KR101646039B1

KR101646039B1 - zinc-silver-indium-sulfide-tryptone complex prepared by treating surface of zinc-silver-indium-sulfide nanoparticles coated with hydrophilic thiol compounds with tryptones

Info

Publication number: KR101646039B1
Application number: KR1020140136807A
Authority: KR
Inventors: 박정규; 정종진; 이승재; 김영규; 임순규
Original assignee: 한국화학연구원; 주식회사 루미맥
Priority date: 2014-10-10
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2016-08-09
Also published as: KR20160043204A

Abstract

본 발명은 친수성 티올(thiol) 화합물로 코팅된 아연-실버-인듐-설파이드 (zinc-silver-indium-sulfide, Zn-Ag-In-S, ZAIS) 나노입자에 트립톤 (tryptone)이 결합된 ZAIS-트립톤 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 친수성 티올(thiol) 화합물로 코팅된 아연-실버-인듐-설파이드 나노입자에 트립톤 (tryptone)이 결합된 ZAIS-트립톤 복합체는 수용액상 용해도와 안정성이 확보되어 생체물질 표지자로 유용하게 이용할 수 있다.The present invention relates to a zinc-silver-indium-sulfide (Zn-Ag-In-S) nanoparticle coated with a hydrophilic thiol compound and a tryptone- -Tripitone complex and a method of preparing the same, wherein the ZAIS-tryptone complex, in which tryptone is bound to zinc-silver-indium-sulfide nanoparticles coated with a hydrophilic thiol compound according to the present invention, The solubility in liquid phase and the stability are secured and can be usefully used as a biomaterial marker.

Description

Silver-indium-sulfide-tryptone complex prepared by surface-treating zinc-silver-indium-sulfide nanoparticles coated with a hydrophilic thiol compound with tryptone and a method for producing the zinc-silver-indium-sulfide-tryptone complex prepared by treating surface of zinc-silver-indium-sulfide nanoparticles coated with hydrophilic thiol compounds with tryptones}

본 발명은 친수성 티올(thiol) 화합물로 코팅된 아연-실버-인듐-설파이드 (zinc-silver-indium-sulfide, Zn-Ag-In-S, ZAIS) 나노입자에 트립톤 (tryptone)이 결합된 ZAIS-트립톤 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a zinc-silver-indium-sulfide (Zn-Ag-In-S) nanoparticle coated with a hydrophilic thiol compound and a tryptone- -Tripitone complex and a method for producing the same.

전통적으로 사용되어 왔던 유기형광 물질의 단점을 보완하기 위해 양자점 (Quantum dots, Q dots, QD)을 포함한 좋은 특성의 형광 나노입자의 개발이 이루어져 왔다. 형광나노입자는 크기가 나노입자 단위까지 커지지만 월등한 광물리화학적 (photophysics-chemistry) 특성 (광안정성, 광세기)을 가지고 있어 이의 개발과 응용에 많은 연구역량이 집중되고 있다.
In order to compensate for the disadvantages of organic fluorescent materials that have been used conventionally, the development of fluorescent nanoparticles having good properties including quantum dots (Q dots, QD) has been developed. Fluorescent nanoparticles have large photophysics-chemistry characteristics (light stability and light intensity), which are large in nanoparticle size, and their research and development are concentrated on their application and application.

이러한 연구의 일환으로써 본 발명자들은 아연-실버-인듐-설파이드(ZAIS)의 조성을 갖는 발광특성이 향상된 발광나노입자를 개발하였다 (등록특허 10-1360087). ZAIS 나노입자의 경우, 월등한 광세기 (intensity)와 광깜빡임 (photoblinking)의 부재 등 양자점보다 더 좋은 형광적 특성과 무독성으로 인해 새로운 생체물질 표지자로서 많은 가능성을 내포하고 있다. 그러나 ZAIS 나노입자를 생체물질 표지자로 이용하기 위해서는 소수성인 입자의 표면을 개질하여 친수성인 입자로의 전환이 필요하였다. 이러한 표면 처리는 MPA (mercaptopropionic acid) 등의 티올기 (thiol group)가 포함된 화합물 등을 이용하였으나, 이러한 화합물과 ZAIS 나노입자의 결합은 불안정한 문제가 있었다.
As a result of this research, the present inventors have developed luminescent nanoparticles having a composition of zinc-silver-indium-sulfide (ZAIS) with improved luminescence properties (Patent No. 10-1360087). ZAIS nanoparticles have many potential as new biomarkers because of their better fluorescence properties and non-toxicity than quantum dots, including superior light intensity and lack of photoblinking. However, in order to use ZAIS nanoparticles as biomarkers, it was necessary to modify the surface of hydrophobic particles to convert them to hydrophilic particles. Such a surface treatment uses a compound containing a thiol group such as MPA (mercaptopropionic acid), etc. However, the combination of such a compound and ZAIS nanoparticles has an unstable problem.

이에, 본 발명의 발명자들은 친수성 ZAIS 나노입자를 개발하기 위해 노력한 결과, ZAIS 나노입자에 초음파 조사를 통하여 코어-쉘 구조의 발광 나노입자를 제조하고, 상기 코어-쉘 구조의 발광 나노입자를 티올 화합물로 코팅한 후, 이를 트립톤과 결합시키면 ZAIS 나노입자의 수용액상 용해도와 안정성이 확보되고, ZAIS 나노입자를 생체물질 표지자로 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the inventors of the present invention have made efforts to develop hydrophilic ZAIS nanoparticles. As a result, the present inventors have found that when ultraviolet light is irradiated to ZAIS nanoparticles to prepare light emitting nanoparticles having a core-shell structure, , It is confirmed that solubility and stability of ZAIS nanoparticles in aqueous solution can be secured and ZAIS nanoparticles can be used as biomaterial markers when they are combined with tryptone to complete the present invention.

본 발명의 목적은, 친수성 티올(thiol) 화합물로 코팅된 아연-실버-인듐-설파이드 (zinc-silver-indium-sulfide, Zn-Ag-In-S, ZAIS) 나노입자에 트립톤 (tryptone)이 결합된 ZAIS-트립톤 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a zinc-silver-indium-sulfide (Zn-Ag-In-S) nanoparticle coated with a hydrophilic thiol compound, Coupled ZAIS-tryptone complex and a method for producing the same.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the above object,

친수성 티올(thiol) 화합물로 코팅된 아연-실버-인듐-설파이드 (zinc-silver-indium-sulfide, Zn-Ag-In-S, ZAIS) 나노입자에 트립톤 (tryptone)이 결합된 ZAIS-트립톤 복합체를 제공한다.
ZAIS-tryptone (tryptone) with zinc-silver-indium-sulfide (Zn-Ag-In-S) nanoparticles coated with a hydrophilic thiol compound Lt; / RTI >

또한,Also,

(a) ZAIS 나노입자에 친수성 티올 화합물을 코팅하는 단계; 및(a) coating a hydrophilic thiol compound on ZAIS nanoparticles; And

(b) 상기 친수성 티올 화합물로 코팅된 ZAIS 나노입자에 트립톤을 처리하여 ZAIS-트립톤 복합체를 만드는 단계를 포함하는 아연-실버-인듐-설파이드 (zinc-silver-indium-sulfide, Zn-Ag-In-S, ZAIS) 나노입자-트립톤 복합체 (ZAIS-트립톤 복합체)의 제조방법을 제공한다.
(b) treating the ZAIS nanoparticles coated with the hydrophilic thiol compound with a tryptone to form a ZAIS-tripotone complex; and zinc-silver-indium-sulfide (Zn-Ag- In-S, ZAIS) nanoparticle-tryptone complex (ZAIS-tryptone complex).

본 발명에 따른 친수성 티올(thiol) 화합물로 코팅된 아연-실버-인듐-설파이드 나노입자에 트립톤 (tryptone)이 결합된 ZAIS-트립톤 복합체는 수용액상 용해도와 안정성이 확보되어 생체물질 표지자로 유용하게 이용할 수 있다.
The ZAIS-tryptone complex in which tryptone is bound to zinc-silver-indium-sulfide nanoparticles coated with a hydrophilic thiol compound according to the present invention has solubility and stability in aqueous solution and is useful as a biomarker Can be used to make.

도 1A는 초음파 합성을 이용한 ZAIS 코어 나노입자 제작의 모식도이다.
도 1B는 초음파 합성을 이용한 ZAIS 코어-쉘 나노입자 제작의 모식도이다.
도 1C는 ZAIS 나노입자를 친수성 나노입자로 표면을 개질하는 방법의 모식도이다.
도 2A, 2B는 ZAIS 나노입자 및 ZAIS-트립톤 복합체의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 3A는 ZAIS 나노입자와 ZAIS-트립톤 복합체의 크기 차이를 나타낸 도이다.
도 3B, 3C는 ZAIS 트립톤 복합체의 발광 특성의 변화를 나타낸 도이다.
도 4A는 ZAIS-MPA 나노입자의 유방암 세포주 (MCF-7, 및 SK-BR-3)에 대한 세포독성 실험결과를 나타낸 도이다.
도 4B는 ZAIS-트립톤 복합체의 아교세포에 대한 세포독성 실험결과를 나타낸 도이다.
도 5A는 ZAIS-트립톤 복합체를 쥐의 뇌실에 주입하는 방법을 나타낸 도이다.
도 5B는 쥐의 뇌실에 주입된 ZAIS-트립톤 복합체의 형광 염색된 영역을 나타낸 도이다.
도 5C는 형광 염색된 쥐의 뇌실의 일부 영역을 확대하여 나타낸 도이다.
도 6은 ZAIS-MPA 나노입자 및 ZAIS-PEI 나노입자의 뇌실하 영역에서의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 7A는 ZAIS-트립톤 복합체로 표지된 C6 세포의 형광 이미지를 나타내는 도이다.
도 7B는 ZAIS-트립톤 복합체로 표지된 C6 세포를 뇌조직에 이식하는 방법을 나타내는 도이다.
도 7C는 뇌조직으로 이식된 ZAIS-트립톤 복합체로 표지된 C6 세포와 그 주변환경을 나타내는 도이다.
도 8A는 ZAIS-트립톤 복합체와 항체를 결합시키는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 8B는 ZAIS-트립톤 복합체에 인체항체를 부착시킨 후 전기영동의 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 ZAIS-트립톤-Herceptin 항체 복합체가 HCC1954 유방암 세포를 표적하는 형광이미지를 나타내는 도이다.1A is a schematic diagram of the production of ZAIS core nanoparticles using ultrasound synthesis.
1B is a schematic diagram of the production of ZAIS core-shell nanoparticles using ultrasound synthesis.
1C is a schematic diagram of a method of modifying the surface of ZAIS nanoparticles with hydrophilic nanoparticles.
2A and 2B are graphs showing electrophoresis results of ZAIS nanoparticles and ZAIS-tryptone complex.
3A shows size differences between ZAIS nanoparticles and ZAIS-tryptone complexes.
Figs. 3B and 3C are graphs showing changes in luminescence characteristics of the ZAIS trip tone complex. Fig.
FIG. 4A is a graph showing the results of cytotoxicity tests on breast cancer cell lines (MCF-7 and SK-BR-3) of ZAIS-MPA nanoparticles.
4B is a graph showing the cytotoxicity test results of the ZAIS-tryptone complex on glial cells.
Figure 5A shows a method of injecting a ZAIS-tryptone complex into the ventricle of a mouse.
Figure 5B shows a fluorescent stained region of a ZAIS-tryptone complex injected into the ventricle of a mouse.
Figure 5C is an enlarged view of a portion of the ventricle of a fluorescently stained mouse.
FIG. 6 shows cytotoxicity of ZAIS-MPA nanoparticles and ZAIS-PEI nanoparticles in the sub-ventricular region. FIG.
7A is a fluorescence image of a C6 cell labeled with a ZAIS-tryptone complex.
Figure 7B is a diagram illustrating a method of transplanting C6 cells labeled with the ZAIS-tryptone complex into brain tissue.
7C is a diagram showing C6 cells labeled with ZAIS-tryptone complex transplanted into brain tissue and its surrounding environment.
8A is a schematic diagram illustrating a method of binding an antibody to a ZAIS-tryptone complex.
8B is a graph showing the results of electrophoresis after attaching a human antibody to a ZAIS-tryptone complex.
9 shows a fluorescence image in which the ZAIS-tryptone-Herceptin antibody complex targets HCC1954 breast cancer cells.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 친수성 화합물로 코팅된 아연-실버-인듐-설파이드 (zinc-silver-indium-sulfide, Zn-Ag-In-S, ZAIS) 나노입자에 트립톤 (tryptone)이 결합된 ZAIS-트립톤 복합체를 제공한다.
The present invention relates to a zinc-silver-indium-sulfide (Zn-Ag-In-S) nanoparticle coated with a hydrophilic compound and a tryptone- Lt; / RTI >

친수성 화합물로 코팅하기 위해 히드록시기, 카르복실기, 아미노기, 멜캅토기 등을 포함하는 유기 리간드를 사용할 수 있고, 바람직하게는 친수성 티올 화합물, 멜캅토기 및 카르복실기를 포함하는 멜캅토산, 더 바람직하게는 C₂ 내지 C₈의 멜캅토산을 사용할 수 있다. 상기 리간드는 쉘의 표면에 화학적 또는 물리적으로 결합할 수 있다. 상기 친수성 티올 화합물은 MPA(mercaptopropionic acid), MAA(mercaptoacetic acid), 또는 MSA(mercaptosuccinic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
An organic ligand including a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, a mercapto group and the like may be used for coating with a hydrophilic compound, preferably a mercapto acid containing a hydrophilic thiol compound, a mercapto group and a carboxyl group, more preferably a C ₂ to C ₈ < / RTI > The ligand may be chemically or physically bound to the surface of the shell. The hydrophilic thiol compound may be any one selected from the group consisting of mercaptopropionic acid (MPA), mercaptoacetic acid (MAA), and mercaptosuccinic acid (MSA).

상기 ZAIS-트립톤 복합체의 여기 파장은 ZAIS 나노입자보다 여기 파장이 길어질 수 있으며, 바람직하게는 여기 파장이 가시광 영역에 속하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
The excitation wavelength of the ZAIS-tryptone complex may be longer than the excitation wavelength of the ZAIS nanoparticles. Preferably, the excitation wavelength may belong to the visible light region, but the present invention is not limited thereto.

상기 ZAIS 나노입자는 아연-실버-인듐-설파이드((Zn_xAg_yIn_z)S₂)의 조성을 갖는 발광나노입자와 아연-실버-인듐-설파이드 ((Zn_xAg_yIn_z)S₂) 발광 나노입자 코어를 둘러싸는 쉘을 포함하는 코어-쉘(core-shell) 구조이며,The ZAIS nanoparticles zinc-silver-indium-sulfide _{_{_{((Zn x Ag y In z}}} ) S 2) light emitting nanoparticles and zinc having the composition of the-silver-indium-sulfide _{_{_{((Zn x Ag y In z}}} ) S 2) A core-shell structure comprising a shell surrounding a light emitting nanoparticle core,

상기 쉘은 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 갈륨, 게르마늄, 이트륨, 지르코늄, 몰리브데늄, 루테늄, 은, 카드뮴, 인듐, 주석, 백금, 금, 납, 란타늄, 세륨, 프로세오디뮴, 네오디움, 사마륨, 유로피움, 가돌리움, 터븀, 디스프로슘, 이터븀 및 루테슘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속이온 및Wherein the shell is selected from the group consisting of magnesium, calcium, strontium, barium, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, zinc, gallium, germanium, yttrium, zirconium, molybdenum, ruthenium, silver, cadmium, At least one metal ion selected from the group consisting of platinum, gold, lead, lanthanum, cerium, prodeodium, neodymium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, ytterbium,

질소, 산소, 인, 황, 비소, 셀레늄 및 텔루륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 음이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 아연설파이드 코어-쉘 ((Zn_xAg_yIn_z)S₂-ZnS) 발광나노입자 (상기에서, 0≤x≤1, 0≤y≤1, 0.1≤z≤1, x+y+z=1) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다..
((Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ -ZnS) characterized by containing at least one anion selected from the group consisting of nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, arsenic, selenium and tellurium. The light emitting nanoparticles (in the above, 0? X? 1, 0? Y? 1, 0.1? Z? 1, x + y + z = 1).

