubr1 Δ 효모 균주와 메티오닌-류신 단백질을 N-말단 아세틸화하는 NatC 아세틸라아제 복합체의 촉매 단위체 (catalytic subunit)인 Naa30이 제거된 naa30Δ 효모 균주에서 wild type 균주에 비해 분해 속도가 감소하였고, Ubr1과 Naa30 모두 제거된 naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서 거의 완전하게 안정화되는 것을 확인하였다 (도 1C 참조). 이때, ML-Ura3 단백질은 naa30 Δ 균주보다 naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서 분해 속도가 확연히 감소해 거의 안정화되었고, 이는 메티오닌-티로신 (MY-Ura3)이나 메티오닌-이소류신 (MI-Ura3) 리포터 단백질 (MY-Ura3) 역시 동일한 결과를 보임을 확인하였다 (도 1D 내지 도 2A, 2C 참조). 이는 N-말단 아세틸화가 차단된 Met-Φ 단백질이 아르기닐화 N-말단 규칙 경로에 의해 분해됨을 시사한다.In this regard, in one embodiment of the present invention, Ubr1 of the yeast N-recognin in the arginylated N-terminal conformation pathway is replaced by an amino acid located next to the unacetylated N-terminal methionine The peptide SPOT array analysis confirmed binding only when the residue was alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, and tryptophan among the 20 amino acids (see FIG. 1A). If the second residue of the protein is alanine or valine, the first residue, methionine, is removed by methionine aminopeptidase in actual cells. Thus, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, and tryptophan predicted that proteins located next to methionine would actually bind to Ubr1, which is the N-lectin in the arginylated N-terminal regulatory pathway in the cell. In addition, it was confirmed that both Ubr1 of yeast and Ubr1 and Ubr2 of rats were not bound to acetylated N-terminal methionine-leucine peptides but bound to non-acetylated N-terminal methionine-leucine peptides (See FIG. 1B), it was confirmed that methionine-lysine peptide did not bind to both Ubr1 of yeast and Ubr1 and Ubr2 of rat regardless of acetylation of N-terminal (see FIG. 1B). And a reporter protein (ML-Ura3) in which the N-terminal amino acid sequence starts with methionine-leucine is ubr1 ? Yeast strain in which Ubr1, which is N-lecognin in the arginylated N- terminal regulatory pathway, is removed and methionine- N- terminal acetylation NatC acetyl la kinase complex catalytic subunit (catalytic subunit) which are Naa30 was removed with a degradation rate reduction compared to the wild type strain in naa30Δ yeast strains which, Ubr1 and Naa30 in naa30 ubr1 Δ Δ strain remove all (See Fig. 1C). At this time, ML-Ura3 protein was substantially stabilized to the decomposition rate significantly decreased in naa30 ubr1 Δ Δ Δ naa30 strains than strain, which It was confirmed that the methionine-tyrosine (MY-Ura3) or methionine-isoleucine (MI-Ura3) reporter protein (MY-Ura3) also exhibited the same results (FIGS. 1D to 2A, 2C). This suggests that the Met-phi protein blocked by N-terminal acetylation is degraded by arginylated N-terminal conformational pathways.

본 발명의 다른 일실시예에서는 비아세틸화된 N-말단을 가지는 메티오닌-류신-GST 단백질 (ML-GST)을 이용한 GST-pulldown 실험을 통해 ML-GST가 Ubr1과 직접 결합하며, 특히 Type 1과 Type 2 결합지역을 모두 포함하는 부분과 특이적으로 결합함을 확인하였다 (도 2F, 2G, 2H, 2I 참조). 또한, 효모에서 정제된 Ubr1-Rad6를 이용한 in vitro 폴리유비퀴틸화 반응 실험에서 ML-GST가 효모의 Ubr1에 의해 폴리유비퀴틸화 되는 것을 확인하였고, 이러한 폴리유비퀴틸화가 Type 1 결합지역에 결합하는 디펩디드 처리에 의해서는 향상되나, Type 2 결합지역에 결합하는 디펩티드 처리에 의해서는 저해되는 결과를 바탕으로 ML-GST가 Ubr1의 Type 2 결합지역과 결합함을 확인하였다 (도 2E 참조). 그리고 CHX-chases 실험과 달리 새롭게 생성된 단백질의 분해 정도를 측정하는 ³⁵S-pulse-chases 실험에서도 상기의 결과들과 일치함을 확인하였으며 (도 6A, 내지 6D 참조), ML - URA3 mRNA 발현량이 각 효모 균주 (naa30 Δ와 naa30 Δ ubr1 Δ)에서 동일함을 RT-PCR 분석으로 검증하여 (도 7C 참조), 상기 결과 모두가 오직 단백질 분해 조절에 의한 것임을 확인하였다.In another embodiment of the present invention, GST-pulldown experiments using N-terminal methionine-leucine-GST protein (ML-GST) with non-acetylation directly binds ML-GST to Ubr1, (FIG. 2F, 2G, 2H, 2I). As shown in FIG. In addition, in vitro polyubiquitination experiments using Ubr1-Rad6 purified from yeast showed that ML-GST was polyubiquitinated by Ubr1 of yeast, and this polyubiquitination was found to bind to Type 1 binding site But it was confirmed that ML-GST binds to the Type 2 binding region of Ubr1 based on the result of inhibition by the dipeptide treatment binding to the Type 2 binding region (see FIG. 2E). And CHX-chases Unlike the experiment in a new ³⁵ S-pulse-chases experiment to measure the degradation degree of the resulting protein was confirmed that, consistent with the results (see Fig. 6A, to 6D), ML - amount URA3 mRNA expression Each yeast strain ( naa30 ? is the same in naa30 ubr1 Δ Δ) to verify the RT-PCR analysis (see Fig. 7C), the results were confirmed both that only by the proteolytic regulation.

본 발명의 또 다른 일실시예에서는, N-말단 아세틸화가 차단된 naa30 Δ 균주에서 ML-Ura3에 비해 MK-Ura3가 거의 완전하게 안정화됨을 CHX-chases 실험을 통해 확인함으로써 (도 2B, 2D 참조), 비아세틸화된 ML-Ura3는 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌인 Ubr1과 결합하고, MK-Ura3는 Ubr1과 결합하지 않음을 보이는 상기 결과와 일치함을 확인하였다.In another embodiment of the present invention, the CHX-chases experiment confirms that MK-Ura3 is almost completely stabilized in the naa30 ? Strain isolated from N-terminal acetylation as compared to ML-Ura3 (see Figs. 2B and 2D) , Confirming that the non-acetylated ML-Ura3 binds to Ubr1, which is the N-lectinin of the arginylated N-terminal regular pathway, and that MK-Ura3 does not bind Ubr1.

상기로부터 N-말단의 메티오닌 다음으로 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판이 위치하는 Met-Φ 단백질들은 선택적으로 아르기닐화 N-말단 규칙 경로 또는 아세틸화 N-단말 규칙 경로에 의해 분해될 수 있으며, 해당 경로는 Met-Φ 단백질의 N-말단 아세틸화에 의해 결정됨을 확인하였다.From the above, Met-phi proteins in which leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, and tryptophan are located next to N-terminal methionine can be selectively degraded by an arginylated N-terminal regulatory path or an acetylated N- , The pathway was determined by N-terminal acetylation of the Met-phi protein.

따라서 본 발명은 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 것을 특징으로 하는 아르기닐화 N-말단 규칙 경로에 의해 분해되는 단백질을 제공할 수 있으며, 아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 것을 특징으로 하는 아세틸화 N-말단 규칙 경로에 의해 분해되는 단백질을 제공할 수 있다.Accordingly, the present invention provides a protein degraded by an arginylated N-terminal regular pathway, characterized in that a hydrophobic residue is located next to the non-acetylated N-terminal methionine, and the acetylated N- Lt; RTI ID = 0.0 > N-terminal < / RTI > regular pathway, which is characterized in that hydrophobic residues are located next to methionine.

