KR101659329B1 - 아플라톡신과 시클로피아존산을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장 - Google Patents

아플라톡신과 시클로피아존산을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아플라톡신과 시클로피아존산을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장에 관한 것으로, 아플라톡신과 시클로피아존산 생성 여부를 비교적 간단한 방법을 통해 신속하게 선별할 수 있다. 또한, 선별된 균주를 실제 식품에 적용시켜 본 결과, 실험과 동일하게 곰팡이 독소 미검출이 확인되어 안정성이 입증되었다.

Description

아플라톡신과 시클로피아존산을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장 {Screening method of strain not to produce aflatoxin, cyclopiazonic acid and mycotoxin free soybean paste therefrom}
본 발명은 아플라톡신(aflatoxin)과 시클로피아존산(cyclopiazonic acid)을 생산하지 않는 균주의 선별 방법 및 이를 이용하여 선별된 균주로 발효하여 제조된 무독소 된장에 관한 것이다.
미생물로 발효하여 제조되는 발효 식품의 경우, 미생물이 분비하는 독소들로 인해 식품 안정성이 위협받고 있는데, 장류를 이용한 음식을 빈번히 섭취하는 식문화를 갖는 우리나라에서 발효 식품의 안전성에 대한 체계적인 연구는 매우 시급하다.
유럽식품안전청은 안전하다고 여겨지는 기준인 QPS의 현황에 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae, 황국균)를 포함시키지 않고 있는데, 2009년 QPS에 등재되었을 때부터 시작하여 가장 최근에 보고된 2013년 보고서에서도 QPS 현황에 이 균을 포함시키지 않고 있는 실정이다(Aspergillus oryzae: Potential for mycotoxin production, therefore not suitable for QPS status).
또한, 이 균을 이용하여 발효 식품을 제조하여 섭취하는 한국을 비롯한 아시아에서도 이 균들의 이용을 재평가해야 한다는 주장들이 제기되고 있기도 하다. 실제로, 전통 발효 식품인 된장에 오랜 기간 사용되어 안전하다고 여겨져 온 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)에서, 다양한 곰팡이독소 (mycotoxin)의 생성능이 보고된 바가 있기도 하다.
따라서, 곰팡이독소의 문제로 말미암은 전통 발효식품에 대한 안전성을 확보하기 위해서는, 아플라톡신과 시클로피아존을 포함하는 곰팡이독소에 대한 연구가 더욱 필요하다.
대한민국 특허공개번호 제10-2014-0034004호 (공개일자: 2014년 03월 19일)에는, 신규한 아플라톡신 B1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 B1 검출용 키트가 기재되어 있다. 대한민국 특허등록번호 제10-0948589호 (등록일자: 2010년 03월 12일)에는, 다양한 식품 속에 저농도로 존재하는 마이코톡신을 분리 및 정제한 후 금속기판 위에 흡착시켜 이차이온 질량분석기로 마이코톡신을 분석하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명에서는 곰팡이독소로 말미암은 발효 식품의 안전성 문제를 해결하고자, 다중복합 PCR 분석법과 HPLC 분석법을 이용하여 곰팡이독소인 아플라톡신, 시클로피아존산(CPA)을 생산하지 않는 균주를 선별할 수 있는 방법을 제공하고, 이를 통해 선별된 균주를 된장 제조를 위한 스타터로 이용함으로써, 발효 식품의 안전성을 확보하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 곰팡이독소 생성 균주 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
한편, 상기 본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 곰팡이독소는 일 예로 B1, 아플라톡신 B2, 아플라톡신 G1, 아플라톡신 G2, 시클로피아존산(cyclopiazonic acid) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하며, 아플라톡신 B1, 아플라톡신 B2, 아플라톡신 G1, 아플라톡신 G2, 시클로피아존산(cyclopiazonic acid) 중 선택되는 어느 하나 이상의 곰팡이독소를 생성하지 않는 균주의 선별 방법을 제공한다.