상기 아연-실버-인듐-설파이드((Zn_xAg_yIn_z)S₂)는 0≤x≤1, 0≤y≤1, 0.1≤z≤1, x+y+z=1 의 조성을 갖는 발광특성이 향상된 발광 나노입자이며, 상기 조성범위를 가짐으로써 발광강도 및 발광파장이 다양한 발광 특성을 가진다. 이에, 상기 조성 범위 내에서 적절히 선택하여 원하는 발광특성을 나타내는 발광 나노입자를 유용할 수 있다.
The zinc-silver-indium-sulfide ((Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ ) has a composition of 0 ≦ x ≦ 1, 0 ≦ y ≦ 1, 0.1 ≦ z ≦ 1, and x + y + Light emitting nanoparticles having improved characteristics, and having the above-mentioned composition range, they have various luminescence characteristics with various emission intensities and emission wavelengths. Thus, the light-emitting nanoparticles exhibiting the desired luminescence characteristics can be appropriately selected within the above composition range.

또한, 상기 아연-실버-인듐-설파이드((Zn_xAg_yIn_z)S₂)의 x,y,z 조성비는 The x, y and z composition ratios of the zinc-silver-indium-sulfide ((Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ )

0≤x≤0.4, 0.1≤y≤0.9, 0.1≤z≤0.9, x+y+z=1; 0? X? 0.4, 0.1? Y? 0.9, 0.1? Z? 0.9, x + y + z = 1;

x= 0.5, 0.1≤y≤0.3, 0.2≤z≤0.4, x+y+z=1; 및 x = 0.5, 0.1? y? 0.3, 0.2? z? 0.4, x + y + z = 1; And

x = 0.6, y = 0.1, z = 0.3;x = 0.6, y = 0.1, z = 0.3;

으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 조성일 수 있다.And a composition of one kind selected from the group consisting of

상기의 조성을 가지는 발광나노입자는 0≤x≤1, 0≤y≤1, 0.1≤z≤1, x+y+z=1 의 조성을 가지는 발광 나노입자보다 상대적으로 더욱 우수한 발광특성을 가진다. 구체적으로, 상기 발광 나노입자는 500 nm 내지 750 nm의 발광파장에서 발광강도가 최대 700 배에 이르는 발광 특성을 가진다. 이에, 상기 조성 범위 내에서 적절히 선택하여 원하는 발광특성을 나타내는 발광 나노입자를 유용할 수 있다.
The luminescent nanoparticles having the above composition have relatively better luminescence characteristics than the luminescent nanoparticles having a composition of 0? X? 1, 0? Y? 1, 0.1? Z? 1, and x + y + z = Specifically, the luminescent nanoparticles have a luminescence characteristic in which the luminescence intensity reaches a maximum of 700 times at an luminescence wavelength of 500 nm to 750 nm. Thus, the light-emitting nanoparticles exhibiting the desired luminescence characteristics can be appropriately selected within the above composition range.

또한, 또한, 상기 아연-실버-인듐-설파이드((Zn_xAg_yIn_z)S₂)의 x,y,z 조성비는In addition, the x, y and z composition ratios of the zinc-silver-indium-sulfide ((Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ )

0.15≤x≤0.25, 0.35≤y≤0.45, 0.35≤z≤0.45, x+y+z=1 일 수 있다.0.15? X? 0.25, 0.35? Y? 0.45, 0.35? Z? 0.45, and x + y + z = 1.

상기 조성비를 가지는 발광 나노입자는 생체 광학 이미징 등의 바이오 영역에 적용될 수 있는데, 이를 위하여는 세포에 직접적인 데미지를 주지 않는 장파장 광원에서 효과적인 발광을 가져야한다. 그러나 기존의 발광입자들은 고에너지를 가지는 단파장의 여기파장에서 발광하여 세포에 직접적으로 데미지를 주는 문제점이 있었다. 본 발명이 제공하는 아연-실버-인듐-설파이드((Zn_xAg_yIn_z)S₂)(0.15≤x≤0.25, 0.35≤y≤0.45, 0.35≤z≤0.45, x+y+z=1)의 조성을 갖는 발광특성이 향상된 발광나노입자-트립톤 복합체는 400 nm이상의 장파장 영역의 여기파장일수록 발광효율이 증가하는 특징을 가지므로 바이오 영역에 적용되어 사용될 수 있다
The luminescent nanoparticles having the above-described composition ratio can be applied to a biomolecule such as a bio-optical imaging. To this end, the luminescent nanoparticle should have effective luminescence in a long-wavelength light source that does not directly damage the cell. However, the conventional luminescent particles emit light at an excitation wavelength of a short wavelength having a high energy, and thus have a problem of directly damaging the cells. (Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ ) (0.15? X? 0.25, 0.35? Y? 0.45, 0.35? _Z ? 0.45, x + y + z = 1 ) Of the light emitting nanoparticle-tryptone complex having improved luminescence characteristics can be applied to the biomolecule because the luminescence efficiency is increased as the excitation wavelength of the long wavelength region of 400 nm or more is increased

또한, 코어 발광 나노입자의 대부분이 상대적으로 낮은 양자효율을 가지기 때문에 다양한 분야에 적용하기 위하여 양자 효율을 증대시켜야 하는데, 이는 안정한 유기 혹은 무기 물질로 코어 발광 나노입자의 표면에 보호막을 씌우는 방법으로 수행할 수 있다. 하지만 종래의 방법들은 코어와 쉘의 합성 과정이 복잡하고 긴 반응 시간을 가지며, 그와 동시에 코어-쉘 구조간의 격자간 불일치, 쉘의 두께에 따른 계면 변형(interface strain)등에 의하여 발광 효율이 감소하는 단점이 있었다.
In addition, since most of the core light emitting nanoparticles have a relatively low quantum efficiency, quantum efficiency must be increased to be applied to various fields. This is accomplished by covering the surface of core light emitting nanoparticles with a stable organic or inorganic material can do. However, in the conventional methods, the synthesis process of the core and the shell is complicated and has a long reaction time. At the same time, the luminescence efficiency is decreased due to the inter-lattice mismatch between the core-shell structure and the interface strain due to the thickness of the shell There were disadvantages.

이에 본 발명은 상기 조성 범위 내에서 적절히 선택하여 원하는 발광특성을 나타내는 아연-실버-인듐-설파이드((Zn_xAg_yIn_z)S₂)(0≤x≤1, 0≤y≤1, 0.1≤z≤0, x+y+z=1)의 조성의 나노입자를 코어로 하고, 나노입자의 양자 효율을 증대시키기 위해 상기 코어의 표면에 단순한 초음파 공정을 이용하여 보호막으로 쉘을 제조함으로써 발광효율이 향상된 코어-쉘 입자를 제공하고, 상기 코어-쉘 입자와 트립톤을 결합한 ZAIS-트립톤 결합체를 제공한다..
In the present invention, zinc-silver-indium-sulfide ((Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ ) (0? _X ? 1, 0? _Y? X < / = z < = 0, x + y + z = 1) as a core, and by using a simple ultrasonic process on the surface of the core to increase the quantum efficiency of the nanoparticles, Provides an improved core-shell particle, and provides a ZAIS-tripotone conjugate combining the core-shell particle with a tryptone.

상기 쉘은 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 갈륨, 게르마늄, 이트륨, 지르코늄, 몰리브데늄, 루테늄, 은, 카드뮴, 인듐, 주석, 백금, 금, 납, 란타늄, 세륨, 프로세오디뮴, 네오디움, 사마륨, 유로피움, 가돌리움, 터븀, 디스프로슘, 이터븀 및 루테슘 등의 금속이온과, Wherein the shell is selected from the group consisting of magnesium, calcium, strontium, barium, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, zinc, gallium, germanium, yttrium, zirconium, molybdenum, ruthenium, silver, cadmium, Metal ions such as platinum, gold, lead, lanthanum, cerium, prodeodmium, neodymium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, ytterbium,

질소, 산소, 인, 황, 비소, 셀레늄, 텔루륨 등의 음이온을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 코어의 쉘로 적용되어 나노입자의 발광 효율을 향상시킬 수 있는 금속 이온 및 음이온이 적절히 조합될 수 있다. The metal ions and the anions which can be applied to the shell of the core to improve the luminous efficiency of the nanoparticles are suitably selected from the group consisting of anions such as nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, arsenic, selenium, tellurium and the like. Can be combined.

또한, 상기 쉘은 아연설파이드(ZnS)인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the shell is preferably zinc sulfide (ZnS), but is not limited thereto.

아연설파이드는 Ⅱ-Ⅳ족 화합물 반도체로써 상온에서 3.7 eV의 넓은 밴드 갭을 가지고 있고, 상온에서의 40 meV 정도의 큰 엑시톤 결합 에너지를 가지고 있어서 상온에서 발광이 가능한 물질로 넓은 투과 밴드와 높은 굴절률을 갖기 때문에 훌륭한 광학 투과 물질이다.
Zinc sulphide is a II-IV compound semiconducting material. It has a wide bandgap of 3.7 eV at room temperature and has a large exciton binding energy of about 40 meV at room temperature. It can emit light at room temperature and has a wide transmission band and high refractive index It is a good optically transparent material because it has.

상기 ZAIS-트립톤 복합체는 실험동물의 뇌실 (Lateral ventricle)에 직접주입 하거나, 배양된 세포 안에 넣어준 후 그 세포 (ZAIS-트립톤-(항체) 복합체 포함)를 뇌 속으로 주입함으로써, 뇌세포의 형광 염색 및 이미징, 뇌세포 이동의 추적용, 또는 줄기세포, 혈액세포, 암세포의 형광 염색, 이미징, 및 이동 추적하는데 이용될 수 있다.
The ZAIS-tryptone complex can be injected directly into the lateral ventricle of an experimental animal or put into a cultured cell and then injected into the brain of the cell (including ZAIS-tryptone- (antibody) complex) Imaging, and tracing of brain cell migration, or for fluorescent staining, imaging, and tracing of stem cells, blood cells, cancer cells.

또한, 상기 ZAIS-트립톤 복합체에는 항체가 더 결합될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, ZAIS-트립톤 복합체에 링커를 이용하여 항체를 결합시키고, 이렇게 결합된 항체가 그 물리적 특성을 잃지 않음을 확인함으로써, ZAIS-트립톤 및 항체 복합체는 뇌세포, 줄기세포, 혈액세포, 암세포 등 다양한 세포의 표적 지향 이미징에 이용 가능하다.
In addition, the ZAIS-tryptone complex may be further conjugated with an antibody. In one embodiment of the present invention, the ZAIS-tryptone complex is conjugated to the antibody using a linker and by confirming that the antibody thus bound does not lose its physical properties, And can be used for target-oriented imaging of various cells such as cells, blood cells, and cancer cells.

상기 항체는 뇌세포, 줄기세포, 혈액세포 또는 암세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 세포의 막 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 표적 세포가 발현하는 하나 또는 다수의 항원에 특이적인 모든 항체일 수 있다.
The antibody may be an antibody that specifically binds to a membrane protein of a cell selected from the group consisting of a brain cell, a stem cell, a blood cell, or a cancer cell. However, the antibody may be an antibody that specifically binds to one or more It may be any antibody specific for the antigen.

또한, 본 발명은In addition,

(B) 상기 친수성 티올 화합물로 코팅된 ZAIS 나노입자에 트립톤을 처리하여 ZAIS-트립톤 복합체를 만드는 단계를 포함하는 아연-실버-인듐-설파이드 (zinc-silver-indium-sulfide, Zn-Ag-In-S, ZAIS) 나노입자-트립톤 복합체 (ZAIS-트립톤 복합체)의 제조방법을 제공한다.
(B) treating the ZAIS nanoparticles coated with the hydrophilic thiol compound with a tryptone to form a ZAIS-tryptone complex; and zinc-silver-indium-sulfide (Zn-Ag- In-S, ZAIS) nanoparticle-tryptone complex (ZAIS-tryptone complex).

상기 단계 (A)의 ZAIS 나노입자는 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.The ZAIS nanoparticles of step (A) may be prepared by a process comprising the following steps.

아연 전구체, 실버 전구체, 인듐 전구체 및 가황제를 용매와 혼합하여 전구체 용액을 만든 후, 초음파를 조사하여 아연-실버-인듐-설파이드 조성의 발광 나노입자를 제조하는 단계(단계 1); 및Preparing a precursor solution by mixing a zinc precursor, a silver precursor, an indium precursor and a vulcanizing agent with a solvent, and then irradiating ultrasound to prepare a light emitting nanoparticle having a zinc-silver-indium-sulfide composition (Step 1); And

초음파 조사를 통해 상기 단계 1에서 제조된 발광 나노입자의 표면을 둘러싸는 쉘을 형성하는 단계(단계 2).
And forming a shell surrounding the surface of the light emitting nanoparticles prepared in the step 1 through ultrasound irradiation (step 2).

상기 단계 1은 아연 전구체, 실버 전구체, 인듐 전구체 및 가황제를 용매와 혼합하여 전구체 용액을 만든 후, 초음파를 조사하여 아연-실버-인듐-설파이드 조성의 발광 나노입자를 제조하는 단계이다. Step 1 is a step of preparing a precursor solution by mixing a zinc precursor, a silver precursor, an indium precursor and a vulcanizing agent with a solvent, and then irradiating ultrasound to prepare a light emitting nanoparticle having a zinc-silver-indium-sulfide composition.

본 발명에 따라 아연-실버-인듐-설파이드 조성의 발광 나노입자를 제작하는 경우, 초음파 조사라는 단순한 공정으로 효과적인 발광 효율을 가지는 코어를 제작할 수 있어, 보다 경제적으로 바이오영역 및 화장품에 응용이 가능한 장점이 있다.
According to the present invention, it is possible to produce a core having an effective luminous efficiency by a simple process such as ultrasonic irradiation in the case of manufacturing a light emitting nanoparticle having a zinc-silver-indium-sulfide composition, .

구체적으로 단계 1은 아연-실버-인듐의 조성에 대한 라이브러리를 구성하는 단계(단계 a), 단계 a에서 구성한 라이브러리에 따라 아연 전구체, 실버 전구체, 인듐 전구체 및 가황제를 용매와 혼합하여 전구체 용액을 제조하는 단계(단계 b), 상기 전구체 용액으로 초음파를 조사하는 단계(단계 c)를 통해 발광 나노입자를 제조할 수 있다.
Specifically, step 1 comprises the step of constructing a library for the composition of zinc-silver-indium (step a), mixing the zinc precursor, silver precursor, indium precursor and vulcanizing agent with a solvent according to the library constructed in step a, (Step b), and irradiating ultrasound with the precursor solution (step c).

먼저, 단계 a에서는 아연-실버-인듐의 조성에 대한 라이브러리를 구성한다. First, step a constitutes a library of zinc-silver-indium compositions.

아연-실버-인듐의 조성에 대한 라이브러리는 구성은, 아연 및 실버를 0에서 1까지 0.1 간격으로 증가시키고, 인듐을 0.1에서 1까지 0.1 간격으로 증가시키며 삼성분계의 라이브러리를 구성한 후 각 조성에 따라 숫자를 붙임으로써 수행된다. The library for the composition of zinc-silver-indium is composed of zinc and silver in 0.1 increments from 0 to 1, increasing indium from 0.1 to 1 in increments of 0.1 and constituting a ternary library, This is done by appending a number.

이처럼 라이브러리를 구성하는 경우, 원하는 발광파장 및 발광강도를 가지는 발광 나노입자를 제조할 수 있는 장점이 있다. 구체적으로, 발광강도가 상대적으로 더욱 우수하거나, 장파장 영역의 여기 파장일수록 발광효율이 증가하여 단파장광원이 가지는 에너지로 인하여 세포에 직접적인 데미지를 입히는 현상을 방지할 수 있는 발광 나노입자를 선택하여 원하는 조성으로 최적화된 발광 나노입자를 빠르게 제조할 수 있다.
When such a library is constructed, there is an advantage that luminescent nanoparticles having a desired emission wavelength and emission intensity can be produced. Specifically, the luminescence intensity is relatively more excellent or the luminescence efficiency is increased as the excitation wavelength in the long wavelength region is increased, so that the luminescent nanoparticles capable of preventing the damage to the cell due to the energy of the short wavelength light source are selected, Can be rapidly produced.

단계 b에서는 단계 a에서 구성한 라이브러리에 따라 아연 전구체, 실버 전구체, 인듐 전구체 및 가황제를 용매와 혼합하여 전구체 용액을 제조한다. In step b, zinc precursor, silver precursor, indium precursor and vulcanizing agent are mixed with a solvent according to the library constituted in step a to prepare a precursor solution.