이와 더불어, 본 발명은 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성이 아니며 양전하를 띄는 염기성 아미노산인 라이신 등의 잔기가 위치하여 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로 모두에 의해 분해되지 않는 단백질을 제공할 수 있다. In addition, the present invention is based on the discovery that residues such as lysine, which is a non-hydrophobic and positively charged basic amino acid next to the N-terminal methionine, are located and are not cleaved by both the arginylated N-terminal conformational pathway and the acetylated N- It can provide proteins that are not.

또한, 단백질에 있어서, 아세틸화된 또는 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 경우 단백질의 분해를 예측하는 방법을 제공할 수 있으며, 아세틸화된 또는 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기를 위치시킴으로써 단백질 분해를 유도하는 방법을 제공할 수 있다. 이때, 상기 단백질은 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 경우 아르기닐화 N-말단 규칙 경로에 의해 분해되며, 아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 경우 아세틸화 N-말단 규칙 경로에 의해 분해되는 것을 특징으로 한다.It is also possible to provide a method for predicting the degradation of a protein in a protein when a hydrophobic residue is located next to an acetylated or non-acetylated N-terminal methionine, and a method for producing an acetylated or non-acetylated N- It is possible to provide a method for inducing proteolysis by placing a hydrophobic residue next to methionine at the terminal. Wherein the protein is degraded by the arginylated N-terminal regular pathway when a hydrophobic residue is located next to the non-acetylated N-terminal methionine and the hydrophobic residue is located next to the acetylated N-terminal methionine Lt; RTI ID = 0.0 > acetylated < / RTI > N-terminal regular pathway.

본 발명에서 상기 소수성 잔기는 류신, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 및 이소류신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the hydrophobic residue may be selected from the group consisting of leucine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, and isoleucine, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성이 아니며 양전하를 띄는 염기성 아미노산인 라이신 등의 잔기가 위치하는 경우 단백질의 분해 저해를 예측하는 방법 및 단백질 분해를 저해하는 방법을 제공할 수 있다. 이때, 상기 단백질은 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로 모두에 의해 분해되지 않는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention can provide a method for predicting the degradation inhibition of protein and a method for inhibiting protein degradation when residues such as lysine, which is a non-hydrophobic and positively charged basic amino acid, are located next to N-terminal methionine. Wherein the protein is not degraded by both the arginylated N-terminal regular pathway and the acetylated N-terminal regular pathway.

본 발명에서 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 경우, 상기 단백질은 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌인 Ubr1 등의 E3 유비퀴틴 리가아제에 의한 폴리유비퀴틸화를 통해 분해되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 공지된 N-말단 분해 신호로 인해 확장된 경로로 분해될 수 있다.In the present invention, when hydrophobic residues are located next to the non-acetylated N-terminal methionine, the protein is a polyubiquitin ligated with an E3 ubiquitin ligase, such as Ubr1, which is an N-reptanine in the arginyl N- But may be decomposed into an extended path due to a known N-terminal decomposition signal.

본 발명에서 N-말단 아세틸라아제에 의해 아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성 잔기가 위치하는 경우, 상기 단백질은 아세틸 N-말단 규칙 경로의 Ac/N-레코그닌인 Doa10 등의 E3 유비퀴틴 리가아제에 의한 폴리유비퀴틸화 반응을 통해 분해되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 공지된 Ac/N-말단 분해 신호로 인해 확장된 경로로 분해될 수 있다.In the present invention, when hydrophobic moieties are located next to N-terminal methionine acetylated by N-terminal acetylase, the protein is selected from the group consisting of E3 ubiquitin such as Doa10, which is Ac / N-lecithin in the acetyl N- May be degraded through a polyubiquitination reaction by a ligase, but not limited thereto, can be decomposed into an extended path due to a known Ac / N-terminal decomposition signal.

본 발명에서 N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성이 아니며 양전하를 띄는 염기성 아미노산 잔기가 위치하는 경우, 해당 잔기는 라이신일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, N-말단의 메티오닌 다음으로 소수성이 아니며 양전하를 띄는 염기성 아미노산 잔기가 위치하여 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로 모두에 의해 분해되지 않는 경우를 포괄한다.
In the present invention, when a basic amino acid residue which is not hydrophobic and is positively hydrophobic is located next to the N-terminal methionine, the corresponding residue may be lysine, but is not limited to, methionine which is not hydrophobic next to N-terminal methionine, Encompasses cases where a basic amino acid residue is located and is not degraded by both the arginylated N-terminal conformation pathway and the acetylated N-terminal conformation pathway.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

MetMet -Φ -Φ 펩타이드의Of peptide N- N- 레코그닌과의With lecithin 결합 Combination

비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음에 위치하는 잔기의 종류에 따른 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌과의 결합 여부를 확인하기 위해 펩타이드 SPOT array 분석 실험을 수행하였다. Met-Z-e^K ^(3-10)펩타이드를 제작하여 C-말단을 cellulose-PEG 막에 동량으로 고정하고, N-말단을 FLAG-에피토프로 표지한 효모의 Ubr1 (Sc^fUbr1)과의 결합을 확인하였다. 이때, e^K ^(3-10)는 기존에 보고되었던 N-말단 규칙 경로에 대한 연구들에서 사용한 extension containing lysine (e^K: 40개의 잔기) 중 앞쪽 8개의 잔기를 말한다. 효모의 Ubr1은 비아세틸화 Met-Z-e^K ^(3-10)펩타이드들 중, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 메티오닌 다음에 위치하는 잔기인 Z가 알라닌 (A), 발린 (V), 류신 (L), 이소류신 (I), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W)인 펩타이드들과 결합하였다. 그러나 시스테인 (C), 아스팔산 (D), 글루탐산 (E), 글라이신 (G), 아스파라진 (N), 글루타민 (Q), 히스티딘 (H), 라이신 (K), 메티오닌 (M), 프롤린 (P), 아르기닌 (R), 세린 (S), 트레오닌 (T)이 N-말단의 메티오닌 다음에 위치하는 경우에는 효모 Ubr1과 결합하지 않았다. A peptide SPOT array assay was performed to confirm the binding of arginyl N-terminal conformational pathway with N-lectinin according to the type of residues following methionine of the non-acetylated N-terminal methionine. Met-Ze ^K ^(3-10) peptide was prepared, and the C-terminal was immobilized in the same amount in the cellulose-PEG membrane and the binding of Ubr1 (Sc ^f Ubr1) of the yeast with N-terminal to FLAG-epitope was confirmed Respectively. At this time, e ^K ^(3-10) containing the lysine extension used in the research on the N- terminal Rule Name that was reported previously: refers to the eight residues of the front (e ^K 40 residues). Ubr1 the yeast is of the non-acetylated Met-Ze ^K ^(3-10) peptide, as shown in Figure 1A, the residue Z which is located in the following methionine-alanine (A), valine (V), leucine (L) , Isoleucine (I), phenylalanine (F), tyrosine (Y) and tryptophan (W) However, it has been reported that cysteine (C), aspartic acid (D), glutamic acid (E), glycine (G), asparagine (N), glutamine (Q), histidine (H), lysine (K), methionine P), arginine (R), serine (S) and threonine (T) did not bind to yeast Ubr1 when they were located after methionine at the N-terminus.

