KR101654878B1 - Composition comprising SMOC1-derived EC Peptide for Promoting Osteoblast Differentiation and the use Thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 SMOC1의 EC(extracellular calcium binding) 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 조골세포 분화 촉진용 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로 보다 구체적으로는 SMOC1의 399-414번째 아미노산 부위를 유효성분으로 포함하는 조골세포 분화 촉진용 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 또한 줄기세포에 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포를 조골 세포로 분화를 촉진시키는 방법 및 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 스캐폴드와 인공 뼈 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드는 조골세포의 분화를 촉진하는 효과가 있으므로 이를 이용하여 뼈 재생을 위한 조직공학적 적용이 가능하다. 또한 뼈 형성 관련 질환의 치료나 뼈 재생을 위한 성장촉진용 첨가제 등으로 유용하게 이용될 수 있다. The present invention relates to a composition for promoting osteoblast differentiation promotion comprising a polypeptide consisting of an EC (extracellular calcium binding) domain fragment of SMOC1 and a use thereof, and more particularly to a composition for promoting osteoblast differentiation promoted by osteoblasts comprising the 399-414 amino acid region of SMOC1 as an active ingredient To a composition for promoting cell differentiation and a use thereof. A method for promoting the differentiation of stem cells into osteoblasts including a step of treating a stem cell with a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1 and a method for producing a scaffold and an artificial bone comprising a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1 . Since the polypeptide consisting of the EC domain fragment of SMOC1 of the present invention has an effect of promoting the differentiation of osteoblasts, tissue engineering application for bone regeneration is possible by using it. Also, it can be usefully used as a growth promoting additive for the treatment of bone formation-related diseases and bone regeneration.
Description
본 발명은 SMOC1의 EC(extracellular calcium binding) 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 조골세포 분화 촉진용 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로 보다 구체적으로는 SMOC1의 399-414번째 아미노산 부위를 유효성분으로 포함하는 조골세포 분화 촉진용 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 또한 줄기세포에 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포를 조골 세포로 분화를 촉진시키는 방법 및 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 스캐폴드와 인공 뼈에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for promoting osteoblast differentiation promotion comprising a polypeptide consisting of an EC (extracellular calcium binding) domain fragment of SMOC1 and a use thereof, and more particularly to a composition for promoting osteoblast differentiation promoted by osteoblasts comprising the 399-414 amino acid region of SMOC1 as an active ingredient To a composition for promoting cell differentiation and a use thereof. Also, the present invention relates to a method for promoting the differentiation of stem cells into osteoblasts, comprising the step of treating a stem cell with a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1, and a scaffold and an artificial bone comprising a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1 .
생리활성 펩타이드(biological active peptide)는 생체 내 효소 작용에 의해 가수분해되어 자연적으로 유도된 단백질보다 훨씬 짧은 아미노산 서열로서 단백질과는 다른 다양한 생리 기능을 나타낼 수 있다(Danquah MK et al., OA Biotechnology; 29:1-5, 2012). 생리활성 펩타이드는 단백질 혹은 화학물질에 비해 그 안정성이 우수하고, 극히 짧은 서열만으로도 유효한 활성을 나타내며 소량으로도 우수한 기능적 효능을 가지는 것이 특징이다. 최근에는 생체내 자연적인 생리활성 펩타이드 뿐만 아니라 특정 단백질의 활성을 가지는 영역을 기반으로 합성 생리 활성 펩타이드를 제작하여 그 효과를 제시하고 있다. Biologically active peptides can exhibit a variety of physiological functions different from proteins as amino acid sequences much shorter than naturally derived proteins hydrolyzed by enzymatic action in vivo (Danquah MK et al., OA Biotechnology; 29: 1-5, 2012). Physiologically active peptides are excellent in stability compared to proteins or chemical substances, and exhibit effective activities with only a very short sequence, and have excellent functional effects even in small amounts. Recently, synthetic physiologically active peptides have been produced based on not only natural physiologically active peptides in vivo but also regions having a specific protein activity, and propose their effects.
현재까지 뼈 생성 및 조골세포 분화를 조절하는 효과적인 다양한 생리 활성 펩타이드들이 보고되고 있는데, 대표적인 펩타이드로는 알지닌-글라이신-아스파릭 산(arginine-glycine-aspartic acid, RGD) 아미노산 서열을 포함하는 다양한 펩타이드들을 들 수 있다. RGD 서열은 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 비트로넥틴(vitronectin)과 같은 세포외 기질(ECM) 단백질의 수용체인 인테그린(integrin)이 결합하는 아미노산 서열이다. 이 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩타이드들은 골수 간엽줄기세포의 부착이나 spreading, 분화를 조절할 수 있음이 알려져 있다(Villard V, Kalyuzhniy O, Riccio O, et al:.J Pept Sci ;12:206-212, 2006). Various physiologically active peptides effective to control bone formation and osteoblast differentiation have been reported so far. Representative peptides include various peptides including amino acid sequences of arginine-glycine-aspartic acid (RGD) . The RGD sequence is an amino acid sequence that binds integrin, a receptor for extracellular matrix (ECM) proteins such as fibronectin, laminin, collagen, and vitronectin. It is known that synthetic peptides containing this amino acid sequence can control the attachment, spreading and differentiation of mesenchymal stem cells (Villard V, Kalyuzhniy O, Riccio O, et al .: J Pept Sci; 12: 206-212, 2006).
최근 골 발생에 필수적인 단백질인 bone morphogenic protein-2(BMP-2) 단백질의 활성 서열 내에 두 개의 라이신 잔기를 포함하는 epitope (KASSVPTELSAISTLYL)을 기반으로한 cg-BMP-2 knuckl 에피토프 펩타이드가 2D 표면과 3D 알지네이트 하이드로겔(alginate hydrogel)에 적용되었을 때 골수줄기세포의 조골세포로의 분화를 촉진함이 보고되었다(Madl CM et al., Biomacromolecules; 15:445-455, 2014). Recently, cG-BMP-2 knuckl epitope peptide based on epitope (KASSVPTELSAISTLYL) containing two lysine residues in the active sequence of bone morphogenic protein-2 (BMP-2) (Madl CM et al., Biomacromolecules; 15: 445-455, 2014), when applied to alginate hydrogel, to promote the differentiation of bone marrow stem cells into osteoblasts.
이와 더불어, 조골세포 분화의 표지자인 오스테오넥틴(osteonectin, ON)에서 유래된 글루탐산-rich 펩타이드 (6개의 글루탐산; Ac-Glu6)가 수용액상에서 apatite nanoparticle의 확산을 증가시킨다는 것이 보고되었다(Sarvestani AS et al.Eur Biophys J,37:229-234 2008). In addition, it has been reported that glutamate-rich peptide (6 glutamic acid; Ac-Glu6), which is derived from osteonectin (ON), a marker of osteoblast differentiation, increases the proliferation of apatite nanoparticles in aqueous solution (Sarvestani AS et al. < / RTI > Eur Biophys J, 37: 229-234 2008).