상기 단계 b의 전구체의 금속이온은 아연, 실버, 인듐이고 음이온은 황으로 할 수 있다. 이때 금속염은 질산염, 탄산염, 염화염, 인산염, 붕산염, 산화염, 술폰산염, 황산염, 스테아린산염, 미리스틴산염, 초산염 및 운데실레닉염 등으로 할 수 있다. The metal ion of the precursor of step b may be zinc, silver or indium and the anion may be sulfur. In this case, the metal salt may be nitrate, carbonate, chloride, phosphate, borate, oxide, sulfonate, sulfate, stearate, myristate, acetate and undecylenic salt.

상기 아연 전구체로는 아연 다이에틸다이타이오카바메이트, 아연 다이메틸다이타이오카바메이트, 아연 아세테이트, 아연 운데실레네이트, 아연 스테아레이트, 아연 아세틸아세토네이트, 아연 나이트레이트, 아연 클로라이드 등을 사용할 수 있다. As the zinc precursor, there can be used zinc diethityldithiocarbamate, zinc dimethyldithiocarbamate, zinc acetate, zinc undecylenate, zinc stearate, zinc acetylacetonate, zinc nitrate, zinc chloride and the like have.

상기 가황제로는 아연 다이에틸다이타이오카바메이트, 아연 다이메틸다이타이오카바메이트, 황, 다이에틸다이타이오카바메이트, 다이메틸다이타이오카바메이트 등을 사용할 수 있다.
Examples of the vulcanizing agent include zinc diethytyldithiocarbamate, zinc dimethyldithiocarbamate, sulfur, diethyldithiothiocarbamate, dimethyldithiocarbamate, and the like.

상기 단계 b의 용매는 에테르계, 탄화수소계, 알콜계, 그리고 아민계로 할 수 있다. The solvent in step (b) may be ether, hydrocarbon, alcohol, or amine.

에테르계 용매는 옥틸에테르, 부틸에테르, 헥실에테르, 벤질에테르, 페닐에테르, 데실에테르 등이 될 수 있다. 상기 용액들은 고비점 용매로써 초음파조사시 짧은 시간에 반응 온도를 높게 올리고, 또한 고온상태를 유지하게 해주는 장점이 있다. The ether solvent may be an octyl ether, a butyl ether, a hexyl ether, a benzyl ether, a phenyl ether, a decyl ether or the like. These solutions have the advantage of raising the reaction temperature to a high level in a short time during the ultrasonic irradiation with the high boiling point solvent and maintaining the high temperature state.

탄화수소계 용매는 헥산, 톨루엔, 크실렌, 클로로벤조익산, 벤젠, 헥사데신, 테트라데신, 옥타데신으로 할 수 있다. 상기 용액들은 고비점 용매로써 초음파조사시 짧은 시간에 반응 온도를 높게 올리고, 또한 고온상태를 유지하게 해주는 장점이 있다. The hydrocarbon-based solvent may be hexane, toluene, xylene, chlorobenzoic acid, benzene, hexadecyne, tetradecyne, or octadecyne. These solutions have the advantage of raising the reaction temperature to a high level in a short time during the ultrasonic irradiation with the high boiling point solvent and maintaining the high temperature state.

알콜계 용매는 옥틸알콜, 데카놀, 헥사데카놀, 에틸렌글리콜, 1,2-옥테인디올, 1,2-도데케인디올, 1,2-헥사데케인디올으로 할 수 있다. 상기 용액들은 긴 알킬체인의 말단에 하이드록시기를 가지고 있어 형성된 나노입자를 안정화시키는 장점이 있다. The alcohol-based solvent may be octyl alcohol, decanol, hexadecanol, ethylene glycol, 1,2-octane diol, 1,2-dodecane diol and 1,2-hexadecane diol. These solutions have the advantage of stabilizing the formed nanoparticles because they have hydroxy groups at the ends of the long alkyl chains.

아민계 용액은 도데실아민, 헥사데실아민, 옥틸아민, 트리옥틸아민, 디메틸옥틸아민, 디메틸도데실아민으로 할 수 있다. 상기 용액들은 긴 알킬체인의 말단에 아민기를 가지고 있어 형성된 나노입자를 안정화시키는 장점이 있다. The amine-based solution may be a dodecylamine, hexadecylamine, octylamine, trioctylamine, dimethyloctylamine, or dimethyldodecylamine. These solutions have the advantage of stabilizing the formed nanoparticles because they have an amine group at the end of the long alkyl chain.

그러나 상기 용매가 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 금속염을 용해할 수 있는 용매를 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
However, the solvent is not limited thereto, and a solvent capable of dissolving the metal salt may be appropriately selected and used.

상기 단계 b의 전구체 용액의 제조는 하기와 같이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 아연전구체로 아연 나이트레이트 하이드레이트를 사용하고, 실버 전구체로 실버 나이트레이드를 사용하고, 인듐 전구체로 인듐 나이트레이드 하이드레이트를 사용하며, 가황제로 다이메틸다이싸이오카바메이트 (dimethyldithiocarbamate)를 사용할 수 있고, 용매로는 도데실아민 등을 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적에 부합하는 이상 반드시 상기 내용에 한정되는 것은 아니다.
The preparation of the precursor solution of step b above can be carried out as follows. For example, it is possible to use zinc nitrate hydrate as the zinc precursor, silver niobate as the silver precursor, indium niobate hydrate as the indium precursor, and dimethyldithiocarbamate as the vulcanizing agent And dodecylamine or the like can be used as the solvent. However, it is not necessarily limited to the above contents as long as it meets the object of the present invention.

단계 c에서는 상기 전구체 용액으로 초음파를 조사한다. In step c, ultrasonic waves are irradiated with the precursor solution.

초음파 조사를 하면 용액 내부에서 초음파로 인하여 미세 공동(cavitation)이 생성되었다 파괴되는 과정에서 에너지가 전달되어 반응상 촉매 효과가 있어서 발광나노입자가 합성된다.When ultrasonic irradiation is performed, cavitation is generated due to ultrasonic waves in the solution. Energy is transferred in the process of destruction and the reaction is catalytic effect, so that light emitting nanoparticles are synthesized.

상기 단계 c의 초음파조사는 2 내지 200 kHz의 범위에서 1분 내지 12시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. The ultrasonic irradiation in step c is preferably performed in the range of 2 to 200 kHz for 1 minute to 12 hours.

주파수가 2 kHz 미만인 경우 초음파를 통하여 충분한 에너지가 공급되지 않아 발광 나노입자의 생성이 저조하다는 문제점이 있고, 200 kHz 이상인 경우 나노입자를 생성하기 위해 공급되는 에너지가 과도하여 나노입자 생성에 적절하도록 조절하기 어렵다는 문제점이 있다. When the frequency is less than 2 kHz, sufficient energy is not supplied through the ultrasonic wave to generate low emission nanoparticles. When the frequency is higher than 200 kHz, the energy supplied to generate nanoparticles is excessive, There is a problem that it is difficult.

또한, 초음파 조사가 1분 미만으로 수행되는 경우 초음파조사가 충분히 이루어지지 않아 발광 나노입자가 합성이 저조하다는 문제점이 있고, 12시간을 초과하는 경우 과도한 에너지의 공급으로 나노입자가 아닌 거대(bulk) 입자가 형성된다는 문제점이 있다.
When ultrasonic irradiation is performed for less than 1 minute, there is a problem in that synthesis of light-emitting nanoparticles is poor due to insufficient ultrasonic irradiation, and when the time exceeds 12 hours, bulk energy, not nanoparticles, There is a problem that particles are formed.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 초음파 조사를 통해 상기 단계 1에서 제조된 발광 나노입자의 표면을 둘러싸는 쉘을 형성하는 단계이다. In the manufacturing method of the present invention, the step 2 is a step of forming a shell surrounding the surface of the light emitting nanoparticles produced in the step 1 through ultrasonic irradiation.

본 발명에 따라 쉘을 제작하는 경우, 초음파 조사라는 단순한 공정을 통해 코어로만 이루어져 있는 발광 나노입자보다 높은 발광 효율을 가지는 코어-쉘 구조를 제작할 수 있어, 보다 경제적으로 높은 광효율을 낼 수 있는 장점이 있다.
In the case of manufacturing a shell according to the present invention, it is possible to produce a core-shell structure having a higher luminous efficiency than that of a light-emitting nano particle composed only of a core through a simple process of ultrasonic irradiation, have.

구체적으로 단계 2는 쉘의 원료 물질이 되는 전구체 용액으로, 상기 단계 1에서 제조된 발광 나노입자를 첨가하는 단계(단계 a), 상기 발광 나노입자가 첨가된 전구체 용액으로 초음파를 조사하는 단계(단계 b), 초음파가 조사된 코어-쉘 구조 발광 나노입자를 세척 및 분산하는 단계(단계 c)를 통해 코어-쉘 구조 발광 나노입자를 제조할 수 있다.
Specifically, step 2 is a precursor solution to be a raw material of the shell, adding the light-emitting nanoparticles prepared in step 1 (step a), irradiating ultrasound with the precursor solution to which the light-emitting nanoparticles are added b), and washing and dispersing the core-shell structured light-emitting nanoparticles irradiated with ultrasound (step c) to prepare core-shell structured light-emitting nanoparticles.

먼저, 단계 a에서는 쉘의 원료물질을 용매와 혼합하여 만든 전구체 용액으로, 상기 단계 1에서 제조된 발광 나노입자를 첨가한다. First, in step a, the light emitting nanoparticles prepared in step 1 are added as a precursor solution prepared by mixing a shell raw material with a solvent.

상기 단계 a의 쉘은 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 갈륨, 게르마늄, 이트륨, 지르코늄, 몰리브데늄, 루테늄, 은, 카드뮴, 인듐, 주석, 백금, 금, 납, 란타늄, 세륨, 프로세오디뮴, 네오디움, 사마륨, 유로피움, 가돌리움, 터븀, 디스프로슘, 이터븀 및 루테슘 등의 금속이온과, Wherein the shell of step a is selected from the group consisting of magnesium, calcium, strontium, barium, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, zinc, gallium, germanium, yttrium, zirconium, molybdenum, ruthenium, Metal ions such as indium, tin, platinum, gold, lead, lanthanum, cerium, prodeodmium, neodymium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, ytterbium,

또한, 상기 단계 a의 쉘은 아연설파이드(ZnS)인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
In addition, the shell of step a is preferably zinc sulfide (ZnS), but is not limited thereto.

이때 금속염은 질산염, 탄산염, 염화염, 인산염, 붕산염, 산화염, 술폰산염, 황산염, 스테아린산염, 미리스틴산염, 초산염 및 운데실레닉염 등으로 할 수 있다. In this case, the metal salt may be nitrate, carbonate, chloride, phosphate, borate, oxide, sulfonate, sulfate, stearate, myristate, acetate and undecylenic salt.

상기 단계 a의 용매는 에테르계, 탄화수소계, 알콜계, 그리고 아민계로 할 수 있다. The solvent in step (a) may be ether, hydrocarbon, alcohol, or amine.

에테르계 용매는 옥틸에테르, 부틸에테르, 헥실에테르, 벤질에테르, 페닐에테르, 데실에테르 등으로 할 수 있고, 탄화수소계 용매는 헥산, 톨루엔, 크실렌, 클로로벤조익산, 벤젠, 헥사데신, 테트라데신, 옥타데신 등으로 할 수 있으며, 알콜계 용매는 옥틸알콜, 데카놀, 헥사데카놀, 에틸렌글리콜, 1,2-옥테인디올, 1,2-도데케인디올, 1,2-헥사데케인디올으로 할 수 있다. 또한, 아민계 용액은 도데실아민, 헥사데실아민, 옥틸아민, 트리옥틸아민, 디메틸옥틸아민, 디메틸도데실아민으로 할 수 있다. The ether solvent may be selected from the group consisting of octyl ether, butyl ether, hexyl ether, benzyl ether, phenyl ether, decyl ether and the like. The hydrocarbon solvents include hexane, toluene, xylene, chlorobenzoic acid, benzene, hexadecyne, Decene, etc., and the alcoholic solvent may be octyl alcohol, decanol, hexadecanol, ethylene glycol, 1,2-octane diol, 1,2-dodecane diol and 1,2-hexadecane diol. . In addition, the amine-based solution may be a dodecylamine, hexadecylamine, octylamine, trioctylamine, dimethyloctylamine, or dimethyldodecylamine.

상기 단계 a의 전구체 용액의 제조는 하기와 같이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 아연전구체로 아연 운데실레네이트를 사용하고, 가황제로 황을 사용할 수 있고, 용매로는 도데실아민 등을 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적에 부합하는 이상 반드시 상기 내용에 한정되는 것은 아니다.
The preparation of the precursor solution of step a can be carried out as follows. For example, zinc undecylenate may be used as the zinc precursor, sulfur may be used as the vulcanizing agent, and dodecylamine or the like may be used as the solvent. However, since it is in conformity with the object of the present invention, no.

단계 b에서는 상기 발광 나노입자가 첨가된 전구체 용액으로 초음파를 조사한다.In step b, ultrasonic waves are irradiated to the precursor solution to which the light emitting nanoparticles are added.

상기 단계 b의 초음파조사는 2 내지 200 kHz의 범위에서 1분 내지 12시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. The ultrasonic irradiation in step b is preferably performed in the range of 2 to 200 kHz for 1 minute to 12 hours.

주파수가 2 kHz 미만인 경우 초음파를 통하여 충분한 에너지가 공급되지 않아 쉘 생성이 저조하다는 문제점이 있고, 200 kHz 이상인 경우 쉘을 생성하기 위해 공급되는 에너지가 과도하여 쉘의 생성에 적절하도록 조절하기 어렵다는 문제점이 있다. When the frequency is less than 2 kHz, sufficient energy is not supplied through the ultrasonic wave, so that the generation of the shell is poor. In the case of 200 kHz or more, the energy supplied to generate the shell is excessively excessive, have.

또한, 초음파 조사가 1분 미만으로 수행되는 경우 초음파조사가 충분히 이루어지지 않아 쉘의 합성이 저조하다는 문제점이 있고, 12시간을 초과하는 경우 과도한 에너지의 공급으로 나노입자가 아닌 거대(bulk) 입자가 형성된다는 문제점이 있다.
In addition, when ultrasonic irradiation is performed for less than 1 minute, there is a problem that ultrasonic irradiation is not sufficiently performed and synthesis of the shell is poor. When the ultrasonic irradiation is performed for more than 12 hours, .

단계 c에서는 초음파가 조사된 코어-쉘 구조 발광 나노입자를 세척 및 분산한다.In step c, the ultraviolet-irradiated core-shell structured light emitting nanoparticles are washed and dispersed.

상기 단계 c의 세척은 합성된 코어-쉘 발광 나노입자를 금속 전구체 용액으로부터 불필요한 물질들을 제거하고 분리하기 위해 수행된다. The washing of step c) is performed to remove synthesized core-shell light emitting nanoparticles from the metal precursor solution to remove and remove unnecessary materials.

상기 세척은 에탄올, 메탄올, 옥틸알콜, 헥산, 톨루엔, 클로로포름 등에서 이루어질 수 있으며, 2 내지 10회 정도 수행하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. The washing may be performed using ethanol, methanol, octyl alcohol, hexane, toluene, chloroform, etc., and preferably about 2 to 10 times, but is not limited thereto.

알콜계 용매로는 에탄올, 메탄올, 옥틸알콜 등이 있다. 상기 용액은 극성 용매로써 무극성 용매에 분산되어 있는 나노입자의 침전을 유도하여 제조된 나노입자의 분리를 쉽게 할 수 있다는 장점이 있다.Examples of the alcohol solvent include ethanol, methanol, and octyl alcohol. The solution is advantageous in that the nanoparticles prepared by inducing precipitation of nanoparticles dispersed in a non-polar solvent as a polar solvent can be easily separated.

탄화수소계 용매로는 헥산, 톨루엔, 클로로 포름 등이 있다. 상기 용액은 무극성 용매로써 알킬체인에 의하여 안정화된 나노입자들을 균일하게 분산시킬 수 있다는 장점이 있다.Examples of the hydrocarbon solvent include hexane, toluene, and chloroform. This solution has the advantage of uniformly dispersing nanoparticles stabilized by an alkyl chain as a non-polar solvent.

