KR101642776B1

KR101642776B1 - Antibiotic composition including stem cell

Info

Publication number: KR101642776B1
Application number: KR1020140042454A
Authority: KR
Inventors: 차상호; 김찬란; 박용호; 장기윤; 송재영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-04-09
Filing date: 2014-04-09
Publication date: 2016-07-29
Also published as: KR20150117345A

Abstract

본 발명은 줄기세포를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 줄기세포를 포함하는 조성물 또는 세포치료제는 염증성 사이토카인의 초기 증가를 유도하고, iNOS의 발현 및 상기 큰 대식세포 내의 일산화질소의 합성을 증가시켜 항생 효과를 가지고, 폐질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 염증성 질환에 대한 원천기술을 제공해 줄 수 있어 의약 산업에서 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a composition comprising stem cells, wherein a composition or a cell treatment agent containing stem cells of the present invention induces an initial increase of inflammatory cytokines, and the expression of iNOS and the synthesis of nitrogen monoxide in the large macrophages Which has antibiotic effect, can prevent or treat pulmonary diseases, and can provide a source technology for inflammatory diseases and can be usefully used in the pharmaceutical industry.

Description

ANTIBIOTIC COMPOSITION INCLUDING STEM CELL [0002]

본 발명은 줄기세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition comprising stem cells.

마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)는 M. chelonae, M. fortuitum, M. smegmatis 등과 함께 비결핵 항산균(Nontuberculous mycobacteria, NTM)에 속하는 신속 발육 균(rapidly growing mycobacteria, RGM) 중 하나로, 과거에는 주로 외상이나 이물질의 주입 등에 의한 국소적인 피부, 연조직 감염에 대한 증례가 주로 보고되었다. 하지만 최근에는 M. abscessus에 의한 폐질환이 RGM의 70 ~ 80%를 차지할 만큼 그 중요성이 부각되고 있다. 특이하게도 M. abscessus에 의한 폐질환은 미국과 일본에서는 매우 드물게 보고되고 있지만, 국내에서는 전체 NTM에 의한 폐질환 중 마이코박테리움 아비움 콤플렉스(Mycobacterium avium complex, MAC) 다음으로 많은 비율을 차지하고 있다. 국내에서 NTM 폐질환 중, M. abscessus가 차지하는 비중이 높음에도 불구하고 외국과 마찬가지로 아직 M. abscessus의 병원성과 치료에 대한 연구는 부족한 현실이다. 뿐만 아니라 다른 폐질환과 달리 M. abscessus 감염 환자의 치료 종료 후, 재발률 및 장기 경과에 대한 연구는 매우 드물다. 이러한 M. abscessus는 대부분의 항생제와 1차 항결핵제에 내성을 보인다. 다만 클라시스로마이신(clarithromycin)과 아미카신(amikacin), 세폭시틴(cefoxitin)에 대해서는 감수성을 나타내지만, 이러한 매크로라이드(macrolide)계 항생제를 경구용 항생제로 장기간 단독 치료하면, 유도내성의 빈도가 높아진다. 최근 erm 유전자의 존재가 확인되면서 클라시스로마이신에 대한 유도내성이 증명되었다. 미국흉부학회와 미국감염학회는 클라시스로마이신 혹은 아지스로마이신(azithromycin)을 아미카신(amikacin), 세폭시틴(cefoxitin), 이미페넴(imipenem) 등의 정주용 항생제와 함께 2 ~ 4개월 동안 사용할 것을 권장하고 있다. 그러나 정주용 항생제를 수 주에서 수 개월 병합 치료하면 임상적, 방사선학적 호전은 보이지만 비용과 합병증 등의 문제가 발생하고, 치료 기간을 연장하더라도 균음전에 효과가 있는지에 대해서는 아직까지 확실하게 입증되지 않았다. 이 외에도 새로운 항생제를 도입하여 M. abscessus 폐질환의 치료를 시도하고 있으며, 그 중 혐기성 균 치료에 효과적인 메트로니다졸(metronidazole), 나병 치료에 사용되는 클로파지민(clofazimine), 다제내성균에 감수성을 보이는 리네졸리드(linezolid) 와 티게사이클린(tigecycline)은 M. abscessus에 대해 시험관 내 약제 감수성 검사와 큰대식세포 내 감염 실험에서 우수한 항균력이 나타났으나 현재까지 실제 임상적용 연구는 매우 미미한 실정이다. Mycobacterium abscessus is one of rapidly growing mycobacteria (RGM) belonging to Nontuberculous mycobacteria (NTM) along with M. chelonae, M. fortuitum, M. smegmatis , In the past, cases of localized skin and soft tissue infections caused mainly by trauma or foreign matter injection were reported. Recently, however, the importance of M. abscessus pulmonary disease has been emphasized so that it accounts for 70 ~ 80% of RGM. In particular, M. abscessus -induced pulmonary disease is very rarely reported in the United States and Japan, but in Korea, it accounts for a large proportion of the lung disease caused by the whole NTM, followed by the Mycobacterium avium complex (MAC) . Despite the high proportion of M. abscessus in NTM lung disease in Korea, there is still a lack of research on the pathogenicity and treatment of M. abscessus as in other countries. In addition, unlike other pulmonary diseases, studies of recurrence and long-term follow-up after the end of treatment for M. abscessus infections are very rare. M. abscessus is resistant to most antibiotics and first-line anti-tuberculosis agents. Although susceptibility to clarithromycin, amikacin and cefoxitin is shown, long-term monotherapy of these macrolide antibiotics with oral antibiotics leads to inducible resistance The frequency increases. Recently, the presence of the erm gene has been confirmed, demonstrating inducible resistance to clathiomycin. The American Thoracic Society and the American Society of Infectious Diseases (NSAID) have used clathromycin or azithromycin for 2 to 4 months with amixacin, cefoxitin, and imipenem . However, the combination of antibiotics for several weeks and several months has improved clinical and radiological results, but it has not yet been proven whether it is cost effective or complicated, . In addition, new antibiotics have been introduced to treat M. abscessus pulmonary disease. Metronidazole, clofazimine, which is effective in treating anaerobic bacteria, and clofazimine, which is used to treat leprosy, Linezolid and tigecycline exhibited excellent antimicrobial activity against M. abscessus in in vitro drug susceptibility test and RDA in infectious phagocytic infestation.

