KR101652059B1 - Novel CAF-like Fibroblast and Use Thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)-유사 섬유모세포, 이의 제작방법 및 이를 이용한 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명은 암세포의 침윤 저해물질을 신뢰도 높은 방법으로 대량/고속(High throughput)으로 스크리닝할 수 있으며, 본 발명의 CAF-유사 세포는 본 발명의 스크리닝 시스템의 핵심적인 구성인 CAF와 유사한 표현형을 가지면서도 대량의 수득이 가능할 뿐 아니라 반영구적인 사용이 가능하여 보다 효율적인 스크리닝 시스템의 구축이 가능하도록 한다.
아울러, 본 발명의 CAF-유사 세포는 암세포와 암 주변 섬유모세와의 상호작용을 통합적으로 설명하고, 암세포의 발생, 증식, 침윤 및 전이를 비롯한 다양한 종양 관련 메카니즘을 연구하는 데에 유용한 연구 도구(research tool)로서 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to carcinoma-associated fibroblasts (CAF) -like fibroblasts, a method for producing the same, and a method for screening cancer cell infiltration inhibitors using the same.
The present invention is capable of screening substances inhibiting the infiltration of cancer cells at high throughput in a reliable manner and the CAF-like cells of the present invention have a phenotype similar to that of CAF, which is a key constituent of the screening system of the present invention But also a semi-permanent use is possible, so that a more efficient screening system can be constructed.
In addition, the CAF-like cells of the present invention integrally explains the interaction between cancer cells and cancer fiber around the cancer, and is a research tool useful for studying various tumor-related mechanisms including cancer cell development, proliferation, invasion and metastasis research tool.

Description

신규한 ＣＡＦ-유사 섬유모세포 및 그의 용도{Novel CAF-like Fibroblast and Use Thereof} Novel CAF-like fibroblasts and their uses {Novel CAF-like Fibroblast and Use Thereof}

본 발명은 신규한 CAF-유사 섬유모세포 및 이를 이용한 암세포 침윤 저해제 스크리닝 시스템에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel CAF-like fibroblast and a cancer cell infiltration inhibitor screening system using the same.

암세포는 양성 종양과 달리 침윤 및 전이의 특성을 가진다. 암세포의 침윤(invasion)이란 성장한 암 조직이 처음 발생한 부위의 주변 조직을 파고 들어가며 증식하는 것을 말하며, 전이(metastasis)는 암의 초기 발생 조직에서 다른 조직으로 확산되는 것을 말한다. 이러한 암세포의 침윤과 전이(metastasis)는 불가분의 관계로서 침윤과정은 전이의 초기 단계라고 할 수 있다.Unlike benign tumors, cancer cells have the characteristics of invasion and metastasis. Cancer invasion refers to proliferation of the surrounding tissues of the site where the cancerous tissue initially developed, and metastasis refers to spreading from the early developmental tissue of the cancer to other tissues. The invasion and metastasis of these cancer cells are inseparable, and the invasion process is an early stage of metastasis.

암세포의 침윤 과정은 단백질 분해효소의 과다 분비로 인한 세포외 기질(extracellular matrix)의 분해 및 방향성을 가진 암세포의 이동으로 구성되며, 이러한 침윤 과정은 암세포의 단독 작용이 아닌 미세 주위 환경을 이루고 있는 세포들의 유도 작용에 의해 일어난다. 섬유모세포(fibroblast)는 기질을 이루는 대표적인 세포로서, 섬유모세포가 상피 또는 상피 암종에 미치는 영향 및 이들 섬유모세포를 표적으로 한 암 치료법에 대한 연구가 점차 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 유방암에서 암세포로 변이가 시작된 상피 세포 주위에 섬유모세포가 있을 때, 상피 세포가 과다한 세포 증식, 세포 자살 프로그램의 상실, 조직 침입 능력 등 암세포의 특성을 빠른 속도로 획득하는 것이 확인되었으며(Sadlonova et al. 2005), 전립선암에서 유래된 섬유모세포는 전립선 암 세포의 증식을 촉진하고 암세포의 분화에 영향을 준다고 보고되었다(Orimo et al. 2005). 이에, 섬유모세포를 타겟으로 하여 암세포의 침윤을 억제할 수 있을 뿐 아니라, 암세포 침윤을 위한 인 비트로 환경을 조성함으로써 암세포 침윤을 억제하는 약물의 스크리닝에도 유용하게 이용될 수 있다.The process of infiltration of cancer cells is composed of decomposition of extracellular matrix due to excessive secretion of proteolytic enzymes and migration of cancer cells with directionality. Such infiltration process is not a sole action of cancer cells but a cell By the induction action of. Fibroblast is a typical cell which is a substrate, and the influence of fibroblasts on epithelial or epithelial carcinoma and the treatment of cancer therapy targeting these fibroblasts are actively being actively studied. For example, when fibroblasts are present around epithelial cells that have undergone mutation from breast cancer to cancer cells, it has been confirmed that epithelial cells acquire characteristics of cancer cells such as excessive cell proliferation, loss of apoptosis program, and tissue invasion ability (Sadlonova et al., 2005), fibroblasts derived from prostate cancer have been reported to promote the proliferation of prostate cancer cells and affect the differentiation of cancer cells (Orimo et al., 2005). Accordingly, the fibroblast can be used as a target to inhibit the infiltration of cancer cells. In addition, by forming an in vitro environment for cancer cell infiltration, it can be usefully used for screening drugs inhibiting cancer cell infiltration.

한편, 인간 섬유모세포는 텔로머라제의 촉매성 서브유닛인 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 유전자를 도입함으로써 불멸화될 수 있다. 체세포에서 점차적인 텔로머릭 DNA 길이 감소에 기인한 복제성 노화는 DNA 복제시 텔로머릭 DNA의 추가를 조절하는 텔로모라제에 의해 억제된다. 그러나, 불멸화된 섬유모세포와 암세포의 침윤 간의 관계는 아직 알려진 바가 없다.
On the other hand, human fibroblasts can be immortalized by introducing the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene, a catalytic subunit of telomerase. Reproducible senescence due to the gradual decrease in telomeric DNA length in somatic cells is suppressed by telomorphic agents that regulate the addition of telomeric DNA during DNA replication. However, the relationship between immortalized fibroblasts and invasion of cancer cells is not yet known.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

대한민국 등록특허 제1008602호Korean Patent No. 1008602

본 발명자들은 암조직 유래 섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)와 유사한 표현형을 가져 암세포의 발생, 증식, 침윤 및 전이를 비롯한 다양한 종양 관련 메카니즘을 연구하는 데에 유용한 섬유모세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 정상 섬유모세포를 불멸화시킨 뒤 암세포와 공동배양할 경우 CAF와 매우 유사한 생물학적 특성을 보이는 CAF-유사 섬유모세포를 수득할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have conducted extensive studies to develop fibroblasts useful for studying various tumor-related mechanisms including development, proliferation, invasion and metastasis of cancer cells, which have similar phenotype to carcinoma-associated fibroblasts (CAF) Respectively. As a result, the present inventors completed the present invention by confirming that CAF-like fibroblasts having biological characteristics very similar to CAF can be obtained when the normal fibroblasts are immortalized and co-cultured with cancer cells.

따라서 본 발명의 목적은 CAF-유사 섬유모세포 제작방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing a CAF-like fibroblast.

본 발명의 다른 목적은 CAF-유사 섬유모세포를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a CAF-like fibroblast.

본 발명의 또 다른 목적은 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법 및 스크리닝 시스템을 제공하는 데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a screening method and a screening system for a cancer cell infiltration inhibitor.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)-유사 섬유모세포 제작방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing carcinoma-associated fibroblasts (CAF) -like fibroblasts, comprising the steps of:

(a) 인체로부터 분리된 섬유모세포를 불멸화하는 단계; 및(a) immobilizing fibroblasts isolated from a human body; And

(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 섬유모세포를 암세포와 공배양(Co-culture) 하는 단계.(b) Co-culturing the fibroblasts obtained in step (a) with cancer cells.

본 발명자들은 암조직 유래 섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)와 유사한 표현형을 가져 암세포의 발생, 증식, 침윤 및 전이를 비롯한 다양한 종양 관련 메카니즘을 연구하는 데에 유용한 섬유모세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 정상 섬유모세포를 불멸화시킨 뒤 암세포와 공동배양할 경우 CAF와 매우 유사한 생물학적 특성을 보이는 CAF-유사 섬유모세포를 수득할 수 있음을 확인하였다.The present inventors have conducted extensive studies to develop fibroblasts useful for studying various tumor-related mechanisms including development, proliferation, invasion and metastasis of cancer cells, which have similar phenotype to carcinoma-associated fibroblasts (CAF) Respectively. As a result, it was confirmed that CAF-like fibroblasts showing biological characteristics very similar to CAF can be obtained when the normal fibroblasts are immortalized and co-cultured with cancer cells.

본 명세서에서 용어“불멸화(immortalization)”는 세포 고유의 특성을 유지한 채 지속적으로 계대배양이 가능하도록 하는 것을 의미하며, 보다 구체적으로는 본 발명의 방법에 의하지 않고 수득된 세포, 즉 불멸화되지 않은 세포에 비하여 증가된 계대수 동안 배양이 가능한 세포를 의미한다. 보다 더 구체적으로는 100 계대까지 유지되는 세포를 의미하며, 가장 구체적으로는 60 계대까지 유지되는 세포를 의미한다.As used herein, the term " immortalization " means allowing continuous subculture while retaining intrinsic characteristics of the cell. More specifically, the cells obtained without the method of the present invention, that is, immortalized Means a cell capable of culturing for an increased number of passages relative to the cell. More specifically, it refers to a cell that maintains up to 100 passages, and most specifically refers to a cell that maintains up to 60 passages.