다음으로, 세척된 나노입자들이 침전된 후, 상층액을 제거하여 발광 나노입자를 분리한다. 상기 상층액을 제거하는 방법은 원심분리법인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 원심분리법을 사용하면 원심력과 비중의 차이를 이용하여 반응기 내의 용매와 섞여있는 용해되지 않은 발광 나노입자를 분리할 수 있다.Next, after the washed nanoparticles are precipitated, the supernatant is removed to separate the emitting nanoparticles. The method of removing the supernatant is preferably a centrifugation method, but is not limited thereto. By using the centrifugation method, it is possible to separate undissolved luminescent nanoparticles mixed with the solvent in the reactor by using the difference in centrifugal force and specific gravity.

상기 단계 c의 분산은 분리된 발광 나노입자를 용매에 분산시켜 이를 수득하기 위해 수행된다. 상기 분산은 헥산, 톨루엔, 클로로포름, 물 등에서 이루어질 수 있다. The dispersion of step c) is carried out to disperse the separated light emitting nanoparticles in a solvent to obtain it. The dispersion may be performed in hexane, toluene, chloroform, water or the like.

일반적으로 균일한 크기에 안정성이 높은 반도체 나노입자들은 표면이 소수성을 띄기 때문에 수용액에서는 사용할 수 없는 단점을 지닌다. 하지만 나노입자의 생체재료나 바이오 분야의 응용을 위해서는 이러한 단점을 극복하기 위해 친수성으로 표면을 처리해야 한다. In general, semiconductor nanoparticles having a uniform size and high stability have a disadvantage that they can not be used in an aqueous solution because their surfaces are hydrophobic. However, nanoparticles need to be treated with hydrophilic surface to overcome these disadvantages for biomaterials and biotechnology applications.

따라서, 친수성 화합물로 코팅하기 위해 히드록시기, 카르복실기, 아미노기, 멜캅토기 등을 포함하는 유기 리간드를 사용할 수 있고, 바람직하게는 친수성 티올 화합물, 멜캅토기 및 카르복실기를 포함하는 멜캅토산, 더 바람직하게는 C₂ 내지 C₈의 멜캅토산을 사용할 수 있다. 상기 리간드는 쉘의 표면에 화학적 또는 물리적으로 결합할 수 있다. 상기 친수성 티올 화합물은 MPA(mercaptopropionic acid), MAA(mercaptoacetic acid), 또는 MSA(mercaptosuccinic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지 않는다
Therefore, an organic ligand including a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, a mercapto group and the like can be used for coating with a hydrophilic compound, and preferably a mercapto acid including a hydrophilic thiol compound, a mercapto group and a carboxyl group, more preferably C ₂ To C ₈ of mercapto acid may be used. The ligand may be chemically or physically bound to the surface of the shell. The hydrophilic thiol compound may be any one selected from the group consisting of MPA (mercaptopropionic acid), MAA (mercaptoacetic acid), and MSA (mercaptosuccinic acid), but is not limited thereto

상기의 단계를 거쳐 제조된 친수성 티올 화합물로 코팅된 ZAIS 나노입자를 이용하여 단계 (B)를 수행하여 ZAIS-트립톤 복합체를 제조할 수 있다.The ZAIS-tryptone complex can be prepared by carrying out step (B) using ZAIS nanoparticles coated with the hydrophilic thiol compound prepared through the above steps.

상기 단계(B)는 단위 농도의 티올 화합물 코팅 ZAIS 나노입자에 트립톤 펩타이드 용액을 넣은 후 phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 조건에서 15분 이상 상온에서 반응시키는 것이 바람직하다. 또한 단계 (B)에서 사용되는 생리학적 수용액 완충용액 (buffer solution) 종류는 PBS에 한정되지 않는 다양한 종류의 완충용액이 될 수 있으며, 반응 pH 영역도 7.4에 한정되지 않는다. 제조된 ZAIS-트립톤 복합체를 코팅되지 않은 트립톤으로부터 제거하기 위해 세척 및 분리를 하고, PBS에 분산한다. In step (B), it is preferable to add a tryptone peptide solution to a thiol compound-coated ZAIS nanoparticle at a unit concentration, and then react at room temperature for 15 minutes or more in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4. Also, the physiological buffer solution used in step (B) may be various kinds of buffer solutions not limited to PBS, and the reaction pH range is not limited to 7.4. The prepared ZAIS-tryptone complex is washed and separated to remove from uncoated tryptone and dispersed in PBS.

상기 단계 (B)를 거쳐 제조된 ZAIS-트립톤 복합체에 항체 및 화학적 연결체 (bifunctional chemical crosslinker)를 첨가하여 ZAIS-트립톤 복합체와 항체를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
The method may further include adding an antibody and a bifunctional chemical crosslinker to the ZAIS-tryptone complex prepared through the step (B) to bind the ZAIS-tryptone complex and the antibody.

상기 단계 (B)는 20~40 mg/ml 농도의 트립톤을 처리 할 수 있으나, 본 발명의 목적에 부합하는 이상 반드시 상기 농도로 처리해야 하는 것은 아니다.
The step (B) can treat the tryptone at a concentration of 20 to 40 mg / ml. However, the step (B) does not necessarily treat the tryptone at the concentration as long as it meets the object of the present invention.

본 발명의 구체적인 실시예에서, ZAIS 나노입자와 친수성 펩타이드나 단백질과의 무작위적 결합 (passivation)을 통하여 안정성을 테스트 한 결과, 트립톤이나 혈청 (Albumin) 단백질의 경우 생리학적 수용액에 장기간 안정적으로 부착되어 있으며 이에 의해 ZAIS-나노입자가 수용액에 안정적으로 용해되어 있는 것을 발견하였다. In a specific embodiment of the present invention, ZAIS nanoparticles were tested for stability through random passivation of hydrophilic peptides or proteins, and as a result, tryptone or serum proteins (albumin) And found that the ZAIS-nanoparticles were stably dissolved in the aqueous solution.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, MPA 로 코팅된 ZAIS 나노입자에 주어진 양의 트립톤 펩타이드를 첨가하고 phosphate buffered saline (PBS)와 0.1 M borate buffer, pH 8.8의 각 조건에서 15분간 상온에서 반응을 시킨 후 전기영동한 결과, 트립톤 펩타이드가 ZAIS-MPA 를 안정적으로 코팅하는 것을 알 수 있었다 (도 2).
In a specific example of the present invention, ZAIS nanoparticles coated with MPA were added to a given amount of tryptone peptide, and reacted at room temperature for 15 minutes under conditions of phosphate buffered saline (PBS) and 0.1 M borate buffer, pH 8.8 And electrophoresed. As a result, it was found that the tryptone peptide stably coats ZAIS-MPA (FIG. 2).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, ZAIS 나노입자를 트립톤 펩타이드로 무작위 결합시킨 ZAIS-트립톤 복합체는 5 ~ 10 nm 정도의 크기 (지름)를 보여 4 nm 크기의 (지름) ZAIS 나노입자에 비해 크게 증가하지 않는 것을 확인하였다 (도 3A).
Further, in a specific embodiment of the present invention, the ZAIS-tryptone complex randomly bound to ZAIS nanoparticles with tryptone peptides has a size (diameter) of about 5 to 10 nm and has a diameter of 4 nm (diameter) (Fig. 3A).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, ZAIS-트립톤 복합체의 형광방출 최고파장은 거의 변화가 없는 반면, 여기 파장이 긴 파장 영역인 가시광 영역으로 이동함으로써, ZAIS-트립톤 복합체가 형광 이미징 프로브로 사용하기에 적절함을 확인하였다 (도 3B, 3C).
Further, in a specific embodiment of the present invention, the ZAIS-tryptone complex is transferred to the fluorescent imaging probe by moving to the visible light region where the excitation wavelength is a long wavelength region, while the fluorescence emission maximum wavelength of the ZAIS- (Fig. 3B, 3C).

또한, 본 발명의 구체적인 실험예에서, ZAIS-트립톤 복합체를 아교세포(Astrocyte)에 투여하여 세포독성을 확인한 결과, 100 μl/ml 농도 한도에서는 세포 독성이 없음을 확인하였다 (도 4B).
In a specific example of the present invention, ZAIS-tryptone complex was administered to astrocytes to confirm cytotoxicity. As a result, it was confirmed that there was no cytotoxicity at a concentration of 100 μl / ml (FIG. 4B).

또한, 본 발명의 구체적인 실험예에서, ZAIS-트립톤 복합체는 뇌실 (Lateral ventricle) 에 직접 주입되어 뇌실하 영역 (Subventricular zone) 에 분포되어 있는 뇌실막 세포와 뇌 줄기세포를 표지할 수 있음이 보여졌고, 장시간 광안정이 뛰어난 ZAIS 나노입자의 특징에 의거 이들 세포의 위치와 이동을 추적 가능함을 알 수 있었다 (도 5).
In a specific example of the present invention, the ZAIS-tryptone complex was shown to be capable of labeling the ventricular cells and the brain stem cells, which are directly injected into the lateral ventricle and distributed in the subventricular zone , And the location and migration of these cells can be traced based on the characteristics of ZAIS nanoparticles, which are excellent in long-term photoluminescence (FIG. 5).

또한, 본 발명의 구체적인 실험예에서, ZAIS-MPA 나노입자 및 ZAIS-PEI 나노입자의 뇌실 주입시 세포독성을 확인한 결과, 상당한 세포독성이 관찰됨을 확인하였다 (도 6).
In addition, in a specific experimental example of the present invention, it was confirmed that cytotoxicity of ZAIS-MPA nanoparticles and ZAIS-PEI nanoparticles in the ventricle injection was observed, and that considerable cytotoxicity was observed (FIG. 6).

또한, 본 발명의 구체적인 실험예에서, 뇌종양 세포에 ZAIS-트립톤 복합체를 세포 이물 흡수 (endocytosis) 과정을 통해 주입시킨 후, 쥐(mouse)의 뇌에 이식시켜 미세아교세포 (Microglia cell)의 이동과 대식작용을 추적, 관찰 할 수 있음을 보임으로써 줄기세포 등 다양한 세포의 in vitro에서 형광표지, 이식, 위치확인, 추적, 주변 미세환경 변화 등의 용도에 유용하게 쓰일 수 있음을 예시하였다 (도 7).
In addition, in a specific example of the present invention, ZAIS-tryptone complex is injected into a brain tumor cell through an endocytosis process and then transplanted into the brain of a mouse to move the microglial cell And it can be used for various applications such as fluorescent labeling, transplantation, positioning, tracking, and microenvironmental change in a variety of cells such as stem cells 7).

또한, 본 발명의 구체적인 실험예에서, MPA 로 코팅된 ZAIS 나노입자를 트립톤 펩타이드로 코팅시켜 ZAIS-트립톤 복합체를 만들고 이 복합체에 적정 농도의 항체를 처리하여 반응시킴으로써 ZAIS-트립톤-항체 복합체를 완성시켰고, In vitro / In vivo에서 ZAIS형광 나노입자가 생물학적으로 다양하게 응용될 수 있음을 확인하였다 (도 8).
In a specific example of the present invention, a ZAIS-tryptone complex is prepared by coating MPA-coated ZAIS nanoparticles with a tryptone peptide, and the conjugate is treated with an appropriate concentration of an antibody to react with the ZAIS-tryptone-antibody complex And it was confirmed that ZAIS fluorescent nanoparticles can be biologically diversified in vitro / in vivo (FIG. 8).

또한, 본 발명의 구체적인 실험예에서, ZAIS-트립톤-항체 복합체 제조방법을 이용하여 Herceptin항체를 ZAIS-트립톤 복합체에 부착하였고 이 복합체를 세포실험에 적용시킨 결과 부착된 항체의 기능이 적절히 유지되어 표적지향 이미징이 가능한 것을 볼 수 있었다 (도 9).
In addition, in a specific example of the present invention, Herceptin antibody was attached to a ZAIS-tryptone complex using a ZAIS-tryptone-antibody complex preparation method and the complex was applied to a cell experiment, So that target-oriented imaging was possible (FIG. 9).

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples and experimental examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples and experimental examples.

<실시예 1> 초음파 조사법을 이용한 ZAIS 나노입자 라이브러리 제작 및 MPA 코팅Example 1 Preparation of ZAIS Nanoparticle Library Using Ultrasonic Irradiation and MPA Coating

<1-1> ZAIS 코어 나노입자의 제작<1-1> Fabrication of ZAIS core nanoparticles

ZAIS 코어 나노입자 [(Zn_xAg_yIn_z)S₂]는 양이온 원료로 아연 나이트레이트 Zn(NO₃)₂ ·6H₂O, 실버 나이트레이트 AgNO₃, 인듐 나이트레이트 In(NO₃)₃ ·3H₂O와 음이온 원료로서 다이메틸다이타이오카바메이트를 10 ml 도데실아민에 섞어 초음파 조사기 (Sonic dismembrator Model 500, Fisher Scientific, USA) 로 10분간 조사한 후 상온에서 냉각하여 합성한다. ZAIS 코어 나노입자의 분리·정제를 위해서 반응용기에 적정량의 클로로포름과 메탄올을 1:1 비율로 첨가하여 나노입자를 침전시키고 원심분리 시킨 후 상층액을 제거한다. 위 정제과정을 세번 정도 반복실행한 후 클로로포름에 분산시켜 최종 정제된 ZAIS 코어 나노입자를 얻었다. 도 1A는 아연, 실버, 인듐의 조성비에 변화를 주어 초음파 합성을 통해 라이브러리를 만든 후 365 nm 파장의 자외선에서 나오는 형광이미지를 한번에 보여준다.
ZAIS core nanoparticles _{_{_{[(Zn x Ag y In z}}} ) S 2] are zinc nitrate _{_{Zn (NO 3) 2 · 6H}} 2 O, silver nitrate, AgNO _3, indium nitrate, In (NO ₃₎ a cationic material _3, 3H ₂ O and dimethyidithiocarbamate as an anion source are mixed with 10 ml of dodecylamine and irradiated with an ultrasonic wave irradiator (Sonic Dismembrator Model 500, Fisher Scientific, USA) for 10 minutes, followed by cooling at room temperature. To separate and purify the ZAIS core nanoparticles, an appropriate amount of chloroform and methanol are added to the reaction vessel at a ratio of 1: 1 to precipitate the nanoparticles, centrifuge the nanoparticles, and remove the supernatant. The above purification process was repeated three times and then dispersed in chloroform to obtain final purified ZAIS core nanoparticles. FIG. 1A shows a fluorescence image from ultraviolet light of 365 nm wavelength at a time after making a library through ultrasound synthesis by varying the composition ratio of zinc, silver, and indium.

<1-2> ZAIS 코어-쉘 나노입자의 제작<1-2> Fabrication of ZAIS core-shell nanoparticles

ZAIS 코어-쉘 나노입자 [(Zn_xAg_yIn_z)S₂-ZnS]는 <실시예 1>에서 (도 1A) 제조된 ZAIS 코어 나노입자 [(Zn_xAg_yIn_z)S₂] 에 쉘 원료물질인 아연 운데실레네이트와 황을 넣고 섞은 후, 초음파 조사기를 이용하여 10분간 조사하여 아연설파이드 - ZnS - 쉘을 포함하는 형태의 코어 쉘 나노입자로 제조된다 (도1B). 상기 반응용기에 적정량의 콜로로포름과 메탄올을 1:1 비율로 첨가하여 세척한후 원심분리로 분리하는 세척과정을 세번 반복한 후 클로로포름에 분산시켜 최종 정제된 ZAIS 코어-쉘 나노입자를 얻었다. ZAIS 코어-쉘 나노입자는 ZAIS 코어 나노입자에 비해서 형광세기가 급격히 증가하여 높은 발광강도를 가짐을 보여준다.
The ZAIS core-shell nanoparticles [(Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ -ZnS] were synthesized from the ZAIS core nanoparticles [(Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ ] prepared in Example 1 The shell raw material, zinc undecylenate, was mixed with sulfur and then irradiated with an ultrasonic wave for 10 minutes to prepare core-shell nanoparticles containing zinc sulfide-ZnS-shell (FIG. 1B). The reaction vessel was washed with an appropriate amount of colloform and methanol in a ratio of 1: 1, washed and separated by centrifugation, and then dispersed in chloroform to obtain final purified ZAIS core-shell nanoparticles. The ZAIS core-shell nanoparticles show a higher fluorescence intensity than the ZAIS core nanoparticles due to the rapid increase in fluorescence intensity.