한편, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하며, 아플라톡신 B1, 아플라톡신 B2, 아플라톡신 G1, 아플라톡신 G2, 시클로피아존산(cyclopiazonic acid) 중 선택되는 어느 하나 이상의 곰팡이독소를 생성하지 않는 균주의 선별 방법은, 본 발명의 프라이머 세트를 사용함에 특징이 있고, 균주 선별시 사용하는 PCR 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 PCR 방법을 이용할 수 있으므로, PCR에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
한편, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하며, 아플라톡신 B1, 아플라톡신 B2, 아플라톡신 G1, 아플라톡신 G2, 시클로피아존산(cyclopiazonic acid) 중 선택되는 어느 하나 이상의 곰팡이독소를 생성하지 않는 균주의 선별 방법에 있어서, 상기 균주는 일 예로 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 또는 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus)일 수 있다.
삭제
본 발명에서 개발한 프라미어 세트를 이용할 경우, 아플라톡신, 시클로피아존산 비생성 균주를 경제적이고, 간단한 방법을 통해 신속하게 선별할 수 있다. 또한, 이와 같은 방법을 통해 선별한 균주를 실제 적용 모델인 된장에 적용시켜 본 결과, 예측한 결과와 동일하게 나와, 실제 제품에도 충분히 적용 가능한 것으로 판단되었다.
도 1은 아스퍼질러스(Aspergillus) 균주로부터 아플라톡신의 검출을 위한 다중 복합 PCR 분석 결과이다. 도 1의 (A)는 omtB , aflR, ver -1 및 omtA에 대한 PCR 결과이고, 도 1의 (B)는 aflR, ver -1 에 대한 PCR 결과이며, 도 1의 (C)는, 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 또는 아스퍼질러스 플라부스 (A. flavus)에 대한 동정(identification) 결과이다.
도 2는 아스퍼질러스 균주로부터 유래한 아플라톡신 G1, B1, G2 및 B2의 HPLC 결과값에 대한 스탠다드 유효 분석 결과이다.
도 3은 아스퍼질러스 균주 유래의 CPA 검출을 위한 분석 결과이다. 도 3의 A는 maoA에 대한 PCR 결과이고, 도 3의 B는 dmaT에 대한 PCR 결과이며, 도 3의 C는 pks-nrps에 대한 PCR 결과이다. 도 3의 D는 대조군으로 사용된 베타-투불린(β-tubulin) 유전자에 대한 PCR 결과이다.
도 4는 곰팡이독소가 없는 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 중 우수한 된장 제조능을 갖는 균주를 선별하고자, 단백질분해효소(protease) 활성 평가를 수행한 결과이다. 도 4의 (A)는 결과값의 스탠다드에 대한 유효화 여부를 보여주며, 도 4의 (B)는 5종 균주에 대한 상대적인 단백질분해효소 활성을 나타낸다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 본 발명에서 개발한 프라이머를 이용한 아플라톡신 , 시클로피아존산 비 생산 무독성 균주의 선별]
(1) 아플라톡신 , 시클로피아존산 비생산 균주의 선별
아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) 41 종에 대해, 본 발명에서 개발한 프라이머 세트를 적용하여, 다중 복합 유전자 분석 기법과 HPLC 분석법을 통해, 아플라톡신(아플라톡신B1, 아플라톡신B2, 아플라톡신G1, 아플라톡신 G2)과 시클로피아존산(cyclopiazonic acid, CPA) 비생성 균주를 선별하고자 하였다.
상기 두 종류의 곰팡이독소 유전자에 특이적인 프라이머 세트는 표 1에 나타내었다. 우선, 아플라톡신 생합성에 필수적인 구조 유전자와 조절 유전자 총 4개 (omtB, aflR , ver -1, omtA)를 선택하였다. 또한, CPA 독소 생성 가능성을 선별해 내기 위한 유전자로는 3개 (maoA , dmaT , pks - nrps) 를 선택하였다. 또한, 이 분석에서 사용한 곰팡이 종이 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 또는 플라부스 (A. flavus) 인지 확인하기 위해, 종 특이적인 유전자(pepO)에 대한 프라이머를 채택하여 PCR을 수행하였다.
