KR101646189B1 - Marker for diagnosing intrinsic atopic dermatitis and use thereof - Google Patents
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Abstract
하나 이상의 구체예는 내인성 아토피 피부염의 발명과 연관된 SNP 마커, 상기 마커를 포함하는 마이크로어레이 및 키트, 및 상기 마커를 이용하여 내인성 아토피 피부염 발병의 변경된 위험도를 갖는 개체를 확인하는 방법을 제공한다.One or more embodiments provide SNP markers associated with the invention of endogenous atopic dermatitis, microarrays and kits comprising the markers, and methods of identifying individuals with altered risk of developing endogenous atopic dermatitis using the markers.
내인성 아토피 피부염, SNP Endogenous atopic dermatitis, SNP
Description
하나이상의 구체예는 내인성 아토피 피부염 진단용 마커, 그를 포함하는 조성물, 마이크로어레이, 키트 및 그의 용도에 관한 것이다.One or more embodiments relate to markers for the diagnosis of endogenous atopic dermatitis, compositions comprising the same, microarrays, kits and uses thereof.
아토피 피부염 (atopic dermatitis: AD)은 전세계적으로 퍼져있는 일반적이고, 만성적인 염증성의 피부 질환이다. 아토피 피부염에서, 피부는 건조하고, 쉽게 자극을 받으며, 알러지 반응에서 즉각 과민반응 (immediate hypersensitivity)을 일으키고, 종종 두껍게 되고, 보통 붉어지며, 자주 감염되며, 종종 분비물을 배출하고 (exudatvie), 특히 가렵다 (itchy). 아토피 피부염은 특이적 알러지원 (allergen)에 노출되는 경우 즉각 과민반응을 일으키는, IgE 항체를 형성할 수 있는 특징을 가지고 있다. 이러한 표현형의 발현은 복수 개의 유전적 인자가 관여하는 것으로 알려져 있다. 아토피 민감성 유전자에는 여러 HLA 클라스 II 분자들, IL-4 수용체 단백질, IgG 고친화성 수용체 단백질이 포함된다. Atopic dermatitis (AD) is a common, chronic, inflammatory skin disease that has spread worldwide. In atopic dermatitis, the skin is dry, easily irritated, causes immediate hypersensitivity in allergic reactions, is often thick, usually reddened, often infected, often exudatvie, especially itchy (itchy). Atopic dermatitis is characterized by the ability to form IgE antibodies that cause immediate hypersensitivity when exposed to a specific allergen. Expression of these phenotypes is known to involve multiple genetic factors. Atopy sensitivity genes include several HLA class II molecules, IL-4 receptor proteins, and IgG high affinity receptor proteins.
아토피 피부염은 외인성 아토피 피부염 (extrinsic type AD)과 내인성 아토피 피부염 (비알러지성, intrinsic type AD)으로 구분할 수 있다. 외인성 아토피 피부염은 혈청 IgE 수준이 높고 알러겐 특이적 IgE가 존재하는 알러지 인자와 연관된 아토피 피부염이다. 내인성 아토피 피부염은 혈청 IgE 수준이 정상이나 외인성 아토피 피부염과 비슷한 피부 병흔 (skin lesion) 및 분포 양상을 나타내는 비알러지성 아토피 피부염이다. 내인성 아토피 피부염 환자는 전체 아토피 피부염 환자의 10~45%를 차지하는 것으로 보고되고 있다. Atopic dermatitis can be divided into extrinsic type AD and endocrine atopic dermatitis (intrinsic type AD). Exogenous atopic dermatitis is atopic dermatitis associated with an allergic factor with high serum IgE levels and allergen-specific IgE. Endogenous atopic dermatitis is a nonallergic atopic dermatitis that exhibits normal skin IgE levels or skin lesions and distribution patterns similar to extrinsic atopic dermatitis. Patients with endogenous atopic dermatitis account for 10 to 45% of all patients with atopic dermatitis.
상기한 바와 같이, 내인성 아토피 피부염은 알러지성 아토피 피부염과 증상은 동일하나 혈청 IgE 수준이 정상범위로 낮고 알러겐 특이적 IgE가 검출되지 않아 유전자 검사를 통한 고위험군에 대한 조기 진단을 통한 예방적 관리가 중요하다. As described above, endogenous atopic dermatitis has the same symptoms as allergic atopic dermatitis, but serum IgE level is low to normal range and allergen-specific IgE is not detected. Therefore, preventive management through early diagnosis of high risk through genetic testing It is important.
일 구체예는, 개체의 내인성 아토피 피부염의 발병과 연관성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 포함하는 마이크로어레이, 조성물 및 키트를 제공한다. One embodiment provides a polynucleotide having an association with the onset of an endogenous atopic dermatitis of an individual, and a microarray, composition, and kit comprising the same.
다른 일 구체예는, 개체의 내인성 아토피 피부염 발병의 변경된 위험도를 갖는 대상을 확인하는 방법을 제공한다. Another embodiment provides a method of identifying a subject having an altered risk of developing an endogenous atopic dermatitis of an individual.
일 구체예는, 서열번호 1 내지 9의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치를 포함하고 상기 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 SNP 위치는 101번째 뉴클레오티드인 개체의 내인성 아토피 피부염 발병 위험을 진단하기 위한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. One embodiment is a polynucleotide selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 9, or a complementary polynucleotide thereof, comprising at least 10 consecutive nucleotides selected from the polynucleotide, including the SNP position of the polynucleotide Wherein the SNP position is a 101 < th > nucleotide, to provide a polynucleotide for diagnosing the risk of endogenous atopic dermatitis in an individual.
"내인성 아토피 피부염 (intrinsic atopic dermatitis: IAD)"란 당업자에게 널리 알려진 의미로 사용된다. 상기 내인성 아토피 피부염은 만성 또는 재발성 피부질환으로서, 가려움증, 피부 건조증, 및/또는 특징적인 습진을 수반하는 것일 수 있다. "내인상 아토피 피부염 발병 위험"이란 내인성 아토피 피부염 발병의 상대적인 위험일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 발병의 확률이 정상인 군에 비하여 증가되어 있는지, 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 위험은 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체가 다른 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체에 비하여 아토피 피부염 발병의 확률이 증가되어 있는지 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다. 상기 개체는 인간일 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 한국인일 수 있다.The term " intrinsic atopic dermatitis (IAD) "is used by the person skilled in the art in a widely known sense. The endogenous atopic dermatitis may be a chronic or recurrent skin disease, involving itching, dry skin, and / or characteristic eczema. "My impression of the risk of developing atopic dermatitis" may be a relative risk of developing endogenous atopic dermatitis. For example, the risk may be indicative of whether the probability of onset is increased or decreased relative to a normal group. In addition, the risk may be indicative of whether the individual having a particular allele or genotype has an increased or decreased probability of developing atopic dermatitis as compared to an individual having another specific allele or genotype. The entity may be a human. For example, the human being may be a Korean.