또 다른 분화 표지자인 오스테오칼신(osteocalcin, OC)으로부터 유래된 펩타이드(OSC)의 C-말단 amidation은 수산화인회석 결정화 (hydroxyapatite crystalli- zation)를 촉진하는 것으로 알려져 있다(Hosseini S et al.,. J Biol Chem ;288:7885-7893, 2013). C-terminal amidation of peptides (OSC) derived from osteocalcin (OC), another differentiation marker, is known to promote hydroxyapatite crystallization (Hosseini S et al., J Biol Chem ; 288: 7885-7893, 2013).
최근 본 발명자들은 SMOC1 펩타이드가 골수줄기세포의 조골세포 분화를 촉진한다는 보고를 한 바 있다 (Choi et al., J Proteome Res 9:2946-2956. 2010). 이 연구에서는 SMOC1 유전자를 인간 골수줄기세포에 과발현 혹은 넉다운 시켜 조골세포의 분화를 촉진함을 확인하였다. 그러나, 실제로 SMOC1 단백질은 분비형 단백질로서 세포막 단백질 혹은 다른 세포외 기질 단백질과 상호작용하여 기능하는 단백질로서 알려져 있다. Recently, the present inventors have reported that SMOC1 peptide promotes osteoblast differentiation of bone marrow stem cells (Choi et al., J Proteome Res 9: 2946-2956, 2010). In this study, we confirmed that SMOC1 gene promotes osteoblast differentiation by over-expressing or knocking down human bone marrow stem cells. However, in fact, SMOC1 protein is a secreted protein and is known to function by interacting with cell membrane proteins or other extracellular matrix proteins.
현재까지 SMOC1 단백질을 외부에서 처리하여 세포에 미치는 영향을 분석한 결과는 알려진 적이 없다. 이에 우리는 SMOC1 단백질의 기능적 도메인 중 하나인 EC (extracellular calcium binding) 도메인의 서열을 분석하여 후보 펩타이드 서열을 결정하고 그 효과를 분석하였다.
Until now, the effect of SMOC1 protein exogenously on cells has not been known. We analyzed the sequence of EC (extracellular calcium binding) domain, one of the functional domains of SMOC1 protein, and determined the candidate peptide sequence and analyzed its effect.
이에 본 발명자들은 SMOC1의 기능적 도메인의 하나인 세포외 칼슘 결합 도메인의 아미노산 서열을 기초로 펩타이드를 합성하였으며, 이들 펩타이드가 조골세포분화에 유효한 효과를 미치는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have synthesized peptides based on the amino acid sequence of the extracellular calcium binding domain, which is one of the functional domains of SMOC1, and confirmed that these peptides have an effective effect on osteoblast differentiation, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 SMOC1의 EC(extracellular calcium binding) 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 줄기세포의 조골세포 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for promoting osteoblast differentiation of stem cells comprising a polypeptide consisting of an EC (extracellular calcium binding) domain fragment of SMOC1.
본 발명의 또 다른 목적은, A further object of the present invention is to provide
줄기세포에 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포를 조골 세포로 분화 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.The present invention provides a method for promoting the differentiation of stem cells into osteoblasts, comprising the step of treating a stem cell with a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1.
본 발명의 또 다른 목적은, SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 스캐폴드(scaffold)를 제공하는 것이다.It is yet another object of the present invention to provide a scaffold comprising a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1.
본 발명의 또 다른 목적은, 인공 뼈 구조체에 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 부착하는 단계를 포함하는 인공 뼈 제조 방법을 제공하는 것이다.
Yet another object of the present invention is to provide a method for manufacturing an artificial bone comprising the step of attaching a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1 to an artificial bone structure.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 줄기세포의 조골세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a composition for promoting osteoblast differentiation of stem cells comprising a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 줄기세포에 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포를 조골 세포로 분화 촉진시키는 방법을 제공한다.In order to accomplish still another object of the present invention, the present invention provides a method for promoting the differentiation of stem cells into osteoblasts, comprising the step of treating a stem cell with a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은, SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 스캐폴드(scaffold)를 제공한다.In order to achieve still another object of the present invention, there is provided a scaffold comprising a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 인공 뼈 구조체에 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 부착하는 단계를 포함하는 인공 뼈 제조 방법을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, there is provided an artificial bone manufacturing method comprising attaching a polypeptide comprising an EC domain fragment of SMOC1 to an artificial bone structure.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 줄기세포의 조골세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for promoting osteoblast differentiation of a stem cell comprising a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1.
상기 EC 도메인은 SMOC1 단백질의 기능적 도메인 중 하나이다.The EC domain is one of the functional domains of the SMOC1 protein.
상기 폴리펩티드는 SMOC1 단백질의 EC 도메인에서 유래된 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 신생 생리활성 펩타이드이다. Wherein said polypeptide is composed of an amino acid derived from the EC domain of the SMOC1 protein.
본 발명의 상기 폴리펩티드는 서열번호1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.The polypeptide of the present invention is characterized by being composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
상기 서열번호1은 SMOC1 단백질의 EC 도메인에서 유래된 16개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 신생 생리활성 펩타이드이다. 서열번호1의 펩타이드는 SMOC1 전체 펩타이드 서열 중 399-414까지의 서열로 1976.27 g/mol의 분자량을 가지며 친수성이다. SEQ ID NO: 1 is a novel physiologically active peptide which is composed of 16 amino acids derived from the EC domain of SMOC1 protein. The peptide of SEQ ID NO: 1 is a sequence of up to 399-414 of the entire SMOC1 peptide sequence and has a molecular weight of 1976.27 g / mol and is hydrophilic.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 제작될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 서열번호1 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산을 제작한다. 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.Polypeptides according to the invention can be extracted naturally or produced by genetic engineering methods. For example, a nucleic acid encoding SEQ ID NO: 1 or its functional equivalent is prepared according to a conventional method. DNA sequences can also be synthesized by standard methods known in the art, for example, using an automated DNA synthesizer (commercially available from Biosearch or Applied Biosystems). The constructed nucleic acid is inserted into a vector containing one or more expression control sequences (e.g., promoters, enhancers, etc.) operatively linked to the expression of the nucleic acid and the recombinant The host cell is transformed with an expression vector. The resulting transformant is cultured under culture medium and conditions suitable for expression of the nucleic acid to recover a substantially pure polypeptide expressed by the nucleic acid from the culture. The recovery can be carried out using methods known in the art (for example, chromatography). By "substantially pure polypeptide" as used herein is meant that the polypeptide according to the invention is substantially free of any other proteins derived from the host cell. Genetic engineering methods for the synthesis of polypeptides of the present invention can be found in Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second (1998) and Third (2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif., 1991; And Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 12073-12080,1990.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
Also, the polypeptide of the present invention can be easily prepared by chemical synthesis (Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., NY, 1983) known in the art. Representative methods include, but are not limited to, liquid or solid phase synthesis, fractional condensation, F-MOC or T-BOC chemistry (see for example Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press , Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
본 발명의 상기 조성물은 조골세포 분화의 표지자인 제1형 콜라겐 및 osteocalcin(OC)의 발현 증가와 함께 조골세포 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 한다. The composition of the present invention is characterized in that osteoblast differentiation is promoted together with an increase in expression of
상기 조골세포란 골아세포라고도 불린다. 조골세포는 세포 밖으로 골질을 분비하고 스스로는 골질에 싸여 골세포로 변한다. 조골세포는 섬유모세포에서 분화한 것으로, 분열 능력이 크고, 형성 과정에 있는 경골의 표층에 한 층으로 배열되어 수상돌기로 서로 연락하고 있다. 이 세포군의 바깥쪽에는 골막이 있다. 뼈 형성이 끝나도 골막내면에는 조골세포가 존재하지만 노화된 뼈에서는 그 수가 감소한다. The osteoblast is also called an osteoblast. Osteoblasts secrete bone mass out of the cell, and themselves become bone cells, transforming into bone cells. Osteoblasts are differentiated from fibroblasts. They have high cleavage ability. They are arranged in a layer on the surface layer of the tibia in the process of formation and communicate with each other by dendrites. There is a periosteum on the outside of this cell group. At the end of bone formation, there are osteoblasts inside the periosteum, but the number decreases in aged bone.