본 발명의 프라이머 세트
프라이머 시퀀스 (5′>3′) Amplicon
(bp)		 유전자 서열목록
PEPO1 CGACGTCTACAAGCCTTCTGGAAA 200
 pepO
서열번호 15
PEPO2 CAGCAGACCGTCATTGTTCTTGTC 서열번호 16
omtB(F)-F GCCTTGACATGGAAACCATC 1333
 omtB 서열번호 1
omtB(F)-R CCAAGATGGCCTGCTCTTTA 서열번호 2
aflR1 TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG 1032
 aflR 서열번호 3
aflR2 CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG 서열번호 4
ver-1F ATGTCGGATAATCACCGTTTAGATGGC 895
 ver -1 서열번호 5
ver-1R CGAAAAGCGCCACCATCCACCCCAATG 서열번호 6
omt1 GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC 797
 omtA 서열번호 7
omt2 GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG 서열번호 8
maoA F GACCGTCGCTGTCGTTGAAC 462
 maoA 서열번호 9
maoA R ACTCCGATGTACTGAATGACG 서열번호 10
dmaT F GTCTCTGGATCGTTCCGTCG 765
 dmaT 서열번호 11
dmaT R GTATAGCACAGCTCCGATGT 서열번호 12
pks F GTATAGCACAGCTCCGATGT 986
 pks - nrps 서열번호 13
pks R GAATGCAAGGAGCCTCTCGT 서열번호 14
1) 아플라톡신에 대한 PCR 조건은, 95℃에서 4분 동안 초기 디내추레이션(denaturation); 95℃에서 1분 동안 35 사이클의 디내추레이션, 57℃에서 1분 동안 어니얼링(annealing), 72℃에서 1분 동안 익스텐션(extension); 72℃에서 7분 동안 파이널 익스텐션 (final extension)임.
2) CPA에 대한 PCR 조건은, 95℃에서 1분 동안 초기 디내추레이션; 94℃에서 30초 동안 30 사이클의 디내추레이션, 55℃에서 30초 동안 어니얼링, 72℃에서 1분 동안 익스텐션; 72℃에서 5분 동안 파이널 익스텐션임.
실험 결과, 아플라톡신 관련 유전자의 발현은 다중 복합(multiplex) PCR을 통해 확인되었고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 아스퍼질러스(Aspergillus) 균주로부터 아플라톡신의 검출을 위한 다중 복합 PCR 분석 결과이다. 도 1에서 다양한 PCR 산물에 대해 화살표로 각각 표시하고, 해당 유전자 명칭을 기재하였다. M은 100 bp DNA ladder를 의미하고; C는 주형(template)을 사용하지 않은 PCR 대조군을 의미한다. 1, FMB S41403; 2, FMB S41735; 3, FMB S40250; 4, FMB S44995; 5, FMB S44999; 6, FMB S41730; 7, FMB S40247; 8, FMB S44246; 9, FMB S46471; 10, FMB S41736; 11, FMB S40244; 12, FMB S40233; 13, FMB S995; 14, FMB S859; 15, FMB S998; 16, FMB S955; 17, FMB S954; 18, FMB S40234; 19, FMB S888; 20, FMB S40280; 21, FMB S46497; 22, FMB S42589.
도 1의 (A)에서는, omtB , aflR, ver -1 및 omtA에 대한 다중 복합 PCR이 19종의 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 또는 아스퍼질러스 플라부스 (A. flavus)에 대해 수행되었다. lane 18 및 19는 lane 1~17과 비교하여 특징적으로 다른 사이즈의 PCR 밴드를 보여준다.
도 1의 (B)에서는, 모든 종에 포함되어 있는 omtB , omtA 유전자를 제외하고, 2개의 유전자 aflR, ver -1 에 대한 다중 복합 PCR이 17 종의 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 또는 아스퍼질러스 플라부스 (A. flavus)에 대해 수행되었다. 17종 중에서 5종만이 4개의 유전자가 모두 존재하는 결과를 보였다.
도 1의 (C)에서는, 22 종의 아스퍼질러스 균주에 대해 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 또는 아스퍼질러스 플라부스 (A. flavus)의 동정(identification)이 수행되었다. 종 특이적인 유전자 보유 패턴을 확인함으로써, 본 실험에 사용된 19종이 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 또는 아스퍼질러스 플라부스 (A. flavus) 종으로 확인되었다.