"폴리뉴클레오티드"란 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 단일가닥 또는 이중가닥 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합에 의하여 혼성화될 수 있는 성질을 갖는 것이면, 천연 뉴클레오티드로 구성된 것뿐만 아니라, 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드 및 이들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)). 상기 폴리뉴클레오티드는 PNA를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 분석 반응에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그가 결합되어 있는 복합체의 검출의 편이를 위하여, 검출가능한 표지 (예, Cy3, Cy5 형광성 물질)가 부착, 예를 들면, 3'말단 또는 5'말단에 부착되어 있는 것일 수 있다."Polynucleotide" may be DNA or RNA. The polynucleotide may also be in single stranded or double stranded form. The polynucleotide may also be a polynucleotide which is not only composed of a natural nucleotide but also a natural nucleotide, an analogue of a natural nucleotide, a sugar, a base or a phosphate site of a natural nucleotide, which is capable of being hybridized to a complementary nucleotide by hydrogen bonding (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90: 543-584 (1990)), and nucleotides selected from the group consisting of . The polynucleotide includes PNA. Further, the polynucleotide may be attached with a detectable label (e.g., Cy3, Cy5 fluorescent substance), for example, in order to facilitate detection of the polynucleotide or the complex to which the polynucleotide is bound in the assay reaction, Terminal or 5 ' end.
상기 폴리뉴클레오티드는 SNP 부위에서 단일 뉴클레오티드 다형을 나타내는 것이다. 따라서, 하나의 단일가닥 폴리뉴클레오티드가 아토피 피부염의 발병 위험과 연관되어 있는 경우, 상기 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 당연히 아토피 피부염의 발병 위험과 연관되어 있는 것을 판단될 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 폴리뉴클레오티드는, 하나의 특정한 서열을 가진 아토피 피부염의 발병 위험과 연관되어 있는 단일가닥 폴리뉴클레오티드 및 그에 상보적인 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들면, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드는 101번째 (SNP 위치) 뉴클레오티드가 "C 또는 T"이다. 이 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는, 101번째 (SNP 위치)의 "C 또는 T" 뉴클레오티드를 포함하고 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 101번째 (SNP 위치)에 대응되는 위치에 "G 또는 A" 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 측면에서, 본 명세서의 모든 서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, national center for biotechnology information) 젠뱅크 (GENEBANK)에 등록된 SNP의 rs번호로 확인되는 플랑킹 서열 (flanking sequence)로 나타낸다. The polynucleotide represents a single nucleotide polymorphism at the SNP site. Thus, when one single-stranded polynucleotide is associated with the risk of developing atopic dermatitis, it can be judged that the polynucleotide complementary to the single-stranded polynucleotide is naturally associated with the risk of developing atopic dermatitis. Thus, a polynucleotide according to one embodiment comprises a single-stranded polynucleotide and a polynucleotide having a complementary sequence associated with the risk of developing atopic dermatitis having one specific sequence. For example, the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 has the nucleotide at position 101 (SNP position) is "C or T ". In this case, the polynucleotide includes 10 or more consecutive nucleotides selected from the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, including the " C or T "nucleotide at the 101st (SNP position) Position "G or A" nucleotides. In this regard, all sequences herein are referred to as the promoter sequence identified by the rs number of the SNP registered in the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, national center for biotechnology information) GENBANK (flanking sequence).
SNP (single nucleotide polymorphism)란 당업계에 통상적으로 알려진 의미로 사용된다. SNP는 집단 내의 게놈에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형을 나타낼 수 있다. 상기 SNP는 집단 내의 SNP의 소수 대립인자의 빈도가 1%이상인 것일 수 있다. Single nucleotide polymorphism (SNP) is used in the sense commonly known in the art. A SNP can represent a single nucleotide polymorphism present in a genome within a population. The SNP may have a frequency of a minor allele of the SNP in the population of 1% or more.
상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 30 뉴클레오티드인 것일 수 있다.The polynucleotide may be 10-100 nucleotides in length. For example, the polynucleotide may be 10 to 50 nucleotides in length, or 10 to 30 nucleotides in length.
상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. "프라이머"란 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서, 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합 한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소의 존재) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들면, 온도와 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. The polynucleotide may be a primer or a probe. "Primer" refers to a single-stranded polynucleotide capable of acting as a starting point in polymerization of a nucleotide by a polymerase. For example, the primer can be a single primer that can serve as a starting point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (i.e., the presence of four different nucleoside triphosphates and polymerization enzymes) in a suitable buffer and a suitable temperature. Strand < / RTI > polynucleotide. The appropriate length of the primer may vary depending on various factors, for example, temperature and use of the primer. The primer may be 15 to 30 nucleotides in length. Short primer molecules generally require lower temperatures to form sufficiently stable hybrid complexes with the template.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 상기 프라이머는 상기한 폴리뉴클레오티드 자체 뿐만 아니라, 상기한 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 서열로서 중합반응에서 개시점으로 작용할 수 있는 것도 포함된다. 예를 들면, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 상보성을 갖는 서열일 수 있다. 프라이머의 설계는 주어진 증폭하고자 하는 표적핵산의 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램을 사용하여 설계할 수 있다. 상기 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램의 예는 PRIMER 3 프로그램이 포함된다. The sequence of the primer does not need to have a sequence completely complementary to a partial sequence of the template, and it is sufficient if the complementarity within the range capable of hybridizing with the template and acting as a primer is inherent. Accordingly, the primer includes not only the polynucleotide itself but also a sequence that specifically hybridizes to the polynucleotide described above, which can act as a starting point in the polymerization reaction. For example, it may be a sequence completely complementary to the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, or a sequence complementary to such a sequence that hybridizes to this sequence and can perform a primer action. The design of the primer can be readily carried out by those skilled in the art by reference to the sequence of the target nucleic acid to be amplified. For example, it can be designed using a commercially available program for primer design. Examples of commercially available programs for primer design include the PRIMER 3 program.
상기 폴리뉴클레오티드가 PCR 프라이머로서 사용되는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드에 더하여, 그의 상보적 가닥에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함할 수 있다. When the polynucleotide is used as a PCR primer, in addition to the polynucleotide, it may include a primer that specifically binds to its complementary strand.
"프로브"란 특정 표적 서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합에 의하여 혼성화될 수 있는 성질을 갖는 것이면, 천연 뉴클레오티드로 구성된 것뿐만 아니라, 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드 및 이들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 PNA를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 분석 반응에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그가 결합되어 있는 복합체의 검출의 편이를 위하여, 검출가능한 표지 (예, Cy3, Cy5 형광성 물질)가 부착, 예를 들면, 3'말단 또는 5'말단에 부착되어 있는 것일 수 있다."Probe" refers to a polynucleotide that specifically binds to a specific target sequence. The polynucleotide may be DNA or RNA. The polynucleotide may be in single stranded form. The polynucleotide may also be a polynucleotide which is not only composed of a natural nucleotide but also a natural nucleotide, an analogue of a natural nucleotide, a sugar, a base or a phosphate site of a natural nucleotide, which is capable of being hybridized to a complementary nucleotide by hydrogen bonding And nucleotides selected from the group consisting of combinations thereof. The polynucleotide includes PNA. Further, the polynucleotide may be attached with a detectable label (e.g., Cy3, Cy5 fluorescent substance), for example, in order to facilitate detection of the polynucleotide or the complex to which the polynucleotide is bound in the assay reaction, Terminal or 5 ' end.