본 발명에서 이용되는 세포의 불멸화 방법은 예를 들어 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 방법, SV40 대형 T-항원(SV40 Large T-antigen) 방법, HPV E6/E7 방법, EBV 방법, MycT58A 방법, RasV12 방법, p53 방법 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 다양한 불멸화 방법에 적용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 불멸화[단계 (a)]는 상기 섬유모세포에 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 또는 SV40 대형 T-항원(SV40 Large T-antigen)을 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 형질전환하여 이루어지고, 보다 구체적으로는 hTERT를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 형질전환하여 이루어진다. Examples of immortalization methods used in the present invention include hTERT (human telomerase reverse transcriptase) method, SV40 large T-antigen method, HPV E6 / E7 method, EBV method, MycT58A method, RasV12 method , p53 method, and the like can be used, but the present invention is not limited thereto and can be applied to various immortalization methods known in the art. According to a specific embodiment of the present invention, the immortalization (step (a)) of the present invention includes a nucleotide encoding hTERT (human telomerase reverse transcriptase) or SV40 large T-antigen , And more specifically, a vector comprising a nucleotide encoding hTERT is transformed.

본 발명의 명세서에서 용어“세포의 특성(characteristics)"은 특정한 세포만이 갖고 있는 고유한 형태(morphology)와 표현형(phenotype)을 포함하는 것으로, 형태는 해당 세포만이 고유하게 가지고 있는 모양 및 색상을 의미하며, 유전자형은 해당 세포에서만 특징적으로 발현되는 마커 유전자를 의미한다.In the specification of the present invention, the term " characteristics of a cell "includes morphology and phenotype of only specific cells. , And the genotype refers to a marker gene that is expressed only in the cell.

본 명세서에서 용어“계대수(passage number)”는 성장을 촉진하도록 세포를 충분히 낮은 밀도로 유지시키기 위하여, 세포 집단이 배양 용기로부터 제거되고 계대배양 과정을 거쳤던 횟수를 의미한다.As used herein, the term " passage number " refers to the number of times a cell population has been removed from a culture vessel and underwent a subculture to maintain the cell at a sufficiently low density to promote growth.

본 명세서에서 용어“공배양(co-culture)”은 동일한 배양환경을 가지는 동일한 배양 공간에서 둘 이상의 상이한 종류의 대상세포를 배양하는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 본 발명자들은 정상 섬유모세포, 보다 구체적으로는 치은 섬유모세포(gingival fibroblast)를 당업계에 공지된 방법으로 불멸화시킨 뒤 암세포와 공배양하면 암세포의 침윤을 유도하는 암조직 유래 섬유모세포와 유사한 표현형을 가지게 됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법으로 제작된 CAF-유사 세포는 암세포와 암 주변 섬유모세와의 상호작용을 통합적으로 설명하고, 암세포의 발생, 증식, 침윤 및 전이를 비롯한 다양한 종양 관련 메카니즘을 연구하는 데에 유용한 연구 도구(research tool)로서 유용하게 이용될 수 있다.As used herein, the term " co-culture " means culturing two or more different types of target cells in the same culture space having the same culture environment. According to the present invention, the present inventors have succeeded in immortalizing a normal fibroblast, more specifically a gingival fibroblast, by a method known in the art, and co-culturing with cancer cells to induce the invasion of cancer cells, And a similar phenotype. Thus, the CAF-like cells prepared by the method of the present invention will be integrated to explain the interaction between the cancer cells and the cancer fiber around the cancer, and to study various tumor-related mechanisms including cancer cell development, proliferation, invasion and metastasis And can be usefully used as a useful research tool.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a)는 상기 섬유모세포에 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 또는 SV40 대형 T-항원(SV40 Large T-antigen)을 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 형질전환하여 이루어진다. 보다 구체적으로는, hTERT를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 형질전환하여 이루어진다.According to a specific embodiment of the present invention, step (a) of the present invention comprises the step of introducing into said fibroblast a vector comprising a nucleotide encoding hTERT (human telomerase reverse transcriptase) or SV40 large T-antigen Lt; / RTI > More specifically, a vector containing a nucleotide encoding hTERT is transformed.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). hTERT 또는 SV40 대형 T-항원을 코딩하는 뉴클레오타이드의 세포 내 도입은 당업계에 알려진 다양한 동물 형질전환 방법을 통하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서 용어“형질전환”은 적절한 유전자 전달체를 통해 본 발명의 뉴클레오타이드를 숙주세포에 도입하는 것을 말한다. As used herein, the term " nucleotide " is a deoxyribonucleotide or ribonucleotide present in single-stranded or double-stranded form and includes analogs of natural nucleotides unless otherwise specifically mentioned (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90: 543-584 (1990)). Intracellular introduction of nucleotides encoding hTERT or SV40 large T-antigens can be carried out through various animal transformation methods known in the art. As used herein, the term " transformation " refers to the introduction of the nucleotide of the present invention into a host cell through a suitable gene carrier.

본 명세서에서, 용어“유전자 전달체(gene carrier)”는 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.As used herein, the term " gene carrier " means any means of delivering a gene into a cell, and gene transfer has the same meaning as transduction of a gene into a cell. At the tissue level, the term gene transfer has the same meaning as the spread of a gene. Therefore, the gene delivery system of the present invention can be described as a gene penetration system and a gene diffusion system.

본 발명의 유전자 전달체는 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템이 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 유전자 전달체는 레트로바이러스 벡터이다. The gene delivery system of the present invention can be applied to all gene delivery systems used for conventional gene therapy, and preferably plasmids, adenoviruses (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3: 2075-2080 (1997) ), Adeno-associated viruses (AAV, Lashford LS., Et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), retroviruses (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors .. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed A. Meager, 1999), lentivirus (Wang G. et al, J. Clin Invest 104 (11...): R55-62 (1999)), herpes simplex virus (Chamber R., et al, Proc Natl Acad Sci USA 92:.... 1411-1415 (1995)), Bash Catania virus (Puhlmann M. et al, Human Gene Therapy 10:. 649-657 (1999)) , Liposomes (Methods in Molecular Biology, Vol. 199, SC Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) or niosomes. Specifically, the gene carrier used in the present invention is a retrovirus vector.

본 발명에서, 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 상기 접촉시키는 단계는 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.In the present invention, when the gene carrier is prepared based on a viral vector, the contacting step is carried out according to a virus infection method known in the art. Infection of host cells with viral vectors is described in the above cited documents.

본 발명에서 유전자 전달체가 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.If the gene delivery system in the present invention is a kit inner (naked) or recombinant DNA molecule is a plasmid, microinjection (Capecchi, MR, Cell, 22 :. 479 (1980); and Harland and Weintraub, J. Cell Biol 101: 1094- 1099 (1985)), calcium phosphate precipitation method (Graham, FL et al., Virology , 52: 456 (1973), and Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 6: 716-718 (1986)), liposome-mediated transfection (Eugene et al., EMBO J. , 1: 841 (1982), and Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol. method (Wong, TK et al, Gene , 10:87 (1980); Nicolau and Sene, Biochim Biophys Acta, 721: .... 185-190 (1982); and Nicolau et al, methods Enzymol, 149 :. 157 (1987)) and DEAE-dextran treatment (Gopal, MoI. Cell Biol. , 5: 1188-1190 (1985)) and gene bendardment (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 9568-9572 (1990)).

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 벡터는 선별 마커(selective marker)를 포함할 수 있으며, 구체적으로는 상기 선별마커는 양성 선별 마커이다. 본 명세서에서 용어“양성 선별 마커(positive selection marker)”는 명백하게 형질전환된 유전자를 가지는 세포들에서만 일정한 조건들 하에서 생존 및/또는 성장하게 하는 산물을 인코딩하는 유전자를 의미한다. 전형적인 선별 마커들은 퓨로마이신(puromycin), 앰피실린(ampicillin), 네오마이신(neomycin), 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 테트라사이클린(tetracyclin)과 같은 항생제 또는 다른 독성물질(toxin)들에 대한 저항성, 보완적인 영양요구성 결함(complement auxotrophic deficiency)들 또는 복합 배지로부터 입수가능하지 않은 공급 결정적인 영양분(supply critical nutrient)들을 부여하는 단백질들을 인코딩한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 양성 선별 마커는 네오마이신 유사체인 G418에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 인코딩한다.According to a specific embodiment of the present invention, the vector used in the present invention may include a selective marker, specifically, the selectable marker is a positive selectable marker. As used herein, the term " positive selection marker " refers to a gene that encodes a product that, apparently, causes cells having the transgene to survive and / or grow under certain conditions. Typical selectable markers are resistance to antibiotics or other toxins such as puromycin, ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracyclin, complementary nutrition Encodes proteins that confine complement auxotrophic deficiencies or supply critical nutrients not available from complex media. According to a specific embodiment of the present invention, the positive selectable marker used in the present invention encodes a protein that confers resistance to G418, a neomycin analogue.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 섬유모세포는 치은 섬유모세포(gingival fibroblasts)이다.According to a specific embodiment of the present invention, the fibroblast used in the present invention is gingival fibroblasts.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)의 암세포는 구강편평상피암종(oral squamous cell carcinoma, OSCC)이다.According to a specific embodiment of the present invention, the cancer cell of step (b) of the present invention is oral squamous cell carcinoma (OSCC).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 상술한 방법으로 제조된 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)-유사 섬유모세포를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a carcinoma-associated fibroblasts (CAF) -like fibroblast produced by the above-described method of the present invention.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 CAF-유사 섬유모세포는 α-SMA, 비멘틴(vimentin), IL(interlukin)-6 또는 IL-8의 발현이 증가된다.According to a specific embodiment of the present invention, the CAF-like fibroblast of the present invention has an increased expression of? -SMA, vimentin, IL (interlukin) -6 or IL-8.

발명에 따르면, 본 발명의 방법으로 수득한 CAF-유사 섬유모세포는 근섬유모세포(myofibroblast)의 표지자인 특성을 가지는 α-SMA 및 비멘틴 뿐 아니라 암 미세환경에서 가장 많이 발현된다고 알려진 사이토카인인 IL-6 및 IL-8의 발현이 유의하게 증가하여, CAF와 매우 유사한 표현형을 가짐이 확인되었다. According to the invention, the CAF-like fibroblast cells obtained by the method of the present invention are useful for the treatment of inflammatory diseases such as alpha-SMA and vimentin, which are characteristic markers of myofibroblasts, as well as cytokines IL- 6 and IL-8 expression was significantly increased, confirming that it has a phenotype very similar to CAF.