본 발명에서 조골세포는 골수 줄기세포로부터 분화시켜 얻었다. 골수 줄기세포를 12시간 동안 안정화시킨 후 조골세포 분화 유도를 위해 10 nM dexamethasone, 50 g/mL ascorbic-acid-2-phosphate and 10 mM - glycerophosphate(Sigma-Aldrich)를 포함하는 조골세포 분화 유도배지(OSM)를 사용하였다. 3주 후 조골세포로 분화 정도를 측정하였다. In the present invention, osteoblasts were differentiated from bone marrow stem cells. After bone marrow stem cells were stabilized for 12 hours, osteoblast differentiation induction medium (Sigma-Aldrich) containing 10 nM dexamethasone, 50 g / ml ascorbic acid-2-phosphate and 10 mM glycerophosphate OSM) was used. After 3 weeks, the degree of differentiation into osteoblasts was measured.
상기 조골세포 분화를 촉진시키는 것은 골수 줄기세포를 조골세포 분화 유도 배지에 놓고 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 조골세포로 분화가 더욱 빠르게 진행된 것을 의미한다.Promoting osteoblast differentiation implies that bone marrow stem cells are differentiated into osteoblast cells more rapidly when compared to a control group without osteoclast differentiation induction medium.
조골세포의 초기 분화 표지자로는 제1형 콜라겐과 alkaline phosphatase (ALP)가 있고 후기 분화 표지자로는 osteocalcin (OC)가 있다. 또 다른 분화 표지 유저자로는 bone sialoprotein (BSP)과 Osteonectin (ON)가 있다. 이 중 SMOC1 유래 EC 펩타이드 단편은 제1형 콜라겐과 osteocalcin (OC)이 증가하는 것을 특징으로 한다.Early differentiation markers for osteoblasts include
조골세포의 초기 분화 표지자인 제1형 콜라겐은 골기질의 주성분이며 이는 2개의 (1) chain과 2개의 (2) chain으로 구성된다. 제1형 콜라겐은 인간의 몸을 구정하는 콜라겐 중 가장 많은 부분을 차지한다. 제1형 콜라겐은 상처 난 조직을 치료하는데 쓰이며 힘줄, 인대, 근원섬유, 뼈의 유기적 부분, 진피 등에 존재한다. Type I collagen, the early differentiation markers of osteoblasts, is the main component of bone matrix, which is composed of two (1) chains and two (2) chains.
또한, 조골세포의 후기 분화 표지자인 "osteocalcin(OC)"은 감마-카르복시글루탐산 포함 단백질(BGLAP)로도 알려져 있으며 뼈 및 상아질에 존재하는 비교원질(noncollagenous) 단백질이다.
In addition, "osteocalcin (OC)", a late differentiation marker of osteoblasts, is also known as gamma-carboxyglutamic acid-containing protein (BGLAP) and is a noncollagenous protein present in bone and dentin.
본 발명의 상기 줄기세포는 인간 유래의 골수줄기세포인 것을 특징으로 한다.The stem cells of the present invention are characterized by being human-derived bone marrow stem cells.
본 발명에서 용어 '줄기세포'는 골수(bone-marrow, BM), 말초신경 혈액, 제대혈, 골막(periosteum), 진피(dermis) 및 중배엽 기원의 조직 등으로부터 분리되고 정제될 수 있다. 본 발명에서 줄기세포는 골수로부터 분리된 것이 바람직하다.In the present invention, the term 'stem cells' can be separated and purified from bone marrow (BM), peripheral nerve blood, umbilical cord blood, periosteum, dermis and mesodermal origin tissues. In the present invention, stem cells are preferably separated from bone marrow.
골수 유래 줄기세포는 골수의 공급원에 따라 다수의 상이한 기계적 분리 방법에 의해 분리되며, 이러한 분리 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 줄기세포의 분리 과정에서 가장 결정적인 것은 특정하게 제조된 배지를 사용하는 것이다. 상기 배지는 분화 없이 줄기세포를 성장 가능하게 하고 배양 접시의 플라스틱 또는 유리 표면에 줄기세포만의 직접 부착을 가능하게 하는 제제를 함유하고 있음을 특징으로 한다. 예를 들면, 골수에 소량 존재하는 줄기세포의 선택적인 부착을 가능하게 하는 배지를 사용함으로써, 골수에 존재하는 기타 세포(즉, 적혈구 및 백혈구 등)로부터 줄기세포를 분리해 내는 것이 가능하다.
The bone marrow-derived stem cells are separated by a number of different mechanical separation methods depending on the source of bone marrow, and such separation methods are well known in the art. The most crucial step in the process of stem cell isolation is to use a specially prepared medium. The culture medium is characterized by containing stem cells capable of growing without any differentiation and capable of direct attachment of only stem cells to the plastic or glass surface of the culture dish. For example, it is possible to separate stem cells from other cells present in the bone marrow (i.e., red blood cells, leukocytes, etc.) by using a medium that allows selective attachment of stem cells present in a small amount in bone marrow.
본 발명은 줄기세포에 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포를 조골세포로 분화 촉진시키는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for promoting the differentiation of stem cells into osteoblasts, comprising the step of treating a stem cell with a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1.