<1-3> MPA 코팅된 친수성 ZAIS 나노입자의 제작<1-3> Fabrication of MPA coated hydrophilic ZAIS nanoparticles

도 1C는 ZAIS 나노입자를 수용액에서도 분산시키기 위해 친수성 나노입자로 표면을 개질하기 위한 방법을 보여주고 있다. 10 ml의 메탄올에 400μl 3-merceptopropionic acid (MPA) 를 첨가한 후, 1M KOH용액을 첨가하여 pH를 13이상이 되도록 조절했다. 이 MPA 용액에 클로로포름에 분산되어 있는 소수성 ZAIS 나노입자를 첨가한 후 30분간 교반시켜준다. 그 후 이 용액을 약 20분간 원심분리 시키고 (10,000 x g) 상층액을 제거한 후, 메탄올로 세번 세척-원심분리-상층액제거 과정을 거쳐 물에 분산시켜주면 친수성 ZAIS 나노입자가 만들어진다.
Figure 1C shows a method for modifying a surface with hydrophilic nanoparticles to disperse ZAIS nanoparticles in an aqueous solution. After adding 400 μl 3-merceptopropionic acid (MPA) to 10 ml of methanol, 1 M KOH solution was added to adjust the pH to 13 or higher. Hydrophobic ZAIS nanoparticles dispersed in chloroform were added to this MPA solution, followed by stirring for 30 minutes. The solution is then centrifuged for about 20 minutes (10,000 xg), and the supernatant is removed. Three washings with methanol - centrifugation - supernatant removal and dispersion in water yield hydrophilic ZAIS nanoparticles.

MPA를 이용한 친수성 표면개질이 균일하게 수행되었는지 확인하기 위해 아가로스 젤에 네종류의 친수성 ZAIS 나노입자를 전기영동시켜 나노입자의 이동성과 퍼짐정도를 확인하였다 (도 1D). 표면개질된 ZAIS 나노입자들의 8 μl 샘플에 2μl 의 80% 글리세롤과 섞은 후 0.8 % 아가로스젤에 로딩하여 1x TBE 버퍼용액에서 전기영동하였다. 나노입자 표면에 코팅된 MPA의 카르복실기가 가진 음전하로 인해 전기장에서 이동하게 되고, 아가로즈 젤 고분자에 생긴 구멍을 통해 크기별로 분리가 된다. 전기영동이 끝난 젤을 자외선 조사판 (UV Transilluminator)에 놓고 이미지를 확인한 결과 MPA 코팅이 균일하게 잘 되어서 이동성도 균등하게 양호하고 이동시 퍼짐효과도 없어서 수용액 안정적인 친수성 ZAIS 나노입자가 만들어 졌음을 확인했다. 그림 1D에서 보여주는 각 레인에 로딩되어 전기영동된 친수성 ZAIS 나노입자는 다음과 같다: a: (Zn_0.3Ag_0.2In_0.5)S₂, b: (Zn_0.2Ag_0.3In_0.5)S₂, c: (Zn_0.1Ag_0.4In_0.5)S₂, d: (Zn₀Ag_0.5In_0.5)S₂
In order to confirm whether the hydrophilic surface modification using MPA was performed uniformly, four types of hydrophilic ZAIS nanoparticles were electrophoresed on the agarose gel to confirm the mobility and spread of the nanoparticles (FIG. 1D). An 8 μl sample of surface modified ZAIS nanoparticles was mixed with 2 μl of 80% glycerol, loaded onto 0.8% agarose gel and electrophoresed in 1 × TBE buffer solution. The negative charge of the carboxyl group of the MPA coated on the surface of the nanoparticles causes them to move in the electric field, and they are separated in size by the holes formed in the agarose gel polymer. The electrophoretic gel was placed on a UV Transilluminator and the images were checked to confirm that the hydrophilic ZAIS nanoparticles were stable because the MPA coating was uniformly smooth, The hydrophilic ZAIS nanoparticles loaded and electrophoresed on each lane shown in Figure 1D are as follows: a: (Zn _0.3 Ag _0.2 In _0.5 ) S ₂ , b: (Zn _0.2 Ag _0.3 In _0.5 ) S ₂ , c: Zn _0.1 Ag _0.4 In _0.5 ) S ₂ , d: (Zn ₀ Ag _0.5 In _0.5 ) S ₂

<실시예 2> ZAIS-트립톤 복합체의 제작 및 아가로스 젤에서의 이동패턴 분석&Lt; Example 2 > Preparation of ZAIS-tryptone complex and analysis of migration pattern in agarose gel

본 발명자들은 티올 화합물로 코팅된 ZAIS 나노입자에 다양한 양의 트립톤을 첨가하여 코팅시킨 후, 아가로스 젤에 전기영동시켜 ZAIS-트립톤 복합체의 크기 변화와 이동양상을 분석하였다.
The present inventors analyzed ZAIS-tryptone complex size and migration pattern by adding various amounts of triptone to ZAIS nanoparticles coated with a thiol compound, and then electrophoresing on agarose gel.

구체적으로, <실시예 1-3>에서 제조된 MPA 코팅된 친수성 ZAIS 코어 나노입자 [(Zn_0.0Ag_0.3In_0.7)S₂] 각 50μl에 1.38X PBS (phosphate-buffered saline) 130μl를 첨가한 후, 1X PBS에 농도별로 용해된 트립톤(BD Bioscience, 카탈로그 번호 211701) 120μl씩 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 반응에서 첨가된 트립톤의 최종농도는 0, 2, 10, 20 mg/ml였고, 알부민 코팅 방법 (한국특허출원번호: 10-2013-0046982)과 비교를 위해 ZAIS 코어 나노입자 용액에 bovine serum albumin (BSA, 시그마 알드리치, 카탈로그 번호 A7030) 120μl를 첨가하여BSA 의 최종농도를 10 mg/ml로 만들어 전기영동으로 트립톤 코팅 방법과 비교하였다. 본 실시예에서 사용된 PBS의 조성은 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄ 로 되어 있고, pH는 7.4로 조정하여 30분 동안 반응시킨 샘플들은 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 분석하였다.
Specifically, 130 μl of 1.38 × PBS (phosphate-buffered saline) was added to each 50 μl of the MPA-coated hydrophilic ZAIS core nanoparticles [(Zn _0.0 Ag _0.3 In _0.7 ) S ₂ ] prepared in Example 1-3 , 120 μl of tryptone (BD Bioscience, Cat. No. 211701) dissolved in 1 × PBS was added, and reacted at room temperature for 30 minutes. The final concentration of tryptone added in this reaction was 0, 2, 10 and 20 mg / ml. For comparison with the albumin coating method (Korean Patent Application No. 10-2013-0046982), bovine serum 120 μl of albumin (BSA, Sigma Aldrich, catalog number A7030) was added to make the final concentration of BSA 10 mg / ml and compared with the tryptone coating method by electrophoresis. The composition of the PBS used in this example was 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO ₄ , and 2 mM KH ₂ PO ₄ . And analyzed by electrophoresis on agarose gel.

그 결과, MPA 코팅된 친수성 ZAIS 나노입자는(각 5번 레인) MPA에 있는 음전하를 띤 카르복실기로 인해 전기영동시 (-)극에서 (+)극 방향으로 (바닥방향) 이동하였다 (도 2A, 2B).
As a result, the MPA-coated hydrophilic ZAIS nanoparticles migrated from the (-) pole to the (+) pole (bottom) direction during electrophoresis due to the negatively charged carboxyl group in MPA (each lane 5) 2B).

대조군으로 제조한 알부민 코팅된 ZAIS 나노입자는 (각 6번 레인) 나노입자의 표면에 붙은 알부민 단백질들의 크기 대비 음전하 수에 의해 전기영동시 (-)극에서 (+)극 방향으로 (바닥방향) 이동하고, 단위 입자당 부착되는 알부민 수에 의해 크기가 증가되므로 전기영동시 속도가 느려지고 단위 입자에 부착된 알부민의 비율에 따라 다소 흐리고 두꺼운 밴드로 나타나는 현상도 나타났다 (도 2A 6번 레인). PBS 보다 pH가 더 높은 0.1M Borate 버퍼 (pH 8.8)에서는 단위 입자당 다수의 고른 비율의 알부민의 접착에 의하여 얇고 형광이 강한 밴드로 나타났다 (도 2B 6번 레인).
The albumin-coated ZAIS nanoparticles prepared in the control group (negative 6-lane) exhibited negative (+) polarity (bottom) orientation at the time of electrophoresis due to the negative charge number relative to the size of the albumin proteins attached to the surface of the nanoparticles. And the size increases due to the number of albumin attached per unit particle, so that the rate of electrophoresis is slowed down, and the phenomenon appears as a thick and dark band depending on the ratio of albumin attached to the unit particle (FIG. 2A, No. 6 lane). In the 0.1 M borate buffer (pH 8.8), which had a higher pH than PBS, a thin and fluorescent band appeared due to the adhesion of a large number of albumin per unit particle (FIG. 2B lane 6).

단백질인 알부민에 비해서 트립톤은 크기가 작은 펩타이드 형태이므로 알부민 코팅 ZAIS 나노입자에 비해 트립톤 코팅 ZAIS 나노입자는 전기영동 속도가 더 빠르며, MPA 코팅된 ZAIS 나노입자와 비슷한 전기영동 속도를 보인다. 특히 2, 10, 20 mg/ml 로 트립톤 농도를 더욱 높일수록 밴드가 MPA-ZAIS 나노입자 보다 위에 위치하고 있어, 트립톤 농도가 높을 수록 코팅이 더욱 완벽하게 되면서 나노입자의 크기가 증가함을 알 수 있다 (도 2A, 1,2,3번 레인). 알부민의 경우처럼, 트립톤도 0.1M Borate 버퍼를 사용할 경우더욱 견고하게 코팅되어 전기영동시 밴드의 두께가 더욱 얇아짐을 볼 수 있다. (도 2B, 2,3,4 번 레인)
Compared to albumin, the tryptone-coated ZAIS nanoparticle has a faster electrophoresis and electrophoresis speed similar to that of MPA-coated ZAIS nanoparticles compared to Albumin-coated ZAIS nanoparticles. In particular, the higher the tryptone concentration, 2, 10, and 20 mg / ml, the more the band is located above the MPA-ZAIS nanoparticles, and the higher the tryptone concentration, (Figs. 2A, 1, 2, and 3 lanes). As in the case of albumin, trytotone is more robustly coated with 0.1 M borate buffer, and the thickness of the band becomes thinner during electrophoresis. (Fig. 2B, 2, 3, 4 lane)

<실시예 3> ZAIS 나노입자와 ZAIS-트립톤 복합체 크기 및 발광특성 분석<Example 3> Size and emission characteristics of ZAIS nanoparticles and ZAIS-tryptone complex

도 3에서는 티올 화합물로 코팅된 ZAIS 나노입자에 트립톤을 첨가하여 코팅시킨 ZAIS-트립톤 복합체와 친수성 (hydrophilic) 물질로 표면을 개질하기 전의 ZAIS 발광나노입자 [(Zn_0.0Ag_0.3In_0.7)S₂] 의 비교 결과를 보여준다. 투과전자현미경 (TEM: transmission electron microscope) 으로 확인된 ZAIS 발광나노입자는 약 4 nm 가량의 지름을 가진 구형입자로 고르게 분포되어 있고 (도 3A 위 그림), 반면 20 mg/ml 농도의 트립톤 용액으로 제조된 ZAIS-트립톤 복합체의 경우에는 약 5 ~ 10 nm 가량의 지름을 가진 구형입자의 형태를 띄고 ± 2.5 nm 정도 가량의 크기의 차이를 가진 분포를 보이고 있다 (도 3A 아래 그림). 트립톤은 카세인 (casein) 단백질을 조각낸 비정형의 펩타이드로, 이러한 트립톤의 특징으로 인해 ZAIS-트립톤 복합체의 크기가 표면개질 되기 전의 ZAIS 발광나노입자에 비해 커지고, 크기 분포 또한 ± 2.5 nm 정도 가량의 비균질도를 보인다. 따라서, ZAIS-나노입자를 트립톤으로 코팅하는 것이 크기가 20 nm 정도로 대폭 증가되는 알부민으로 코팅하는 것보다 생체적용에 유리하다.
In FIG. 3, ZAIS-tryptone complexes coated with thiol-coated ZAIS nanoparticles by adding tryptone and ZAIS-light-emitting nanoparticles [(Zn _0.0 Ag _0.3 In _0.7 ) S ₂ ]. ZAIS luminescent nanoparticles identified by transmission electron microscopy (TEM) are evenly distributed as spherical particles with a diameter of about 4 nm (Fig. 3A, above), whereas tryptone solutions at a concentration of 20 mg / The ZAIS-tryptone complex produced by the method of the present invention has spherical particles having a diameter of about 5 to 10 nm and a distribution with a size difference of about 2.5 nm (FIG. 3A, below). Tryptone is an amorphous peptide fragment of casein protein. Due to the nature of this tryptone, the size of the ZAIS-tryptone complex is larger than that of the ZAIS light-emitting nanoparticles before the surface modification, and the size distribution is also about ± 2.5 nm Of inhomogeneities. Thus, coating the ZAIS-nanoparticles with tryptone is more advantageous for biocompatibility than coating with albumin, which is greatly increased in size to about 20 nm.

도 3B와 3C에서는 발광 영역에 따른 ZAIS-트립톤 복합체 두 종류를 제조하여 발광특성의 변화를 분석한 결과를 보여준다. (Zn_0.0Ag_0.3In_0.7)S₂발광나노입자는 346 nm에서 여기 (excitation) 최고파장을 보이고, 632 nm에서 형광방출 (emission) 최고파장을 보이지만 (도 3B, 파란색), (Zn_0.0Ag_0.3In_0.7)S₂-트립톤 복합체의 경우 462 nm에서 여기 최고파장을, 662 nm에서 형광방출 최고파장을 보임으로써 (도 3B, 붉은색) 여기-발광 파장 영역이 모두 이동한 모습을 보인다.
In FIGS. 3B and 3C, two kinds of ZAIS-tryptone complexes according to the light emitting region were prepared and the results of analysis of the change in the luminescent properties are shown. _{_{_{(Zn 0.0 Ag 0.3 In 0.7)}}} S 2 luminescent nanoparticles showing the excitation (excitation) maximum wavelength at 346 nm, but the fluorescence emission (emission) maximum wavelength at 632 nm (Fig. 3B, blue), (Zn _0.0 Ag _0.3 In _0.7 ) S ₂ -triptone complex shows excitation peak wavelength at 462 nm and peak emission wavelength at 662 nm (Fig. 3B, red color).

한편, (Zn_0.2Ag_0.1In_0.7)S₂발광나노입자는 여기 최고파장은 352 nm 에서, 형광방출 최고파장은 538 nm에서 나타나지만 (도3C, 파란색), (Zn_0.2Ag_0.1In_0.7)S₂-트립톤 복합체는 412 nm에서 여기 최고파장을, 538 nm에서 형광방출 최고파장을 보인다 (도 3C, 초록색). 여기 최고파장은 이동했지만, 형광방출 최고파장은 변화가 없었다.
On the other _{_{_{hand, (Zn 0.2 Ag 0.1 In 0.7}}} ) S 2 luminescent nanoparticles where maximum wavelength is 352 nm, the fluorescence emission maximum wavelength appears at 538 nm (Fig. 3C, _{_{blue), (Zn 0.2 Ag 0.1 In}} 0.7) S 2 -Tripitone complex exhibits an excitation peak wavelength at 412 nm and a peak fluorescence emission at 538 nm (Figure 3C, green). Here, the peak wavelength was shifted, but the peak emission wavelength was unchanged.

즉, 초록색과 붉은색 형광방출을 보이는 대표적인 두 ZAIS 나노입자를 트립톤으로 표면개질 했을 경우 발광특성이 변하였다. (Zn_0.0Ag_0.3In_0.7)S₂-트립톤 복합체 (붉은색 형광방출)는 116 nm 가량 여기 최고파장이, 30 nm 가량 방출 최고파장이 긴파장 영역으로 이동했다. (Zn_0.2Ag_0.1In_0.7)S₂-트립톤 복합체 (초록색 형광방출)는 60 nm 가량 여기 최고파장이 긴파장 영역으로 이동했고, 방출 최고파장 변화는 없었다. 트립톤으로 표면을 개질한 것이 주로 여기 최고파장의 이동을 초래해서 자외선 영역의 여기 파장을 가시광 영역으로 이동시킴으로써 ZAIS-트립톤 복합체가 형광이미징 프로브로 사용되기에 적절하게 발광특성을 변화시켰음을 보여준다.
That is, when two representative ZAIS nanoparticles showing green and red fluorescence emission were surface-modified with tryptone, the luminescence characteristics were changed. (Zn _0.0 Ag _0.3 In _0.7 ) The S ₂ -tripton complex (red fluorescence emission) was shifted to a wavelength range of excitation wavelength of about 116 nm and emission wavelength of about 30 nm. (Zn _0.2 Ag _0.1 In _0.7 ) The S ₂ -tripton complex (green fluorescence emission) migrated to the wavelength range of excitation maximum wavelength around 60 nm, and there was no change in emission maximum wavelength. By modifying the surface with tryptone, the excitation wavelength of the ultraviolet region was shifted to the visible region mainly by causing the shift of the highest wavelength, thereby showing that the ZAIS-tryptone complex changed the luminescence property appropriately to be used as a fluorescent imaging probe .