본 명세서에서 용어“발현의 증가”란 해당 유전자 또는 단백질의 정량적인 발현 양상이 대조군에 비하여 유의하게 증가된 경우를 의미하며, 보다 구체적으로는 대조군의 130% 이상의 발현량을 보이는 경우를 의미하고, 보다 더 구체적으로는 대조군의 150% 이상의 발현량을 보이는 경우를 의미한다. As used herein, the term " increase in expression " means a case where a quantitative expression pattern of the gene or protein is significantly increased as compared with the control, more specifically, a case where the expression level of the control is over 130% More specifically, the expression level of the control group is 150% or more.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method of screening for a cancer cell infiltration inhibitor comprising the steps of:

(a) 다공성 필터(porous filter)로 격리된 상부 챔버(upper-chamber)와 하부 챔버(lower-chamber)에 각각 암세포 및 본 발명의 방법으로 제작된 CAF (carcinoma-associated fibroblasts)-유사 섬유모세포를 접종하는 단계;(a) cancer cells and carcinoma-associated fibroblasts (CAF) -like fibroblasts fabricated by the method of the present invention in an upper chamber and a lower chamber separated by a porous filter, respectively, Inoculating;

(b) 후보물질(candidate)을 상기 상부 챔버에 첨가하는 단계; 및(b) adding a candidate to the upper chamber; And

(c) 상기 다공성 필터를 통과한 암세포의 수를 측정하는 단계로서, 후보물질을 첨가한 경우에서 후보물질을 첨가하지 않은 경우에 비해 다공성 필터를 통과한 암세포의 수가 적은 경우, 후보물질을 암세포 침윤 저해제로 판단한다.
(c) measuring the number of cancer cells that have passed through the porous filter, wherein when the number of cancer cells passed through the porous filter is smaller than when the candidate substance is not added when the candidate substance is added, It is judged to be an inhibitor.

본 발명의 스크리닝 방법은 종래 화학주성(chemotaxis)에 의한 세포 이동(migration) 또는 침윤 (invasion) 분석 등에 사용되어 오던 보이든 챔버 분석법(Boyden chamber assay) 또는 트랜스웰 분석법(transwell assay)을 변형하여, 암세포의 이동을 유도하는 화학주성인자 대신 암세포의 침윤을 유도하는 암세포 주변의 기질세포, 즉 섬유모세포를 이용한다. 이를 통해 MatrigelTM 등에 포함되어 있을 수 있는 화학주성 유도물질(chemo-attractant)의 영향을 배제하고, 생체 내 세포외 기질의 환경을 보다 유사하게 조성함으로써 보다 신뢰도 암세포 침윤 저해제의 스크리닝이 가능하다. 본 발명은 더 나아가 암세포의 침윤을 유도하는 암조직 유래 섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF) 대신 불멸화 후 암세포와 공배양하여 CAF와 유사한 표현형을 가지는 섬유모세포를 제작, 이를 이용함으로써 종래 대량의 수득이 어렵고 스크리닝을 수행할 때 마다 암 환자로부터 새로이 채취하여야 하는 CAF를 대체하였다. 이를 통해 본 발명의 스크리닝 시스템은 핵심적인 구성인 CAF와 동일한 기능을 하지면서도 대량의 수득 및 반영구적인 사용이 가능한 CAF-유사 세포를 이용함으로써 보다 효율적인 스크리닝 시스템의 구축이 가능해졌다. The screening method of the present invention modifies a Boyden chamber assay or a transwell assay, which has been conventionally used for cell migration or invasion analysis by chemotaxis, Instead of a chemotactic factor that induces the migration of cancer cells, stromal cells around the cancer cells inducing the invasion of the cancer cells, that is, fibroblasts, are used. This allows the screening of cancer cell infiltration inhibitors to be more reliable by eliminating the effects of chemo-attractants, which may be contained in Matrigel TM, and making the environment of the extracellular matrix in vivo more similar. The present invention further relates to a method of producing a fibroblast having a phenotype similar to CAF by co-culturing with immortalized cancer cells instead of carcinoma-associated fibroblasts (CAF) inducing invasion of cancer cells, And CAF, which should be newly collected from cancer patients every time the screening is performed. Thus, the screening system of the present invention can construct a more efficient screening system by using CAF-like cells capable of obtaining a large amount and using semi-permanently while having the same function as CAF which is a core constitution.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 다공성 필터는 콜라겐 (collagen)으로 코팅되어 있고, 보다 구체적으로는, 콜라겐 타입 I(collagen type I)으로 코팅되어 있다. 본 발명에서는 종래 트랜스웰 분석법에서 사용되는 Matrigel TM 대신 에 다공성 필터에 콜라겐을 코팅하여 사용함으로써, MatrigelTM에 포함되어 있을 수 있는 화학주성 유도물질(chemo-attractant)의 영향이 배제되고, 단지 CAF-유사세포와 암세포 간의 상호 작용에 의한 암세포의 침윤 유도를 효율적으로 관찰할 수 있다.According to a specific embodiment of the present invention, the porous filter of the present invention is coated with collagen, and more specifically, coated with collagen type I. In the present invention, by using collagen coated on the porous filter instead of Matrigel TM used in the conventional transwell analysis method, the influence of the chemo-attractant which may be contained in MatrigelTM is excluded, and only CAF-like The induction of cancer cell infiltration by the interaction between the cell and the cancer cell can be efficiently observed.

본 명세서에서 용어“후보물질”은 섬유모세포에는 독성을 나타내지 않으면서 암세포 자체에 대해 독성을 나타내거나, 섬유모세포로부터 분비되어 암세포 침윤을 유도하는 사이토카인(cytokine) 또는 키모카인(chemokine)의 분비를 억제하거나 이의 작용을 방해하는 것, 기타 암세포의 이동 및 침윤을 유의미하게 억제하는 것이 기대되는 물질이다. 본 발명의 후보물질은 합성화합물, 천연화합물, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
As used herein, the term " candidate substance " refers to a cytokine or a chemokine secreted from a fibroblast and inducing cancer cell infiltration, without exhibiting toxicity to the fibroblast, Inhibit the action of it, interfere with its action, and are expected to significantly inhibit the migration and invasion of cancer cells. Candidate materials of the present invention include, but are not limited to, synthetic compounds, natural compounds, low molecular weight compounds, high molecular weight compounds, nucleic acid molecules (e.g. DNA, RNA, PNA and aptamers), proteins, sugars and lipids.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)는 다공성 필터를 통과한 암세포를 고정시킨 후 염색하여 염색된 세포의 수를 측정하는 단계를 포함한다. According to a specific embodiment of the present invention, the step (b) of the present invention includes a step of fixing the cancer cells that have passed through the porous filter, and then staining to measure the number of stained cells.

본 발명에 따르면, 다공성 필터를 통과한 암세포의 수를 측정함으로써 암세포의 침윤을 억제하는 후보물질을 선별할 수 있다. 염색방법은 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 DNA 특이적 형광 염료(Hoechst 33258), 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염료를 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.According to the present invention, candidate substances that inhibit the infiltration of cancer cells can be selected by measuring the number of cancer cells that have passed through the porous filter. For example, DNA-specific fluorescent dyes (Hoechst 33258) and crystal violet dyes can be used as the dyeing method, but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method of screening for a cancer cell infiltration inhibitor comprising the steps of:

(a) 다공성 필터(porous filter)로 격리된 상부 챔버(upper-chamber)와 하부 챔버(lower-chamber)에 각각 암세포 및 불멸화시킨 섬유모세포를 접종하는 단계;(a) inoculating cancer cells and immortalized fibroblasts into an upper chamber and a lower chamber isolated by a porous filter, respectively;

(b) 후보물질(candidate)을 상기 상부 챔버에 첨가하는 단계; 및(b) adding a candidate to the upper chamber; And

(c) 상기 다공성 필터를 통과한 암세포의 수를 측정하는 단계로서, 후보물질을 첨가한 경우에서 후보물질을 첨가하지 않은 경우에 비해 다공성 필터를 통과한 암세포의 수가 적은 경우, 후보물질을 암세포 침윤 저해제로 판단한다.(c) measuring the number of cancer cells that have passed through the porous filter, wherein when the number of cancer cells passed through the porous filter is smaller than when the candidate substance is not added when the candidate substance is added, It is judged to be an inhibitor.

본 발명에 따르면, 본 발명에서 이용되는 섬유모세포는 상부 챔버에 접종된 암세포가 다공성 필터를 통과하도록 유도하며, 이러한 섬유모세포는 불멸화 및 암세포와의 공배양을 통해 수득된다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 시스템에 있어 하부 챔버에 접종되는 섬유모세포는 (ⅰ)불멸화 및 (ⅱ) 암세포와의 공배양의 두가지 단계가 완료된 세포일 수도 있으며, 또는 불멸화 단계만 거친 후 하부 챔버에 접종되어 상부 챔버에 접종된 암세포와의 상호작용을 통해 CAF-유사 섬유모세포의 표현형을 획득함으로써 본 발명에서 목적하는 스크리닝 시스템이 이용될 수 있다. 이 경우 불멸화된 섬유모세포를 하부 챔버에 접종함으로써 암세포와의 공배양의 효과가 발생하므로, 접종 전 사전 공배양의 과정을 생략할 수 있는 이점이 있다. According to the present invention, the fibroblasts used in the present invention induce cancer cells inoculated into the upper chamber to pass through the porous filter, and these fibroblasts are obtained through immortalization and co-culture with cancer cells. Accordingly, in the screening system of the present invention, the fibroblasts inoculated into the lower chamber may be cells in which the two steps of (i) immortalization and (ii) co-culture with cancer cells have been completed, or only after the immortalization step, Thereby obtaining the phenotype of CAF-like fibroblast through interaction with cancer cells inoculated into the upper chamber, whereby the screening system desired in the present invention can be used. In this case, since the immobilized fibroblast is inoculated into the lower chamber, co-cultivation with cancer cells occurs, so that there is an advantage that the process of pre-culture before the inoculation can be omitted.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 시스템을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a screening system for a cancer cell infiltration inhibitor, comprising:

(a) 암세포가 접종된 상부 챔버(upper-chamber);(a) an upper chamber into which cancer cells have been inoculated;

(b) 제 6 항의 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)-유사 섬유모세포가 접종된 하부 챔버(lower-chamber); 및 (b) a lower-chamber inoculated with CAF (carcinoma-associated fibroblasts) -like fibroblasts of claim 6; And

(c)상기 상부 챔버 및 상기 하부 챔버를 격리하는 다공성 필터(porous filter).(c) a porous filter for isolating the upper chamber and the lower chamber.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 시스템을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a screening system for a cancer cell infiltration inhibitor, comprising:

(a) 암세포가 접종된 상부 챔버(upper-chamber);(a) an upper chamber into which cancer cells have been inoculated;

(b) 불멸화시킨 섬유모세포가 접종된 하부 챔버(lower-chamber); 및 (b) a lower-chamber inoculated with immortalized fibroblasts; And

(c)상기 상부 챔버 및 상기 하부 챔버를 격리하는 다공성 필터(porous filter).(c) a porous filter for isolating the upper chamber and the lower chamber.