본 명세서에 기재된처리하는은 화학적 약품이나 물질 또는 생물학적 펩타이드 등을 첨가/부가하는 의미로 사용되었다.The treatments described herein are used in the sense of adding / adding chemical reagents or substances or biological peptides and the like.
본 발명은 줄기세포에 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 처리하여 조골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 즉, SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양함으로써 조골세포로 분화시킬 수 있다. 상기 배지는 바람직하게는 골형성 배지이다. SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드는 줄기세포를 조골세포로 분화하는 과정에서 초기 단계, 즉 분화 유도 개시 또는 분화 유도 후 1 내지 15일 이내에 처리하는 것이 바람직하다.
The present invention relates to a method of treating a stem cell with a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1 to differentiate into an osteoblast. That is, stem cells can be differentiated into osteoblasts by culturing the stem cells in a medium containing a polypeptide consisting of the EC domain fragment of SMOC1. The medium is preferably a bone formation medium. It is preferable that the polypeptide consisting of the EC domain fragment of SMOC1 is treated at an early stage in the process of differentiating stem cells into osteoblasts, that is, within 1 to 15 days after induction of differentiation induction or induction of differentiation.
본 발명의 상기 폴리펩티드는 서열번호1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.The polypeptide of the present invention is characterized by being composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
본 발명의 상기 서열번호1은 SMOC1 단백질의 EC 도메인에서 유래된 16개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 신생 생리활성 펩타이드이다. 서열번호1의 펩타이드는 SMOC1 전체 펩타이드 서열 중 399-414까지의 서열로 1976.27 g/mol의 분자량을 가지며 친수성이다.
SEQ ID NO: 1 of the present invention is a novel physiologically active peptide which is composed of 16 amino acids derived from the EC domain of SMOC1 protein. The peptide of SEQ ID NO: 1 is a sequence of up to 399-414 of the entire SMOC1 peptide sequence and has a molecular weight of 1976.27 g / mol and is hydrophilic.
본 발명은 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 스캐폴드(scaffold)를 제공한다.The present invention provides a scaffold comprising a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOCl.
본 발명에서 스캐폴드(scaffold)는 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착기질을 칭하는 것으로, 이러한 스캐폴드는 인체조직 재생을 위한 세포 이식에 사용되고 있으며, 또한 세포의 대량배양 및 증식에 있어서 그 중요성은 매우 높다. 그 이유는 줄기세포 또는 생검으로부터 얻은 세포들이 환자들에게 보다 효과적으로 사용되기 위해서는 체외에서 가능한 많은 수의 세포가 얻어져야 함은 물론 새로운 자기유래의 조직으로 분화가 이루어져야 하는데, 스캐폴드의 사용은 이들을 가능하게 할 수 있는 유일한 방법이기 때문이다. 인체 조직의 재생을 위해 사용되는 스캐폴드 재료의 주된 요건으로는 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 틀의 역할을 충분히 해내야 하고, 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 벽으로서의 역할도 담당해야 하는데, 이는 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성이 있어야 함을 의미한다. 또한, 이식된 세포가 충분히 조직으로서 본연의 기능과 역할을 수행하게 되면 원하는 시간에 따라 생체 내에서 완전히 분해되어 사라질 수 있는 생분해성을 지녀야 한다. 이상적인 생체적합성 스캐폴드의 속성에는 시험관내 또는 생체내에서 세포 성장을 지지하는 능력, 다양한 범위의 세포 유형 또는 계통의 성장을 지지하는 능력, 요구되는 유연성 또는 경직성의 다양한 수준을 갖는 능력, 다양한 수준의 생분해성을 갖는 능력, 2차 손상을 유발하지 않고 생체내에서 목적하는 부위로 도입되는 능력 및 원하는 작용 부위로 약물, 세포 및/또는 생활성 물질의 운반을 위한 저장소 또는 담체로서 제공되는 능력이 포함되어야 한다. 또한, 뼈 조직 공학을 위한 스캐폴드는 세포 부착, 증식, 조직 성장 및 적절한 영양분 공급을 수행할 수 있는 생물학적 환경을 조성하기 위해 높은 다공성과 상호 연결된 기공 구조가 필수적이다. 이러한 요구를 가장 잘 충족하는 것으로 생분해성 고분자와 칼슘인산으로 구성된 세라믹을 들 수 있다. 생분해성 고분자는 정해진 크기나 모양으로 조직을 재생할 수 있는 능력이 있고, 칼슘인산 세라믹은 뼈나 치아와 같은 경조직의 재생에 많이 활용되고 있다. 이들 두 유형의 스캐폴드는 생체 내에서나 생체 외에서 세포의 점착과 확장을 위한 임시적인 장소를 제공해주기에 세포증식 및 세포분화를 위한 스캐폴드로 사용하기에 좋은 물질이다.In the present invention, a scaffold refers to a physical support and an adhesive substrate made to be able to in vitro culture and transplantation of tissue cells. Such a scaffold is used for cell transplantation for regeneration of human tissue, And its importance in propagation is very high. The reason for this is that in order for cells from stem cells or biopsies to be used more effectively in patients, it is necessary to obtain as many cells as possible from the outside of the body, as well as to differentiate into new tissue derived from a self, It is the only way to make it happen. The main requirement of the scaffold material used for the regeneration of human tissues is that the tissue cells must adhere to the surface of the material to form a three-dimensional structure, And the wall between host cells, which means that there must be a non-toxic biocompatibility that does not cause blood coagulation or inflammation after transplantation. In addition, when the transplanted cells sufficiently perform their function and role as a tissue, they must have biodegradability that can be completely decomposed and disappeared in a living body according to a desired time. The properties of an ideal biocompatibility scaffold include, but are not limited to, the ability to support cell growth in vitro or in vivo, the ability to support growth of a wide range of cell types or strains, the ability to have various levels of flexibility or rigidity required, Ability to be biodegradable, ability to be introduced into a desired site in vivo without causing secondary damage, and ability to be provided as a repository or carrier for delivery of drugs, cells and / or living materials to a desired site of action . In addition, scaffolds for bone tissue engineering are required to have high porosity and interconnected pore structures to create a biological environment capable of performing cell attachment, proliferation, tissue growth and proper nutrient delivery. One of the most satisfying of these needs is ceramics composed of biodegradable polymers and calcium phosphate. Biodegradable polymers have the ability to regenerate tissues in a predetermined size or shape, and calcium phosphate ceramics are widely used for the regeneration of hard tissues such as bones and teeth. These two types of scaffolds provide a temporary site for adhesion and expansion of cells in vivo or ex vivo, and thus are useful as scaffolds for cell proliferation and cell differentiation.