<실험예 1> ZAIS 나노입자와 ZAIS-트립톤 복합체의 농도별 세포 안정성 확인EXPERIMENTAL EXAMPLE 1 Confirmation of Cell Stability of ZAIS Nanoparticles and ZAIS-Tryptone Complex by Concentration

ZAIS-나노입자를 MPA (Mercaptopropionic acid)로 표면을 개질시켜 수용성인 ZAIS-MPA 나노입자를 만들고, ZAIS-MPA 나노입자를 트립톤으로 코팅시켜 ZAIS-트립톤 복합체를 만든 후에 이에 대한 세포 독성을 시험하였다. 각각의 제조방법은 상기 <실시예 1>과 <실시예 2>에서 제조한 방법과 동일하다.
ZAIS-MPA nanoparticles were modified with MPA (mercaptopropionic acid) to prepare water-soluble ZAIS-MPA nanoparticles, and ZAIS-MPA nanoparticles were coated with tryptone to form a ZAIS-tryptone complex. Respectively. The respective production methods are the same as those in the above-described <Example 1> and <Example 2>.

<1-1> ZAIS 나노입자의 유방암 세포주에서의 세포 독성 확인<1-1> Cytotoxicity of ZAIS nanoparticles in breast cancer cell lines

ZAIS-MPA 나노입자를 농도별로 (6 ~ 200 ㎍/ml) 두 종류의 유방암 세포 - MCF-7과 SK-BR-3 - 에 처리하여 세포독성을 시험하였다 (도 4A).
Cellular toxicity was tested by treating ZAIS-MPA nanoparticles with two concentrations of breast cancer cells (MCF-7 and SK-BR-3) at different concentrations (6-200 ug / ml) (FIG.

구체적으로, 두 세포주를 48 웰 세포배양 용기에 적정량을 적정시간 (24 ~ 48 시간) 동안 배양한다. 무혈청 (serum-free) 세포배양액에 ZAIS-MPA 나노입자를 농도별로 녹인 후에, 48 웰 세포배양 용기에서 혈청 세포배양액을 제거한 후, 상기 ZAIS-MPA 나노입자 농도별 용액을 400 μl 각각 넣어주고 CO₂ 세포배양기에서 2~ 4시간 가량 배양한다. 배양 후에 48 웰 세포배양 용기에서 상기 ZAIS-MPA 나노입자 용액을 제거한 후, 세포배양액으로 씻어주고 (wash), 500μl 혈청 세포배양액을 넣어준 후에 24 ~ 48 시간 동안 CO₂ 세포배양기에서 배양한다. 배양 후 세포의 양을 MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy -methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] (Promega, 카탈로그번호 G5421)를 이용한 실험으로 정량한다. MTS 를 이용한 실험은 MTS라는 화학물질이 세포의 대사작용에 의해서 화학적 변형이 되면서 490 nm 파장의 빛을 흡수하게 되고, 결과적으로 490 nm 파장에서 흡광도가 높을 수록 세포 수가 많다는 것을 나타낸다. 이렇게 대사체의 양으로 정량한 세포의 양을 대조군 시료 비교하여 세포독성과 안정성을 평가한다.
Specifically, two cell lines are cultured in a 48-well cell culture container for an appropriate amount of time (24-48 hours). After dissolving the ZAIS-MPA nanoparticles in the serum-free cell culture medium in a concentration-dependent manner, 400 μl of each solution of the ZAIS-MPA nanoparticles was added to each well of a 48-well cell culture container, ₂ cell incubator for about 2 to 4 hours. After the culture, remove the ZAIS-MPA nanoparticle solution in a 48-well cell culture vessel, wash with a cell culture solution, add 500 μl of serum cell culture solution, and cultivate in a CO ₂ cell culture incubator for 24 to 48 hours. The amount of cells after culturing was measured by MTS [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxy-methoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H- tetrazolium] (Promega, catalog number G5421 ). Experiments using MTS indicate that a chemical called MTS is chemically modified by cell metabolism to absorb light at a wavelength of 490 nm, and as a result, the higher the absorbance at a wavelength of 490 nm, the greater the number of cells. The amount of the cells quantified by the amount of the metabolite is compared with the control sample to evaluate cytotoxicity and stability.

MTS를 이용한 실험을 수행하기 위해, 200 μl 무혈청 세포배양액에 20 μl MTS 용액을 첨가하여 MTS 세포 배양액을 만든다. 상기 배양이 끝난 48 웰 세포 배양 용기의 각 웰에서 세포배양액을 제거한 후 MTS 세포 배양액을 넣어주고 1 ~ 2 시간 가량 CO₂ 세포배양기에서 넣어 둔 후에 상층액 100 μl를 자외선-가시광선 흡광기 용 96 웰 용기에 넣는다. 모든 샘플이 모아지면, 96웰 전용 자외선-가시광선 흡광기에 넣고 490 nm 파장에서 흡광도를 측정한다. 상기 MTS 를 이용한 실험에는 ZAIS 57 [(Zn_0.0Ag_0.3In_0.7)S₂], ZAIS 58 [(Zn_0.1Ag_0.2In_0.7)S₂], ZAIS 59 [(Zn_0.2Ag_0.1In_0.7)S₂], 세 종류의 ZAIS-MPA 나노입자가 사용되었다.
To carry out the experiment using MTS, 20 μl MTS solution is added to 200 μl serum-free cell culture medium to make MTS cell culture solution. After removing the cell culture medium from the wells of the cultured 48-well cell culture container, the MTS cell culture medium was added thereto, and the mixture was placed in a CO ₂ cell incubator for 1 to 2 hours. Then, 100 μl of the supernatant was added to the 96-well ultraviolet- Put in well vessel. Once all samples have been collected, they are placed in a 96-well dedicated ultraviolet-visible light absorbance and absorbance is measured at a wavelength of 490 nm. In the experiment using MTS, ZAIS 57 [(Zn _0.0 Ag _0.3 In _0.7 ) S ₂ ], ZAIS 58 [(Zn _0.1 Ag _0.2 In _0.7 ) S ₂ ] and ZAIS 59 [(Zn _0.2 Ag _0.1 In _0.7 ) S ₂ ] , Three types of ZAIS-MPA nanoparticles were used.

그 결과, ZAIS-MPA 나노입자의 세포 독성/안정성은 두가지 유방암 세포주에 (MCF-7, SK-BR-3) 대하여 200 ㎍/ml 농도 한도에서 세포독성이 없다는 결과를 얻었다 (도 4A).
As a result, cytotoxicity / stability of ZAIS-MPA nanoparticles was found to be cytotoxic at a concentration of 200 μg / ml in two breast cancer cell lines (MCF-7, SK-BR-3) (FIG.

<1-2> ZAIS-트립톤 복합체의 아교세포에서의 세포 독성 확인<1-2> Cytotoxicity of ZAIS-tryptone complex in glial cells

ZAIS-트립톤 복합체는 농도별로 (0 ~ 800 ㎍/ml) 뇌세포의 한 종류인 아교세포 (Astrocyte)에 투여하여 아교세포의 사멸과정에서 배출되는 LDH (Lactate dehydrogenase) 양을 측정하여 세포독성과 안정성을 확인하였다. 세포가 사멸하게 되면 세포막이 그 형태를 잃어 세포질의 세포 내 물질이 세포막 밖으로 배출된다. 그 중 LDH와 Diaphorase는 NAD+/NADH 라는 보조인자 (co-factor)를 통해 Lactic acid를 Pyruvic acid 로, Tetrazolium을 Formazan 으로 변환시키고 Formazan은 490 nm 파장의 빛을 흡수하여, 이 파장에서 흡광도를 통해 간접적으로 LDH 양을 측정하고 대조군 시료와의 차이를 비교하여 세포독성과 안정성을 평가한다.
The ZAIS-tryptone complex was administered to astrocyte, one of brain cells (0 ~ 800 ㎍ / ml), to measure the amount of LDH (lactate dehydrogenase) Stability was confirmed. When the cells die, the cell membrane loses its shape and the cellular material inside the cell is released outside the cell membrane. Among them, LDH and Diaphorase convert Lactic acid to Pyruvic acid and Tetrazolium to Formazan through NAD + / NADH co-factor, Formazan absorb light of 490 nm wavelength, and indirectly through absorbance at this wavelength And the cytotoxicity and stability are evaluated by comparing the difference with the control sample.

상기 <실험예 1-2>의 MTS 를 이용한 실험과 같은 방법으로 아교세포를 배양한 48 웰 세포배양 용기에 농도별로 ZAIS-트립톤 복합체를 투여하고, 일정시간 배양 후 ZAIS-트립톤 복합체 배양액을 제거한 후 혈청 세포배양액으로 CO₂ 세포배양기에서 배양한 아교세포 시료를 준비하였다. 이후에 48 웰 세포배양 용기를 10분간 원심분리 (250 G)를 한 후, 상층액 100 μl를 96 웰 세포배양 용기에 옮겼다. 그리고 LDH 반응 용액을 (Solution C: Takara, 카탈로그번호 MK401) 각 웰에 100 μl 주입한 후, CO₂ 세포배양기에서 넣어 약 30분 정도 배양하였다. 반응을 종료시키기 위해 1N 염산 용액을 각 웰에 50μl 넣은 후 자외선-가시광선 흡광기에서 490 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
The ZAIS-tryptone complex was administered to a 48-well cell culture container in which the glial cells were cultured in the same manner as in the experiment using the MTS of the above <Experimental Example 1-2>, and the ZAIS-tryptone complex culture solution after removal of the glial cells were prepared samples incubated in a CO ₂ cell incubator with serum cell culture medium. Thereafter, the 48-well cell culture container was centrifuged (250 G) for 10 minutes, and 100 μl of the supernatant was transferred to a 96-well cell culture container. Then, 100 μl of the LDH reaction solution (Solution C: Takara, catalog number MK401) was injected into each well, and the mixture was incubated in a CO ₂ cell incubator for about 30 minutes. To terminate the reaction, 50 μl of 1 N hydrochloric acid solution was added to each well, and the absorbance was measured at 490 nm in an ultraviolet-visible light absorber.

그 결과, ZAIS-트립톤 복합체 100 ㎍/ml 농도 한도에서는 LDH 양이 대조군의 양과 비슷하여 세포 독성이 없다고 평가할 수 있지만, 200 ~ 800 ㎍/ml의 농도에서 LDH 양이 비례적으로 증가하여 사멸되고 있는 세포가 증가하고 있음이 나타났다 (도 4B). 이는 ZAIS-트립톤 복합체의 크기가 ZAIS-MPA 나노입자에 비해서 크다는 점과 암 세포주에 비해 아교세포가 외부 환경 변화에 더 민감한 것이 주요 원인이 되어 ZAIS-트립톤 복합체의 세포 안정성과 ZAIS-MPA 나노입자의 안정성이 다소 차이가 나는 것으로 보인다.
As a result, the amount of LDH in the ZAIS-tryptone complex at a concentration of 100 μg / ml is similar to that of the control group, and thus it can be estimated that there is no cytotoxicity. However, at a concentration of 200 to 800 μg / ml, (Fig. 4B). This is because ZAIS-tryptone complex is larger than ZAIS-MPA nanoparticles and is more susceptible to changes in external environment compared to cancer cell lines. Therefore, the cell stability of ZAIS-tryptone complexes and ZAIS- The stability of the particles seems to be somewhat different.

<실험예 2> ZAIS-트립톤 복합체의 뇌실 주입 및 특정 뇌세포 표지Experimental Example 2 Injection of the ZAIS-tryptone complex into the ventricle and specific brain cell marking

뇌의 뇌실 (Lateral ventricle)에는 뇌척수액 (Cerebrospinal fluid)으로 가득차 있어 뇌와 척수의 생리작용, 면역작용 등 다양한 역할을 한다. 또한 이 뇌실과 뇌의 경계면에 뇌실하영역 (Subventricular zone: SVZ)이 존재하여 뇌실과 뇌를 구분짓는다. 이 뇌실하 영역에는 견고한 뇌실막 세포 (Ependymal cell) 들이 외부에 위치하고 있고 뇌실막세포 안쪽에는 신경줄기세포 (Neural stem cell)가 존재함이 알려졌다. 본 실험예에서는 뇌실하영역에 위치한 뇌실막세포와 신경줄기세포를 ZAIS-트립톤 복합체로 염색하여 그 위치와 이동을 확인하였다 (도 5A 위 그림).
The lateral ventricle of the brain (cerebrospinal fluid) is filled with the brain and spinal cord physiology, immune function and play a variety of roles. The subventricular zone (SVZ) is present at the interface between the ventricle and the brain to distinguish the ventricle from the brain. It is known that the ependymal cells are located externally and the neural stem cells are located inside the ventricle. In this experiment, the ventricular cells and neural stem cells located in the sub-ventricular region were stained with ZAIS-tryptone complex to confirm its position and movement (FIG.

구체적으로, 40 ~ 120 mg/ml 농도로 PBS 에 용해되어 있는 각각 붉은색 형광을 방출하는 (Zn_0.0Ag_0.3In_0.7)S₂- 트립톤 복합체와 초록색 형광을 방출하는 (Zn_0.2Ag_0.1In_0.7)S₂- 트립톤 복합체를 ICV (Intracerebroventricular) 주입 방식으로 최대 5 μl 양으로 뇌실에 주입하였다. ICV 주입방식은 공간 위치 좌표를 확인 할 수 있는 기기에 쥐(mouse)를 고정시키고 쥐의 뇌골격에 미세하게 구멍을 뚫어준 후 주사기로 물질을 주입하는 것을 말한다 (도 5A 아래 그림). 주입이 완료된 후 피부를 봉합한 후 쥐의 상태를 면밀히 관찰하였다. 적정 실험시간 후에 실험결과의 확인을 위해 뇌를 고정시켜, 얇게 자르고 염색하는 과정인 조직학적 방법 (histological method) 을 통해 실험 시료를 얻었다. 이를 위해 염화 펜토바비탈 (Sodium pentobarbital)을 주입하여 실험 쥐를 마취시킨 후, 0.1M PBS (pH 7.4)에 용해되어 있는 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde) 용액으로 뇌실 (Lateral ventricle)을 통해 관류 (perfusion)를 시켰다. 뇌를 분리한 후 30 % 수크로즈 (sucrose) 용액에 담가서 조직이 완전히 가라앉을 때까지 4℃ 에 보관시키고, 냉동 절단 화합물 (frozen section compound: Leica)을 냉동 절단틀 (frozen section mold)에 적당량 넣은 후 뇌조직을 냉동 절단틀에 넣은 후 냉동 절단 화합물이 잘 섞이도록 해주고 뇌조직을 급속히 냉동시켰다. -80℃에 시료를 보관한 후, 미세절단기 (Microtome)로 얇게 잘라, 10 ~ 80 μm 두께로 자른 뇌조직 절편은 광학현미경, 혹은 형광현미경으로 관찰할 수 있는 시료로 만들었다.
Specifically, the (Zn _0.0 Ag _0.3 In _0.7 ) S ₂ -tripitone complex, which emits red fluorescence, dissolved in PBS at a concentration of 40-120 mg / ml, and Zn _0.2 Ag _0.1 In _0.7 ) S ₂ - tryptone complex was injected intracerebroventricular (ICV) infusion into the ventricle in a volume of 5 μl. The ICV injection method involves immobilizing a mouse on a device capable of confirming spatial position coordinates and finely puncturing the rat skeleton and injecting the material into the syringe (FIG. 5A, below). After the injection was completed, the skin was closed and the condition of the mice was closely observed. After the appropriate experimental period, the test samples were obtained by histological method, which is a process of pinning and thinning and dying the brain to confirm the experimental results. For this purpose, sodium pentobarbital was injected into the mice and anesthetized. The animals were anesthetized with 4% paraformaldehyde solution in 0.1 M PBS (pH 7.4) and perfused through the lateral ventricle perfusion). After the brain was detached, it was immersed in a 30% sucrose solution and stored at 4 ° C until the tissue was completely submerged. An appropriate amount of frozen section compound (Leica) was placed in a frozen section mold After the brain tissue was placed in the freezing cutter, the frozen cutting compound was mixed well and the brain tissue was rapidly frozen. Samples were stored at -80 ° C, cut into thin slices with a microtome, and cut into 10-80 μm thick sections. The sections were prepared by optical microscopy or fluorescence microscopy.