본 발명에서 이용되는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 시스템의 각 구성에 대해서는 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
Since each constitution of the screening system of the cancer cell infiltration inhibitor used in the present invention has already been described above, the description thereof will be omitted in order to avoid excessive duplication.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)-유사 섬유모세포, 이의 제작방법 및 이를 이용한 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.(a) The present invention provides carcinoma-associated fibroblasts (CAF) -like fibroblasts, a method for producing the same, and a method for screening cancer cell infiltration inhibitors using the same.

(b) 본 발명은 암세포의 침윤 저해물질을 신뢰도 높은 방법으로 대량/고속(High throughput)으로 스크리닝할 수 있다.(b) The present invention is capable of screening substances inhibiting the infiltration of cancer cells at high throughput in a reliable manner.

(c) 본 발명의 CAF-유사 세포는 본 발명의 스크리닝 시스템의 핵심적인 구성인 CAF와 유사한 표현형을 가지면서도 대량의 수득이 가능할 뿐 아니라 반영구적인 사용이 가능하여 보다 효율적인 스크리닝 시스템의 구축이 가능하도록 한다. (c) The CAF-like cells of the present invention have a phenotype similar to that of CAF, which is a key constituent of the screening system of the present invention, but can be used in a large amount and can be used semi-permanently so that a more efficient screening system can be constructed do.

(d) 본 발명의 CAF-유사 세포는 암세포와 암 주변 섬유모세와의 상호작용을 통합적으로 설명하고, 암세포의 발생, 증식, 침윤 및 전이를 비롯한 다양한 종양 관련 메카니즘을 연구하는 데에 유용한 연구 도구(research tool)로서 유용하게 이용될 수 있다.
(d) The CAF-like cells of the present invention integrally explain the interaction of cancer cells with the cancer fiber around the cancer, and research tools useful for studying various tumor-related mechanisms including cancer cell development, proliferation, invasion and metastasis and can be usefully utilized as a research tool.

도 1은 인간 치은 섬유모세포의 불멸화 및 이의 확인결과를 보여주는 그림이다. 도 1a는 hTERT가 양성 대조군인 Hela 세포에 비하여 hTERT- hNOF에서 발현이 증가되었음을 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과이다. 도 1b는 hTERT mRNA에 대한 RT-PCR 결과로서, hTERT가 불멸화 세포(hTERT-hNOF)에서는 양성의 발현을 보이나, hNOF에서는 초기(10계대)와 후기(27계대) 모두에서 발현되지 않음을 보여준다. 도 1c는 65계대의 hTERT-hNOF(a-c) 및 10 계대의 hNOF(d-f)에서의 hTERT에 대한 면역형광 염색 후 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. 초기 계대의 hNOF(10계대)는 hTERT를 발현하지 않은 반면 후기 계대의 hTERT-hNOF(65계대)는 양성 반응을 보였다. 도 1d는 8계대(a), 31계대(b) 및 50계대(c) hNOF의 SAb-Gal 활성을 나타내는 그림이다. SAb-Gal 활성 측정결과 복제성 노화는 모세포인 hNOF의 31계대에서 나타남을 확인하였다. 31계대의 hNOF에서 파란색으로 염색된 핵은 확대되고 확장되었음에 반해 초기(8계대) 및 후기(50계대) 계대의 hTERT-hNOF는 SAb-Gal 염색에서 음성의 결과를 나타내었다. 데이터 또는 사진은 3번의 독립된 실험에서의 대표적 결과를 보여주는 것이다.
도 2a는 도립 현미경으로 관찰한 hNOF, hTERT-hNOF 및 L929 세포의 외형을 보여주는 그림이다. hNOF 및 hTERT-hNOF 세포는 특징적인 방추형 섬유모세포의 형태를 보이는 반면 L929 세포는 이에 비해 둥근 다각형의 모양을 나타낸다. 도 2b는 액틴 및 비멘틴과 같은 세포골격 단백질에 대한 면역형광염색 결과를 보여주는 공초점 현미경 이미지이다. 핵 염색은 DAPI로 실시하였다. hNOF(a-d), hTERT-hNOF (e-h) 및 L929 세포(i-l). hNOF 및 hTERT-hNOF는 유사한 형태를 보인 반면 L929 세포는 외형이 상이하였다. L929 세포는 비멘틴을 발현하지 않았다. 도 2c는 hTERT-hNOF에서 hNOF에 비하여 비멘틴의 발현이 증가하였음을 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과이다. L929 세포는 다른 세포들에 비해 가장 적은 발현을 보였다. HeLa 세포는 음성 대조군으로 사용되었으며 액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다. 데이터 또는 사진은 3번의 독립된 실험에서의 대표적 결과를 보여주는 것이다.
도 3은 YD10B, hTERT-hNOF, YD10B와 공배양한 hTERT-hNOF, YD10B와 공배양 또는 단독 배양한 CAF 1 및 CAF 2에 대한 RT-PCR을 결과로서, a-SMA 및 Vimentin의 mRNA 발현량(도 3a) 및 IL-6 및 IL-8의 mRNA 발현량(도 3b) 차이를 각각 보여준다.
도 4는 YD10B, hTERT-hNOF, YD10B와 공배양한 hTERT-hNOF, YD10B와 공배양 또는 단독 배양한 CAF 1 및 CAF 2에 대해 웨스턴 블롯팅 분석결과로서, a-SMA 및 Vimentin의 단백질 발현량(도 6a) 및 p16 및 p21 단백질 발현량(도 6b) 차이를 보여준다.
도 5는 ELISA를 이용한 사이토카인 분비량 측정결과를 보여주는 그림이다.
도 6은 단독배양 혹은 YD10B 세포와 공동배양된 섬유모세포(CAF, hTERT-hNOF)의 베타갈락토시데이즈 활성 분석결과를 보여주는 그림이다.
도 7은 hTERT-NOF에 의해 YD10B(도 7a) 및 YD38(도 7b) 세포주의 침윤성이 크게 증가된 것을 보여주는 그림이다.
도 8은 암 세포주(YD-10B, YD38)를 24-트랜스웰 챔버(transwell chamber)의 상부웰(upper well)에 접종하고, CAF와 hTERT-hNOF는 하부웰(lower well)에 첨가한 뒤 암세포의 침윤을 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 도 8 a 및 8b는 각각 상부웰에 YD-10B 및 YD38를 접종한 결과이다. Fig. 1 shows the results of immortalization and confirmation of human gingival fibroblasts. FIG. 1A shows Western blotting results showing that hTERT was increased in hTERT-hNOF compared to Hela cells, which is a positive control group. Fig. 1B shows RT-PCR results of hTERT mRNA showing that hTERT is positive in hTERT-hNOF, but not hNOF in both early (late passage 10) and late (27th passage). Fig. 1C shows the result of observation with confocal microscope after immunofluorescence staining for hTERT in hTERT-hNOF (ac) and hNOF (df) in 65 passages. HNOF (10 passages) in the early passage did not express hTERT, whereas hTERT-hNOF (65 passages) in the latter pass passage was positive. 1 (d) is a graph showing SAb-Gal activity of hNOF in the 8th passage (a), 31 passage (b) and 50 passage (c) As a result of SAb-Gal activity measurement, it was confirmed that replication-induced senescence occurs in the passage 31 of hNOF as a parent cell. In the 31st hNOF, the blue-stained nuclei were enlarged and expanded, whereas the hTERT-hNOF in the early (8th and late 50th) passages showed negative results in SAb-Gal staining. Data or photographs show representative results in three independent experiments.
FIG. 2A is a diagram showing the appearance of hNOF, hTERT-hNOF and L929 cells observed with an inverted microscope. hNOF and hTERT-hNOF cells are characteristic of spindle fibroblasts, while L929 cells exhibit round polygonal shapes. Figure 2b is a confocal microscope image showing immunofluorescence staining results for cytoskeletal proteins such as actin and visentin. Nuclear staining was performed with DAPI. hNOF (ad), hTERT-hNOF (eh) and L929 cells (il). hNOF and hTERT-hNOF showed similar morphology while L929 cells differed in appearance. L929 cells did not express visentin. FIG. 2C shows Western blotting results showing that the expression of visentin was increased in hTERT-hNOF compared to hNOF. L929 cells showed the least expression compared to other cells. HeLa cells were used as a negative control and Actin was used as a loading control. Data or photographs show representative results in three independent experiments.
FIG. 3 shows the results of RT-PCR of CAF 1 and CAF 2 co-cultured with or without hTERT-hNOF and YD10B co-cultured with YD10B, hTERT-hNOF and YD10B, and mRNA expression levels of a-SMA and Vimentin 3A) and mRNA expression levels of IL-6 and IL-8 (Fig. 3B), respectively.
FIG. 4 shows Western blotting analysis results of CAF 1 and CAF 2 co-cultured or cultured alone with hTERT-hNOF and YD10B co-cultured with YD10B, hTERT-hNOF and YD10B, and the protein expression levels of a-SMA and Vimentin 6a) and the amount of p16 and p21 protein expression (Fig. 6b).
FIG. 5 is a graph showing the results of measurement of cytokine secretion amount by ELISA. FIG.
FIG. 6 is a graph showing the results of analysis of beta-galactosidase activity of fibroblasts (CAF, hTERT-hNOF) co-cultured with YD10B cells alone.
Fig. 7 is a graph showing that the invasiveness of YD10B (Fig. 7A) and YD38 (Fig. 7B) cell lines was greatly increased by hTERT-NOF.
FIG. 8 shows the results obtained by inoculating the cancer cell line (YD-10B, YD38) into the upper well of a 24-transwell chamber, adding CAF and hTERT-hNOF to the lower well, . Figure 2 shows the results of the measurement of the infiltration rate. Figures 8a and 8b are the results of inoculating YD-10B and YD38 into the upper well, respectively.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험방법Experimental Method