상기 결과는 쥐의 Ubr1 (Mm^fUbr1)과 Ubr2 (Mm^fUbr2)을 이용한 실험에서도 동일하게 나타났다. 즉, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 쥐의 Ubr1, Ubr2 역시 메티오닌-류신-e^K(3-10) 펩타이드와는 결합하였지만, 메티오닌-라이신-e^K ^(3-10) 펩타이드와는 결합하지 않았다. 또한, 효모의 Ubr1, 그리고 쥐의 Ubr1, Ubr2 모두 N-말단이 비아세틸화된 메티오닌-류신-e^K ^(3-10) 펩타이드와는 결합하나 N-말단이 아세틸화된 동일한 펩타이드와는 결합하지 않음을 보였다.The above results were the same in the experiment using mouse Ubr1 (Mm ^f Ubr1) and Ubr2 (Mm ^f Ubr2). That is, as shown in Figure 1B, the rat Ubr1, Ubr2 also methionine-leucine -e ^{K (3-10)} but is combined with the peptide, methionine-lysine -e ^K ^(3-10) peptide did not bind. In addition, the yeast Ubr1, and the N- terminal both Ubr1, Ubr2 of rat non-acetylated methionine-leucine -e ^K ^(3-10) peptide and is not bonded with the same peptide bound one N- terminal acetylation is Respectively.

상기와 같이, 펩타이드 SPOT array 분석 결과에 의하면 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음에 위치하는 잔기가 알라닌, 발린, 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 이소류신일 경우, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌인 Ubr1이 결합함을 알 수 있다. 그러나 실제 세포 내에서 N-말단의 메티오닌 다음에 알라닌, 발린이 위치하는 경우, 메티오닌 아미노펩티다아제에 의해 메티오닌이 제거되므로, in vivo 상태에서는 Ubr1은 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌 다음에 곁사슬이 길며 소수성인 Φ 잔기들 (류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 이소류신)이 위치하는 서열을 가지는 단백질들만 Ubr1과 결합함을 알 수 있다.
As described above, according to the results of peptide SPOT array analysis, when the residue after methionine at the non-acetylated N-terminus is alanine, valine, leucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan and isoleucine, arginyl N- Of N-lysine, Ubr < 1 > However, when alanine, valine is located in the actual cell followed by N-terminal methionine, methionine is removed by methionine aminopeptidase, so in In the vivo state, Ubr1 binds only Ubr1 with proteins having sequences with long side chains and hydrophobic Φ residues (leucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, isoleucine) followed by non-acetylated N-terminal methionine have.

아르기닐화Arginylation N-말단 규칙 경로와 N-terminal rule path and 아세틸화Acetylation N-말단 규칙 경로에 의한 By N-terminal rule pathway MetMet -Φ 단백질의 분해-Protein degradation

실제 세포 내에서 Met-Φ 단백질의 분해 양상을 분석하기 위해, 35kDa의 분자량을 가지는 모델 리포터인 Ub-메티오닌-Z-e^K-ha-Ura3 (Ub-MZ-Ura3) 단백질을 발현하는 벡터를 제작하였다. 상기 모델 리포터는 N-말단에 한 분자의 동일한 유비퀴틴이 융합되어 있어, 단백질의 초기 합성을 동일하게 해주며, 리보솜에서 합성되는 동시에 탈유비퀴틸라아제 (deubiquitylase)에 의해 유비퀴틴이 제거되어 거의 동량의 MZ-Ura3 단백질을 생성할 수 있다. 또한, 효모 내에서 낮은 복제수를 갖는 플라스미드를 이용하여 단백질 과량 발현에 의한 세포의 부담을 최소화하고, Cu² ⁺로 유전자의 발현을 조절할 수 있는 CUP1 유전자의 프로모터를 이용해 세포 내 단백질의 발현을 조절할 수 있다. To analyze the degradation pattern of Met-Φ protein in the actual cell, to prepare a model reporter Ub- methionine ^{-Ze K -ha-Ura3 (Ub-} MZ-Ura3) vector expressing the protein has a molecular weight of 35kDa. The model reporter has the same ubiquitin fused at its N-terminus, so that the initial synthesis of the protein is the same, and the ubiquitin is removed by deubiquitilase while being synthesized in the ribosome, MZ-Ura3 protein. In addition, by using a plasmid having a low copy number in yeast, the expression of the intracellular protein can be regulated by using the promoter of the CUP1 gene, which minimizes the cell burden due to protein overexpression and regulates the expression of the gene by Cu ² ⁺ .

효모의 wild type 균주에서 ML-Ura3는 NatC 아세틸라아제 복합체에 의해 일부가 N-말단 아세틸화된다. 다시 말해, 세포 내에서 ML-Ura3는 N-말단이 비아세틸화된 단백질과 아세틸화된 단백질이 혼합된 상태로 존재한다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, 효모 세포 내에서 발현된 ML-Ura3는 CHX-chases 실험에서, wild type 균주에 비해 NatC 아세틸라아제 복합체의 촉매 단위체 (catalytic subunit)인 Naa30이 제거된 naa30 Δ 균주나 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌인 Ubr1이 제거된 ubr1 Δ 균주에서 분해가 느려짐을 보였다. 또한, ML-Ura3는 naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서 거의 완전히 안정화됨을 보였다. 상기의 실험을 통해 ML-Ura3가 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로 모두에 의해 분해될 수 있음을 알 수 있다.ML-Ura3 is partially N-terminally acetylated by the NatC acetylla- tion complex in yeast wild-type strains. In other words, ML-Ura3 is present in a mixed state of N-terminally acetylated protein and non-acetylated protein. As shown in Fig. 1C, ML-Ura3 expressed in yeast cells was found to be naa30 [ Delta] strains in which Naa30 , a catalytic subunit of the NatC acetyllaase complex, was removed compared to the wild type strain in the CHX- Degradation was slowed in the ubr1 Δ strain from which Ubr1 , the N-lectinin of the N-terminal conformational pathway, was removed. In addition, ML-Ura3 showed that nearly fully stabilized in naa30 ubr1 Δ Δ strain. These experiments show that ML-Ura3 can be degraded by both the arginylated N-terminal conformational pathway and the acetylated N-terminal conformational pathway.

CHX-chases 실험에서는 세포 내 이미 생성된 오래된 단백질과 새롭게 생성된 단백질을 구별할 수 없으므로, 새롭게 생성된 단백질 역시 동일한 분해 양상을 보이는지 확인하기 위하여 ³⁵S-pulse-chases 실험을 수행하였다. 도 6A, B, C, D에서 나타낸 바와 같이 새롭게 생성된 ML-Ura3 역시 N-말단의 유비퀴틴 융합과 상관없이 CHX-chases와 동일한 분해 양상을 보였다. 다시 말해, 동위원소인 ³⁵S로 표지된 ML-Ura3 단백질이 naa30Δ 균주보다 naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서 더욱 안정화됨을 확인하였다. In the CHX-chases experiment, ³⁵ S-pulse-chases experiments were performed to determine whether the newly generated proteins exhibited the same decomposition behavior because they could not distinguish between the old protein that was already produced in the cell and the newly generated protein. As shown in FIGS. 6A, B, C, and D, the newly generated ML-Ura3 showed the same degradation pattern as CHX-chases regardless of the N-terminal ubiquitin fusion. In other words, it was confirmed that the ML-Ura3 protein labeled with the isotope ³⁵ S further stabilized in naa30 ubr1 Δ Δ strain than naa30Δ strain.