따라서, 상기 문제를 해결하기 위해서, 항생제 내성이 없고, 기존의 항생제를 대체할 수 있는 항생제에 대한 연구가 필요하다.Therefore, in order to solve the above problem, it is necessary to study antibiotics which can replace conventional antibiotics without antibiotic resistance.

본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 항생 조성물, 폐질환 예방 또는 치료용 조성물 및 항생용 세포치료제에 관한 것이다.The present invention relates to an antibiotic composition comprising stem cells as an active ingredient, a composition for preventing or treating pulmonary disease, and an anticancer cell therapeutic agent.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 항생 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides an antibiotic composition comprising stem cells as an active ingredient.

또한 본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 폐질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary disease, which comprises stem cells as an active ingredient.

또한 본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 항생용 세포치료제를 제공한다. The present invention also provides an antibiotic cell therapeutic agent comprising stem cells as an active ingredient.

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포 일 수 있고, 또한, 뼈(compact bone), 골수(bone marrow), 지방(adipose tissue), 제대혈(umbilical cord blood), 제대조직(umbilical cord matrix), 태반(placenta), 귀(ear), 폐(lung), 피부(skin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 중간엽 줄기세포 일 수 있다. The stem cell may be a mesenchymal stem cell, and may also be a bone, a bone marrow, an adipose tissue, an umbilical cord blood, an umbilical cord matrix, a placenta ), Ear, lung, skin, and combinations thereof. The term " mesenchymal stem cell "

상기 조성물 또는 세포치료제는 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.)으로부터 선택된 1종 이상의 미생물에 대한 항생 활성을 갖는 것 일 수 있다. 또한, 상기 폐질환은 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.)으로부터 선택된 1종 이상의 미생물의 감염에 의하여 유발된 것 일 수 있다. The composition or the cell therapy agent may have an antibiotic activity against at least one microorganism selected from the genus Mycobacterium sp. In addition, the pulmonary disease may be caused by infection of one or more microorganisms selected from the genus Mycobacterium sp. ( Mycobacterium sp.).