불멸화된 치은 섬유모세포의 확립-세포배양 및 hTERT 형질전환 Establishment of immortalized gingival fibroblasts - Cell culture and hTERT transformation

1차 배양을 위한 hNOF는 구강점막 질환이 없는 환자 중 3번째 어금니를 발치한 환자에서 수득하였으며, 연구를 위한 환자 동의서와 연구윤리 위원회 승인을 받았다(IRB-2-2009-0002). L929 세포주(NCTC clone 929)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 배양된 세포는 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagles Medium, Gibco, BRL, USA) 및 Ham’s Nutrient Mixture F-12(Gibco, BRL, USA)가 3:1의 조성을 가지고 10% FBS(fetal bovine serum, Hyclone, UT, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, NY, USA)이 보충된 F 배지에서 유지하였다. 치은 섬유모세포(gingival fibroblast)의 불멸화를 위하여, 퓨로마이신 내성의 레트로바이러스 벡터 plpc-hTERT(Clontech laboratories, CA, USA)를 Gp2 293 세포주에 형질전환하고, 2.5μg/ml 퓨로마이신(Calbiochem, CA, USA)에서 2주 간 양성 클론들을 선별하였다. 세포 상등액을 수집하여 0.45 lm 포어의 필터로 여과한 뒤 6웰 플레이트에서 hNOF를 감염시키는 데에 사용하였다. hNOF 세포의 컨플루언시가 70%에 이르렀을 때 바이러스 상등액을 첨가하였다. 형질전환된 세포는 2.5μg/ml 퓨로마이신을 이용하여 선별하였으며, 생존한 세포를 2.5μg/ml 퓨로마이신이 포함된 F 배지에서 유지하였다. 연속적인 서브컬쳐를 통해 매 10 계대마다 대조군으로서의 2.5μg/ml 퓨로마이신 처리된 hNOF와 비교하면서 형질전환된 세포를 확인하였다. hTERT-hNOF에서의 hTERT 형질전환은 웨스턴 블롯팅, RT-PCR 및 면역형광염색을 통해 확인하였다. 나아가, hTERT-hNOF 및 hNOF 세포주는 한국 세포주 은행에서 STR 프로파일링(DNA 핑거프린팅)을 하여 동일한 기원을 가짐을 확인하였다. 모든 세포주는 습도를 유지한 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 유지하였으며, 배양 배지는 3일마다 교체하였다. hNOF는 노화될 때까지 연속적으로 계대배양하였고 hTERT-hNOF는 70계대까지 배양하였다. 10계대 이하의 hNOF는 본 연구에서 hTERT-hNOF와의 생물학적 특성을 비교하는 데에 이용되었다.
HNOF for primary culture was obtained in patients who had undergone a third molar out of patients without oral mucosal disease, and received patient consent and research ethics committee approval for research (IRB-2-2009-0002). L929 cell line (NCTC clone 929) was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). The cultured cells were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium, Gibco, BRL, USA) and Ham's Nutrient Mixture F-12 (Gibco, BRL, USA) USA) and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen, NY, USA) supplemented with F medium. For the immortalization of gingival fibroblasts, the puromycin resistant retrovirus vector plpc-hTERT (Clontech laboratories, CA, USA) was transformed into Gp2 293 cell line and treated with 2.5 μg / ml puromycin (Calbiochem, CA, USA) for 2 weeks. The cell supernatant was collected, filtered through a 0.45 lm pore filter, and used to infect hNOF in a 6-well plate. The virus supernatant was added when confluence of hNOF cells reached 70%. The transformed cells were selected using 2.5 μg / ml puromycin, and the surviving cells were maintained in F medium containing 2.5 μg / ml puromycin. Transformed cells were identified by continuous subculture as compared to 2.5 μg / ml puromycin treated hNOF as a control for every 10 passages. hTERT transformation in hTERT-hNOF was confirmed by Western blotting, RT-PCR and immunofluorescence staining. Furthermore, the hTERT-hNOF and hNOF cell lines were confirmed to have the same origin by STR profiling (DNA fingerprinting) in Korean cell line bank. All cell lines were maintained in a humidified incubator at 37 ° C, 5% CO 2 , and the culture medium was changed every 3 days. hNOF was subcultured continuously until senescence and hTERT-hNOF was cultured up to 70 passages. Less than 10 passages of hNOF were used in this study to compare biological characteristics with hTERT-hNOF.

hTERT 형질전환의 확인Identification of hTERT Transfection

hTERT-hNOF에서의 hTERT 형질전환을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅을 종래에 보고된 방법에 몇몇 변형을 가하여 수행하였다(Robertson DM, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci.46:470-8(2005)). 요약하면, hNOF, hTERT-hNOF 및 Hela 세포(양성 대조군)을 파쇄하여 수득한 40μg 단백질을 8% 폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 SDS(sodium dodecyl sulfate) PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막은 이후 상온에서 2시간 동안 0.1% Tween 20을 함유하는 TBS(Tris-buffered saline)에서 탈지유로 블로킹하고 hTERT에 대한 1차 항체(1:200 희석, 래빗 폴리클로날 항체, Santa Cruz, CA, USA)와 함께 4℃에서 밤새 배양 후 TBST로 2회 세척하였다. 이어서 막은 2차 항체와 접합된 HRP(horseradish peroxidase)(1:500 희석)(Cell Signaling, MA, USA)와 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 단백질 밴드는 화학발광(ECL) 검출 킷(Santa Cruz, CA, USA)을 이용하여 검출하였다. 항-액틴 항체(Sigma, MO, USA)를 로딩 대조군으로 사용하였다.Western blotting was performed by adding some modifications to the previously reported method to confirm hTERT transformation in hTERT-hNOF (Robertson DM, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 46: 470-8 (2005)) . Briefly, 40 μg protein obtained by disrupting hNOF, hTERT-hNOF and HeLa cells (positive control) was subjected to SDS (sodium dodecyl sulfate) polyacrylamide gel electrophoresis using 8% polyacrylamide gel and subjected to nitrocellulose membrane I moved. The membranes were then blocked with skim milk in TBS (Tris-buffered saline) containing 0.1% Tween 20 for 2 hours at room temperature and incubated with primary antibody (1: 200 dilution, rabbit polyclonal antibody, Santa Cruz, CA, USA ) Overnight at 4 ° C and then washed twice with TBST. The membranes were then incubated with HRP (horseradish peroxidase) (1: 500 dilution) conjugated with secondary antibody (Cell Signaling, MA, USA) for 2 hours at room temperature. Protein bands were detected using a chemiluminescence (ECL) detection kit (Santa Cruz, CA, USA). Anti-actin antibody (Sigma, MO, USA) was used as the loading control.

hTERT 형질전환 여부는 RT-PCR을 통해서도 확인하였다. 요약하면, RNeasy 킷(Qiagen, GmbH, Germany)을 이용하여 hNOF(10계대 및 27계대 미만) 및 hTERT-hNOF(46 계대)로부터 총 RNA를 분리하고, 1 μg 총 RNA를 cDNA 합성에 사용하였다. RT-PCR을 위한 프라이머 서열은 다음과 같다: hTERT, 5’-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’(정방향) 및 5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’ (역방향); GAPDH, 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’(정방향) 및 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(역방향). hTERT에 대한 PCR 과정은 95℃에서 30초 간 변성을 30 사이클, 60℃에서 30초 간 어닐링 및 72℃에서 1분 간 재결합으로 이루어졌다. Transformation of hTERT was also confirmed by RT-PCR. In summary, total RNA was isolated from hNOF (less than 10 and less than 27) and hTERT-hNOF (46) using the RNeasy kit (Qiagen, GmbH, Germany) and 1 μg total RNA was used for cDNA synthesis. The primer sequences for RT-PCR are as follows: hTERT, 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3 '(forward) and 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3' (reverse direction); GAPDH, 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 '(forward) and 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' (reverse direction). The PCR procedure for hTERT was 30 cycles of denaturation at 95 ° C for 30 cycles, annealing at 60 ° C for 30 seconds and recombination at 72 ° C for 1 minute.

hNOF(10 계대) 및 hTERT-hNOF(65 계대)에서의 hTERT에 대한 면역형광 염색은 마우스 단일클론 항체(ab5181 Abcam plc, Cambridge, UK)를 이용하여 제조자의 설명서대로 수행하였다. Alex fluor 549 항-마우스 항체(1:500 희석)(Invitrogen, Oregon, USA)를 형광접합 2차 항체로 사용하였다. 핵을 10μg/ml DAPI(4’,6- diamidino-2-phenylindole, Sigma, MO, USA)로 표지하였다. 면역형광은 공초점 현미경(LSM510 Meta, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
Immunofluorescent staining for hTERT in hNOF (10 passages) and hTERT-hNOF (65 passages) was performed according to the manufacturer's instructions using mouse monoclonal antibody (ab5181 Abcam plc, Cambridge, UK). Alex fluor 549 anti-mouse antibody (1: 500 dilution) (Invitrogen, Oregon, USA) was used as the fluorescent conjugated secondary antibody. The nuclei were labeled with 10 μg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, Sigma, MO, USA). Immunofluorescence was observed using a confocal microscope (LSM510 Meta, Carl Zeiss, Jena, Germany).

hTERT-hNOF 세포주의 형태 관찰Observation of hTERT-hNOF cell line morphology

hTERT-hNOF, hNOF 및 L929 세포의 외형을 관찰하고 도립 현미경(inverted microscope)으로 촬영하였다. 아울러, 세포골격 단백질인 액틴(actin) 및 비멘틴(vimentin)에 대한 면역형광 염색을 각각 FITC 접합 항-액틴 항체(1:50) 및 Cy3 접합 항-비멘틴(1:200) 항체(Sigma, MO, USA)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 제조자의 설명서에 따라 수행하였다. 핵의 염색은 10 μg/ml DAPI를 이용하여 수행하였다. 면역형광염색 결과는 공초점 현미경(LSM510 Meta, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
The outline of hTERT-hNOF, hNOF and L929 cells was observed and photographed with an inverted microscope. Immunofluorescence staining for the cytoskeletal proteins actin and vimentin was performed using FITC conjugated anti-actin antibody (1:50) and Cy3 conjugated anti-vimentin (1: 200) antibody (Sigma, MO, USA) at room temperature for 1 hour according to the manufacturer's instructions. Nuclear staining was performed using 10 μg / ml DAPI. Immunofluorescence staining results were observed using a confocal microscope (LSM510 Meta, Carl Zeiss, Jena, Germany).