이상의 결과로부터, 다른 사이즈의 PCR 밴드 패턴을 보인 2개의 종을 포함하여, 아플라톡신 생합성에 관여하는 유전자의 존재를 보이지 않은 14종의 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae)가 아플라톡신 생합성능이 없을 것으로 예측하고, 1차 선별을 완료하였다.
한편, 다음 단계로서 아플라톡신 생성능을 최종 확인하기 위해 HPLC 분석을 실시하였다. 그 결과, 4개의 아플라톡신 생합성 유전자 모두에 대해 PCR 밴드가 확인된 5종의 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 중 1종의 FMB S41403에서만 아플라톡신이 검출되고, 나머지에서는 검출되지 않았다. 곰팡이독소 생합성 유전자 중 한 개라도 존재가 확인되지 않은 균주는 HPLC 분석 결과에서 독소 생산이 음성으로 확인되었다.
HPLC에 대한 분석 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 표 2는 총 아플라톡신에 대한 HPLC의 종합적인 결과, 반복 횟수 및 검출 수준을 나타낸다. 총 아플라톡신의 검출에 대해 '+'는 양성, '-'는 음성을 나타낸다. Repeat 1, Repeat 2 및 Repeat 3는 비희석, 1/2 희석, 1/10 희석 샘플에 대한 검출 값을 의미한다. 도 2는 HPLC 결과값에 대한 스탠다드 유효 분석의 결과를 보여준다.
아플라톡신에 대한 HPLC의 종합적인 결과, 반복 횟수 및 총 검출 수준
균주 Repeat
1		 Repeat
2 		Repeat
3		 HPLC의
종합적인 결과
검출 수준 (ppb)
FMB S41403 +
AFB1, 53.90; AFB2, 0.67		 +
AFB1, 26.90;
AFB2, 0.29		 +
AFB1, 2.91;
AFB2, 0.03		 + (AFB1, AFB2)
FMB S41735 - - - -
FMB S40250 - - - -
FMB S44995 - - - -
FMB S44999 - - - -
FMB S41730 - - - -
FMB S40247 - - - -
FMB S46471 - - - -
FMB S44246 - - - -
FMB S41736 - - - -
FMB S40244 - - - -
FMB S40233 - - - -
FMB S995 - - - -
FMB S859 - - - -
FMB S998 - - - -
FMB S955 - - - -
FMB S954 - - - -
FMB S40234 - - - -
FMB S888 - - - -
아플라톡신 검출을 위한 PCR 및 HPLC 결과 요약
근원 균주 아플라톡신 유전자 클러스터의 PCR
(omtB / aflR / ver -1/ omtA)		 아플라톡신에 대한 종합적인 PCR 결과 HPLC
(총 아플라톡신)
대막장
(Daemacjang)1 		A. flavus
FMB S41403		 +/+/+/+ 4 bands + (AFB1, AFB2)
판매되는 전통 누룩
(Traditional nuruk in market)		 A. oryzae
FMB S41735		 +/+/+/+ 4 bands -
메주
(Meju)		 A. oryzae
FMB S40250		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
간장
(Soy sauce)		 A. oryzae
FMB S44995		 +/+/+/+ 4 bands -
중국 간장
(Chinese soy sauce)		 A. oryzae
FMB S44999		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
판매되는 전통 누룩
(Traditional nuruk in market)		 A. oryzae
FMB S41730		 +/+/+/+ 4 bands -
메주
(Meju)		 A. oryzae
FMB S40247		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
쌀
(Rice)		 A. oryzae
FMB S44246		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
메주
(Meju)		 A. oryzae
FMB S46471		 +/-/+/+ Missing aflR -
판매되는 전통 누룩
(Traditional nuruk in market)		 A. oryzae
FMB S41736		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
메주
(Meju)2 		A. oryzae
FMB S40244		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
누룩
(Nuruk)3 		A. oryzae
FMB S40233		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
ATCC16507 A. oryzae
FMB S995		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
ATCC14605 A. oryzae
FMB S859		 +/+/+/+ 4 bands -
시리얼
(Cereal)		 A. oryzae
FMB S998		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
정보없음 A. oryzae
FMB S955		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
정보없음 A. oryzae
FMB S954		 +/+/-/+ Missing ver -1 -
Nuruk A. oryzae
FMB S40234
4 other bands4 		-
ATCC22787 A. oryzae
FMB S888		 -
* Daemacjang1, 검은콩 페이스트; Meju2, 건조된 발효콩 블럭; Nuruk3, 전통적인 한국 발효 스타터; A. flavus , Aspergillus flavus; A. oryzae , Aspergillus oryzae; without, w/o; AFB1, aflatoxin B1; AFB2, aflatoxin B2; +, 아플라톡신 검출에 대해 양성; -, 아플라톡신 검출에 대해 음성. 4밴드 크기가 오리지날 아플라톡신 생합성 유전자와 다르게 나타남.