이와 더불어, 도 7C에서 나타낸 바와 같이, RT-PCR 실험으로 naa30 Δ 균주와 naa30Δ ubr1 Δ 균주에서 ML - URA3의 mRNA 발현양이 동일함을 확인하여, 상기의 결과들에서 보이는 ML-Ura3의 분해 양상이 오로지 단백질의 분해 속도 차이에 의한 것임을 확인하였다. In addition, as shown in Figure 7C, RT-PCR experiments with naa30 Δ strain and naa30Δ ubr1 ML in Δ strain to confirm that the same mRNA expression of URA3, decomposition aspect of the ML-Ura3 seen in the above results Was found to be due only to the difference in protein degradation rate.

이에 더하여, 도 1D 및 2A, B에 나타낸 바와 같이, ML-Ura3 단백질과 마찬가지로 Met-Φ 단백질인, 즉 N-말단 메티오닌 다음의 잔기가 이소류신이나 티로신인 MI-Ura3, MY-Ura3 단백질의 CHX-chase 실험 결과 역시 naa30 Δ 균주에 비해 naa30 Δ ubr1Δ 균주에서 단백질의 분해가 현저히 감소하는 결과를 보였다.In addition, as shown in FIGS. 1D and 2A, B, the Met-Φ protein, that is, the residue following the N-terminal methionine is isoleucine or tyrosine, as well as the ML-Ura3 protein, chase experiments also showed a result that is significantly reduced degradation of the protein in naa30 Δ ubr1Δ strain compared to naa30 Δ strain.

또한, 도 2B, D에 나타낸 바와 같이, naa30 Δ 균주에서 ML-Ura3 단백질은 상대적으로 빠른 속도로 분해됨에 비해, 두 번째 잔기가 라이신으로 치환된 MK-Ura3 단백질은 naa30 Δ 균주에서 상당히 안정화됨을 보여, ML-Ura3는 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌인 Ubr1과 결합하여 폴리유비퀴틸화를 통해 분해되나, MK-Ura3 단백질은 도1 A, B의 결과와 동일하게 in vivo에서도 Ubr1과 결합하지 않아 단백질 분해가 일어나지 않음을 확인하였다. In addition, as shown in FIG. 2B, D, ML-Ura3 protein in naa30 Δ strain is compared to the relatively decomposed rapidly, show both that the second moiety is quite stable, the MK-Ura3 protein replaced with lysine in naa30 Δ strain , ML-Ura3 is cleaved through polyubiquitilization in association with Ubr1, which is the N-lecagonin of the arginylated N-terminal regulatory pathway, but the MK-Ura3 protein is in In vivo , it was confirmed that protein degradation did not occur due to not binding with Ubr1.

ML-Ura3, MI-Ura3, MY-Ura3의 모델 리포터를 이용한 상기의 결과들은 N-말단의 아세틸화 여부에 의해 Met-Φ 단백질이 아세틸화 N-말단 규칙 경로와 아르기닐화 N-말단 규칙 경로를 선택적으로 이용해 분해될 수 있음을 의미한다.
The above results using model reporters of ML-Ura3, Ml-Ura3, MY-Ura3 indicate that the Met-phi protein is bound to the acetylated N-terminal conformation pathway and arginyl N- Lt; RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI >

MetMet -Φ 단백질의 N-말단 분해신호 (N-terminal degradation signal of -Φ protein ( MetMet ^ΦΦ /N-/ N- degrondegron 또는 or MetMet ^ΦΦ /N-말단 분해 신호)를 특이적으로 인지하는 / N-terminal degraded signal) Ubr1Ubr1 의 결합 지역Joining area of

도 2F에 나타낸 바와 같이, 1,950개의 아미노산으로 구성된 효모의 Ubr1은 타입 1 결합지역 (Type 1 binding site)과 타입 2 결합지역 (Type 2 binding site)을 가지고 있다. Ubr1의 N-말단 근처에 위치하는 약 80개 잔기의 UBR 도메인은 타입 1 결합지역을 포함하고 있으며, 이 결합지역은 단백질 N-말단의 아르기닌, 라이신, 히스티딘 등의 염기성 잔기를 특이적으로 인지하여 결합한다. 또한, UBR 도메인 근처에 존재하는 타입 2 결합지역은 단백질 N-말단의 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 이소류신 등의 Φ 잔기 (긴 곁사슬을 가지며 소수성인 잔기)를 인지하여 결합한다.As shown in FIG. 2F, Ubr1 of yeast consisting of 1,950 amino acids has a Type 1 binding site and a Type 2 binding site. The UBR domain of about 80 residues located near the N-terminus of Ubr1 contains a type 1 binding site that specifically recognizes basic residues such as arginine, lysine, histidine, etc. at the N-terminus of the protein . In addition, the type 2 binding site present near the UBR domain recognizes and binds to the Φ residue (long side chain and hydrophobic residue) of the protein N-terminal leucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan and isoleucine.

Met-Φ 단백질의 비아세틸화된 N-말단의 메티오닌을 인지하여 결합하는 Ubr1 (^fUbr1)의 결합지역을 확정하기 위해 정제된 ML-e^K-GST(ML-GST) 단백질과 효모의 Ubr1 단백질을 이용해 GST pull-down을 수행하였다. N-말단이 FLAG-에피토프로 표지된 Ubr1 (^fUbr1¹ ^-1950)과 Ubr1의 구획화된 지역들을 각기 포함하는 조각 단백질들 (^fUbr1^1-717, ^fUbr1¹ ^-310, ^fUbr1⁹⁸ ^-518, ^fUbr1²⁰⁹ ^-717, ^fUbr1²⁰⁹ ^-1140)을 이용한 Ubr1과 ML-GST 사이의 GST pull-down 실험을 통해, 도 2G 내지 2I에 나타낸 바와 같이, Ubr1의 타입 1, 타입 2 결합지역을 모두 포함하는 Ubr1 (^fUbr1¹ ^-1950)과 Ubr1의 조각 단백질 (^fUbr1¹ ^-717)만 ML-GST가 결합함을 확인하였다. 또한, 도 2E에 나타낸 바와 같이, Ubr1-Rad6를 이용한 ML-GST의 in vitro 폴리유비퀴틸화 실험에서 Ubr1에 의한 ML-GST의 폴리유비퀴틸화가 타입 1 결합지역에 특이적으로 결합하는 디펩타이드 (아르기닌-알라닌) 처리에 의해서는 향상되나, 타입 2 결합지역에 특이적인 디펩티드 (류신-알라닌)에 의해서는 억제되고, 두 디펩티드 (아르기닌-알라닌, 류신-알라닌) 동시 처리에 의해서는 류신-알라닌 펩티드 처리 시와 동일하게 억제되는 결과를 보였다.Met-protein ratio Φ acetylated Ubr1 protein of the N- ^{ML-e K -GST (ML-} GST) protein and for yeast tablets aware of the methionine of the terminal to determine the binding region of Ubr1 (Ubr1 ^f) combining the The GST pull-down was performed. The N- terminal fragment, which each comprise a partitioned area of the Ubr1 ^(f Ubr1 ¹ ^-1950) and Ubr1 labeled proteins FLAG- epitope ^{^{^{^{(f Ubr1 1-717, f Ubr1 1}}}} -310, f Ubr1 98 -518, ^f Ubr1 ²⁰⁹ ^-717, ²⁰⁹ ^-1140 Ubr1 ^f) using the Ubr1 and ML-GST pull-down experiments with the GST between, as shown in Fig. 2G to 2I, including both type 1, type 2 binding region of Ubr1 the only ^{^{ML-GST Ubr1 (f Ubr1 1}} -1950) and protein fragment ^(f Ubr1 ¹ ^-717) of Ubr1 confirmed that the bond. In addition, as shown in FIG. 2E, in ML-GST using Ubr1-Rad6 In vitro polyubiquitination experiments showed that the polyubiquitination of ML-GST by Ubr1 was enhanced by treatment with a peptide (arginine-alanine) that specifically binds to the type 1 binding site, (Arginine-alanine, leucine-alanine) was inhibited by the peptide (leucine-alanine), and was inhibited by the simultaneous treatment of the two dipeptides (arginine-alanine, leucine-alanine) in the same manner as in the case of leucine-alanine peptide treatment.