상기 스캐폴드의 재료는 스캐폴드가 기능과 역할을 충분히 수행할 때까지 유지된 후 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성을 지녀야 한다. 이에, 바람직한 생분해성 고분자의 재료는 폴리글리롤산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 등이 있으며, 세라믹으로는 -tricalcium phosphate(-TCP) 단독 또는 hydroxyapatite(HA)와의 composite 이 있다. The material of the scaffold should be biodegradable such that the scaffold is maintained until it fulfills its function and role and is completely degraded and eliminated in vivo. Preferred materials for the biodegradable polymer include polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polylactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA), polycaprolactone (PCL), polyethylene glycol , Ceramic as a ceramic, -tricalcium phosphate (-TCP) alone or composite with hydroxyapatite (HA).
본 발명의 상기 폴리펩티드는 서열번호1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
The polypeptide of the present invention may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
본 발명은 인공 뼈 구조체에 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 부착하는 단계를 포함하는 인공 뼈 제조 방법을 제공한다.The present invention provides a method for manufacturing an artificial bone comprising the step of attaching a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1 to an artificial bone structure.
상기 인공 뼈 구조체는 폴리글리롤산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 칼슘인산 세라믹(-TCP/HA)등으로 이루어 질 수 있다. 제조된 고분자 및 세라믹 스캐폴드는 조절된 크기와 배열의 기공을 가진 3차원 구조를 가진다. The artificial bone structure may be selected from the group consisting of polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polylactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA), polycaprolactone (PCL), polyethylene glycol (PEG) / HA) and the like. The prepared polymer and ceramic scaffold have a three-dimensional structure with pores of controlled size and arrangement.
상기 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 부착하는 방법은 당업계에 공지된 단백질 고정화 방법일 수 있다. 현재까지 개발된 단백질 고정화 방법에는 단백질의 결합 형태에 따라 물리적 방법과 화학적 방법이 있는데, 물리적 방법에는 포괄법과 흡착법이 있고, 화학적 방법에는 공유결합법과 화학적 가교법이 있다. 아울러, 고정화하기위한 수단에 따라 단백질을 고정화하는 방법은 ) 지지체(support) 또는 담체(carrier)에 결합시키는 방법, ) 포괄법 또는 캡슐화 방법(entrapment, encapsulation), ) 가교화 또는 교차 방법(cross-linking)으로 구분될 수 있다. 본 발명의 단백질 고정화 방법의 한 예로는 다음과 같다. 가교제 결합 단계로 수산화기가 노출된 인공 뼈 구조체에 에탄올과 APTES((3-Aminopropyl)triethoxysilane)를 처리하고 25에서 6시간동안 반응시킨다. 그 후 페길레이션 단계로 PEG Disuccinimidyl Succinate와 DMF과 에탄올을 2:3 비율로 혼합한 용액을 처리하고 25에서 6시간동안 반응시킨다. 그 후 목표 펩타이드를 부착하는 단계로 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드와 PBS를 4에서 12시간동안 반응시킨다.The method of attaching the polypeptide consisting of the EC domain fragment of SMOC1 may be a protein immobilization method known in the art. The protein immobilization methods developed so far include physical methods and chemical methods depending on the type of protein binding. Physical methods include inclusion method and adsorption method, and chemical methods include covalent bonding method and chemical crosslinking method. The method of immobilizing a protein according to the means for immobilizing may include a method of binding to a support or a carrier, an entrapment method, or an encapsulation method) linking. An example of the protein immobilization method of the present invention is as follows. In the crosslinking step, ethanol and APTES ((3-Aminopropyl) triethoxysilane) are applied to the artificial bone structures exposed to hydroxyl groups and reacted for 25 to 6 hours. After that, PEG Disuccinimidyl Succinate, DMF and ethanol were mixed at a ratio of 2: 3, and the mixture was reacted at 25 for 6 hours. Then, the step of attaching the target peptide is performed by reacting the polypeptide consisting of the EC domain fragment of SMOC1 with PBS at 4 for 12 hours.
본 발명의 상기 폴리펩티드는 서열번호1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
The polypeptide of the present invention may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
본 발명은 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 조골세포 분화 촉진용 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로 보다 구체적으로는 SMOC1의 399-414번째 아미노산 부위를 유효성분으로 포함하는 조골세포 분화 촉진용 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드는 조골세포의 분화를 촉진하는 효과가 있으므로 이를 이용하여 뼈 재생을 위한 조직공학적 적용이 가능하다. 또한 뼈 형성 관련 질환의 치료나 뼈 재생을 위한 성장촉진용 첨가제 등으로 유용하게 이용될 수 있다.
The present invention relates to a composition for promoting osteoblast differentiation promotion comprising a polypeptide consisting of an EC domain fragment of SMOC1 and a use thereof, and more particularly, to a composition for promoting osteoclast differentiation promotion comprising SMC1 amino acid 399-414 as an active ingredient And uses thereof. Since the polypeptide consisting of the EC domain fragment of SMOC1 of the present invention has an effect of promoting the differentiation of osteoblasts, tissue engineering application for bone regeneration is possible by using it. Also, it can be usefully used as a growth promoting additive for the treatment of bone formation-related diseases and bone regeneration.
도 1은 SMOC1의 EC(extracellular calcium binding) 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드의 결정을 위하여 EC domain의 서열을 분석하여 펩타이드의 순도와 용해도가 최적화되도록 선택한 펩타이드 단편 및 단편의 특징을 나타낸 모식도이다.
도 2는 합성된 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드가 골수줄기세포의 증식에 미치는 영향을 MTT assay를 이용하여 분석한 그래프이다(SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 0, 0.02, 0.1, 0.5, 2.5 μM 농도로 골수 간엽줄기세포에 처리하여 0, 1, 3, 5 그리고 7일째 그 증식 정도를 관찰함.).
도 3은 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를의 미네랄 형성 유도능을 알아보기 위하여, 골수 간엽줄기세포를 분화유도 배지와 함께 농도 별로 처리하여 Alizarin Red 염색을 통하여 그 염색 수준을 확인 및 통계 처리한 것이다.
도 4는 농도 의존적으로 증가된 미네랄 침착 정도와 더불어, SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드가 분화 표지자 분자들의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 분화 유도 후 14일째 세포로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행한 결과이다(Col1: type 1 Collagen, OC: Osteocalcin, ON: Osteonectin, BSP: Bone Sialoprotein, ALP: Alkaline Phosphatase. GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
도 5는 골수 간엽줄기세포에서 재조합 full length SMOC1와 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드 간의 조골세포 분화능 비교 분석한 사진이다(왼쪽 패널 : 대조군, 가운데 패널 : full length SMOC1 펩티드, 오른쪽 패널 : SMOC1 EC 단편 펩티드).