상기 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.) 미생물은 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 폴튜튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. The Mycobacterium sp. Microorganisms include Mycobacterium abscessus , M. chelonae , M. fortuitum , Mycobacterium sp., Mycobacterium sp. M. smegmatis , and a combination thereof.

상기 배양물은 상기 줄기세포의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. The culture may be any one selected from the group consisting of a culture of the stem cells, a concentrate of the culture, a dried product of the culture, and a combination thereof.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명자는 중간엽 줄기세포를 이용한 항생제 효능을 동물감염 모델을 이용하여 확인하였고, 폐렴균에 대한 중간엽줄기세포를 이용한 치료에서 염증성 사이토카인의 변화, 폐렴균에 대한 중간엽줄기세포를 이용한 치료에서 염증성 면역세포의 증가에 대한 치료적 의의를 확인하여 본 발명을 완성 하였다. In order to solve the above problems, the present inventors confirmed the antibiotic efficacy using mesenchymal stem cells using an animal infectious model. In the treatment using mesenchymal stem cells for pneumococci, changes in inflammatory cytokines, The present invention has been completed upon confirming the therapeutic significance of the increase of inflammatory immune cells in the treatment using mesenchymal stem cells.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 줄기세포(stem cell)란 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 미분화 세포로, 배아줄기세포와 성체줄기세포를 모두 포함하는 의미이고, 일 예로 뼈(compact bone), 골수(bone marrow), 지방(adipose tissue), 제대혈(umbilical cord blood), 귀(ear), 폐(lung), 피부(skin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래 것일 수 있다. 또한 상기 줄기세포는 줄기세포 자체, 상기 줄기세포의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물 또는 농축물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. As used herein, unless otherwise specified, a stem cell refers to a cell capable of differentiating into various types of body tissues, that is, an undifferentiated cell, including embryonic stem cells and adult stem cells, For example, selected from the group consisting of a compact bone, a bone marrow, an adipose tissue, an umbilical cord blood, an ear, a lung, a skin, May be derived from either one. The stem cells may be any one selected from the group consisting of stem cells themselves, cultures of the stem cells, concentrates of the cultures, cultures or concentrates of the cultures, and combinations thereof.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 항생(antibiosis)은 다른 미생물의 생육 또는 발육을 저해시키는 작용을 의미하고, 항균을 포함한다.Unless otherwise specified in the present specification, antibiosis means an action that inhibits growth or development of other microorganisms, and includes antibacterial activity.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 배양물이란 특정 미생물 또는 세포를 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 상기 특정 미생물 또는 세포를 포함하는 배양물 또는 상기 미생물 또는 세포를 제거한 배양물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 배양물, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물 등, 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 상기 제형은 액체 또는 고체일 수 있다.As used herein, the term "culture" means a culture of a specific microorganism or cell in a culture medium or a culture medium, and the culture may be a culture containing the specific microorganism or cell, a culture obtained by removing the microorganism or cell It may contain water. The culture is not limited to a culture, a concentrate of the culture, a dried culture, or the like. For example, the formulation may be a liquid or a solid.

상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여, 배양대상 즉, 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.
In order to cultivate a specific microorganism, the medium may include a nutrient required for a cultured object, that is, a microorganism to be a cultured material, and a substance for a special purpose may be further added and mixed. The medium is also referred to as an incubator or a culture medium, and is a concept including both natural medium, synthetic medium and selective medium.

이하 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 항염 조성물, 항생 조성물 및 폐질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 중 어느 하나 일 수 있다. 또한 상기 항생 조성물은 항균 조성물로도 표현될 수 있다.The present invention relates to a composition comprising stem cells as an active ingredient. The composition may be any one of a anti-inflammatory composition, an antibiotic composition, and a pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary disease. The antibiotic composition may also be represented by an antimicrobial composition.