상기의 결과들로부터 Met-Φ 단백질의 비아세틸화된 N-말단 메티오닌은 단백질 분해 신호 (Met^Φ/N-말단 분해신호)로 작용하고, Ubr1과 결합하여 폴리유비퀴틸화 되며, 이러한 결합은 Ubr1의 타입 2 결합지역에 특이적임을 도출할 수 있다.
From the above results, the non-acetylated N-terminal methionine of the Met-phi protein acts as a proteolytic signal (Met ^? / N-terminal degradation signal) and is polyubiquitinated in association with Ubr1, Lt; RTI ID = 0.0 > of Type 2 < / RTI >

MetMet ^ΦΦ /N-말단 분해신호에 의한 비정상적인 삼차구조를 갖는 단백질의 분해/ Degradation of proteins with abnormal tertiary structure by N-terminal degradation signal

다양한 종류의 단백질들이 합성 이후 잘못된 접힘 (misfolding)으로 인해 비정상적인 삼차 구조를 갖게 되는 경우, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌인 Ubr1에 의해 폴리유비퀴틸화 되어 분해됨이 이미 밝혀져 있다. 비정상적인 삼차 구조를 가지며, Ubr1의 기질인 110kDa의 ΔssC²² ^-519Leu2_myc 단백질은 신호 서열 (signal sequence)이 제거되고, 유전자 상으로 변이된 Prc1 단백질의 일부분 (ΔssC²² ^-519)과 Leu2 단백질 그리고 C-말단의 myc-에피토프로 이루어져 있고, N-말단이 메티오닌-이소류신으로 시작하는 Met-Φ 단백질이다. 따라서 본 발명자들은 ΔssC²² ^-519Leu2_myc 단백질의 분해가 Met^Φ/N-말단 분해신호로 인한 것인지를 검증하기 위해, 먼저 CHX-chases 분석 실험을 수행하였다.It has already been shown that when various kinds of proteins have an abnormal tertiary structure due to misfolding after synthesis, they are polyubiquitylated and decomposed by Ubr1, an N-lecithin of the arginyl N-terminal conformational pathway. Abnormal has a tertiary structure, of the substrate of 110kDa Ubr1 ΔssC ²² ^-519 Leu2 _myc protein signal sequence (signal sequence) is removed and, a portion of the gene with the mutant protein Prc1 (ΔssC ²² ^-519) and Leu2 protein and C -Terminal < / RTI > epitope, which is termed the methionine-isoleucine at the N-terminus. Therefore, the present inventors first performed a CHX-chase analysis experiment to verify whether the degradation of the ΔssC ²² ^-519 Leu2 _myc protein is due to the Met ^Φ / N-terminal degradation signal.

도 3A 및 3D에 나타낸 바와 같이, 정상세포에서 MI-ΔssC²² ^-519Leu2_myc 단백질은 빠른 속도로 분해되나, ubr1 Δ 균주에서는 천천히 분해되며, naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서는 분해 속도가 현저히 느려져 거의 완전하게 안정화됨을 확인하여 다른 실시예들의 결과와 일치함을 보였다. 또한, ΔssC²² ^-519 N-말단의 37개의 잔기와 Ura3, C-말단의 HA-에피토프로 구성된 모델 기질인 MI-ΔssC²² ^-58-Ura3_HA 단백질을 이용한 CHX-chases 분석 실험에서도, 도 3B 및 3E에 나타낸 바와 같이, wild type에 비해 ubr1 Δ 균주에서 단백질의 분해가 현저히 느려지는 것을 확인하였다. 상기의 결과들에서, MI-ΔssC²² ^-519Leu2_myc과 MI-ΔssC²² ^-58-Ura3_HA 단백질의 분해는 모두 Met-Φ/N-말단 분해신호로 인한 것임을 알 수 있다. As shown in Figs. 3A and 3D, as in normal cells ^MI-22 ^-519 ΔssC Leu2 _myc protein but decompose rapidly, the ubr1 Δ strains are slowly decomposed, naa30 ubr1 Δ Δ strain in almost complete decomposition rate significantly slowed And confirmed to be stabilized, which is consistent with the results of other embodiments. Also, in the CHX-chase analysis experiment using the MI-ΔssC ²² ^-58 -Ura3 _HA protein, which is a model substrate composed of 37 residues of ΔssC ²² ^-519 N-terminal and HA-epitope of Ura ³ and C-terminal, As shown in FIG. 3E, the degradation of the protein in the ubr1 Δ strain was markedly slower than that in the wild type. In the above results, MI-ΔssC ²² ^-519 Leu2 _myc and MI-ΔssC ²² ^-58 -Ura3 _HA Protein degradation is all due to the Met-Φ / N-terminal degradation signal.

이에 더하여, MI-ΔssC²² ^-58-Ura3_HA 단백질의 두번째 잔기인 이소류신이 라이신으로 치환된 MK-MI-ΔssC²² ^-58-Ura3_HA 단백질은 wild type에서의 CHX-chases 분석 실험 결과, 도 3C 및 3E에 나타낸 바와 같이, MI-ΔssC²² ^-58-Ura3_HA 단백질에 비해 상당히 안정화됨을 보였다. 이는 MI-ΔssC²² ^-58-Ura3_HA 단백질의 분해가 Met^Φ/N-말단 분해신호로 인한 것임을 재검증하는 동시에, N-말단의 메티오닌 다음으로 라이신 등의 비소수성 잔기가 위치할 경우 아르기닐화 N-말단 규칙 경로와 아세틸화 N-말단 규칙 경로 모두에 의해 분해되지 않을 수 있음을 나타낸다.
In addition, MK-MI-ΔssC ²² ^-58 -Ura3 _HA substituted with isoleucine, the second moiety of the MI-ΔssC ²² ^-58 -Ura3 _HA protein, The protein showed significant stabilization as compared to the MI-ΔssC ²² ^-58 -Ura3 _HA protein as shown in FIGS. 3C and 3E as a result of CHX-chase analysis in the wild type. This means that MI-ΔssC ²² ^-58 -Ura3 _HA At the same time that the degradation of the protein is due to the Met ^Φ / N-terminal degradation signal, and when non-hydrophobic residues such as lysine are located next to methionine at the N-terminus, an arginyl N- And may not be degraded by all of the terminal regulatory pathways.

MetMet ^ΦΦ /N-말단 분해신호로 인한 천연단백질의 분해/ N-terminal degradation signal degradation of natural protein

상기 실시예 1 내지 4의 결과에 따르면, Met-Φ 단백질은 N-말단 메티오닌이 (1) 비아세틸화 상태에서 Met^Φ/N-말단 분해신호 (Met^Φ/N-degron)로 작용하여, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로의 N-레코그닌인 Ubr1 등의 E3-유비퀴틴 리가아제에 의해 폴리유비퀴틸화 되거나, (2) N-말단 아세틸화 상태에서 아세틸화 Met^Φ/N-말단 분해신호 (AcMet^Φ/N-말단 분해신호 또는 AcMet^Φ/N-degron)로 작용하여, 아세틸화 N-말단 규칙 경로의 Ac/N-레코그닌인 Doa10등의 E3-유비퀴틴 리가아제에 의해 폴리유비퀴틸화 되어, 최종적으로 프로테아좀 복합체에 의해 분해될 수 있다. 다시 말해, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 이러한 이중 경로 회로(dual-pathway circuit)는 동일한 Met-Φ 단백질이 N-말단 아세틸화 여부에 따라 두 N-말단 규칙 경로를 선택적으로 이용하여 분해될 수 있음을 의미한다. According to the results of the Examples 1-4, the Met-protein is Φ N- terminal methionine acts as (1) non-acetylated Met ^Φ / N- terminal degradation signal ^(Φ Met / N-degron) in the state, which are Ubiquitin ligase such as Ubr1 which is an N-lecagonin in the guanylated N-terminal regulatory pathway or (2) an acetylated Met ^Φ / N-terminal digestion signal in the N-terminal acetylated state AcMet ^Φ / N-terminal degradation signal or AcMet ^Φ / N-degron) and is polyubiquitylated by E3-ubiquitin ligase such as Doa10 Ac / N-lectin in the acetylated N-terminal conformation pathway , And finally degraded by the proteasome complex. In other words, as shown in FIGS. 8 and 9, this dual-pathway circuit is capable of selectively degrading the same Met-phi protein by selectively using two N-terminal conformational pathways depending on whether the N- .