한편, 상기의 19종 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae)에 대해, 시클로피아존산(CPA)의 생합성능을 확인하고자, 3개의 유전자 maoA , dmaT , pks - nrps를 타겟으로 하여 PCR을 수행하였다. 유전자 분석 결과는 도 3에서 보는 바와 같이 나타났다.
도 3은 아스퍼질러스 균주 유래의 CPA 검출을 위한 PCR 분석 결과인데, 도 3의 A는 maoA에 대한 PCR 결과이고, 도 3의 B는 dmaT에 대한 PCR 결과이며, 도 3의 C는 pks - nrps에 대한 PCR 결과이다. 이때, 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) NBRC 4177 유전체 DNA가 양성 대조군으로 사용되었고, 베타-투불린(β- tubulin) 유전자가 PCR 대조군(도 3의 D)으로 사용되었다. 도 3에서 M은 100 bp DNA ladder를 나타내고, P는 PCR 양성 대조군, C는 주형(template)이 없는 PCR 음성 대조군을 나타낸다. 도 3에서 1, FMB S41403; 2, FMB S41735; 3, FMB S40250; 4, FMB S44995; 5, FMB S44999; 6, FMB S41730; 7, FMB S40247; 8, FMB S44246; 9, FMB S46471; 10, FMB S41736; 11, FMB S40244; 12, FMB S40233; 13, FMB S995; 14, FMB S859; 15, FMB S998; 16, FMB S955; 17, FMB S954; 18, FMB S40234; 19, FMB S888;을 의미함.
한편, 하기 표 4는 19종의 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 또는 아스퍼질러스 플라부스 (A. flavus)로부터 수득한 CPA 생성능 관련 유전자의 PCR 패턴 분석 및 HPLC 분석 결과에 대한 요약이다. HPLC 분석 결과, 종에 따라서 1배 농도에서는 CPA가 검출되지 않았더라도, 5배 농축한 샘플에서는 CPA가 검출되었다. 또한, 3개의 유전자 중 1개라도 PCR 밴드가 확인되지 않은 종은 CPA를 생산하지 않음이 HPLC 분석 결과를 통해 최종 확인되었다.