상기 프로브는, SNP 부위를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드에 완전 상보적인 서열일 수 있다. 또한, 상기 프로브는, SNP 부위를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 프로브는, SNP 부위를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적 혼성화를 손상되지 않는 범위 내에서, 변형된 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있다. 상기 프로브의 예는, SNP 부위를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드에 완전 상보적인 서열로 이루어진 완전 매치 프로브 (perfect match probe) 및 SNP 부위를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드에 대하여, 상기 SNP 부위를 제외한 모든 서열에 대하여 완전 상보적인 서열을 갖는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. The probe may be an entirely complementary sequence to the polynucleotide comprising the SNP site. In addition, the probe may have a substantially complementary sequence within a range that does not interfere with specific hybridization to the polynucleotide including the SNP site. In addition, the probe may have a modified nucleotide within a range that does not impair the specific hybridization to the polynucleotide including the SNP site. Examples of the probe include a perfect match probe consisting of a sequence completely complementary to the polynucleotide including a SNP site and a polynucleotide having a SNP site, And a probe having a completely complementary sequence.
상기 프라이머 및 프로브를 사용하여 SNP 부위에 특정한 대립인자를 가진 뉴클레오티드 서열을 증폭하거나 그 존재를 확인할 수 있다.The primers and probes can be used to amplify or confirm the presence of nucleotide sequences with specific alleles at the SNP site.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 9의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드의 조합물일 수 있다. The polynucleotide may be a polynucleotide selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-9 or a combination of complementary polynucleotides thereof.
다른 구체예는, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 개체의 내인성 아토피 피부염의 발병 위험을 진단하기 위한 조성물을 제공한다. Another embodiment provides a composition for diagnosing the risk of developing endogenous atopic dermatitis of an individual comprising the polynucleotide.
상기 조성물에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드, 개체 및 내인성 아토피 피부염에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 조성물은 고상 조성물 또는 액상 조성물일 수 있다. 상기 액상 조성물은 상기 폴리뉴클레오티드를 적절한 액체 매질 중에 포함할 수 있다. 상기 액상 매질은 당업계에서 폴리뉴클레오티드의 액상 매질로 사용되는 임의의 것일 수 있다. 또한, 상기 액상 매질은 상기 조성물를 사용하고자 하는 목적에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 액상 매질은 물, PCR 버퍼 및 혼성화 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.In the composition, the polynucleotide, the individual, and the endogenous atopic dermatitis are as described above. The composition may be a solid phase composition or a liquid phase composition. The liquid composition may comprise the polynucleotide in a suitable liquid medium. The liquid medium may be any of those used in the art as the liquid medium of the polynucleotide. In addition, the liquid medium may be appropriately selected depending on the intended use of the composition. For example, the liquid medium may be selected from the group consisting of water, PCR buffer, and hybridization buffer.
다른 구체예는, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 개체의 내인성 아토피 피부염의 발병 위험을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다. Another embodiment provides a microarray for diagnosing the risk of developing endogenous atopic dermatitis of an individual comprising the polynucleotide.
상기 폴리뉴클레오티드, 개체 및 내인성 아토피 피부염에 대하여는, 상기한 바와 같다. "마이크로어레이"란 기판 표면의 구분된 영역에 상기 폴리뉴클레오티드가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것을 의미한다. 상기 마이크로어레이는, 상기 영역이 예를 들면 400/cm2 이상, 103/cm2, 또는 104/cm2의 밀도로 기판 상에 배열되어 있는 것일 수 있다.The above polynucleotide, individual, and endogenous atopic dermatitis are as described above. The term "microarray" means that the polynucleotide is immobilized at a high density in the divided region of the substrate surface. The microarray may be such that the regions are arranged on the substrate at a density of, for example, 400 / cm 2 or more, 10 3 / cm 2 , or 10 4 / cm 2 .
다른 구체예는, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 개체의 내인성 아토피 피부염의 발병 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다. Another embodiment provides a kit for diagnosing the risk of developing endogenous atopic dermatitis of an individual comprising the polynucleotide.
상기 폴리뉴클레오티드, 개체 및 아토피 피부염에 대하여는, 상기한 바와 같다. 상기 폴리뉴클레오티드는 기판 표면 상의 구분된 영역에 고밀도로 배열되어 있는 마이크로어레이 형태일 수 있다.The above polynucleotide, individual and atopic dermatitis are as described above. The polynucleotides may be in the form of microarrays, arranged at high density in discrete regions on the substrate surface.
상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭하고, 증폭 산물의 존재 유무를 통하여, 개체의 아토피 피부염의 발병 위험을 진단하기 위한 키트일 수 있다. 이 경우, 상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드를 프라이머로서 포함하는 동시에, 증폭에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 상기 증폭 시약은 예를 들면, dNTP, 폴리머라제, 및 적절한 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 예를 들면, SNP 부위에 해당하는 뉴클레오티드 서열이 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드를 형성하고, 상기 3' 말단 뉴클레오티드는 상기 SNP 부위의 뉴클레오티드에 상보적이거나 (특이적 프라이머) 상보적이지 않은 것 (비특이적 프라이머)으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 비특이적 프라이머는 상기 3' 말단 뉴클레오티드뿐만 아니라 다른 부위에도 상보적이지 않은 서열을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한, 사용 설명서를 포 함할 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 서열이 증폭되고, 상기 비특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 서열이 증폭되지 않는 경우, 증폭에 사용된 시료 중에서 내인성 아토피 피부염과 연관된 표적 서열이 존재하는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 개체의 내인성 아토피 피부염의 발병 위험을 결정하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함할 수 있다.The kit may be a kit for specifically diagnosing the risk of developing atopic dermatitis of an individual through amplification of the polynucleotide and presence or absence of an amplification product. In this case, the kit may include the polynucleotide as a primer and the reagent necessary for amplification. The amplification reagent may comprise, for example, dNTPs, polymerases, and suitable buffers. For example, the primer may be one in which the nucleotide sequence corresponding to the SNP site forms the 3'-terminal nucleotide of the primer, the 3'-terminal nucleotide is complementary to the nucleotide at the SNP site (specific primer) (Non-specific primers). The non-specific primer may include a sequence that is not complementary to the 3 'terminal nucleotide as well as other sites. The kit may also include instructions for use. For example, in the case where the target sequence is amplified in the amplification reaction using the specific primer and the target sequence is not amplified in the amplification reaction using the non-specific primer, Including a description of determining the presence of a target sequence and determining the risk of developing an endogenous atopic dermatitis of an individual from the result.