단백질 분해의 선택적 경로 이용이 실제 천연단백질들에서도 적용되는지를 확인하기 위하여, 효모 내 단백질들의 약 15%를 차지하는 Met-Φ 단백질 중에서 Msn4, Sry1, Arl3, 및 Pre5 단백질을 이용한 실험을 수행하였다. 상기 단백질들은 효모의 wild type에서 Met-Φ 단백질인 동시에, N-말단이 아세틸화된다고 보고된 단백질군에서 임의로 선택되었고, 실험의 용이성을 위하여 모든 단백질들은 C-말단에 HA-에피토프로 표지하여, 실시예 1 내지 4에서 상기 하였던 낮은 복제수를 갖는 플라스미드의 CUP1 프로모터의 조절 하에 효모 내에서 발현되었다. 상기하였듯이, Met-Φ 단백질들은 NatC N-말단 아세틸라아제 복합체에 의해 부분적으로 N-말단 아세틸화 될 것으로 예상되었다.
In order to confirm whether the selective pathway of proteolysis is also applied to natural proteins, experiments using Msn4, Sry1, Arl3, and Pre5 proteins among Met-Φ proteins accounting for about 15% of the proteins in yeast were performed. These proteins were arbitrarily selected from the wild-type yeast wild-type Met-Φ protein and the N-terminal acetylated protein group. For ease of experiment, all proteins were labeled with HA-epitope at the C- Was expressed in yeast under the control of the CUP1 promoter of the plasmid with the low copy number as described above in Examples 1-4. As mentioned above, Met-phi proteins were expected to be partially N-terminal acetylated by the NatC N-terminal acetylase complex.

<5-1> <5-1> Msn4Msn4 단백질 protein

70kDa의 Msn4 (ML-Msn4_ha ₎는 N-말단이 메티오닌-류신으로 시작되며, 효모에서 다양한 스트레스에 반응하여 특정 유전자들의 발현을 촉진하는 전사 조절 인자 로, 정상적인 환경의 wild type에서는 단백질의 반감기 (t₁ _/2 << 1 hr) 상당히 짧은 단백질이다. Msn4 (ML-Msn4 _ha ₎ of 70 kDa is a transcriptional regulator that starts N-terminal methionine-leucine and promotes the expression of specific genes in response to various stresses in yeast. In the wild type of normal environment, t _{_1/2} << ₁ hr) is considerably shorter proteins.

도 4A 및 도 4B에 나타낸 바와 같이, ML-Msn4_ha는 wild type에서 상당히 빠르게 분해되며, ubr1 Δ 균주에서 상대적으로 분해속도가 느려짐을 CHX-chases 분석 실험으로부터 확인하였다. 또한, naa30 Δ 균주에서 역시 wild type에 비해 ML-Msn4_ha의 분해가 느려지며, naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서는 ubr1 Δ 균주나 naa30 Δ에서 보다 분해 속도가 현저히 느려짐을 확인하였다. 상기의 결과는 효모 세포 내에서 생성된 ML-Msn4_ha의 일부분만 N-말단 아세틸화되어, AcMet^Φ/N-말단 분해신호로 인해 아세틸화 N-말단 규칙 경로로 분해되고, 비아세틸화 ML-Msn4_ha는 Met^Φ/N-말단 분해신호로 인해 아르기닐화 N-말단 규칙 경로로 분해됨을 단적으로 보여준다. 이에 더하여, naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서 보이는 ML-Msn4_ha의현저한 양적 증가와 안정화는 두 분해 경로의 차단에 의해 단백질 분해가 저해되어 나타나는 현상임을 알 수 있다.As shown in FIGS. 4A and 4B, the ML-Msn4 _ha was rapidly degraded in the wild type and the degradation rate was relatively slow in the ubr1 Δ strain, which was confirmed from the CHX-chase analysis experiment. Further, in naa30 Δ strain also the decomposition of said ML-Msn4 _ha slower than wild type, the naa30 ubr1 Δ Δ Δ strains or isolates ubr1 from naa30 Δ It was confirmed that the decomposition rate was significantly slower. The above results indicate that only a portion of ML-Msn4 _ha produced in yeast cells is N-terminal acetylated and degraded to the acetylated N-terminal regular pathway due to the AcMet ^Φ / N-terminal degradation signal, Msn4 _ha is shown to degrade into arginylated N-terminal conformational pathway due to the Met ^Φ / N-terminal breakdown signal. In addition, seen in naa30 ubr1 Δ Δ strain of ML-Msn4 _ha Significant quantitative increase and stabilization can be seen as inhibition of protein degradation by blockage of two degradation pathways.

또한, 도 4C 및 4D에 나타낸 바와 같이, ML-Msn4_ha의 두 번째 잔기가 류신에서 라이신으로 치환된 MK-Msn4_ha는 naa30 Δ 균주에서 분해가 거의 되지 않음을 보여, 모델 리포터 단백질을 이용한 상기의 실험결과들과 동일한 결과를 보였다.
As shown in Figs. 4C and 4D, MK-Msn4 _ha in which the second residue of ML-Msn4 _ha was replaced with lysine in leucine showed almost no degradation in naa30 ? Strain, The results are the same as the experimental results.

<5-2> <5-2> Sry1Sry1 단백질 protein

35kDa의 Sry1 (MI-Sry1_ha)은 N-말단이 메티오닌-이소류신으로 시작되며, 3-hydroxyaspartate 탈수효소 (dehydratase)로 미생물에게 잠재적으로 독성이 있는 대사물질인 3-hydroxyaspartate를 옥살로아세테이트와 암모니아로 변환하는 중요한 단백질이다. The 35 kDa Sry1 (MI-Sry1 _ha ) begins with methionine-isoleucine at the N-terminus and is a 3-hydroxyaspartate dehydratase, a 3-hydroxyaspartate metabolite that is potentially toxic to microorganisms. It is an important protein to convert.

본 발명자들은, 명확한 검증을 위하여, 상기하였던 낮은 복제수를 갖는 플라스미드에서 CUP1 프로모터 조절 하의 외생적 발현 조건과 함께 유전체 내에서 SRY1 프로모터 조절 하의 내생적 발현 조건에서 각각 MI-Sry1_ha의 분해 정도를 분석하였다.The inventors have, for the specific test, analyze the degradation degree of the endogenous expression conditions under SRY1 promoter control in the dielectric with the exogenous expression conditions under CUP1 promoter control in having a low copy number who plasmid each MI-Sry1 _ha Respectively.