또한 본 발명은 항생용 세포치료제에 관한 것이다. 상기 세포치료제는 줄기세포를 유효성분으로 포함한다. 상기 항생용 세포치료제는 유효성분으로 세포를 포함하는 제제를 의미하는 것으로 항생 효과를 나타냄으로써 질병의 치료, 개선 또는 예방이 가능하다. The present invention also relates to an antibiotic cell therapeutic agent. The cell therapy agent includes stem cells as an active ingredient. The antibiotic cell therapeutic agent means an agent containing cells as an active ingredient and exhibits an antibiotic effect, thereby treating, ameliorating or preventing diseases.

상기 줄기세포(stem cell)란 미분화 세포로서, 오랜 기간 동안 분열을 하고, 자기 갱신(self-renewal)을 할 수 있으며, 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 다형성능을 가지는 세포를 의미한다. 상기 줄기세포는 배아 줄기세포와 성체 줄기세포를 모두 포함하는 의미이다. The stem cell is an undifferentiated cell that can divide for a long period of time and self-renewal, and when given a condition, a cell having polymorphism capable of differentiating into various types of cells it means. The stem cells include both embryonic stem cells and adult stem cells.

상기 줄기세포는 바람직하게는 성체 줄기세포 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 중간엽 줄기세포 일 수 있으며, 뼈(compact bone), 골수(bone marrow), 지방(adipose tissue), 제대혈(umbilical cord blood), 제대조직(umbilical cord matrix), 태반(placenta), 귀(ear), 폐(lung), 피부(skin), 혈액, 간장, 피부, 신경, 부신, 자궁, 위장관 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로부터 유래된 중간엽 줄기세포 일 수 있다. Preferably, the stem cell is an adult stem cell, more preferably a mesenchymal stem cell. The stem cell may be a compact bone, a bone marrow, an adipose tissue, an umbilical cord blood, , The umbilical cord matrix, the placenta, the ear, the lung, the skin, the blood, the liver, the skin, the nerves, the adrenal gland, the uterus, the gastrointestinal tract, And may be mesenchymal stem cells derived from any selected one.

상기 줄기세포는 시판되는 줄기세포 또는 생체 조직으로부터 분리한 것을 이용할 수 있다.The stem cells may be those isolated from commercially available stem cells or living tissues.

상기 줄기세포는 줄기세포 자체 또는 줄기세포의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물 또는 농축물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. The stem cells may be any one selected from the group consisting of stem cells themselves or cultures of stem cells, concentrates of the cultures, cultures or concentrates thereof, and combinations thereof.

상기 줄기세포 배양을 위한 배지는 배양체가 되는 줄기세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것은 모두 사용할 수 있고, 특수한 목적을 위한 물질이 추가적으로 첨가되어 혼합된 것도 사용할 수 있다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 제한 없이 사용할 수 있고, 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지 일 예로, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM-High Glucose, DMEM/F12 Glutamax, Advanced DMEM, DMEM-Low Glucose, MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 이러한 보조성분으로는 일 예로, 태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G (Penicillin G), 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate) 및 겐타마이신(gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B(amphotericin B) 및 니스타틴(nystatin) 등의 항진균제(antifungal agent) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 어느 하나일 수 있다. The culture medium for the stem cell culture may be any medium containing nutrients required for stem cells to be cultured, or may be supplemented with additional substances for special purposes. The medium commonly used in the field to which the present invention belongs can be used without limitation, can be artificially synthesized, and commercially produced medium can be used. Examples of commercially available media include DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM-High Glucose, DMEM / F12 Glutamax, Advanced DMEM, DMEM-Low Glucose, Minimal Essential Medium, BME (Basal Medium Eagle) , F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) and Isocove's Modified Dulbecco's Medium. In addition, one or more auxiliary components may be added to the cell culture medium, if necessary. Examples of such auxiliary components include sera such as fetal calf, horse or human, and penicillin G Antibiotics such as penicillin G, streptomycin sulfate and gentamycin, antifungal agents such as amphotericin B and nystatin, and combinations thereof. And may be any one of the selected components.