상기 키트는, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그로부터 유래된 프로브를 시료 중의 핵산과 혼성화시키고, 그 혼성화 결과로부터 개체의 내인성 아토피 피부염의 발병 위험을 진단하기 위한 키트일 수 있다. 이 경우, 상기 키트는, 상기 프로브 및 혼성화에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 혼성화에 필요한 시약이란 예를 들면, 혼성화 버퍼가 포함될 수 있다. 상기 핵산은 증폭 또는 증폭되지 않은 것일 수 있다. 따라서, 상기 키트는 핵산의 증폭에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 상기 키트는, 상기 폴리뉴클레오티드에 완전 상보적인 프로브 (perferct match probe) 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 있어서, SNP 부위를 제외한 모든 부위에서 상보적인 미스매치 프로브 (mismatch probe)를 포함할 수 있다. 상기 프로브는 기판 상의 복수 개의 구분된 영역에 고정되어 있는 마이크로어레이의 형태일 수 있다. 상기 키트는 또한, 사용 설명서를 포함할 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 완전 상보적인 프로브를 사용한 혼성화 반응에서 표적 서열이 검출되고, 상기 미스매치 프로브를 사용한 혼성화 반응에서 표적 서열이 검출되지 않는 경우, 시료 중에서 내인성 아토피 피부염과 연관 된 서열이 존재하는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 개체의 내인성 아토피 피부염의 발병 위험을 결정하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함할 수 있다.The kit may be a kit for hybridizing the polynucleotide or a probe derived therefrom with a nucleic acid in a sample and diagnosing the risk of the endogenous atopic dermatitis of the individual from the hybridization result. In this case, the kit may include the probe and a reagent necessary for hybridization. Reagents necessary for hybridization include, for example, a hybridization buffer. The nucleic acid may not be amplified or amplified. Thus, the kit may further comprise reagents necessary for amplification of the nucleic acid. The nucleic acid may be labeled with a detectable label. The kit may comprise a perferct match probe that is completely complementary to the polynucleotide or a mismatch probe that is complementary at all sites except for the SNP site in the polynucleotide. The probes may be in the form of microarrays fixed to a plurality of discrete regions on the substrate. The kit may also include instructions for use. For example, when the target sequence is detected in the hybridization reaction using the completely complementary probe and the target sequence is not detected in the hybridization reaction using the mismatch probe, the sequence of the sequence associated with endogenous atopic dermatitis Including the description of determining the presence of atopic dermatitis, and determining the risk of developing an endogenous atopic dermatitis of the individual from the result.
다른 구체예는, 분리된 핵산 시료를 제공하는 단계; 및 Another embodiment provides a method for detecting nucleic acid, comprising: providing a separate nucleic acid sample; And
상기한 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 단계를 포함하는 내인성 아토피 피부염 발병의 변경된 위험도를 갖는 개체를 확인하는 방법을 제공한다.Determining the nucleotide at the SNP position of the polynucleotide as described above. ≪ Desc / Clms Page number 12 >
상기 방법은, 분리된 핵산 시료를 제공하는 단계를 포함한다. 개체로부터 핵산을 분리하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 분리하거나 PCR과 같은 핵산 증폭 방법에 의하여 특정한 영역을 증폭함으로써 분리될 수 있다. 상기 분리된 핵산 시료에는 순수하게 분리된 핵산뿐만 아니라 조 분리된 핵산, 예를 들면, 핵산을 포함하는 세포 파쇄물도 포함한다. 상기 핵산 증폭 방법에는 PCR, 리가제 연쇄반응 (LCR), 전사증폭 (transcription amplification), 자기 유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)가 포함된다. 상기 분리된 핵산은, DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 DNA에는 게놈 DNA, cDNA 또는 재조합 DNA일 수 있다. 상기 RNA는 mRNA 일 수 있다.The method comprises providing a separate nucleic acid sample. Methods for separating nucleic acids from an individual are known in the art. For example, DNA can be isolated directly from tissues or cells by amplifying specific regions by nucleic acid amplification methods such as PCR. The separated nucleic acid sample includes not only the purely isolated nucleic acid but also a cell lysate containing a crude nucleic acid, for example, a nucleic acid. Such nucleic acid amplification methods include PCR, ligase chain reaction (LCR), transcription amplification, self-sustained sequence replication, and nucleic acid-based sequence amplification (NASBA). The separated nucleic acid may be DNA or RNA. The DNA may be a genomic DNA, a cDNA, or a recombinant DNA. The RNA may be mRNA.
상기 방법은, 또한, 상기한 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 단계를 포함한다. The method also includes determining the nucleotide at the SNP position of the polynucleotide described above.
SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 것은 알려져 있다. 예를 들면, 알려진 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 방법 (sequencing method)에 의하여 SNP 위치의 뉴클레오티드를 직접적으로 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 결정 방법에는 상거 (또는 디데옥시) 방법 또는 막삼-길버트 (화학 절단) 방법이 포함될 수 있다. 또한, SNP 위치의 서열을 포함하는 프로브를 대상 폴리뉴클레오티드와 혼성화시키고, 혼성화 결과를 분석함으로써, SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정할 수 있다. 혼성화 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 대상 핵산에 표지하고, 혼성화된 대상 핵산을 검출함으로써 확인되거나, 전기적 방법 등에 의하여 확인될 수 있다. 또한, 단일염기 연장 (single base primer extension: SBE) 방법이 이용될 수 있다.It is known to determine the nucleotide at the SNP position. For example, the nucleotide at the SNP position can be determined directly by a nucleotide sequencing method of known nucleic acids. The nucleotide sequence determination method may include a sanguine (or dideoxy) method or a curd-gilbert (chemical cleavage) method. In addition, the nucleotide at the SNP position can be determined by hybridizing a probe containing the sequence of the SNP position with the polynucleotide of interest, and analyzing the hybridization result. The degree of hybridization can be confirmed, for example, by marking a detectable label on the target nucleic acid, detecting the hybridized target nucleic acid, or confirming it by an electrical method or the like. In addition, a single base primer extension (SBE) method can be used.
상기 방법에 있어서, 상기 SNP 부위의 폴리뉴클레오티드를 결정하는 단계는 상기 폴리뉴클레오티드가 고정화되어 있는 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. In the above method, the step of determining a polynucleotide of the SNP region may include hybridizing the nucleic acid sample to a microarray on which the polynucleotide is immobilized; And detecting the hybridization result.
또한, 상기 방법은, 상기 SNP 부위의 뉴클레오티드를 결정한 결과 위험 대립인자가 존재하는 경우, 상기 개체를 내인성 아토피 피부염 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다. In addition, the method may include determining that the subject belongs to a high-risk group having an incidence of endogenous atopic dermatitis when a risk allele is present as a result of the determination of the nucleotide at the SNP site.