CHX-chases 분석 실험 결과, 도 6E에 나타낸 바와 같이, 외생적으로 발현된 MI-Sry1_ha는 wild type과 naa30 Δ 균주에서 단백질 발현 수준 자체가 상당히 낮음을 보여, 단백질의 분해가 상당히 빠른 속도로 진행됨을 확인하였다. 이에 반하여, ubr1 Δ와 ubr1 Δ naa30 Δ 균주에서 MI-Sry1_ha의 단백질 발현 수준은 wild typed이나 naa30 Δ 균주에 비해 약 25배 이상 높았고, 단백질의 분해 역시 현저히 느려짐을 보였다. 이와 더불어, 도 6F에 나타낸 바와 같이, naa30 Δ와 naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서 외생적으로 발현된 MI-Sry1_ha의 ³⁵S-pulse-chases 분석 실험 역시, CHX-chases 분석 실험과 동일한 결과를 보였다. MI - SRY1의 mRNA 발현양은, 도 7D에 나타낸 바와 같이, 각 균주에서 모두 동일한 수준을 보여, 상기의 결과들은 모두 단백질의 분해 정도에 의한 것임을 확인하였다. As shown in FIG. 6E, CHX-chase analysis showed that the expression level of exogenously expressed MI-Sry1 _ha in the wild type and naa30 Δ strain was very low, and protein degradation proceeded at a remarkably rapid rate Respectively. In contrast, the level of protein expression of MI-Sry1 _ha in ubr1 Δ and ubr1 Δ naa30 Δ strains was about 25 times higher than that of wild-typed or naa30 Δ strains, and protein degradation was also significantly slower. In addition, as shown in Fig. 6F, showed naa30 Δ and naa30 Δ ubr1 Δ expressed from the exogenously strain MI-Sry1 _ha of ³⁵ S-pulse-chases Assay too, the same result as CHX-chases Assay. MI - SRY1 's As shown in Fig. 7D, the amount of mRNA expression was the same in all strains, and all of the above results were confirmed to be due to the degree of protein degradation.

또한, 도 5D에 나타낸 바와 같이, 내생적으로 발현된 MI-Sry1_ha3 (3개의 HA-에피토프가 C-말단에 표지되어 있음)의 CHX-chases 분석 실험에서도 외생적으로 발현된 MI-Sry1_ha와동일한 양상을 보였다. 내생적으로 발현된 MI - SRY1의 mRNA 발현양도 naa30Δ와 naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서 모두 동일한 수준을 보여, 상기의 결과들은 모두 외생적 발현 시와 동일하게 단백질의 분해 정도에 의한 것임을 확인하였다.In addition, as shown in Fig. 5D, endogenously expressed MI-Sry1 _ha3 (Three HA-epitopes were labeled at the C-terminus), the CHX-chases assay also revealed that exogenously expressed MI-Sry1 _ha Respectively. Of endogenously expressed MI - SRY1 show the same level of both the mRNA expression and transfer naa30Δ naa30 ubr1 Δ Δ strain, the above results it was confirmed that both of the degree of degradation of the same protein when the exogenous expression.

이와 더불어, naa30 Δ 균주에서, 다시 말해 NatC N-말단 아세틸라아제 복합체가 결핍된 균주에서 두 번째 아미노산인 이소류신이 라이신으로 치환된 MK-Sry1_ha는, 도 5C에 나타낸 바와 같이, MI-Sry1_ha에 비해 분해 속도가 현저히 느려짐을 보였다. 이는 N-말단이 비아세틸화된 상태에서 메티오닌 다음에 라이신이 위치할 경우, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로에 의해서도 단백질이 분해되지 않을 수 있음을 보여준다.
In addition, MK-Sry1 _ha in which a second amino acid is replaced with lysine in the naa30 ? Strain, i.e. , the strain lacking the NatC N-terminal acetylase complex, was found to be MI-Sry1 _ha The decomposition rate was significantly slower than that of This shows that if the lysine is located after the methionine in the non-acetylated state of the N-terminus, the protein may not be degraded by the arginylated N-terminal regular pathway.

<5-3> <5-3> Arl3Arl3 단백질 protein

22kDa의 Arl3 (MF-Arl3_ha2)는 N-말단이 메티오닌-페닐알라닌으로 시작되며, 골지와 연결된 세포질 내 GTPase 단백질이다. Arl3의 N-말단 아세틸화는 Arl3를 골지로 타켓팅하기 위해 필요한 것으로 알려져 있다.The 22 kDa Arl3 (MF-Arl3 _ha2 ) is a cytoplasmic GTPase protein that starts with methionine-phenylalanine at the N-terminus and is linked to Golgi. N-terminal acetylation of Arl3 is known to be necessary for targeting Arl3 to Golgi.

CHX chases 분석 실험 결과, 도 4E에 나타낸 바와 같이, MF-Arl3_ha2는 naa30Δ 균주에서 반감기가 35분 이하로 단백질의 분해가 상당히 빠르게 일어났고, 이를 통해 비아세틸화된 Met-Φ 단백질은 Met^Φ/N-말단 분해 신호로 인해 아르기닐화 N-말단 분해 경로에 의해 분해됨을 확인하였다. 상기의 실시예들과 마찬가지로, 두 번째 아미노산인 페닐알라닌이 라이신으로 치환된 MK-Arl3_ha2는 naa30Δ 균주에서 상당히 안정화되는 양상을 보여, MK-Arl3_ha2 역시 아르기닐화 N-말단 경로에 의해 분해되지 않을 수 있음을 확인하였다.
CHX chases analysis results, also, MF-Arl3 _ha2 woke the decomposition of the protein quite rapidly below the half-life of 35 minutes up from naa30Δ strain, which the non-acetylated Met-Φ protein through, as shown in 4E is Met ^Φ / Terminal degradation pathway due to the N-terminal degradation signal. As in the above examples, MK-Arl3 _ha2 in which the phenylalanine, which is the second amino acid, was substituted with lysine was stabilized in the naa30Δ strain, and MK-Arl3 _ha2 was also not degraded by the _arginylated N-terminal pathway Respectively.

<5-4> <5-4> Pre5Pre5 단백질 protein

25kDA의 Pre5 (MF-Pre5_ha)는 N-말단이 메티오닌-페닐알라닌으로 시작되는 20S 프로테아좀 복합체의 단위체 단백질이다.25 kDa Pre5 (MF-Pre5 _ha ) is a 20S proteasome monomeric protein whose N-terminus begins with methionine-phenylalanine.

상기의 실시예들과는 다르게, 도 5A에 나타낸 바와 같이, CHX-chases 분석 실험 결과에서 MF-Pre5_ha는 wild type에서도 반감기가 1시간 이상으로 분해가 지연됨을 보였고, 이는 ubr1 Δ, naa30 Δ ubr1 Δ 에서도 유사한 양상을 보였다. 반면에, naa30 Δ 균주에서 MF-Pre5_ha는 CHX-chases의 시작점에서도 감지할 수 없을 정도의 빠른 속도로 분해됨을 보였다. 새롭게 합성된 단백질의 분해 정도를 분석하는 ³⁵S-pulse-chases 결과 역시, 도 7A에 나타낸 바와 같이, MF-Pre5_ha가 naa30 Δ 균주에서는 빠르게 분해되나, naa30 Δ ubr1 Δ 균주에서는 상대적으로 분해가 지연됨을 확인하였다. 또한, 도 7F에 나타낸 바와 같이, 두 균주에서 MF - PRE5의 mRNA의 발현은 거의 동일함을 RT-PCR 분석을 통해 확인하여, 상기의 결과들에서 보이는 MF-Pre5_ha의 양상은 모두 단백질 분해에 의해서만 일어나는 현상임을 보였다.Unlike the above embodiments, as shown in Fig. 5A, CHX-chases Assay results from the MF-Pre5 _ha showed a decomposition is delayed by more than the half-life is one hour in the wild type, which ubr1 Δ, naa30 Δ ubr1 Δ in Showed similar pattern. On the other hand, MF-Pre5 _ha in the naa30 Δ strain was degraded at an undetectable rate at the beginning of CHX-chases. Results newly analyzing the decomposition degree of the synthesized protein ³⁵ S-pulse-chases, too, as shown in Fig. 7A, MF-Pre5 _ha is naa30 the Δ strain but rapidly decompose, naa30 Δ ubr1 Δ strain in the relative degradation is delayed by Respectively. As shown in FIG. 7F, the expression of MF - PRE5 mRNA was almost identical in both strains, and RT-PCR analysis confirmed that the MF-Pre5 _ha expression in the above results is due to proteolysis This is a phenomenon that only happens by.