도 6는 full length SMOC1 펩티드와 SMOC1의 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드의 분화 표지자 분자들의 발현에 미치는 영향을 비교한 결과이다(BSP: Bone Sialoprotein, Col1: type 1 Collagen, OC: Osteocalcin, ON: Osteonectin, OPN: Osteopontin, ALP: Alkaline Phosphatase. GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).FIG. 1 is a schematic diagram showing the characteristics of peptide fragments and fragments selected to optimize the purity and solubility of the peptide by analyzing the sequence of the EC domain for the determination of a polypeptide consisting of an EC (extracellular calcium binding) domain fragment of SMOC1.
FIG. 2 is a graph showing the effect of polypeptides composed of EC domain fragments of synthesized SMOC1 on the proliferation of bone marrow stem cells using MTT assay (0, 0.02, 0.1, 0.5, 2.5 μM of bone marrow mesenchymal stem cells treated at 0, 1, 3, 5 and 7 days.
FIG. 3 is a graph showing the effect of SMOC1 EC domain fragments on the induction of mineral formation of bone marrow mesenchymal stem cells with differentiation induction medium and treatment with Alizarin Red staining, will be.
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the concentration-dependent increase in mineral deposition and the effect of the polypeptide consisting of the EC domain fragment of SMOC1 on the expression of differentiation marker molecules. At day 14 after induction of differentiation, RNA was extracted from the cells and subjected to RT- (Col1:
FIG. 5 is a comparative analysis of osteoblast differentiation potential between recombinant full length SMOC1 and SMOC1 EC domain fragments in bone marrow mesenchymal stem cells (left panel: control panel, middle panel: full length SMOC1 peptide, right panel: SMOC1 EC fragment peptide ).
FIG. 6 shows the results of comparing the effect of full-length SMOC1 peptide on expression of differentiation marker molecules of a polypeptide consisting of EC domain fragment of SMOC1 (BSP: Bone Sialoprotein, Col1:
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
<실험 방법><Experimental Method>
<실험 1> 펩타이드 서열 선택과 합성<
SMOC1의 EC(extracellular calcium binding) 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드의 결정을 위하여 EC domain의 서열을 분석하여 펩타이드의 순도와 용해도가 최적화되도록 선택하였다(도 1). 선택된 펩타이드는 SMOC1 전체 펩타이드 서열 중 399-414까지의 서열로서 Lys - Cys - Ala - Arg - Arg - Phe - Thr - Asp - Tyr - Cys - Asp - Leu - Asn - Lys - Asp - Lys (KCARRFTDYCDLNKDK) 순서로 구성되어 있다. 합성된 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드는 1976.27 g/mol의 분자량을 가지며 친수성이다. 펩타이드는 펩트론에 의뢰하여 합성하였고, HPLC를 통해 95% 이상의 순도로 정제하였다.
For the determination of the polypeptide consisting of the EC (extracellular calcium binding) domain fragment of SMOC1, the sequence of the EC domain was analyzed to select the purity and solubility of the peptide to be optimized (Fig. 1). The selected peptides have the sequence of Lys-Cys-Ala-Arg-Phe-Thr-Asp-Tyr-Cys-Asp-Leu-Asn-Lys-Asp-Lys (KCARRFTDYCDLNKDK) as a sequence from 399-414 of total SMOC1 peptide sequence . The polypeptide consisting of the synthesized SMOC1 EC domain fragment has a molecular weight of 1976.27 g / mol and is hydrophilic. Peptides were synthesized with reference to peptones and purified by HPLC over 95% purity.
<실험 2> 인간 골수 줄기세포의 분리와 세포 배양<Experiment 2> Isolation and Cell Culture of Human Bone Marrow Stem Cells
인간 골수 줄기세포는 고관절 치환술을 위해 수술하는 환자로부터 동의를 받아 채취한 골수에서 분리하였다. 골수 줄기세포의 분리 방법은 기존의 통상적인 방법을 따랐다(Nagpal R et al. Food Funct ;2:18-27, 2011). 즉, 골수를 phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4로 희석하고 histopaque (Sigma-Aldrich; St Louis, MO)를 이용하여 밀도 구배 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 단핵 세포들(mononuclear cells)을 수집하여 PBS로 씻고, 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)을 포함하는 -MEM (-Minimum Essential medium eagle, alpha) 배지에 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 배양 후 12시간째 비부착 세포들은 제거하고 부착된 세포만을 키워 실험에 사용하였다. 성장배지는 이틀에 한 번씩 갈아주며 모든 실험에는 4-5회 계대배양된 세포를 사용하였다.
Human bone marrow stem cells were isolated from bone marrow collected with consent from patients undergoing surgery for hip arthroplasty. Separation of bone marrow stem cells followed conventional conventional methods (Nagpal R et al. Food Funct. 2: 18-27, 2011). Bone marrow was diluted in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, and density gradient centrifugation was performed using histopaque (Sigma-Aldrich; St Louis, MO). After centrifugation, mononuclear cells were collected, washed with PBS, and cultured in PBS containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) (-Minimum essential medium eagle, alpha) medium at 37 ° C and 5% CO 2 . After 12 hours of incubation, nonadherent cells were removed and adhered cells were used for experiments. Growth medium was changed once every two days and all experiments used 4-5 subcultured cells.
<실험 3> 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction, RT-PCR)의 실시<
TRIzol(Invitrogen, Calsbad CA)를 이용하여 배양된 골수간엽 줄기세포로부터 RNA를 추출하였다. 1μg의 RNA를 superscript II (Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 재조합 Taq 중합효소(Takara, Japan)를 이용하여 다음과 같은 조건에서 시행하였다. 95℃에서 2분간 denaturation 한 후, 95℃에서 45초, 각 프라이머별로 해당하는 온도로 45초간 annealing, 72℃에서 60초간 extension하고 final extension을 72℃에서 10분간 수행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다. 모든 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 Wisedoc (Daihan Scientific, Korea)을 이용하여 확인하였다.
RNA was extracted from cultured bone marrow mesenchymal stem cells using TRIzol (Invitrogen, Calsbad CA). 1 μg of RNA was synthesized using superscript II (Invitrogen). Polymerase chain reaction (PCR) was performed using recombinant Taq polymerase (Takara, Japan) under the following conditions. Denaturation at 95 ° C for 2 minutes, annealing at 95 ° C for 45 seconds, annealing at 45 ° C for each primer, extension at 72 ° C for 60 seconds, and final extension at 72 ° C for 10 minutes. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an internal control. All PCR products were electrophoresed on 1% agarose gel, stained with ethidium bromide and confirmed using Wisedoc (Daihan Scientific, Korea).
<실험 4> MTT Assay의 실시<Experiment 4> Execution of MTT Assay
골수 간엽줄기세포는 96 well plate에 700 cells/well의 밀도로 심고 12시간가량 안정화 시켰다. 세포들은 조골세포 분화 유도 배지에서 0, 1, 3, 5, 7일간 배양되었다. 각 지정된 시간에 최종농도가 50 μg/mL되도록 MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 3시간 동안 배양하였다. 세포 내에 형성된 formazan을 DMSO를 이용하여 용해시키고, ELISA plate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(Epoch, VT).