"위험 대립인자 (risk allele)"란 기준 대립인자를 소수대립인자 a로 하여 질병군에서의 a의 빈도가 정상군에서의 a의 발현 빈도 보다 큰 경우에는 a를 위험 대립인자로 하고, 그 반대의 경우에는 A를 위험 대립인자로 할 수 있다. 개체가 위험 대립인자를 많이 가질수록 내인성 아토피 피부염의 발병 가능성이 높을 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1,7,8 및 9의 경우 101번째에서 소수 대립인자 a가 존재하는 경우, 상기 대상을 내인성 아토피 피부염 발병의 확률이 높은 위험군에 속하 는 것으로 판정하거나, 서열번호 2,3,4,5및 6의 경우 101째에서 소수 대립인자 a가 존재하는 경우, 상기 개체를 내인성 아토피 피부염 발병의 확률이 낮은 군 또는 주 대립인자 A가 존재하는 경우 내인성 아토피 피부염 발명의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다. 대립인자 A 및 a에 대하여는 표 1에 나타낸 바와 같다. 예를 들면, 결정된 SNP 부위의 뉴클레오티드가 서열번호 1의 SNP 부위에 대하여 T, 서열번호 7의 SNP 부위에 대하여 G, 서열번호 8의 SNP 부위에 대하여 G, 서열번호 9의 SNP 부위에 대하여 G, 서열번호 2의 SNP 부위에 대하여 A, 서열번호 3의 SNP 부위에 대하여 G, 서열번호 4의 SNP 부위에 대하여 C, 서열번호 5의 SNP 부위에 대하여 T 및 서열번호 6의 SNP 부위에 대하여 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드인 경우, 상기 개체를 내인성 아토피 피부염 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다. 또한, 결정된 SNP 부위의 뉴클레오티드가 서열번호 1의 SNP 부위에 대하여 G, 서열번호 7의 SNP 부위에 대하여 T, 서열번호 8의 SNP 부위에 대하여 A, 서열번호 9의 SNP 부위에 대하여 A, 서열번호 2의 SNP 부위에 대하여 G, 서열번호 3의 SNP 부위에 대하여 A, 서열번호 4의 SNP 부위에 대하여 T, 서열번호 5의 SNP 부위에 대하여 A 및 서열번호 6의 SNP 부위에 대하여 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드인 경우, 상기 개체를 내인성 아토피 피부염 발병의 확률이 낮은 군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.A "risk allele" is defined as a minor allele (a), a is a risk allele when the frequency of a in the disease group is greater than the frequency of a in the normal group, and vice versa A may be a risk allele. The more likely an individual has a risk allele, the greater the likelihood of endogenous atopic dermatitis. For example, in the case of SEQ ID NOS: 1, 7, 8 and 9, in the presence of a minority allele a, the subject is judged to belong to a high-risk group of endogenous atopic dermatitis, 3, 4, 5, and 6, in the presence of a minority allele a, the subject has a low probability of developing endogenous atopic dermatitis, or in the presence of major allele A, the possibility of endogenous atopic dermatitis It can be determined to belong to the risk group. Alleles A and a are shown in Table 1. For example, if the nucleotide at the determined SNP site is T for the SNP site of SEQ ID NO: 1, G for the SNP site of SEQ ID NO: 7, G for the SNP site of SEQ ID NO: 8, G for the SNP site of SEQ ID NO: G for the SNP region of SEQ ID NO: 3, C for the SNP region of SEQ ID NO: 4, T for the SNP region of SEQ ID NO: 5, and T for the SNP region of SEQ ID NO: The subject can be judged to belong to a high-risk group having a high incidence of endogenous atopic dermatitis. The nucleotide at the determined SNP site is G for the SNP site of SEQ ID NO: 1, T for the SNP site of SEQ ID NO: 7, A for the SNP site of SEQ ID NO: 8, A for the SNP site of SEQ ID NO: 2 for the SNP region, A for the SNP region of SEQ ID NO: 3, T for the SNP region of SEQ ID NO: 4, A for the SNP region of SEQ ID NO: 5, and C for the SNP region of SEQ ID NO: 6 , It can be determined that the subject belongs to a group having a low probability of developing endogenous atopic dermatitis.
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 인간일 수 있다. 상기 인간은 한국인일 수 있다. 상기 방법에 있어서, "변경된 위험도"란 내인성 아토피 피부염 발병의 상대적인 위험도일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험도는 발병의 확률이 정상인 군에 비 하여 증가되어 있는지, 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 위험도는 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체가 다른 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체에 비하여 내인성 아토피 피부염 발병의 확률이 증가되어 있는지 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다. In the method, the subject may be a human. The human being may be Korean. In the above method, the "altered risk" may be the relative risk of developing an endogenous atopic dermatitis. For example, the risk may be indicative of whether the probability of onset is increased or decreased relative to a normal group. The risk may also be indicative of whether the individual having a particular allele or genotype has an increased or decreased probability of developing endogenous atopic dermatitis as compared to an individual having another specific allele or genotype.
표 1. Table 1.
표 1은 내인성 아토피 피부염 환자 212명과 정상인 473명에 대한 SNP 부위의 유전형의 빈도 및 소수대립인자 빈도를 나타내는 표이다. 표 1에 나타낸 SNP의 서 열 내 위치는 101번째이다.Table 1 shows the frequency of genotype and frequency of minor alleles in SNP sites in 212 patients with endogenous atopic dermatitis and 473 healthy individuals. The position in the sequence of the SNP shown in Table 1 is 101st.
표 1에 있어서, rs 번호는 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, national center for biotechnology information) 젠뱅크 (GENEBANK)에 등록된 SNP의 번호로서, 상기 서열번호에 나타낸 서열은 SNP를 포함하는 이들 서열의 일부를 나타낸 것이다. 당업자라면, rs 번호를 참조하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. 표 1에서, 서열번호로 표시되는 서열은 NCBI 젠뱅크 등록번호 (rs 번호)에 의하여 나타내어지는 서열을 일부로서 SNP 부위를 포함하는 서열이다.In Table 1, the rs number is the SNP number registered in the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, national center for biotechnology information) GENBANK, and the sequence shown in the SEQ ID NO: Lt; RTI ID = 0.0 > SNP. ≪ / RTI > Those skilled in the art will readily be able to ascertain the location and sequence of the SNP with reference to the rs number. In Table 1, the sequence represented by the sequence number is a sequence including the SNP site as a part of the sequence represented by the NCBI Genbank registration number (rs number).
표 1에 있어서, MA는 소수 대립인자 (minor allele)을 나타내며, SNP는 SNP 위치에서의 유전형 (genotype) 또는 MAF를 나타낸다. MAF_X (minor allele frequency)는 소수 대립인자 X의 빈도를 나타낸다. 질병군 (intrinsic atopic dermatitis) 및 정상군 (normal)은 각각 내인성 아토피 피부염 환자군 및 정상군에서 유전형 빈도 또는 MAF를 나타낸다. In Table 1, MA represents minor allele, and SNP represents the genotype or MAF at the SNP position. MAF_X (minor allele frequency) indicates the frequency of the minor allele X. Intrinsic atopic dermatitis and normal group represent genotype frequency or MAF in patients with endogenous atopic dermatitis and normal group, respectively.