그 결과, 좌우 뇌실에 각각 붉은색 형광을 방출하는 (Zn_0.0Ag_0.3In_0.7)S₂-트립톤 복합체와 초록색 형광을 방출하는 (Zn_0.2Ag_0.1In_0.7)S₂-트립톤 복합체의 단일 여기 파장을 조사하였을 때 뇌실하영역에 얇은 띠의 형태로 형광 염색되었음을 볼 수 있었다 (도 5B). 뇌실하 영역에서 뇌실과 근접하는 부분에 뇌실막 세포가 촘촘히 배열되어 있고 그 안쪽에는 신경줄기세포가 분포되어 있고 그 두께는 상당히 얇다고 알려져 있으므로, 상기 실험결과에서 ZAIS-트립톤 복합체가 뇌실하 영역에서 세포의 핵이 집중되어 있는 영역에 주로 분포되어 있는 바, 뇌실막 세포와 그 주위에 위치한 신경줄기세포를 염색하고 있음을 나타낸다. 이는 이들 세포를 구분할 수 있는 바이오 마커 항체 염색을 통해서 적절한 실험목적에 맞게 확인할 수 있다.
As a result, a single excitation of (Zn _0.0 Ag _0.3 In _0.7 ) S ₂ -tripitone complex emitting red fluorescence to the left ventricle and a single excitation of (Zn _0.2 Ag _0.1 In _0.7 ) S ₂ -triptone complex emitting green fluorescence, When the wavelength was examined, it was observed that the fluorescent dye was in the form of a thin band in the sub-parenchymal region (Fig. 5B). Since it is known that the ventricular cells are closely arranged in the area near the ventricle in the subventricular zone, the neural stem cells are distributed in the inside thereof, and the thickness thereof is considerably thin, the ZAIS-tryptone complex in the sub- Are mainly distributed in the region where the nuclei of the cells are concentrated, indicating that the ventricular cells and the neural stem cells surrounding the cells are staining. This can be confirmed by appropriate biomarker antibody staining to distinguish these cells.

또한, DNA에 선택적으로 부착하는 DAPI를 이용하여 세포의 핵을 파란색으로 염색하고, 도 5B의 1 영역을 확대하였다 (도 5C).
In addition, DAPI selectively attaching to DNA was used to stain the nuclei of the cells in blue, and one region of FIG. 5B was enlarged (FIG. 5C).

그 결과, 세포의 핵이 염색된 부분 (도 5C 왼쪽 그림 파란색, DAPI 염색)과 ZAIS-트립톤 복합체로 염색된 부분 (도 5C 가운데 그림)을 겹쳐보았을 때 겹쳐짐을 통해 확인할 수 있었다 (도 5C 오른쪽 그림). 만약 일반적인 유기 형광 물질을 사용하였다면 주로 세포막 밖에서 세포막 부분만을 염색하게 되어 핵이 염색된 부분과 겹쳐지지 않을 것이다. 따라서, ZAIS-트립톤 복합체는 나노미터 크기를 갖는 특성으로 인해 세포 이물 흡수 (endocytosis) 과정을 통해 세포질 안에서 머물수 있음을 확인하였고, 상기 ZAIS-트립톤 복합체를 이용하여, 염색된 세포가 이동하거나 유실되거나 형태를 변형할 때 이를 추적할 수 있음을 보여준다.
As a result, it was confirmed that when the nuclei of the cells were stained (blue in FIG. 5C and DAPI stained in the left side of FIG. 5C) and stained portions in the ZAIS-tryptone complex (in the right side of FIG. 5C) Drawing). If a typical organic fluorescent material is used, the cell membrane portion will be mainly stained outside the cell membrane, and the nucleus will not overlap with the stained portion. Therefore, it was confirmed that the ZAIS-tryptone complex can stay in the cytoplasm through the process of endocytosis due to the nanometer-size property. Using the ZAIS-tryptone complex, Or can be tracked as they change form.

<실험예 3> 화학물질로 표면을 개질시킨 ZAIS 발광나노입자가 보여주는 뇌실하 영역에서의 조직독성<Experimental Example 3> Tissue toxicity in the sub-ventricular region of the surface modified with ZAIS light-emitting nanoparticles

ZAIS-트립톤 복합체를 제외한 모든 실험방법은 상기 <실험예 1>의 실험방법과 동일하다. MPA (Mercapto-propionic acid) 로 표면을 개질시켜 수용성인 ZAIS-MPA 나노입자를 만든 방법은 <실시예 1>과 동일하다. PEI (Polyethylene imine) 로 코팅한 ZAIS-PEI 나노입자를 만들기 위해 ZAIS-MPA 나노입자 용액에 적절한 양의PEI (Mw = 10,000, branched, Alfa Aesar 카탈로그 번호 40331) 원액을 넣어 PEI의 최종 농도가 1 mg/ml이 되도록 한다. 용액을 잘 섞어 준 후 30 ~ 60 분 가량 실온에서 코팅반응을 시켜준다. 이후 20,000G 속도의 초원심분리 (Ultracentrifugation) 를 통하여 상층액을 제거한다. ZAIS-PEI 나노입자를 물에 용해시킨 후 초원심분리를 통하여 잔여 PEI를 모두 제거하고, pH paper를 통해서 확인한다. 잔여 PEI가 모두 제거되면 실험목적에 따라서 H₂O나 PBS를 넣어 용해시키되 목적하는 농도를 유지한다. 이 후 제조된 ZAIS-PEI 및 ZAIS-MPA를 뇌실에 주입하고 24시간 이후에 뇌실하 영역을 관찰하였다.
All the experimental methods except the ZAIS-tryptone complex are the same as the experimental method of Experimental Example 1 above. The method of making water-soluble ZAIS-MPA nanoparticles by modifying the surface with MPA (Mercapto-propionic acid) is the same as in <Example 1>. To prepare the PEI (Polyethylene imine) coated ZAIS-PEI nanoparticles, the appropriate amount of PEI (Mw = 10,000, branched, Alfa Aesar Catalog No. 40331) was added to the ZAIS-MPA nanoparticle solution so that the final concentration of PEI was 1 mg / ml. The solution is mixed well and allowed to react at room temperature for 30 ~ 60 minutes. The supernatant is then removed through ultracentrifugation at a rate of 20,000G. After dissolving the ZAIS-PEI nanoparticles in water, remove all residual PEI by ultracentrifugation and confirm with pH paper. Once all of the residual PEI is removed, add the H ₂ O or PBS solution according to the experimental purpose and keep the desired concentration. After the injection, ZAIS-PEI and ZAIS-MPA were injected into the ventricle and the area under the ventricle was observed after 24 hours.

그 결과, ZAIS-PEI나노입자의 경우, PEI는 일차(primary), 이차(secondary), 삼차(tertiary) 아민기를 풍부하게 가지고 있어 PBS나 생리완충조건에서 수소이온을 끌어당겨 풍부한 양전하를 함유한다. 따라서, PEI의 양전하가 알려진 대로 세포질 침투를 증가시켜 뇌실하 영역 깊숙히 염색되지만, 뇌실하 영역의 상당히 많은 조직이 이미 사멸되어 영역에서 떨어져 나간것으로 보인다. 이는 양전하가 가져오는 양전하 스폰지 효과 (Proton sponge effect)로 인하여 세포와 조직독성을 증가시킨 것으로 추정된다 (도 6A).
As a result, in the case of ZAIS-PEI nanoparticles, PEI has abundant primary, secondary, and tertiary amine groups and attracts hydrogen ions under PBS or physiological buffer conditions to contain abundant positive charges. Thus, although the positive charge of PEI increases the cytoplasmic penetration as known, the subventricular area is deeply stained, but a considerable number of tissues in the subventricular area are already dead and appear to have disappeared from the area. It is believed that this increased cell and tissue toxicity due to the positive charge sponge effect (Positive Sponge effect) (Fig. 6A).

반면, ZAIS-MPA나노입자의 경우, ZAIS-MPA 나노입자의 표면에는 MPA의 카르복실기가 드러나 있고, 이의 PI (등전위 점)가 높아서 PBS나 생리완충조건에서는 수소이온의 이탈로 인한 음전하를 형성하지 않고 중성상태를 유지한다. 따라서, ZAIS-PEI나노입자에 비해 덜한 독성을 보였지만, 부분적으로 뇌실하 영역의 조직이 사멸되어 떨어져 나갔음을 확인할 수 있었다 (도 6B).
On the other hand, in the case of ZAIS-MPA nanoparticles, the carboxyl group of MPA is revealed on the surface of ZAIS-MPA nanoparticles and the PI (equipotential point) thereof is high, so that no negative charge is formed due to the release of hydrogen ion under PBS or physiological buffer conditions Maintain a neutral state. Thus, it was less toxic than the ZAIS-PEI nanoparticles, but it was confirmed that the tissue in the sub-ventricular region was partially killed (Fig. 6B).

이는 나노입자를 이용한 뇌세포의 형광염색을 위해서는 표면이 화학물질로 코팅되어 있는 것 보다 트립톤과 같은 생체물질을 이용하는 것이 독성의 정도를 획기적으로 줄일 수 있음을 나타낸다.
This indicates that the use of biomaterials such as tryptone can significantly reduce the degree of toxicity of fluorescent nanoparticles for fluorescence staining of brain cells, rather than coating the surface with chemicals.

<실험예 4> ZAIS-트립톤 복합체가 표지된 암세포를 뇌조직에 이식한 후 주변 미세환경 변화 추적Experimental Example 4 ZAIS-tryptone complex-labeled cancer cells were transplanted into brain tissue,

ZAIS-트립톤 복합체를 세포이식 (cell transplantation) 에 응용하기 위해 뇌종양 세포인 C6 세포 (ATCC, USA)에 표지한 후 쥐(mouse)의 뇌조직에 이식하고 주변의 미세한 변화를 관찰하는 실험을 수행하였다.
In order to apply the ZAIS-tryptone complex to cell transplantation, it was labeled with C6 tumor cell (ATCC, USA) and then transplanted into mouse brain tissue and observed microscopic changes around it Respectively.

구체적으로, C6 세포주는 혈청 세포배양액 (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin & streptomycin: Life technologies, USA)으로 섭씨 37도 5% CO₂ 세포 배양기 (Thermoscientific, HERAcell 150i CO2 incubator) 에서 배양하였다. 6 웰 세포용기 (SPL Life Science, 카탈로그번호 30006)에 동일 조건으로 옮겨 배양한 후, 무혈청 세포배양액 (DMEM, Life technologies, 카탈로그 번호 11965)에 용해되어 있는 100 ㎍/ml 농도의 ZAIS-트립톤 복합체 2 ml를 상기 6 웰 세포용기에 넣은 후 1~2시간 동안 CO₂ 세포 배양기에서 배양시켰다. ZAIS-트립톤 복합체 세포배양액을 6 웰 세포용기에서 제거하고 무혈청 세포배양액 (DMEM)으로 두 번 씻어준 후, 혈청 세포배양액 2 ml을 넣어주고 형광현미경 (Olympus IX81 inverted fluorescence microscope)으로 관찰하였다. 형광이미지는 345-460nm 파장 영역 FWHM 여기 필터 (excitation filter) / 475nm 색분리 필터 (dichroic mirror) / 600-650nm 파장영역 형광방출 필터 (bandpass filter)를 사용하여 얻었다 (도 7A).
Specifically, the C6 cell line was cultured in a 37 ° C 5% CO ₂ cell incubator (Thermoscientific, HERAcell 150i CO2 incubator) with serum cell culture medium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin and streptomycin: Life technologies, USA). (SPL Life Science, Catalog No. 30006) in the same conditions and then cultured in a serum-free cell culture medium (DMEM, Life technologies, catalog No. 11965) at a concentration of 100 μg / ml of ZAIS- 2 ml of the complex was placed in the 6-well cell container and incubated in a CO ₂ cell incubator for 1-2 hours. The ZAIS-tryptone complex cell culture medium was removed from the 6-well cell container and washed twice with serum-free cell culture medium (DMEM). Then, 2 ml of the serum cell culture medium was added and observed with a fluorescence microscope (Olympus IX81 inverted fluorescence microscope). Fluorescence images were obtained using a 345-460 nm wavelength region FWHM excitation filter / 475 nm dichroic mirror / 600-650 nm wavelength region bandpass filter (FIG. 7A).

ZAIS-트립톤 복합체가 C6 세포 내부에 표지된 것을 확인한 후, 트립신 단백질을 이용하여 ZAIS-트립톤 복합체가 포함된 C6세포를 6 웰 세포용기에서 분리시켜 모았다. 1x10⁶ 개의 ZAIS-트립톤 복합체@C6세포를 5 μl부피로 모든 후에 <실험예 2>에서 예시된 방법으로 뇌 조직에 주입하여 이식하였다 (transplantation) (도 7B).
After confirming that the ZAIS-tryptone complex was labeled inside the C6 cells, C6 cells containing the ZAIS-tryptone complex were harvested from 6-well cell containers using trypsin protein. 1x10 < ⁶ > ZAIS-tryptone complex < 6 > C6 cells were injected into brain tissue in a 5 [mu] l volume after the procedure described in Example 2 (FIG. 7B).

3~ 5일 후에 <실험예 2>에서 예시된 조직학적 방법 (histological method)과 동일한 방법으로 ZAIS-트립톤 복합체@C6세포가 이식된 뇌 부분과 이식되지 않은 반대편 부분을 대조군으로 얻었다. 상기 방법으로 얻은 절단된 뇌조직 시료는 PBS에 세척을 한 후 메탄올에 용해된 0.3% H₂O₂ 용액에 30분간 담가 두었다. PBS로 세척 후에 1% 소 혈청 알부민 (BSA, Bovine serum albumin) 과 1.5% 염소 혈청 (goat serum) 이 용해된 PBS 용액에 2 시간 동안 담가 두었다. 그 후 토끼에서 추출한 항-Iba1 항체를 (rabbit anti-Iba1 antibody) 1:1000으로 희석시킨 용액에 4℃ 에서 밤새 (overnight) 담가 두었다. 이 후에 조직 절편을 PBS로 다시 세척 후, 1:500으로 희석시킨 Alexa 488 유기형광 분자가 표지된, 염소에서 추출한 항-토끼 IgG 항체 (goat anti-rabbit IgG antibody) 용액에 2시간 동안 반응시켰다. 이 후에 <실험예 2>와 동일한 방법으로 형광 현미경용 시료로 만들어 관찰하였다.
After 3 to 5 days, the brain part to which the ZAIS-tryptone complex @ C6 cells were transplanted and the opposite part to which the ZAIS-tryptone complex was transplanted were obtained as a control in the same manner as the histological method exemplified in <Experimental Example 2>. The cleaved brain tissue samples obtained by the above method were washed in PBS and immersed in 0.3% H ₂ O ₂ solution in methanol for 30 minutes. After washing with PBS, the cells were immersed in PBS solution containing 1% bovine serum albumin (BSA) and 1.5% goat serum for 2 hours. Then, the anti-Iba1 antibody extracted from the rabbit was immersed in a solution diluted 1: 1000 (rabbit anti-Iba1 antibody) overnight at 4 ° C. The tissue sections were washed again with PBS and reacted for 2 hours with a goat anti-rabbit IgG antibody solution labeled with Alexa 488 organic fluorescent molecule diluted 1: 500. Thereafter, a sample for fluorescence microscopy was prepared in the same manner as in <Experimental Example 2>.