트랜스멤브레인을 이용한 공동 배양(co culture)Co-culture using a transmembrane (co-culture)

상기 실시예에서 제작된 hTERT-hNOF와 CAF, YD10B 및 YD38(OSCC cell line)를 각각 6-웰 트랜스웰 플레이트(멤브레인 포어 크기: 0.4um, 콜라겐 코팅)를 이용하여 공동배양을 진행하였다. 2 x 105 섬유모세포(CAF, hTERT-hNOF)를 6-웰에 분주하고 24시간동안 안정화한 후, 멤브레인 위에는 YD10B 또는 YD38[OSCC(oral squamous cell carcinoma) 세포주]를 각각 2 x 105 씩 분주하고 DMEM 및 Ham's Nutrient Mixture F12를 3:1 비율로 혼합한 FBS가 없는 배지로 5% CO2가 유지되는 37°C 배양기에서 24시간 배양한 다음 실험에 사용하였다.
The hTERT-hNOF, CAF, YD10B, and YD38 (OSCC cell line) prepared in the above example were co-cultured using a 6-well transwell plate (membrane pore size: 0.4 μm, collagen coating). 2 x 10 5 fibroblasts (CAF, hTERT-hNOF) the frequency division in 6-well and dispensed by each of 2 x 10 to 24 hours after stabilization during, or above the membrane YD10B YD38 [OSCC (oral squamous cell carcinoma ) cell lines; 5 DMEM and Ham's Nutrient Mixture F12 at a ratio of 3: 1 and cultured in a 37 ° C incubator maintained at 5% CO 2 for 24 hours.

RNA 추출 및 RT-PCRRNA Extraction and RT-PCR

RNaesy plus mini kit(Qiagen)를 이용하여 각 세포에서 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 마이크로플레이트 리더(Epoch, Biotek, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하고 순도를 검증하였다. 2.5 x RT-&GO (MP bio)를 이용하여 역전사를 진행하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA의 1ug를 이용하여 RT-PCR를 진행하였다.
RNA was extracted from each cell using RNaesy plus mini kit (Qiagen). The extracted RNA was measured for absorbance using a microplate reader (Epoch, Biotek, USA), and RNA was quantified and its purity was verified. CDNA was synthesized by reverse transcription using 2.5 x RT- & GO (MP bio). RT-PCR was performed using 1 ug of the synthesized cDNA.

웨스턴 블롯팅Western blotting

단독배양 혹은 공동배양이 진행된 섬유모세포(CAF, hTERT-hNOF)와 YD10B를 차가운 PBS를 이용해 세 번 수세하고 단백질 분해효소 억제제를 넣은 파쇄 완충액(Cell signaling, Beverly, MA, USA)을 첨가하였다. 스크레이퍼를 사용해 세포를 분리하여 1.5ml 튜브에 옮긴 후 30분 동안 얼음 위에서 파쇄시킨 후, 원심분리(15000rpm, 4°C, 10분)하여 단백질을 추출하였다. (CAF, hTERT-hNOF) and YD10B were washed three times with cold PBS and cell lysis buffer (Cell signaling, Beverly, MA, USA) containing protease inhibitor was added. The cells were separated using a scraper, transferred to a 1.5 ml tube, disrupted on ice for 30 minutes, and centrifuged (15000 rpm, 4 ° C, 10 minutes) to extract the protein.

단백질의 정량은 비신코닌산(bicinchoninic acid, Pierce, Rockford, Illinois, USA)방법으로 수행하였으며, 트리스-글리신 SDS 시료 완충액을 넣고 98°C에서 5분간 변성시켰다. 총 단백질 20μg을 이용하여 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 80V로 전기영동 하였다. PMSF 막을 사용하여 80V에서 1시간동안 이동시켰다. 막을 실온에서 1시간동안 블로킹하였으며 일차 항체를 넣고 4°C에서 밤새 배양하였다. 다음 날 1 x PBST로 5분 동안 3회 수세한 후 HRP가 접합된 2차 항체를 사용하여 실온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 1 x PBST로 5분 동안 3회 수세한 후 화학발광제로 반응시켰다. 막을 카세트에 넣고 x-ray 필름을 올려 노출시킨 후 현상하여 발현 정도를 측정하였다.
Protein quantification was performed by bicinchoninic acid (Pierce, Rockford, Ill., USA). Tris-glycine SDS sample buffer was added and denatured at 98 ° C for 5 minutes. Total protein 20 μg was electrophoresed on SDS-polyacrylamide gel at 80V. PMSF membrane at 80 V for 1 hour. The membranes were blocked for 1 hour at room temperature and primary antibody was added and incubated overnight at 4 ° C. The next day, the cells were washed 3 times with 1 x PBST for 5 minutes, and reacted with HRP conjugated secondary antibody at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with 1 x PBST for 5 minutes, the reaction was carried out with a chemiluminescent agent. The membrane was placed in a cassette, exposed to an x-ray film, developed, and the degree of expression was measured.

ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용한 사이토카인 분비량 측정Measurement of cytokine secretion using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

단독 배양의 경우, 2 x 105 섬유모세포(CAF, hTERT-hNOF)를 6-웰에 분주하여 24시간동안 안정화한 후, FBS가 없는 배지로 24시간동안 배양한 다음 배지를 수집하였다. 공동 배양의 경우, 2 x 105 섬유모세포(CAF, hTERT-hNOF)를 6-웰에 분주하고 24시간동안 안정화 시키고, 막 위에는 YD10B 를 2 x 105 씩 분주하여 24시간 안정화한 후, FBS가 포함되지 않는 배양액으로 24시간 배양하였다. 수집한 배지는 1000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 취하여 CM(conditioned media)으로 사용하였다. 상층액은 IL-6와 IL-8의 포획 항체, IL-6와 IL-8의 재조합 단백질, 검출 항체(R&D systems)를 이용하여 ELISA을 수행하였다.
For a single culturing, 2 x 10 5 fibroblasts after (CAF, hTERT-hNOF) stabilized for 24 hours in a 6-well seeded, were collected and then the medium was cultured for 24 hours in FBS-free medium. For co-culture, 2 x 10 5 fibroblasts (CAF, hTERT-hNOF) were dispensed in 6-wells and stabilized for 24 hours, and 2 x 10 5 of YD10B was dispensed on the membrane for 24 hours. FBS And cultured for 24 hours. The collected medium was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was used as CM (conditioned media). The supernatants were subjected to ELISA using capture antibodies of IL-6 and IL-8, recombinant proteins of IL-6 and IL-8, and detection antibodies (R & D systems).

베타갈락토시데이즈 활성 염색(beta-galactosidase staining)Beta-galactosidase staining (beta-galactosidase staining)

단독배양 혹은 YD10B 세포와 공동배양(48, 72, 96시간)이 진행된 섬유모세포(CAF, hTERT-hNOF)에서 노화 베타-갈락토시데이즈 염색 킷(Cell signaling)을 이용하였고, 제시된 프로토콜에 따라 베타-갈락토시데이즈 활성 염색을 진행하였다.
Aging beta-galactosidase staining kit (Cell signaling) was used in single culture or fibroblast (CAF, hTERT-hNOF) co-cultured with YD10B cells (48, 72, 96 hours) -Galactosidase active staining was carried out.