표 1에 있어서, "p-값"은 상기 SNP의 유전형의 분포가 정상인과 환자군에서 주어진 모형에서 유의하게 차이가 나는지에 대한 검증의 결과인 p-값 (p-value)을 의미한다. "OR (95% CI)"은 유전형을 기준으로 정상인군 중에서 해당 SNP를 가질 확률에 대한 환자군 중에서 해당 SNP를 가질 확률인 오즈비 (odds ratio)를 나타내는 것으로, 괄호 안은 해당 오즈비에 대한 상하 5% 에러 범위를 고려한 95% 신뢰구간의 하한 및 상한을 의미한다. 각 오즈비가 1 보다 큰 경우에는 해당 SNP의 소수 대립인자와 내인성 아토피 피부염의 연관성이 발병 위험을 증가시키는 효과를 나타내는 것이고 1보다 작은 경우에는 해당 소수 대립인자와 내인성 아토피 피부염의 연관성이 발병 위험을 낮추는 효과를 나타내는 것이다. In Table 1, "p-value" means a p-value which is the result of a test to determine whether the distribution of the genotype of the SNP is significant in a given model and in a patient group. "OR (95% CI)" represents the odds ratio, which is the probability of having the corresponding SNP among the patients in the normal group with respect to the probability of having the corresponding SNP based on the genotype. In the parentheses, % Means the lower and upper bounds of the 95% confidence interval taking into account the error range. If the odds ratio is greater than 1, the association of the minor allele of the SNP with endogenous atopic dermatitis increases the risk of developing an infection. If the odds ratio is less than 1, the association of the minor allele with endogenous atopic dermatitis Effect.
즉, 오즈비가 1 보다 큰 경우는 해당 SNP의 소수 대립인자가 내인성 아토피 피부염에 대한 위험인자로 작용하며 오즈비가 1 보다 작은 경우에는 해당 SNP의 소수 대립인자가 아토피 피부염에 대한 보호인자로 작용하는 반면, 주 대립인자가 내인성 아토피 피부염의 위험 인자로 작용하는 것이다. In other words, if the odds ratio is greater than 1, the minor allele of the SNP is a risk factor for endogenous atopic dermatitis. If the odds ratio is less than 1, the minor allele of the corresponding SNP acts as a protective factor against atopic dermatitis , Allergic factor is a risk factor for endogenous atopic dermatitis.
표 1에 있어서, 유의 모델은 각 SNP의 소수 대립인자가 내인성 아토피 피부염 발병과의 연관성을 나타내는 유전 모델로 우성 모델 (dominant)은 AA 유전형을 가지는 사람에 비해, Aa 또는 aa 유전형을 가지는 경우 내인성 아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소할 수 있는 경우를 나타내는 것이다. 즉 소수 대립인자가 하나 또는 두 개 존재할 때 소수 대립인자가 하나도 없는 경우보다 아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소할 수 있다.In Table 1, the significance model is a genetic model in which the minority alleles of SNPs are associated with the onset of endogenous atopic dermatitis. When dominant models have Aa or aa genotypes compared to those with AA genotype, endogenous atopy And the risk of developing dermatitis can be increased or decreased. That is, the risk of developing atopic dermatitis may be increased or decreased when one or two minority alleles are present, even when no minor allele is present.
열성 모델 (recessive)은 AA, Aa 유전형을 가지는 사람에 비해 aa 유전형을 가지는 경우 내인성 아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소할 수 있는 것으로 소수 대립인자를 두 개 다 가질 경우에만 연관성을 나타내는 것이다.Recessive is associated with an increase in the risk of endogenous atopic dermatitis when the aa genotype is compared to those with the AA and Aa genotypes, only when the two minor alleles are involved.
공우성 모델 (codominant)은 AA 유전형에 비해 Aa 유전형을 가질 때 또는 Aa 유전형에 비해 aa를 가질 때 OR 만큼 내인성 아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소하는 특성을 나타내는 것이다.The codominant is characterized by an increase or decrease in the risk of endogenous atopic dermatitis as compared with the AA genotype when the genotype of the genotype Aa is compared to that of the genotype Aa.
대립인자 모델 (Allele)은 A 대립인자에 비해 a 대립인자를 가질 때 OR 만큼 내인성 아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소하는 특성을 나타내는 것이다.Allele has an increased or decreased risk of developing endogenous atopic dermatitis by OR as compared to the A allele with an a allele.
하나 이상의 구체예에 따른, 상기 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 조성물, 마이크로어레이 및 그를 포함하는 키트는 내인성 아토피 피부염의 발병 위험을 신속하고, 효율적으로 진단하는데 사용될 수 있다. The polynucleotides, compositions comprising them, microarrays and kits comprising them, according to one or more embodiments, can be used to rapidly and efficiently diagnose the risk of developing endogenous atopic dermatitis.
또한, 다른 구체예에 따른, 내인성 아토피 피부염 발병의 변경된 위험도를 갖는 개체를 확인하는 방법에 따르면, 개체가 내인성 아토피 피부염 발병의 변경된 위험도를 갖는지 여부를 효율적으로 확인할 수 있다. In addition, according to another embodiment, a method of identifying individuals with altered risk of developing endogenous atopic dermatitis can effectively identify whether an individual has an altered risk of developing endogenous atopic dermatitis.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1: 환자군과 정상군에서 SNP 위치의 대립인자 빈도 분석을 통한 내인성 아토피 피부염과 연관된 SNP 마커의 선별Example 1 Screening of SNP Markers Associated with Endogenous Atopic Dermatitis by Analysis of Allelic Frequency of SNP Locations in Patient and Normal Subjects
본 실시예서는 내인성 아토피 피부염 환자와 정상인의 게놈에 있어서, SNP 위치의 대립인자 빈도를 분석하고, 그 결과로부터 내인성 아토피 피부염과 연관된 SNP 마커를 선발하였다. This example analyzed the allele frequency of SNP location in the genomes of endogenous atopic dermatitis patients and normal individuals and selected SNP markers associated with endogenous atopic dermatitis from the results.
(1) 실험 대상의 분류(1) Classification of experimental subjects
본 실시예에서는, 총 1,118명, 아토피 피부염 환자 212명 (여자: 45.3%, 평균나이: 13.56세)과 473명의 정상 대조군 (여자: 36.6%, 평균나이: 23.23세)을 모 집하였다. In this example, a total of 1,118 patients, 212 patients with atopic dermatitis (female: 45.3%, mean age: 13.56 years) and 473 normal controls (female: 36.6%, mean age: 23.23 years) were collected.