MF-Pre5_ha가wild type에서는 분해가 지연되나, naa30 Δ 균주에서 분해가 빠르게 진행되는 양상은 Pre5가 20S 프로테아좀 복합체의 단위체인 관점에서 설명될 수 있다. N-말단 아세틸화는 단백질 분해 신호로서의 작용뿐 아니라 단백질 간의 상호작용에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 wild type에서의 MF-Pre5_ha의 분해 지연은, 도 9A에 나타낸 바와 같이, N-말단 아세틸화에 따른 단백질의 상호작용으로 Ac/N-말단 분해 신호가 가려짐 (shielding)에 의한 것으로 볼 수 있다. 또한, naa30 Δ 균주에서 보이는 MF-Pre5_ha의 분해 가속은 N-말단 비아세틸화에 의해 단백질 상호 작용이 제거되어 노출된 Met^Φ/N-말단 신호로 인해 아르기닐화 N-말단 규칙 경로에 의해 MF-Pre5_ha가 분해되는 것으로 볼 수 있다. 이는 AcMet^Φ/N-말단 분해신호와 MetΦ/N-말단 분해 신호가, 도 9B에 나타낸 바와 같이, 조건부로 작용하여 단백질 복합체의 단위체 리모델링에 이용될 수 있음을 보이는 강력한 예시이다. 또한, 이러한 단백질 분해의 조건부 작용은 naa30 Δ 균주가 보이는 느린 성장 속도를 부분적으로 설명할 수 있다.MF-Pre5 _ha Although the degradation is delayed in the wild type, the rapid degradation in the naa30 Δ strain can be explained in terms of the unit of the 20S proteasome complex of Pre5. N-terminal acetylation is known to play an important role not only as a proteolytic signal, but also in protein interactions. Thus, the delayed degradation of MF-Pre 5 _ha in the wild type is due to the shielding of the Ac / N-terminal degradation signal due to the interaction of proteins with N-terminal acetylation as shown in FIG. 9A . In addition, the accelerating degradation of MF-Pre5 _ha seen in the naa30 Δ strain was due to the N-terminal deacetylation of which protein interactions were removed, resulting in an arginylated N-terminal conformation pathway due to the exposed Met ^Φ / It can be seen that MF-Pre 5 _ha is degraded. This is a powerful example showing that the AcMet ^Φ / N-terminal degradation signal and the Met ^Φ / N-terminal degradation signal can be used to remodel the protein complex by acting conditionally, as shown in FIG. 9B. In addition, the conditional action of this proteolysis can partly explain the slow growth rate of naa30 ? Strain.

이에, 본 발명자들은 MF-Pre5의 과량발현이 naa30 Δ 균주의 느린 성장 속도에 미치는 영향에 대해 실험을 수행하였다. 프로테아좀의 활성에 대한 세포의 성장 의존도를 증가시키기 위해 37°C의 배양 조건에서의 성장 속도를 비교해 본 결과, 도 5B에 나타낸 바와 같이, MF-Pre5의 과발현에 의해 naa30 Δ 균주의 성장 속도는 wild type과 대비하여 50-85%가 회복되었으며, 이는 MF-Pre5를 과량발현하지 않은 naa30 Δ ubr1 Δ 균주의 성장 속도와 거의 동일한 것으로 확인되었다. Thus, the present inventors conducted an experiment on the effect of overexpression of MF-Pre5 on the slow growth rate of naa30 ? Strain. In order to increase the dependence of the cell growth on the proteasome activity, the growth rate at 37 ° C was compared. As a result, as shown in FIG. 5B, the growth rate of naa30 Δ strain by overexpression of MF- by 50-85% it was recovered, which was confirmed to be substantially the same as the MF-Pre5 growth rate of the excess is not expressed naa30 ubr1 Δ Δ strain compared with the wild type.

상기로부터, naa30 Δ 균주의 느린 성장 속도는 부분적으로 Met-Φ 단백질들이 Met^Φ/N-말단 분해 신호로 인해 아르기닐화 N-말단 규칙 경로로 빠른 속도로 분해되어 일어나는 현상임을 알 수 있다.
From the above, it can be seen that the slow growth rate of the naa30 Δ strain is partly due to the rapid degradation of the Met-Φ proteins into the arginylated N-terminal conformation pathway due to the Met ^Φ / N terminal degradation signal.

Ubr1Ubr1 과 and NatCNatC N-말단 N-terminal 아세틸라아제Acetylase 복합체의 결핍상태에서 보이는 세포의 스트레스 과민성 Stress Sensitivity of Cells in the Deficient Condition of the Complex

상기 실시예들에서의 실험결과로부터, AcMet^Φ/N-말단 분해신호와 MetΦ/N-말단 분해 신호는 세포의 생장에 있어 중요한 역할을 수행할 것임을 쉽게 예측할 수 있다. 이는 각각의 분해 경로를 제거한 세포가 보이는 스트레스 과민성을 통해 쉽게 확인될 수 있을 것으로 예측되었다.From the experimental results in the above examples, it can be easily predicted that AcMet ^Φ / N-terminal degradation signal and Met ^Φ / N-terminal degradation signal will play an important role in cell growth. It was predicted that the stress - sensitivities of the cells that removed each degradation pathway could be easily identified.

세포가 스트레스를 받는 환경을 조성하기 위하여, 잘못된 접힘을 갖는 단백질을 생성하게 하는 아미노산 유사체 (Canavanine, 2-azetidinecarboxylic acid), 세포막이나 기타 다른 구조체를 교란하는 에탄올, 세포벽 합성을 저해하는 Congo Red 또는 Calcofluor White를 각각 처리한 배지를 제작하였고, 해당 배지에서 각 세포의 성장을 관찰하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 아르기닐화 N-말단 규칙 경로나 아세틸화 N-말단 규칙 경로가 제거된 효모들은 wild type에 비하여 여러 스트레스들에 과민성을 보였고, 두 경로 모두가 제거된 naa30 Δ ubr1 Δ 효모는 naa30 Δ나 ubr1 Δ에 비해 현저하게 높아진 스트레스 과민성을 보였다.
In order to create a stressed environment, it is necessary to use amino acids (Canavanine, 2-azetidinecarboxylic acid), ethanol that disrupt cell membranes or other structures, Congo Red or Calcofluor White, respectively, and the growth of each cell was observed in the medium. 6, the aralkyl group N- terminal biotinylated Rule Name and Rule Name N- terminal acetylation is removed yeast are showed sensitization to various stresses compared to the wild type, both the two paths is removed naa30 ubr1 Δ Δ Yeast is naa30 ? and ubr1 Δ .

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

Claims

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As a method for inducing proteolysis by placing tyrosine next to N-terminal methionine in a protein,
The protein is characterized in that the N-terminal is non-acetylated and is polyubiquitinated by E3 ubiquitin ligase containing Ubr1, which is N-recognin in the arginyl N-terminal regular pathway .

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