그 결과, 도 7A의 형광이미지(왼쪽)와 명시 야상 이미지 (bright-field image) - 형광이미지를 겹친 이미지 (오른쪽)를 통해, ZAIS-트립톤 복합체가 세포 이물 흡수 (endocytosis) 과정을 통해 C6 세포의 세포질 안으로 이동하여 표지되었음을 알 수 있었다. 도 7C는 Iba-1 은 뇌조직에서 면역작용과 대식작용에 관계하는 미세아교세포 (Microglia cell)에 대한 특이적인 바이오 마커 (biomarker)로서 형광 항체 이미지를 통해서 (초록색) 미세아교세포의 분포를 보여준다. 특히 외부에서 이식된 ZAIS-트립톤 복합체@C6세포 (도 7C, 붉은색) 주변에 Iba-1에 해당하는 초록색 형광이 집중되어 있는 것은 미세아교세포가 외부 물질이자 암세포인 ZAIS-트립톤 복합체@C6세포를 제거하기 위해 이동하여 대식작용을 하고 있음을 나타낸다. 이처럼 ZAIS-트립톤 복합체가 세포 이식에 대한 표지자 역할을 수행하도록 하여, 세포이동과 이식된 세포의 주변의 미세환경 변화를 추적, 관찰할 수 있는 중요한 수단으로서의 역할이 가능함을 확인할 수 있었다.
As a result, the ZAIS-tryptone complex was detected in the C6 cell (Fig. 7A) through the endocytosis process through the fluorescence image (left) in Fig. 7A and the bright- Of the cells in the cytoplasm. Figure 7C shows the distribution of microglial cells (green) through fluorescent antibody images as a specific biomarker for microglia cells related to immune and macrophage activities in brain tissue . In particular, the concentration of green fluorescence corresponding to Iba-1 around the externally implanted ZAIS-tryptone complex @ C6 cells (Fig. 7C, red) is due to the fact that the microglial cells are foreign substances and cancer cells, ZAIS- C6 cells, indicating that they are acting to move. Thus, it was confirmed that ZAIS-tryptone complex can serve as a marker for cell transplantation, and can serve as an important means for tracking and observing cell migration and microenvironmental changes around the transplanted cells.

<실험예 5> ZAIS-트립톤 복합체에 인체항체 (human IgG)를 부착시킨 후 아가로스 젤에서 이동패턴 분석<Experimental Example 5> Analysis of migration pattern in agarose gel after attaching human antibody (human IgG) to ZAIS-tryptone complex

본 발명자들은 티올 화합물로 코팅된 단위 ZAIS 나노입자를 20 mg/ml농도의 트립톤으로 코팅한 후, IgG항체와 화학적 연결체를 첨가하여 형성된 ZAIS-트립톤-항체 (IgG) 복합체와 ZAIS-트립톤 복합체, 그리고 ZAIS-MPA 나노입자에 IgG 항체를 첨가하여 부착한 ZAIS-항체 (IgG) 를 아가로스 젤에 전기영동시켜 각 나노입자 복합체의 크기 변화와 이동양상을 분석하였다.
The present inventors prepared ZAIS-tryptone-antibody (IgG) complexes and ZAIS-tryptone complexes prepared by coating a thiol compound-coated unit ZAIS nanoparticle with a 20 mg / ml tryptone and then adding an IgG antibody and a chemical linker Tone complexes, and ZAIS-antibody (IgG) attached to ZAIS-MPA nanoparticles with IgG antibody were electrophoresed on agarose gel to analyze the size and migration pattern of each nanoparticle complex.

구체적으로, <실시예 1>에서 제조된 MPA 코팅된 친수성 ZAIS 나노입자 [Zn_0.0Ag_0.3In_0.7)S₂] 50 μl에 1.26X PBS (phosphate-buffered saline) 190 μl를 첨가한 후, 1X PBS에 용해된 100 mg/ml 트립톤(BD Bioscience, 카탈로그 번호 211701)을 60 μl씩 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 반응에서 첨가된 트립톤의 최종농도는 20 mg/ml였고, 상온에서 30분 이상 반응하였다 (도 8의 1번 레인). 도 8의 2번 레인에는 MPA 코팅된 친수성 ZAIS 나노입자 50 μl에 1.29X PBS (phosphate-buffered saline) 175 μl를 첨가한 후, 1X PBS에 용해된 100 mg/ml 트립톤(BD Bioscience, 카탈로그 번호 211701)을 60 μl씩 첨가한 후, 10 mg/ml 인체항체 (human IgG) (Thermo Scientific, 카탈로그번호 31879) 15 μl와 링커를 첨가한 후 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 한편 대조군으로 MPA 코팅된 친수성 ZAIS 나노입자 50 μl에 1.21X PBS (phosphate-buffered saline) 235 μl를 첨가한 후 10 mg/ml 인체항체 (human IgG) (Thermo Scientific, 카탈로그번호 31879) 15 μl를 첨가한 후 상온에서 30분 동안 반응시켰다 (도 8의 3번 레인). <실험예 5>에서 사용된 PBS의 조성은 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄ 이며, 모든 반응 샘플들은 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 분석하였다. 각 레인의 ZAIS-트립톤/항체 복합체는 전기영동시 (-)극에서 (+)극 방향으로 이동한다.
Specifically, 190 μl of 1.26 × PBS (phosphate-buffered saline) was added to 50 μl of the MPA-coated hydrophilic ZAIS nanoparticles [Zn _0.0 Ag _0.3 In _0.7 ] S ₂ prepared in Example 1, (BD Bioscience, Cat. No. 211701) dissolved in 100 μl / well of a 100 μl aliquot was added thereto, followed by reaction at room temperature for 30 minutes. The final concentration of tryptone added in this reaction was 20 mg / ml, and the reaction was performed at room temperature for 30 minutes or longer (lane 1 in FIG. 8). 8, 175 μl of 1.29 × PBS (phosphate-buffered saline) was added to 50 μl of MPA-coated hydrophilic ZAIS nanoparticles, followed by 100 mg / ml tryptone dissolved in 1 × PBS (BD Bioscience, After adding 60 μl each, 15 μl of a 10 mg / ml human IgG (Thermo Scientific, Catalog No. 31879) and a linker were added and reacted at room temperature for 30 minutes. To the control, 50 μl of MPA-coated hydrophilic ZAIS nanoparticles was added with 235 μl of 1.21 × PBS (phosphate-buffered saline), followed by the addition of 15 μl of 10 mg / ml human IgG (Thermo Scientific, Catalog No. 31879) Followed by reaction at room temperature for 30 minutes (lane 3 in FIG. 8). The composition of PBS used in Experimental Example 5 was 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO ₄ and 2 mM KH ₂ PO _4. All reaction samples were analyzed by electrophoresis on 0.8% agarose gel Respectively. The ZAIS-tryptone / antibody complex in each lane migrates from the (-) pole to the (+) pole during electrophoresis.

그 결과, ZAIS-트립톤 복합체는 가장 긴 이동 거리를 보였고 (1번 레인), ZAIS-트립톤-IgG 복합체는 부착된 항체 (IgG) 로 인해 그 크기가 증가하여 ZAIS-트립톤 복합체에 비해 이동거리가 짧아졌다 (2번 레인). 반면 ZAIS-MPA-IgG 복합체의 경우에는 ZAIS-MPA 나노입자와 항체 (IgG)와의 연쇄 결합으로 인해 거대한 복합체를 이루고 그 크기가 생물학적 응용이 힘들정도로 커져 레인 입구에서 크게 이동하지 못하였다. 하지만 일부 ZAIS-MPA 나노입자 는 IgG와 연쇄 결합을 하지 않고 남아서, 작은 크기로 인해 전기영동시 ZAIS-트립톤 복합체와 함께 가장 긴 거리를 이동하였다 (3번 레인). 2번 레인의 경우 ZAIS-트립톤에 항체가 수용액상에 안정화된 복합체를 형성하여 전기영동상에 넓게 분포된 형태로 나타난다. 이는 항체가 가진 양전하성 성격과 각 ZAIS-트립톤 복합체 당 부착된 항체의 비율에 의해 나타나는 것으로 보여진다.
As a result, the ZAIS-tryptone complex showed the longest moving distance (lane 1) and the ZAIS-tryptone-IgG complex increased in size due to the attached antibody (IgG) The distance was shortened (lane 2). In contrast, ZAIS-MPA-IgG complexes formed large complexes due to the cascade of ZAIS-MPA nanoparticles and antibodies (IgG). However, some ZAIS-MPA nanoparticles remained without cascade linkage with IgG and, due to their small size, migrated the longest distance with the ZAIS-tryptone complex during electrophoresis (lane 3). In the case of lane 2, the antibody forms a stabilized complex on the aqueous phase of the ZAIS-tryptone, which is widely distributed on the electrophoresis. This appears to be due to the positivity of the antibody and the ratio of antibody attached per ZAIS-tryptone complex.

<실험예 6> ZAIS-트립톤-항체 복합체의 표적지향 세포 이미징Experimental Example 6: Targeted cell imaging of ZAIS-tryptone-antibody complex

ZAIS-트립톤-항체 복합체의 실질적 응용을 예시하기 위해 유방암 발병요인의 약 20% 를 차지한다고 알려진 막단백질 (membrane protein)인 HER-2를 인식하는 Herceptin 항체를 이용한 실험을 진행하였다.
In order to illustrate the practical application of the ZAIS-tryptone-antibody complex, experiments were carried out using a Herceptin antibody recognizing HER-2, a membrane protein known to account for about 20% of breast cancer risk factors.

구체적으로, HER-2 유전자 과다발현 유방암 세포인 HCC1954 (ATCC, USA)를 혈청 세포배양액 (RPMI1640 + 10% FBS + 1% penicillin & streptomycin: Life technologies, USA) 으로 섭씨 37도 5% CO₂ 세포 배양기 (Thermoscientific, HERAcell 150i CO2 incubator) 에서 배양하였다. 24 웰 세포용기 (SPL Life Science, 카탈로그번호 30024)에 HCC1954세포를 동일 조건에서 옮겨 배양한 후, 배양액을 모두 제거하고 무혈청 세포배양액 (RPMI 1640, Life technologies, 카탈로그 번호 11875) 으로 2회 세척 (wash) 후 같은 무혈청 세포배양액으로 교체하였다. Specifically, HER-2 gene over-expressing breast cancer cells, HCC1954 (ATCC, USA) in serum culture medium (RPMI1640 + 10% FBS + 1 % penicillin & streptomycin: Life technologies, USA) with 37 ° C 5% CO ₂ cell incubator (Thermoscientific, HERAcell 150i CO2 incubator). HCC1954 cells were transferred to a 24 well cell container (SPL Life Science, Catalog No. 30024) under the same conditions, and then the culture medium was removed and washed twice with serum-free cell culture medium (RPMI 1640, Life technologies, catalog No. 11875) wash, and replaced with the same serum-free cell culture medium.

<실험예 5>의 방법과 동일한 조건으로 제조한 ZAIS-트립톤과 Herceptin 복합체 20 μl를 무혈청 세포배양액 (RPMI 1640) 1 ml에 섞은 후 배양액이 제거된 상기 24 웰 세포용기에 넣은 후 30분간 CO₂ 세포 배양기에서 반응시켰다. ZAIS-트립톤-Herceptin 복합체 세포배양액을 24 웰 세포용기에서 제거한 후, 무혈청 세포배양액 으로(RPMI 1640) 두 번 씻어주었다. 그리고 같은 세포배양액 1ml을 넣어 준 후 형광현미경 (Olympus IX81 inverted fluorescence microscope)으로 관찰하였다. 형광이미지 관찰은 345-460nm 파장 영역 FWHM 여기 필터 (excitation filter) / 475nm 색분리 필터 (dichroic mirror) / 600-650nm 파장영역 형광방출 필터 (bandpass filter)에 의하여 진행되었다.
20 μl of ZAIS-tryptone and Herceptin complex prepared under the same conditions as in Experimental Example 5 were mixed with 1 ml of serum-free cell culture medium (RPMI 1640), placed in the 24-well cell container from which the culture medium had been removed, CO ₂ cell incubator. ZAIS-Tryptone-Herceptin complex cell culture was removed from the 24-well cell container and washed twice with serum-free cell culture medium (RPMI 1640). Then, 1 ml of the same cell culture was added and then observed with a fluorescence microscope (Olympus IX81 inverted fluorescence microscope). Fluorescence image observation was performed by a 345-460 nm wavelength region FWHM excitation filter / 475 nm dichroic mirror / 600-650 nm wavelength region bandpass filter.

그 결과, 형광 이미지 (도 9, 오른쪽)와 명시 야상 이미지 (bright-field image, 도 9 왼쪽)를 비교하면 HER-2를 과다발현한 HCC1954 유방암 세포에서 ZAIS의 형광 이미지가 나타나는 것을 볼 수 있었다. 특히 세포안으로 캡슐화되어서 이동하는 나노입자의 특성으로 인해 ZAIS-트립톤-Herceptin 복합체는 표면에서 HER-2 수용체와 결합하여 소포체 (Endoplasmic reticulum) 로 이동한 모습을 볼 수 있다. 상기 실험은 ZAIS에 부착된 항체, Herceptin의 특성을 보여주는 것으로, 항체와 ZAIS 나노 입자간 물리적 부착이 항체의 특성을 손상시키지 않는 것을 확인시켜 주었다.
As a result, a fluorescence image of ZAIS was observed in HCC1954 breast cancer cells overexpressing HER-2 by comparing the fluorescence image (FIG. 9, right) with the bright-field image (left side of FIG. 9). In particular, due to the nature of the nanoparticles that are encapsulated in the cells, the ZAIS-tryptone-herceptin complex can bind to the HER-2 receptor on the surface and migrate to the endoplasmic reticulum. These experiments show the character of the antibody, Herceptin, attached to ZAIS, confirming that the physical attachment between the antibody and ZAIS nanoparticles does not impair the properties of the antibody.

Claims

Is coated with a hydrophilic thiol (thiol) compounds, zinc-silver-indium-sulfide _{_{_{((Zn x Ag y In z}}} ) S 2) the composition of zinc luminescent nanoparticles and having a-silver-indium-sulfide ((Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ ) a core-shell structure comprising a shell surrounding the light emitting nanoparticle core, wherein the shell is selected from the group consisting of magnesium, calcium, strontium, barium, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, A metal selected from the group consisting of nickel, copper, zinc, gallium, germanium, yttrium, zirconium, molybdenum, ruthenium, silver, cadmium, indium, tin, platinum, gold, lead, lanthanum, cerium, prodeodmium, neodymium, , At least one metal ion selected from the group consisting of gadolinium, terbium, dysprosium, ytterbium, and lutetium, and
Zinc sulfide core-shell ((Zn _x Ag _y In _z ) S ₂ -ZnS) light emitting nanoparticles containing at least one anion selected from the group consisting of nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, arsenic, selenium and tellurium Zinc-silver-indium-sulfide, zinc-silver-indium-sulfide, zinc-silver-indium-sulfide, Zn-Ag-In-S, ZAIS) ZAIS-tryptone complex with tryptone bound to nanoparticles.

The ZAIS-tryptone complex according to claim 1, wherein the hydrophilic thiol compound is selected from the group consisting of MPA (mercaptopropionic acid), MAA (mercaptoacetic acid), and MSA (mercaptosuccinic acid).

The ZAIS-trip tone complex according to claim 1, wherein the excitation wavelength of the ZAIS-tryptone complex belongs to a visible light region.

delete

The ZAIS-tryptone complex according to claim 1, wherein the ZAIS-tryptone complex is for fluorescence staining, imaging, or movement tracking of one or more cells of the group consisting of brain cells, stem cells, blood cells, Complex.

The ZAIS-tryptone complex according to claim 1, wherein the antibody is further bound to the ZAIS-tryptone complex.

The ZAIS-tryptone complex according to claim 6, wherein the antibody is an antibody that specifically binds to a membrane protein of a cell selected from the group consisting of brain cells, stem cells, blood cells, or cancer cells.

(A) coating a hydrophilic thiol compound on zinc-silver-indium-sulfide (Zn-Ag-In-S, ZAIS) nanoparticles; And
(B) treating the ZAIS nanoparticles coated with the hydrophilic thiol compound with a tryptone to form a ZAIS-tryptone complex; and zinc-silver-indium-sulfide (Zn-Ag- In-S, ZAIS) nanoparticle-tryptone complex (ZAIS-tryptone complex).

The method of claim 8, further comprising the step of adding an antibody and a bifunctional chemical crosslinker to the ZAIS-tryptone complex of step (B) to bind the ZAIS-tryptone complex and the antibody. Tone composite.

9. The method of claim 8, wherein said step (B) treats a tryptone at a concentration of 20 to 40 mg / ml.