상기 항생 효과는 바람직하게는 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.)으로부터 선택된 1종 이상의 미생물에 대한 것 일 수 있다. The antibiotic effect may preferably be for one or more microorganisms selected from the genus Mycobacterium sp. ( Mycobacterium sp.).

상기 폐질환은 바람직하게는 감염성 폐질환 일 수 있고, 상기 감염성 폐질환은 일 예로 결핵, 폐렴 및 폐결절 일 수 있다. 또한 상기 폐질환은 더욱 바람직하게는 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.)으로부터 선택된 1종 이상의 미생물의 감염에 의한 폐질환 일 수 있다. The lung disease may preferably be an infectious lung disease, and the infectious lung disease may be, for example, tuberculosis, pneumonia and pulmonary nodule. The lung disease may more preferably be a pulmonary disease caused by infection of at least one microorganism selected from the genus Mycobacterium sp.

상기 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.) 미생물은 바람직하게는 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 폴튜튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 가장 바람직하게는 마이코박테리움 압세수스 일 수 있다. The Mycobacterium sp. Microorganism is preferably selected from the group consisting of Mycobacterium abscessus , M. chelonae , M. fortuitum < RTI ID = 0.0 > ), M. smegmatis , and combinations thereof, and most preferably may be M. tuberculosis .

상기 항생 효과, 또는 폐질환의 치료 또는 예방은, 구체적으로 줄기세포에 의하여 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.)으로부터 선택된 1종 이상의 미생물의 생육 또는 생장을 저해됨으로써, 상기 미생물에 의한 병증의 예방 또는 감소에 의한 치료 효과를 갖는 것을 의미한다. 이는 만성폐질환과 같은 폐의 손상에 의한 질환을 치료하는 것과 상이하게, 폐 감염을 일으키는 미생물에 대한 항균활성에 의한 것으로, 본 발명의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 경우 미생물의 감염에 의한 폐질환을 우수하게 개선, 예방 또는 치료할 수 있다. The antibiotic effect or the treatment or prevention of lung disease specifically inhibits the growth or growth of one or more microorganisms selected from the genus Mycobacterium sp. By stem cells, thereby preventing the pathogenesis of the microorganism Or reduction in the number of patients. This is due to the antimicrobial activity against microorganisms causing lung infections, as opposed to treating diseases caused by lung damage such as chronic lung disease. In the case of a composition comprising the stem cells of the present invention as an active ingredient, Can be excellently improved, prevented or treated.

상기 마이코 박테리움 속 미생물의 감염 또는 이에 의한 폐질환에 대하여 본 발명의 줄기세포를 포함하는 조성물 또는 세포치료제를 처리하는 경우, 항생제 내성에 따른 부작용의 영향을 받지 않고, 장기적으로 투여가 가능하며, 효과적으로 항생 효과를 나타내는바, 완치율을 높일 수 있어, 다른 폐질환과 달리 상기 미생물의 경우 항생제 내성 및 1차 항결핵제 내성이 있고, 치료 종료 후 재발률이 높아서 완치가 어려웠던 문제를 해결 할 수 있는 효과가 있다. In the case of treating a composition comprising a stem cell of the present invention or a cell treatment agent against the infection of the microorganism of the genus Mycobacterium or the pulmonary disease caused by the microorganism of the genus Mycobacterium, the composition can be administered over a long period of time without being influenced by side effects due to antibiotic resistance, The antibiotic effect can be improved and the cure rate can be increased. Thus, unlike the other lung diseases, the microorganism has an antibiotic resistance and a first anti-tuberculosis resistance, and has a high recurrence rate after completion of treatment, .