CPA 검출 확인을 위한 PCR 패턴 및 HPLC 분석
근원 균주 CPA 유전자 클러스터의 PCR
(maoA / dmaT / pks - nrps)		 CPA에 대한 종합적인 PCR 결과 HPLC
(CPAL/ CPAH)
대막장1 A. flavus
FMB S41403		 -/+/+ Missing maoA -/-
판매되는 전통 누룩 A. oryzae
FMB S41735		 +/+/+ 3 bands +/+
메주 A. oryzae
FMB S40250		 -/-/- Missing 3 bands -/-
간장 A. oryzae
FMB S44995		 +/-/- Missing dmaT , pks - nrps -/-
중국 간장 A. oryzae
FMB S44999		 +/+/+ 3 bands -/+
판매되는 전통 누룩 A. oryzae
FMB S41730		 +/+/+ 3 bands -/-
메주 A. oryzae
FMB S40247		 +/+/+ 3 bands -/-
쌀 A. oryzae
FMB S44246		 +/+/+ 3 bands -/-
메주 A. oryzae
FMB S46471		 -/-/- Missing 3 bands -/-
판매되는 전통 누룩 A. oryzae
FMB S41736		 -/+/+ Missing maoA -/-
메주2 A. oryzae
FMB S40244		 +/+/+ 3 bands -/+
누룩3 A. oryzae
FMB S40233		 +/+/+ 3 bands +/+
ATCC16507 A. oryzae
FMB S995		 +/+/+ 3 bands -/-
ATCC14605 A. oryzae
FMB S859		 +/+/+ 3 bands -/-
시리얼
(Cereal)		 A. oryzae
FMB S998		 -/+/- Missing maoA , pks - nrps -/-
정보 없음 A. oryzae
FMB S955		 +/+/+ 3 bands +/+
정보 없음 A. oryzae
FMB S954		 +/+/+ 3 bands +/+
누룩 A. oryzae
FMB S40234		 -/-/+ Missing maoA , dmaT -/-
ATCC22787 A. oryzae
FMB S888		 +/+/+ 3 bands +/+
* Daemacjang1, 검은콩 페이스트; Meju2, 건조된 발효콩 블럭; Nuruk3, 전통적인 한국의 발효 스타터; CPAL, 비농축 샘플에서의 검출 결과; CPAH, 5배 농축 샘플에서의 검출 결과; A. flavus , Aspergillus flavus; A. oryzae , Aspergillus oryzae; CPA, cyclopiazonic acid; +, 아플라톡신 검출에 대한 양성; -, 아플라톡신 검출에 대한 음성을 의미함.
1차로 확보한 19종의 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 또는 아스퍼질러스 플라부스(A. flavus) 중 아플라톡신과 CPA가 모두 검출되지 않은 종은 총 11종이었다. 이 종들은 무독성 메주 또는 된장 제조에 활용하기 위해 별도로 보관되었다.
한편, 2차로 확보한 23종에 대해 아플라톡신 생성능을 HPLC로 확인하였다. 하기 표 5에 해당 종에 대한 정보 및 HPLC 분석 결과를 나타내었다.
추가 23종의 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 균주에 대한 아플라톡신 검출 여부 (HPLC 분석 결과)
ID HPLC
(총 아플라톡신)
FMB S44847 -
FMB S45006 -
FMB S44989 -
FMB S44990 -
FMB S44994 -
FMB S45007 -
FMB S40242 -
FMB S45001 -
FMB S44992 -
FMB S44997 -
FMB S40232 -
FMB S44969 -
FMB S44823 -
FMB S45002 -
FMB S45107 -
FMB S44988 -
FMB S44968 -
FMB S44993 -
FMB S45004 -
FMB S44971 -
FMB S44966 -
FMB S44967 -
FMB S44991 -
* '-'는 아플락톡신 검출에 대한 음성을 의미함.
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 추가 23종의 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae)에서는 아플라톡신이 검출되지 않았다.
이상의 결과로부터, 1차에서 아플라톡신, CPA 동시 독소 비생성 균주로 확인된 11종과 2차로 선별한 23종의 아플라톡신 비생성 균주를 합하여 총 34종의 아플라톡신 비생성 균주를 확보할 수가 있었다.
(2) 아플라톡신 , 시클로피아존산 비생산 무독성 균주 중 단백질분해효소 활성이 우수한 균주의 선별
상기에서 선별한 무독성 균주 중 우수한 된장 제조능을 보유한 균주를 선별하고자 하였다. 유전자 분석 및 HPLC 분석 모두에서 아플라톡신과 CPA 생성능이 없는 것으로 선별된 5종의 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) FMB S40250, FMB S40234, FMB S41736, FMB S46471, FMB S998에 대해 단백질분해효소 활성을 측정하였다.
도 4는 곰팡이독소가 없는 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae)의 단백질분해효소(protease) 활성 평가 결과를 나타낸다. 도 4의 (A)는 결과값들의 스탠다드에 대한 유효화 여부를 보여주며, 도 4의 (B)는 5종의 상대적인 단백분해효소 활성을 나타낸다. 이때, 균을 접종하지 않은 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다.