내인성 아토피 피부염 (atopic dermatitis, AD) 환자의 시료는 삼성 의료원 (서울, 한국)에서 진단 받은 비천식성 아토피 환자로부터 수집하였다. 내인성 아토피 피부염은 환자에게서 혈청 IgE 수준이 정상범위로 낮고 알러겐 특이적 IgE가 검출되지 않는 경우, 내인성 아토피 피부염으로 판정하였다.Samples of patients with endogenous atopic dermatitis (AD) were collected from non-asthmatic atopic patients diagnosed at Samsung Medical Center (Seoul, Korea). Endogenous atopic dermatitis was diagnosed as endogenous atopic dermatitis when serum IgE levels were low in normal range and allergen specific IgE was not detected.
정상 대조군은 아토피 피부염에 의한 피부 상해 병력이 없는 의대 학생들 및 지원자들로부터 모집하였다. Normal controls were recruited from medical students and volunteers who did not have a history of skin injury due to atopic dermatitis.
(2) 편광 검출을 통한 유전형 분석(2) Analysis of genotypes through polarization detection
게놈 DNA는 상업적으로 구입가능한 DNA 분리 키트 (Gentra Genomic DNA purification kit, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 5 ㎖의 혈액으로부터 추출하였다. 상기 DNA 중 SNP 부위의 유전형의 확인은 GenomeLabTM SNPstream® system (Ultra-high throughput; UHT system)을 사용하여 수행하였다. 상기 시스템은 멀티플렉스 PCR과 관련한 태그 어레이 단일 염기 확장 유전자 확인 기술 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 및 이에 따른 SNPstream 소프트웨어를 이용한 것이다.Genomic DNA was extracted from 5 ml of blood using a commercially available DNA separation kit (Gentra Genomic DNA purification kit, Minneapolis, MN, USA) according to the protocol provided by the manufacturer. Genotyping of SNP sites in the DNA was performed using the GenomeLab ™ SNPstream ® system (Ultra-high throughput; UHT system). The system utilizes tag sequence single nucleotide extension gene identification technology (Beckman Coulter, Fullerton, Calif., USA) in conjunction with multiplex PCR and SNPstream software accordingly.
상기 UHT 시스템을 이용한 SNP 부위의 유전형 (genotype) 분석을 요약하면, 다음과 같다. 먼저, 게놈 DNA로부터 표 1에 나타낸 9개 SNP 부위를 둘러싸는 서열을 PCR에 의하여 증폭하였다. PCR은 표 2에 나타낸 PCR 프라이머 쌍을 프라이머로 사용하고, 게놈 DNA를 주형으로 하고 Taq Gold 폴리머라제를 중합효소로 사용하여, 384 웰 프레이트의 각 웰에서 동시에 수행하였다. 열순환은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분을 34회 반복하였다. The genotype analysis of the SNP site using the UHT system is summarized as follows. First, the sequences surrounding the 9 SNP regions shown in Table 1 were amplified from the genomic DNA by PCR. PCR was carried out simultaneously in each well of a 384-well plate using PCR primer pairs shown in Table 2 as primers, genomic DNA as a template, and Taq Gold polymerase as a polymerase. The thermocycles were repeated 34 times at 95 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds and at 72 ° C for 1 minute.
표 2. Table 2.
(서열번호)Target sequence
(SEQ ID NO)
프라이머Forward PCR
primer
프라이머Reverse PCR
primer
프라이머SNP-IT
primer
다음으로, 상기 SNP에 대하여 바로 옆까지 어닐링하는 프라이머 (이하 "SNP-IT 프라이머"라고도 함)를 사용하여, 단일 염기 프라이머 연장 반응 (SNP-IT 반응이라고도 함)을 수행하였다. 각 SNP에 대한 SNP-IT 프라이머의 서열은 표 2에 나타낸 바와 같다. SNP-IT 프라이머는 프라이머의 5'말단에 "태그 (tag)" 서열을 포함한다. 이 태그 서열은 다중 (multiplex) SNP-IT 분석의 마지막 단계에서 고상에 고정된 상보적인 프로브 핵산 (이하 "태그 프로브 (tag probe)"라고 함)에 어닐링된다. SNP-IT 반응은 먼저 SNP-IT 프라이머에 대하여 비상보적인 가닥을 엑소뉴클레아제를 사용하여 절단하였다. 다음으로, 각각 달리 형광 표지된 4개의 종결 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, SNP-IT 프라이머 및 DNA 폴리머라제의 존재하에서 단일 염기 연장 반응을 384웰 플레이트의 각 웰에서 수행하였다. 열순환은 94℃에서 20초, 및 40℃에서 11초를 45회 반복하였다. Next, a single base primer extension reaction (also referred to as SNP-IT reaction) was performed using a primer (hereinafter also referred to as "SNP-IT primer") annealing immediately to the SNP. The sequences of the SNP-IT primers for each SNP are shown in Table 2. The SNP-IT primer contains a "tag" sequence at the 5 ' end of the primer. This tag sequence is annealed to a complementary probe nucleic acid (hereinafter referred to as a "tag probe") immobilized on a solid phase at the final stage of multiplex SNP-IT analysis. The SNP-IT reaction was first cleaved using exonuclease to the non-complementary strand for the SNP-IT primer. Next, a single base extension reaction was performed in each well of a 384 well plate in the presence of four differently-labeled differently-terminated dideoxynucleoside triphosphates, SNP-IT primer and DNA polymerase, each of which was different from each other. The heat cycle was repeated 45 times at 94 캜 for 20 seconds, and at 40 캜 for 11 seconds.
다음으로, 384웰을 포함하고 있는 SNPstream® Tag Array plate의 각 웰에 상기 단일 염기 연장 반응의 산물을 첨가하고 혼성화시켰다. 혼성화는 흡한 배양기에서 42℃에서 약 2 시간 동안 배양하여 이루어졌다. 상기 SNPstream®Tag Array plate의 각 웰의 표면에 16개의 구분된 영역이 있으며, 이 구분된 영역에는 태그 서열을 포함하는 태그 프로브가 고정되어 있다. 이 중 4개는 대조군 서열에 상보적인 태그 서열을 가지고 있으며, 12개는 12개의 단일 염기 연장 반응 산물에 상보적인 태그 서열을 가지고 있다. 각 SNP는 웰 위치에 의하여 구분된다. Next, the product of the single base extension reaction was added to each well of a SNPstream ® Tag Array plate containing 384 wells and hybridized. Hybridization was carried out by incubation at 42 ° C for about 2 hours in a sucking incubator. There are sixteen divided regions on the surface of each well of the SNPstream ® Tag Array plate, and a tag probe including a tag sequence is fixed in the divided region. Four of these have a tag sequence complementary to the control sequence and twelve have a complementary tag sequence to twelve single base extension products. Each SNP is identified by its well location.