Bone marrow mesenchymal stem cells were seeded at a density of 700 cells / well in a 96 well plate and stabilized for 12 hours. Cells were cultured for 0, 1, 3, 5, and 7 days in osteoblast differentiation induction medium. Each given time to 50 μg / mL final concentration of MTT (3- (4,5- dimethylthiazol-2 -yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) for three hours in a 37 ℃, 5% CO 2 conditions by the addition Lt; / RTI > Formazan formed in the cells was dissolved in DMSO and the absorbance was measured at 570 nm using an ELISA plate reader (Epoch, VT).
<실험 5> 조골세포 분화유도와 Alizarin red 염색<
조골세포 분화 유도 실험에는 10,000개의 세포가 사용되었으며, 세포는 계대 후 12시간 동안 안정화되었다. 그 후 조골세포 분화 유도를 위해서는 10 nM dexamethasone, 50 g/mL ascorbic-acid-2-phosphate and 10 mM - glycerophosphate(Sigma-Aldrich)를 포함하는 조골세포 분화 유도배지(OSM)를 사용하였다. 분화 유도 3주 후, 배양된 세포의 배지를 제거하고, PBS로 2회 수세한 후, 70% EtOH로 10분간 고정하였다. 고정된 세포를 증류수로 세척 후 alizarin red S (pH4.2, sigma) 용액으로 10분간 염색하였다. 염색 수준의 정량화를 위하여 10% cetylpyridinium chloride (CPC) (Sigma-Aldrich)를 이용하여 염색된 미네랄 입자를 용출시켰다. 흡광도는 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 측정하였다(Epoch, VT).
In osteoblast differentiation induction experiments, 10,000 cells were used and the cells were stabilized for 12 hours after passage. After that, osteoblast differentiation induction medium (OSM) containing 10 nM dexamethasone, 50 g / mL ascorbic-acid-2-phosphate and 10 mM glycerophosphate (Sigma-Aldrich) was used for induction of osteoblast differentiation. After 3 weeks of induction of differentiation, the culture medium was removed, washed twice with PBS, and fixed with 70% EtOH for 10 minutes. The fixed cells were washed with distilled water and stained with alizarin red S (pH 4.2, Sigma) solution for 10 minutes. To quantify the staining level, dyed mineral particles were eluted with 10% cetylpyridinium chloride (CPC) (Sigma-Aldrich). Absorbance was measured at 570 nm using an ELISA reader (Epoch, VT).
<실험6> 재조합 full length SMOC1과 SMOC1 EC 도메인 단편 폴리펩티드의 조골세포 분화능 비교<Experiment 6> Comparison of osteoblast differentiation ability of recombinant full-length SMOC1 and SMOC1 EC domain short polypeptide
재조합 full length SMOC1와 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드 간의 조골세포 분화 정도를 비교 분석하기 위해, recombinant human SMOC1(rhSMOC1) 10 ng/ml와 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드 5 ng/ml를 골수 간엽줄기세포를 분화유도 배지와 함께 16일간 처리하여 Alizarin Red 염색을 통하여 그 염색 수준을 확인하였다(도 5 참조).In order to compare the degree of osteoblast differentiation between recombinant full-length SMOC1 and SMOC1 EC domain fragments, 10 ng / ml of recombinant human SMOC1 (rhSMOC1) and 5 ng / ml of polypeptide consisting of SMOC1 EC domain fragment were added to the bone marrow mesenchymal stem cells Were treated with differentiation induction medium for 16 days to determine their staining level by Alizarin Red staining (see FIG. 5).
상기 결과를 객관적으로 판단하기 위해, 조골세포 분화 표지자의 발현량을 비교하였다. 분화 유도 후 7일 째 세포로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다(도 6 참조).
To determine the results objectively, the expression levels of osteoblast differentiation markers were compared. On the 7th day after induction of differentiation, RNA was extracted from the cells and subjected to RT-PCR (see FIG. 6).
<실험 7> 통계처리<
MTT assay와 alizarin red S 추출의 정량은 반복 시행되었으며, 대조군과의 유의성은 two sided t-test를 이용하여 통계처리 하였다. 본 논문의 수치는 평균과 표준편자로 나타내었고 P<0.05 에서 유의성을 결정하였다.
Quantitation of MTT assay and alizarin red S extraction was repeated and statistical significance was evaluated using two-sided t-test. The values of this study were expressed as mean and standard deviation, and significance was determined at P <0.05.
<실험 결과><Experimental Results>
1) 세포증식에 미치는 영향 분석1) Analysis of effect on cell proliferation
합성된 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드가 골수줄기세포의 증식에 미치는 영향을 MTT assay를 이용하여 분석하였다(도 2). SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드를 0, 0.02, 0.1, 0.5, 2.5 μM 농도로 골수 간엽줄기세포에 처리하여 0, 1, 3, 5 그리고 7일째 그 증식 정도를 관찰하였다. SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드는 배양된 날짜와 상관없이 모든 농도에서 대조군 (SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드가 처리되지 않은 군)과 비교하였을 때 세포의 성장에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
The effect of the synthesized SMOC1 EC domain fragment on the proliferation of bone marrow stem cells was analyzed using the MTT assay (Fig. 2). SMOC1 EC domain fragments were treated with bone marrow mesenchymal stem cells at 0, 0.02, 0.1, 0.5, and 2.5 μM concentrations, and their proliferation was observed on
2) 미네랄 침착에 미치는 영향 분석2) Analysis of effect on mineral deposit
SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드의 미네랄 형성 유도능을 알아보기 위하여, 골수 간엽줄기세포를 분화유도 배지와 함께 농도 별로 처리하여 Alizarin Red 염색을 통하여 그 염색 수준을 확인하였다(도 3). 대조군에 비하여 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드 농도 의존적으로 미네랄 형성 정도가 증가되었다. 이를 정량화하기 위하여 10% CPC로 염색된 미네랄을 녹여내어 흡광도를 측정한 결과, 염색사진과 유사하게 유의적으로 증가하였고, 통계처리 결과 모두 유의적임을 알 수 있었다.
In order to examine the ability of the SMOC1 EC domain fragment to induce mineral formation, bone marrow mesenchymal stem cells were treated with differentiation induction medium at different concentrations to determine their staining level by Alizarin Red staining (FIG. 3). The degree of mineral formation was increased depending on the polypeptide concentration of the SMOC1 EC domain fragment as compared with the control. In order to quantify this, the absorbance of the dyed minerals dissolved in 10% CPC was measured.