실험 결과, 5종 중에서 'FMB S46471'가 가장 우수한 단백질분해효소 활성을 보였다. 따라서, FMB S46471 균주를 하기의 된장 제조에 이용하였다.
[ 실시예 2: 곰팡이독소 비생산 균주를 이용한 된장의 제조]
곰팡이독소인 아플라톡신과 시클로피아존산을 생산하지 않고, 단백질분해효소 활성도 우수한 균주인 상기의 FMB S46471 균주를 이용하여, 실제 적용 식품의 예인 된장을 제조한 후, 아플라톡신, 시클로피아존산의 생성 여부를 확인하고자 하였다.
안동 농협 메주 생산 라인에서 준비된 삶은 콩 (3.5kg)을 식힌 후 FMB S46471 (106 cells/g)을 접종하였다. 이후, 90일의 숙성시간이 지난 후, 제조된 된장에서 곰팡이독소의 생성 여부를 확인하였다. 그 결과는 HPLC 분석법으로 확인하였다 (표 6).
아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) FMB S46471로 발효된 된장에서 아플라톡신의 검출 여부 확인
샘플 총 아플라톡신
(AFG1,AFB1,AFG2,AFB2)
숙성 전 된장 N.D.
90일 숙성 후 된장 N.D.
1) AFG1, aflatoxin G1; AFB1, aflatoxin B1; AFG2, aflatoxin G2; AFB2, aflatoxin B2.
2) N.D., 비검출.
3) 결과값들은 두 번의 평균값으로 나타내었음.
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 90일 숙성 전 후의 된장에서 아플라톡신 (AFG1, AFG2, AFB1, AFB2)은 검출되지 않았다.
<110> BIFIDO CO., LTD. <120> Screening method of strain not to produce aflatoxin, cyclopiazonic acid and mycotoxin free soybean paste therefrom <130> AP-2014-0195 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of omtB <400> 1 gccttgacat ggaaaccatc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of omtB <400> 2 ccaagatggc ctgctcttta 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of aflR <400> 3 tatctccccc cgggcatctc ccgg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of aflR <400> 4 ccgtcagaca gccactggac acgg 24 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of ver-1 <400> 5 atgtcggata atcaccgttt agatggc 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of ver-1 <400> 6 cgaaaagcgc caccatccac cccaatg 27 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of omtA <400> 7 gtggacggac ctagtccgac atcac 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of omtA <400> 8 gtcggcgcca cgcactgggt tgggg 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of maoA <400> 9 gaccgtcgct gtcgttgaac 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of maoA <400> 10 actccgatgt actgaatgac g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of dmaT <400> 11 gtctctggat cgttccgtcg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of dmaT <400> 12 gtatagcaca gctccgatgt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of pks-nrps <400> 13 gtatagcaca gctccgatgt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of pks-nrps <400> 14 gaatgcaagg agcctctcgt 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of pepO <400> 15 cgacgtctac aagccttctg gaaa 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of pepO <400> 16 cagcagaccg tcattgttct tgtc 24

Claims (5)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 곰팡이독소 생성 균주 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 곰팡이독소는,
    아플라톡신 B1, 아플라톡신 B2, 아플라톡신 G1, 아플라톡신 G2, 시클로피아존산(cyclopiazonic acid) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 곰팡이독소 생성 균주 검출용 프라이머 세트.
  3. 제1항의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하며,
    아플라톡신 B1, 아플라톡신 B2, 아플라톡신 G1, 아플라톡신 G2, 시클로피아존산(cyclopiazonic acid) 중 선택되는 어느 하나 이상의 곰팡이독소를 생성하지 않는 균주의 선별 방법.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서,
    상기 균주는,
    아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 또는 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus)인 것을 특징으로 하는 아플라톡신 B1, 아플라톡신 B2, 아플라톡신 G1, 아플라톡신 G2, 시클로피아존산(cyclopiazonic acid) 중 선택되는 어느 하나 이상의 곰팡이독소를 생성하지 않는 균주의 선별 방법.
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