다음으로, 혼성화 결과는 SNPstream® UHT Array ImagerTM를 이용하여 상기 상기 SNPstream? Tag Array plate의 각 웰의 표면에 16개의 구분된 영역에 여기광을 가하고, 그로부터 나오는 방사광을 측정함으로써 측정된 하였다. 측정된 광 강도는 SNPstream? UHT computer에 저장하고, 통계 분석하였다. Next, the hybridization results of the SNPstream using SNPstream UHT Array Imager ® TM? The excitation light was applied to sixteen divided regions on the surface of each well of the Tag Array plate, and measurement was performed by measuring the radiation emitted therefrom. The measured light intensity is SNPstream ? UHT computer and analyzed statistically.
(3) 통계 분석(3) Statistical analysis
본 발명자들은 카이제곱검정 (chi-square test)을 사용하여 개별 변이체들이 시료의 각 유전자 자리 (locus)에서 하디-바인베르그 평형 (Hardy-Weinberg equilibrium, HWE) 법칙을 따르는지 여부를 결정하였다. 개별 SNP들에 있어서 대립인자 효과 (부가적인 대립인자 효과) 및 유전형 효과는 성별 및 나이를 공변량으로 한 로지스틱 회귀 분석 모델을 사용하여 시험하였다. p값이 0.05미만인 것을 유의 성이 있는 것으로 판단하였다. 오즈비 (odds ratio) 또한 로지스틱 회귀 분석 방법을 통해 측정하였다. 통계 분석은 SAS 9.1 (SAS Institute Inc., NC, USA) 및 R 통계 언어 (http://www.r-project.org)를 사용하여 수행하였다.We used a chi-square test to determine whether individual variants follow the Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) rule at each locus of the sample. Allelic effects (additional allelic effects) and genotype effects in individual SNPs were tested using a logistic regression model with sex and age as covariates. The p value of less than 0.05 was judged to be significant. Odds ratios were also measured by logistic regression analysis. Statistical analysis was performed using SAS 9.1 (SAS Institute Inc., NC, USA) and the R statistical language (http://www.r-project.org).
(4) 분석 결과(4) Analysis results
분석 결과는 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 내인성 아토피 피부염과 연관된 9개의 SNP 마커를 확인하였다. 상기 9개의 SNP 마커는 내인성 아토피 피부염 환자와 정상인 사이에서 대립인자 또는 유전형의 출현 빈도가 유의하게 달랐다. 상기 9개의 SNP 마커는 서열번호 서열번호 4 및 6은 우성 (dominant) 유의 모델을 따르고, 서열번호 7은 열성 (recessive) 유의 모델을 따르며 서열번호 1,2,3 및 9는 공우성 (codominant) 유의 모델을 따르고, 서열번호 5 및 8은 대립인자 (allele)유의 모델을 따른다.The results of the analysis are shown in Table 1. As shown in Table 1, nine SNP markers associated with endogenous atopic dermatitis were identified. The nine SNP markers showed significantly different frequencies of alleles or genotypes between endogenous atopic dermatitis patients and normal individuals. SEQ ID NOS: 4 and 6 follow a dominant model, SEQ ID NO: 7 follows a recessive model, SEQ ID NOS: 1, 2, 3 and 9 are codominant, Followed by a model of significance, and SEQ ID NOS: 5 and 8 follow the model of allele oil.
표 1에 있어서, 유의 모델은 각 SNP의 소수 대립인자가 내인성 아토피 피부염 발병과의 연관성을 나타내는 유전 모델로 우성 모델 (dominant)은 AA 유전형을 가지는 사람에 비해, Aa 또는 aa 유전형을 가지는 경우 내인성 아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소할 수 있는 경우를 나타내는 것이다. 즉 소수 대립인자가 하나 또는 두 개 존재할 때 소수 대립인자가 하나도 없는 경우보다 아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소할 수 있다.In Table 1, the significance model is a genetic model in which the minority alleles of SNPs are associated with the onset of endogenous atopic dermatitis. When dominant models have Aa or aa genotypes compared to those with AA genotype, endogenous atopy And the risk of developing dermatitis can be increased or decreased. That is, the risk of developing atopic dermatitis may be increased or decreased when one or two minority alleles are present, even when no minor allele is present.
열성 모델 (recessive)은 AA, Aa 유전형을 가지는 사람에 비해 aa 유전형을 가지는 경우 내인성아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소할 수 있는 것으로 소수 대립인자를 두 개 다 가질 경우에만 연관성을 나타내는 것이다.Recessive is associated with an increase in the risk of endogenous atopic dermatitis when the aa genotype is compared to those with the AA and Aa genotypes, only when the two minor alleles are involved.
공우성 모델 (codominant)은 AA 유전형에 비해 Aa 유전형을 가질 때 또는 Aa 유전형에 비해 aa를 가질 때 OR 만큼 내인성 아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소하는 특성을 나타내는 것이다.The codominant is characterized by an increase or decrease in the risk of endogenous atopic dermatitis as compared with the AA genotype when the genotype of the genotype Aa is compared to that of the genotype Aa.
대립인자 모델(Allele)은 AA유전형에 비해 a 대립인자가 하나씩 증가할 때 마다 OR만큼의 내인성 아토피 피부염의 발병 위험이 증가 또는 감소하는 특성을 나타내는 것이다.Allele is characterized by an increase or decrease in the risk of developing endogenous atopic dermatitis by OR as the a allele increases by one compared to the AA genotype.
또한 상기 9개의 SNP 마커는 아토피 피부염의 또 다른 종류인 외인성 아토피 피부염에 대한 통계분석에서는 정상인에 비해 소수 대립인자의 발현빈도가 모든 유전 모델에서 유의한 차이가 없음이 확인되어 내인성 아토피 피부염에만 유의적인 마커로 작용함을 확인하였다.In addition, the 9 SNP markers showed that the frequencies of minor alleles were not significantly different in all genetic models compared to normal subjects in the statistical analysis of the exogenous atopic dermatitis, another kind of atopic dermatitis, As a marker.
<110> DNA LINK, INC <120> Marker for diagnosing intrinsic atopic dermatitis and use thereof <130> PN085228 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (101) <223> k represents g or t <400> 1 gtcaaactga acattgtcat aatacatgcc ggttgacacc aatcctctgc tcttccagcc 60 caggccttcc cttacgaggt ttaaaaacat gctgaagggt kgaagctacc aagggtcttc 120 tggtgttttt ctcccttcct ctgaagtgca taattattct gtttactgga agattttcaa 180 cacaaaggaa attaacttct c 201 <210> 2 <211> 201 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (101) <223> r represents a or g <400> 2 taaatttcaa gccttgtcct ttcgtaaata gtcattgcaa agacaaagaa ggtgtattta 60 acaaacttga attgtttcca ggtcacccat ttgctgtagc rgtgtttgag gattatgtgt 120 ggttctcaga ttgggctatg ccatcagtaa tgagagtaaa caagaggact ggcaaagata 180 gagtacgtct ccaaggcagc a 201 <210> 3 <211> 201 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (101) <223> r represents a or g <400> 3 tactaaaatt taagtacttg tgtgggagag 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