3) 조골세포 분화 표지자 발현에 미치는 영향 분석3) Effect of osteoblast differentiation markers on expression
농도 의존적으로 증가된 미네랄 침착 정도와 더불어, SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드가 분화 표지자 분자들의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 분화 유도 후 14일 째 세포로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다(도. 4). 조골세포 분화의 초기 표지자인 type I collagen의 발현은 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드 농도 의존적으로 현저히 증가함을 보였다. 그러나 또 다른 조골세포 초기 분화 표지자인 alkaline phosphatase (ALP)의 발현은 변화가 없었다. 후기 분화 표지자 중 osteocalcin (OC)의 발현은 농도 의존적으로 증가하다가 0.5 μM에서 최대의 발현을 보이고 2.5 μM 농도에서는 0.5 μM에서 비슷한 수준을 유지하였다. 그러나 또 분화 표지 유전자인 bone sialoprotein (BSP)는 농도 의존적으로 다소 감소함을 보였다. 특이적으로 Osteonectin (ON)의 발현은 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드 0.1 μM 까지는 저농도에서는 다소 증가하다가 농도가 높아질수록 다시 감소하는 양상을 보였다.
In addition to the concentration-dependent increase in mineral deposition, RNA was extracted from the cells at 14 days after induction of differentiation and RT-PCR was performed to confirm the effect of SMOC1 EC domain fragment polypeptides on the expression of differentiation marker molecules 4). The expression of type I collagen, an early marker of osteoblast differentiation, was significantly increased in a polypeptide-dependent manner with SMOC1 EC domain fragments. However, there was no change in the expression of alkaline phosphatase (ALP), another early markers of osteoblast differentiation. Expression of osteocalcin (OC) in the late differentiation markers was increased in a concentration-dependent manner, and the maximal expression was observed at 0.5 μM and remained at 0.5 μM at 2.5 μM. However, bone sialoprotein (BSP), a marker gene for differentiation, showed a slight decrease in concentration-dependent manner. Specifically, the expression of Osteonectin (ON) was slightly increased at low concentration up to 0.1 μM of polypeptide consisting of SMOC1 EC domain fragment, but decreased again as concentration increased.
4) 재조합 full length SMOC1과 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드 간의 조골세포 분화능 비교 분석4) Comparison of osteoblast differentiation potential between recombinant full-length SMOC1 and SMOC1 EC domain fragments
도5에서 보이는 바와 같이 대조군에 비하여 rhSMOC1(recombinant human SMOC1)을 처리한 군에서 미네랄 침착이 매우 강하게 증가하였으며, SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드 처리군에서도 이와 유사한 정도의 미네랄 침착이 증가되었다. As shown in FIG. 5, mineral deposition was significantly increased in the group treated with rhSMOC1 (recombinant human SMOC1) compared to the control group, and a similar degree of mineral deposition was increased in the polypeptide treated group consisting of the SMOC1 EC domain fragment.
조골세포 분화 표지자의 발현량을 확인한 결과, 도6에서 보이는 바와 같이 조골세포 분화의 초기 표지자인 ALP의 발현은 rhSMOC1에 의해 급격히 증가하였다. SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드에 의해서도 역시 증가하였으나, rhSMOC1 보다 다소 약하게 증가되었다. 반면, type I collagen과 OC, ON, OPN은 rhSMOC1과 비슷한 정도로 발현을 촉진시켰다. 따라서, 이 결과들은 SMOC1 EC 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드가 full length SMOC1과 비숫한 정도로 조골세포 분화 촉진 효과가 있음을 보여준다.
As shown in FIG. 6, the expression of ALP, which is an early marker of osteoblast differentiation, was rapidly increased by rhSMOC1. It was also increased by the polypeptide consisting of the SMOC1 EC domain fragment, but slightly increased slightly than rhSMOC1. On the other hand, type I collagen and OC, ON, and OPN promoted expression to a similar extent as rhSMOC1. Thus, these results show that a polypeptide consisting of the SMOC1 EC domain fragment has the effect of promoting osteoblast differentiation to a degree similar to full length SMOC1.
본 발명의 SMOC1의 EC(extracellular calcium binding) 도메인 단편으로 이루어진 폴리펩티드는 조골세포의 분화를 촉진하는 효과가 있으므로 이를 이용하여 뼈 재생을 위한 조직공학적 적용이 가능하다. 또한 뼈 형성 관련 질환의 치료나 뼈 재생을 위한 성장촉진용 첨가제 등으로 유용하게 이용될 수 있다.
The polypeptide comprising the EC (extracellular calcium binding) domain fragment of SMOC1 of the present invention has an effect of promoting the differentiation of osteoblast, and thus tissue engineering application for bone regeneration is possible using the polypeptide. Also, it can be usefully used as a growth promoting additive for the treatment of bone formation-related diseases and bone regeneration.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Composition Comprising SMOC1-Derived Peptide for Differentiation
Osteoblast and use thereof
<130> NP14-0035
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMOC1-Derived Peptide
<400> 1
Lys Cys Ala Arg Arg Phe Thr Asp Tyr Cys Asp Leu Asn Lys Asp Lys
1 5 10 15
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<120> Composition Comprising SMOC1-Derived Peptide for Differentiation
Osteoblast and use thereof
<130> NP14-0035
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMOC1-Derived Peptide
<400> 1
Lys Cys Ala Arg Arg Phe Thr Asp Tyr Cys Asp Leu Asn
Claims (9)
1. A composition for promoting osteoblast differentiation of stem cells comprising a polypeptide consisting of an extracellular calcium binding (EC) domain fragment of SMOC1 (SPARC related modular calcium binding 1) represented by SEQ ID NO: 1.
The composition for promoting osteoblast differentiation according to claim 1, wherein the composition promotes osteoblast differentiation together with increased expression of type 1 collagen and osteocalcin (OC), which are markers of osteoblast differentiation.
The composition according to claim 1, wherein the stem cells are human-derived bone marrow stem cells.
Comprising the step of treating a stem cell of a human body with a polypeptide consisting of an EC (extracellular calcium binding) domain fragment of SMOC1 (SPARC related modular calcium binding 1) represented by SEQ ID NO: 1, into osteoblasts in vitro How to promote.
6. The method of promoting differentiation of stem cells into osteoblasts in vitro in accordance with claim 5, wherein the polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
6. The method according to claim 5, wherein the treatment of the polypeptide consisting of the EC (extracellular calcium binding) domain fragment of SMOC1 represented by SEQ ID NO: 1 is carried out within 1 to 15 days after induction of differentiation induction or differentiation into osteoblast of stem cells ≪ / RTI >
A scaffold comprising a polypeptide consisting of an extracellular calcium binding (EC) domain fragment of SMOC1 (SPARC related modular calcium binding 1) represented by SEQ ID NO: 1.
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-
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|---|
| Journal of Proteome Research. Vol. 9, No. 6, pp. 2946-2956 (2010) |
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| KR20160046248A (en) | 2016-04-28 |
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