삼차원 배양 (three dimensional culture)Three dimensional culture

1형 콜라겐 용액, 재구성 용액(reconstitution solution)과 10 x DMEM을 8:1:1로 혼합하여 1형 콜라겐 혼합물을 만들었다. 1형 콜라겐 혼합물을 두 개로 나누어 하나의 혼합물에는 세포를 주입하지 않고, 나머지 하나의 혼합물에는 hTERT-NOF를 혼합액 250ul 당 1.5×105개의 세포가 들어가도록 주입한 뒤, 천천히 섞었다. 6 웰 플레이트 내에 마이셀(Millicell, 3.0포어 크기, 12 nm 직경)을 넣고 세포가 함유되지 않은 1형 콜라겐 혼합물과 hTERT-NOF가 함유된 1형 콜라겐 혼합물을 각 250ul씩 분주하였다. 5% CO2가 유지되는 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후, DMEM과 Ham/s nutrient mixture F12를 3:1 비율로 혼합하여 10% FBS(fetal bovine serum) 0.1/ml 콜레라 톡신, 0.4 /ml 하이드로코르티존, 5/ml 인슐린, 5/ml 아포-트랜스페린, 2/ml 3’-5-트리오도-1-타이로닌을 넣은 배지 3.0ml를 마이셀 밖에 넣었다. OSCC 세포주(YD10B, YD38)를 각각 3×105개의 세포씩 콜라겐 혼합물 위에 분주하여 배양하였다. 배양 후 2일 후에 마이셀 안을 공기-액상 상태로 만들어주고 2주간 더 배양하였다. 마이셀 밖의 배지를 2일 마다 한 번씩 교체해 주었다. 배양한 조직을 10% 중성 포르말린으로 고정하고 파라핀에 포매한 뒤, 0.4두께로 잘라서 H&E(hematoxylin and eosin)으로 염색하고 현미경을 이용하여 조직학적인 소견을 관찰하였다.
Type 1 collagen solution, reconstitution solution, and 10 x DMEM were mixed at 8: 1: 1 to form a collagen type I mixture. The 1-type collagen mixture was divided into two, and the cells were not injected into one mixture. The other mixture was injected with hTERT-NOF in an amount of 1.5 × 10 5 cells per 250 μl of the mixed solution, followed by slow mixing. Micelles (Millicell, 3.0 pore size, 12 nm diameter) were placed in a 6-well plate, and a 250 μl aliquot of a 1-type collagen mixture containing no cells and a 1-type collagen mixture containing hTERT-NOF was dispensed. After incubation for 24 hours at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator, DMEM and Ham / s nutrient mixture F12 were mixed at a ratio of 3: 1 and incubated with 10% FBS (fetal bovine serum) 3.0 ml of medium containing hydrocortisone, 5 / ml insulin, 5 / ml apo-transferrin and 2 / ml 3'-5-triiodo-1-thyronine was placed outside the micelle. The OSCC cell line (YD10B, YD38) was cultured at 3 × 10 5 cells per well on collagen mixture. Two days after the incubation, the micelles were made into an air-liquid state and further cultured for 2 weeks. The badge outside the michelle was changed once every two days. The cultured tissues were fixed with 10% neutral formalin, embedded in paraffin, cut to a thickness of 0.4, stained with H & E (hematoxylin and eosin), and histologic findings were observed using a microscope.

침윤 분석(invasion assay)Invasion assay

암 세포주(YD10B, YD38)를 8m 세공 사이즈의 다공성 필터를 갖는 24-트랜스웰 챔버(transwell chamber)의 상부(upper well)에 2 X 104 세포주/웰로 접종하고, CAF와 hTERT-hNOF는 하부웰(lower well)에 암세포와 1:1 비율로 첨가하였다. SO6 (5uM) 또는 대조군으로서 DMSO로 처리하여 48시간 후 세포의 침윤을 측정하기 위해, 콜라겐 코팅된 트랜스웰 막을 통과한 세포를 고정하고, 염색한 후에 광학현미경을 이용하여 사진을 촬영하였다.
Cancer cell lines (YD10B, YD38) were inoculated in an upper well of a 24-transwell chamber with a porous filter of 8 m pore size at 2 X 10 4 cell lines / well, CAF and hTERT-hNOF were inoculated into the lower well (1: 1 ratio) with the cancer cells in the lower well. Cells passed through a collagen-coated transwell membrane were fixed, stained and photographed using an optical microscope to measure infiltration of cells after treatment with SO6 (5 uM) or DMSO as a control group for 48 hours.

통계적 분석 Statistical analysis

SPSS 통계 분석 소프트웨어(version 17.0)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 일원분산분석(one-away ANOVA)으로 세포의 이동활성을 비교하였다. 세포주들 간의 세포독성 반응 패턴은 반복 측정된 ANOVA를 통해 분석하였다. P<0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
Data were analyzed using SPSS statistical analysis software (version 17.0). The cell migration activity was compared by one-way ANOVA. The pattern of cytotoxicity between cell lines was analyzed by repeatedly measured ANOVA. P <0.05 was considered statistically significant.

실험결과Experiment result

hTERT-hNOF 세포주의 확립Establishment of hTERT-hNOF cell line

2.5μg/ml 퓨로마이신을 2주간 처리 후 hTERT-hNOF 세포주를 선별하고 이를 성공적으로 확립하였다. hTERT-hNOF가 퓨로마이신 처리 후에도 살아남은 반면, hNOF는 5일 만에 완전히 사멸하였다. 치은 섬유모세포의 hTERT 형질전환은 웨스턴 블롯팅, RT-PCR 및 면역형광으로 확인하였다. hTERT-hNOF는 웨스턴 블롯팅에서 양성 대조군인 Hela 세포에 비하여 hTERT가 강하게 발현되었다(도 1a). RT-PCR 결과, 46계대의 hTERT-hNOF에서 초기(10계대) 및 후기(27계대) hNOF(모세포주)에 비하여 hTERT mRNA가 강하게 발현되었다(도 1b). 65계대의 hTERT-hNOF에서 hTERT에 대한 면역형광 염색 결과 핵에서의 양성 결과를 보인 반면, 훨씬 낮은 계대를 거친 10계대의 hNOF는 hTERT 발현이 음성의 결과를 나타냈다(도 1c). DNA 핑거프린팅을 통해 hTERT-hNOF가 모세포주인 hNOF에서 기원하였음을 확인하였다(표 1).HTERT-hNOF cell line was selected after treatment with 2.5 μg / ml puromycin for 2 weeks, and it was successfully established. hTERT-hNOF survived after puromycin treatment, whereas hNOF completely died in 5 days. HTERT transformation of gingival fibroblasts was confirmed by Western blotting, RT-PCR and immunofluorescence. In hTERT-hNOF, hTERT was strongly expressed in Western blotting as compared to positive control Hela cells (Fig. 1A). As a result of RT-PCR, hTERT mRNA was strongly expressed in the 46th hTERT-hNOF as compared to the early (10th passage) and late (27th passage) hNOF (parental passage) (FIG. Immunofluorescent staining for hTERT-hNOF in the 65th passage resulted in a positive result in the nucleus, while in the passage of the lower hNOF in the lower passage, hTERT expression was negative (Fig. 1C). DNA fingerprinting confirmed that hTERT-hNOF originated from the parental hNOF (Table 1).

hTERT-hNOF는 70계대 이후까지도 성공적으로 계대배양 되었으며, 복제성 노화의 징후를 보이지 않았다. 반면, 모세포주인 hNOF는 초기 계대(8계대)에서는 β-갈락토시다제에 염색되지 않았으나 27계대 이후에는 성장이 지연되고 31계대에서 핵이 파란색으로 염색된 β-갈락토시다제 염색 결과를 통해 노화가 감지되었다(도 1d). 그러나, 50계대 이상의 hTERT-hNOF 세포에서도 β-갈락토시다제 염색은 되지 않았다(도 1d).
hTERT-hNOF was successfully subcultured even after passage 70, showing no sign of replication-induced aging. On the other hand, hNOF was not stained with β-galactosidase in the early passage (passage 8), but growth was delayed after passage 27, and β-galactosidase staining with nuclei blue in passage 31 Aging was detected (Figure 1d). However, β-galactosidase was not stained even in hTERT-hNOF cells of 50 or more passages (FIG. 1d).

형태의 비교Comparison of forms

hNOF 및 hTERT-hNOF 간의 유의한 형태적 차이는 없었다. 두 세포 모두 특유의 방추형(spindle-shaped)의 섬유모세포 형태를 보여주었다. 반면, L929 세포는 작고 둥근 세포모양을 가졌다(도 2a 및 2b). 세포골격의 특성을 관찰하기 위하여, 액틴 및 비멘틴에 대한 면역형광 염색을 하고 공초점 현미경을 이용하여 영상화하였다. 그 결과, hNOF 및 hTERT-hNOF는 유사한 형태를 가진 반면 L929 세포는 외형이 상이하였다(도 2b). 뿐만 아니라, hNOF 및 hTERT-hNOF는 모두 세포골격 단백질인 액틴과 비멘틴을 발현하였지만 L929는 hNOF 및 hTERT-hNOF의 검출범위에서 비멘틴의 발현이 없었다(도 2b). 흥미롭게도, 비멘틴의 발현은 hNOF에서 보다 hTERT-hNOF에서 더 강하게 나타났으며(도 2b), 이는 웨스턴 블롯팅으로도 확인되었다(도 2c).
There was no significant morphological difference between hNOF and hTERT-hNOF. Both cells showed a spindle-shaped fibroblast form distinctive. On the other hand, L929 cells had a small, round cell shape (Figs. 2a and 2b). To observe the characteristics of cytoskeleton, actin and visentin were immunofluorescently stained and imaged using a confocal microscope. As a result, hNOF and hTERT-hNOF had a similar shape, whereas L929 cells differed in appearance (Fig. 2B). In addition, both hNOF and hTERT-hNOF expressed the cytoskeletal proteins actin and visentin, but L929 did not express visenger in the detection range of hNOF and hTERT-hNOF (Fig. 2B). Interestingly, the expression of visentin was stronger in hTERT-hNOF than in hNOF (Fig. 2b), which was also confirmed by Western blotting (Fig. 2c).

RT-PCR RT-PCR

YD10B, hTERT-hNOF, YD10B와 공배양한 hTERT-hNOF, YD10B와 공배양 또는 단독 배양한 CAF 1 및 CAF 2에 대해 RT-PCR을 수행한 결과를 도 5에 나타내었다. CAF는 양성 대조군으로 사용되었으며, 암세포 중 OSCC 세포주인 YD10B를 선택한 이유는 본 발명에서 이용된 hTERT-hNOF가 치은 섬유모세포(gingival fibroblast)를 불멸화시킨 세포이기 때문이다. YD10B와 hTERT-hNOF를 공동 배양하였을 경우에 hTERT-hNOF를 단독 배양하였을 때에 비해서 a-SMA 및 Vimentin의 mRNA 발현량이 유의하게 증가하는 것을 관찰하였으며(도 3a), 이를 통해 암세포와의 공배양을 통해 hTERT-hNOF가 근섬유모세포(myofibroblast)의 특성을 가지는 CAF와 매우 유사한 표현형을 가짐을 확인하였다. 아울러, hTERT-hNOF를 단독 배양하였을 경우에 비해서 YD10B와 공동 배양하였을 때 암 미세환경에서 가장 많이 발현된다고 알려진 사이토카인인 IL-6 및 IL-8의 발현이 CAF 보다도 크게 증가되는 것을 관찰하였다(도 3b).
RT-PCR was performed on CAF 1 and CAF 2 co-cultured with or alone cultured with hTERT-hNOF, YD10B co-cultured with YD10B, hTERT-hNOF and YD10B, and the result is shown in Fig. CAF was used as a positive control, and the OSCC cell line YD10B was selected as a cancer cell because hTERT-hNOF used in the present invention is an immortalized gingival fibroblast. In the co-culture of YD10B and hTERT-hNOF, mRNA expression of a-SMA and Vimentin was significantly increased compared with hTERT-hNOF alone (Fig. 3a) hTERT-hNOF has a phenotype very similar to that of CAF with myofibroblast characteristics. In addition, the expression of IL-6 and IL-8, the cytokines which are known to be most abundant in the cancerous microenvironment, was significantly higher than that of CAF when co-cultured with YD10B compared to hTERT-hNOF alone 3b).

웨스턴 블롯팅Western blotting

YD10B, hTERT-hNOF, YD10B와 공배양한 hTERT-hNOF, YD10B와 공배양 또는 단독 배양한 CAF 1 및 CAF 2에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과를 도 4에 나타내었다. YD10B와 hTERT-hNOF를 공동 배양하였을 경우에 hTERT-hNOF를 단독 배양하였을 때에 비해서 a-SMA 및 Vimentin의 발현량 증가가 단백질 수준에서도 뚜렷하게 관찰되었으며(도 4a), 노화 관련 마커인 p16 및 p21 단백질 역시 D10B와 hTERT-hNOF를 공동 배양하였을 경우 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4b).
Western blotting was performed on CAF 1 and CAF 2 co-cultured with or alone cultured with hTERT-hNOF, YD10B co-cultured with YD10B, hTERT-hNOF and YD10B, and the result is shown in Fig. The increase in the expression level of a-SMA and vimentin was clearly observed at the protein level (Fig. 4A) when the YD10B and hTERT-hNOF were co-cultured, and the p16 and p21 proteins D10B and hTERT-hNOF were co-cultured (Fig. 4B).

사이토카인 분비(ELISA)Cytokine secretion (ELISA)

상술한 RT-PCR 실험을 통해 종양 관련 사이토카인인 IL-6 및 IL-8의 세포 내 발현을 관찰한 데 이어, ELISA를 통해 상기 사이토카인의 세포 주변으로의 방출을 분석하였다. 그 결과, hTERT-hNOF를 단독 배양하였을 경우에 비해서 YD10B와 공동 배양하였을 때 사이토카인의 방출량 역시 유의하게 증가함을 관찰함으로써(도 5), 암세포와의 공배양을 통해 CAF와 유사한 표현형이 획득됨을 다시 한번 확인하였다.
The intracellular expression of the tumor-associated cytokines IL-6 and IL-8 was observed through the RT-PCR experiment described above, and the release of the cytokine to the cells was analyzed by ELISA. As a result, it was observed that cytotoxic release was also significantly increased when co-cultured with YD10B (Fig. 5), compared to when hTERT-hNOF alone was cultured (Fig. 5) Again confirmed.

베타갈락토시데이즈 활성Beta galactosidase activity

단독배양 혹은 YD10B 세포와 공동배양(48, 72, 96시간)이 진행된 섬유모세포(CAF, hTERT-hNOF)에 대해 또 다른 노화의 표지자인 베타갈락토시데이즈 활성 염색을 수행한 결과, YD10B 세포와 공동배양한 hTERT-hNOF에서 베타갈락토시데이즈 활성이 가장 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(도 6).
As a result of beta-galactosidase staining, another marker of aging, single-culture or fibroblast (CAF, hTERT-hNOF) co-cultured with YD10B cells (48, 72, 96 hours) Beta-galactosidase activity was most significantly increased in the co-cultured hTERT-hNOF (FIG. 6).

삼차원 배양Three-dimensional culture

세포가 함유되지 않은 1형 콜라겐 혼합물과 hTERT-NOF가 함유된 1형 콜라겐 혼합물에 각각 OSCC 세포주를 분주하여 배양한 결과, hTERT-NOF가 함유된 경우 YD10B(도 7a) 및 YD38(도 7b) 세포주의 침윤성이 크게 증가된 것을 각각 확인하였다.
When the OSCC cell line was separately cultured in a mixture of type 1 collagen without cell and type 1 collagen containing hTERT-NOF, the YD10B (Fig. 7A) and YD38 (Fig. 7B) Respectively, were significantly increased.

침윤 분석Infiltration analysis

암 세포주(YD10B, YD38)를 다공성 필터의 24-트랜스웰 챔버의 상부에 접종하고, CAF와 hTERT-hNOF를 하부웰에 첨가한 뒤 SO6(Hsp90 억제제, 5μM) 또는 대조군으로서 DMSO로 처리하여 침윤정도를 비교한 결과, 대조군(DMSO)에서는 증가된 침윤 능력이 침윤 작용의 억제자로 알려진 화합물인 S06 5μM를 처리하였을 때 CAF 또는 hTERT-hNOF와 공동 배양된 암 세포주 모두에서 감소됨을 보였다(도 8). 이로써, 본 발명의 세포는 암세포 침윤 억제물질의 스크리닝에 유용하게 적용될 수 있음이 확인되었다.
The cancer cell line (YD10B, YD38) was inoculated on top of the 24-transwell chamber of the porous filter, CAF and hTERT-hNOF were added to the lower well and treated with SO6 (Hsp90 inhibitor, 5 μM) or DMSO as control , The increased infiltration capacity in the control (DMSO) was reduced in both cancer cells co-cultured with CAF or hTERT-hNOF when treated with 5 μM S06, a compound known to inhibit infiltration (Fig. 8). Thus, it was confirmed that the cells of the present invention can be usefully applied for screening of cancer cell infiltration inhibiting substances.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (19)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 다음의 단계를 포함하는 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)-유사 섬유모세포 제작방법으로 제조된 CAF-유사 섬유모세포:
(a) 인체로부터 분리된 정상(normal) 치은 섬유모세포(gingival fibroblasts)를 불멸화시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 섬유모세포를 암세포인 구강편평상피암종(oral squamous cell carcinoma, OSCC)과 공배양(Co-culture)하는 단계.
CAF-like fibroblast cells prepared by carcinoma-associated fibroblasts (CAF) -like fibroblast production method comprising the steps of:
(a) immortalizing normal gingival fibroblasts isolated from the human body; And
(b) Co-culturing the fibroblasts obtained in step (a) with oral squamous cell carcinoma (OSCC), which is a cancer cell.
제 6 항에 있어서, 상기 CAF-유사 섬유모세포는 α-SMA, 비멘틴(vimentin), IL(interlukin)-6 또는 IL-8의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 CAF-유사 섬유모세포.
7. The CAF-like fibroblast according to claim 6, wherein the CAF-like fibroblast has an increased expression of? -SMA, vimentin, IL (interlukin) -6 or IL-8.
다음의 단계를 포함하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법:
(a) 다공성 필터(porous filter)로 격리된 상부 챔버(upper-chamber)와 하부 챔버(lower-chamber)에 각각 암세포 및 제 6 항의 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)-유사 섬유모세포를 접종하는 단계;
(b) 후보물질(candidate)을 상기 상부 챔버에 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 다공성 필터를 통과한 암세포의 수를 측정하는 단계로서, 후보물질을 첨가한 경우에서 후보물질을 첨가하지 않은 경우에 비해 다공성 필터를 통과한 암세포의 수가 적은 경우, 후보물질을 암세포 침윤 저해제로 판단한다.
A method of screening for a cancer cell infiltration inhibitor comprising the steps of:
(a) inoculating cancer cells and carcinoma-associated fibroblasts (CAF) -like fibroblasts of claim 6 into an upper chamber and a lower chamber isolated by a porous filter, respectively;
(b) adding a candidate to the upper chamber; And
(c) measuring the number of cancer cells that have passed through the porous filter, wherein when the number of cancer cells passed through the porous filter is smaller than when the candidate substance is not added when the candidate substance is added, It is judged to be an inhibitor.
제 8 항에 있어서, 상기 다공성 필터는 콜라겐 (collagen)으로 코팅된 것을 특징으로 하는 방법.
9. The method of claim 8, wherein the porous filter is coated with collagen.
제 8 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 다공성 필터를 통과한 암세포를 고정시킨 후 염색하여 염색된 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[9] The method of claim 8, wherein the step (b) comprises measuring the number of stained cells after fixing the cancer cells that have passed through the porous filter.
삭제delete 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 불멸화시킨 치은 섬유모세포는 섬유모세포에 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 또는 SV40 대형 T-항원(SV40 Large T-antigen)을 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 형질전환하여 불멸화시킨 섬유모세포인 것을 특징으로 하는 CAF-유사 섬유모세포.
7. The method according to claim 6, wherein the immortalized gingival fibroblast of step (a) comprises a vector comprising a nucleotide encoding hTERT (human telomerase reverse transcriptase) or SV40 large T-antigen Like fibroblasts characterized in that they are fibroblasts transformed and immortalized.
제 12 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 불멸화시킨 치은 섬유모세포는 섬유모세포에 hTERT를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 형질전환하여 불멸화시킨 섬유모세포인 것을 특징으로 하는 CAF-유사 섬유모세포.
13. The CAF-like fibroblast according to claim 12, wherein the immortalized gingival fibroblasts of step (a) are fibroblasts obtained by transforming a fibroblast cell with a vector containing a nucleotide encoding hTERT to an immortalized gingival fibroblast.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 다음을 포함하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 장치:
(a) 암세포가 접종된 상부 챔버(upper-chamber);
(b) 제 6 항의 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)-유사 섬유모세포가 접종된 하부 챔버(lower-chamber); 및
(c)상기 상부 챔버 및 상기 하부 챔버를 격리하는 다공성 필터(porous filter).Screening apparatus for a cancer cell infiltration inhibitor comprising:
(a) an upper chamber into which cancer cells have been inoculated;
(b) a lower-chamber inoculated with CAF (carcinoma-associated fibroblasts) -like fibroblasts of claim 6; And
(c) a porous filter for isolating the upper chamber and the lower chamber. 삭제delete
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