본 발명의 일 실시예에서 상기 줄기세포를 포함하는 조성물 또는 세포치료제는 염증성 사이토카인의 초기 증가를 유도하고, iNOS의 발현 및 상기 큰 대식세포 내의 일산화질소의 합성을 증가시켜 항생 효과를 나타냄을 가짐을 확인하였다. 또한, 항생제 내성을 유발하지 않고, 인체에서 분리된 줄기세포를 원료로 하는 것이므로, 독성이 적어 부작용의 문제가 없는 장점이 있다. In one embodiment of the present invention, the stem cell-containing composition or cell therapy agent induces an initial increase of inflammatory cytokine and exhibits an antibiotic effect by increasing the expression of iNOS and the synthesis of nitrogen monoxide in the large macrophages Respectively. In addition, since stem cells isolated from the human body are used as raw materials without inducing antibiotic resistance, there is an advantage that there is no problem of side effects due to low toxicity.

상기 조성물은 각각의 조성물 총 중량에 대하여 상기 줄기세포를 유효성분으로 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 상기 항생 조성물 또는 약학적 조성물의 각각의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다. 또한 상기 세포치료제도 치료제 전체 중챵에 대하여 상기 줄기세포를 유효성분으로 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 그 목적에 따라서 유효성분의 함량을 조절할 수 있다.The composition may contain 0.001 to 99.99% by weight, preferably 0.1 to 99% by weight, of the stem cell as an active ingredient, based on the total weight of each composition, and the method of using the antibiotic composition or the pharmaceutical composition, The content of the active ingredient can be appropriately controlled depending on the purpose of use. The cell treatment agent may also contain 0.001 to 99.99% by weight, preferably 0.1 to 99% by weight, of the stem cell as an effective ingredient with respect to the whole mesenchymal drug, and the content of the effective ingredient can be controlled according to the purpose.

상기 조성물 또는 세포치료제는 인간을 포함하는 동물에 직접 적용되어 항생 활성 및/또는 폐질환 치료 활성을 나타낼 수 있고, 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 꿩 또는 닭 등의 가금류를 포함하는 조류 또는 인간, 돼지, 소, 염소 등의 포유류 일 수 있다.The composition or the cell therapeutic agent may be directly applied to an animal including a human to exhibit an antibiotic activity and / or a therapeutic activity for lung disease, and the animal may be a bird corresponding to a plant, such as a pheasant or a bird, Human, pig, cattle, goat, and the like.

상기 조성물 또는 세포치료제는 상기 유효성분 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류, 미네랄류 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함할 수 있다.The composition or the cell therapy agent may further include any one selected from the group consisting of carbohydrates, proteins, lipids, vitamins, minerals, and combinations thereof, in addition to the active ingredients.

상기 당질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적절히 선택될 수 있고, 일예로 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비타민류는 특별한 제한은 없으며, 상기 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. The saccharide may be appropriately selected according to the purpose and use of the saccharide. Examples of the saccharide include honey, dextrin, sucrose, palatinose, glucose, fructose, starch syrup, sugar alcohol, sorbitol, xylitol, maltitol, But is not limited thereto. The protein may be selected depending on the purpose and use of the protein. Examples of the protein include milk-derived proteins such as casein and whey protein, soybean proteins, animal-derived enzymes such as trypsin and pepsin And hydrolysates by neutrase and alkylase, but are not particularly limited thereto. The lipid may be selected depending on the purpose and use of the lipid. For example, the first lipid may be selected from saturated fatty acids, sunflower oil containing polyunsaturated fatty acids, rapeseed oil, olive oil, safflower oil, corn oil , A variety of plant-derived fats such as soybean oil, palm oil and palm oil, middle-chain fatty acid, EPA, DHA, soybean-derived phospholipids and milk-derived phospholipids. The above-mentioned vitamins are not particularly limited, and the minerals may be appropriately selected depending on the purpose and use of the minerals. Examples thereof include potassium phosphate, potassium carbonate, potassium chloride, sodium chloride, calcium lactate, calcium gluconate, calcium pantothenate, , Magnesium chloride, ferrous sulfate, sodium hydrogencarbonate, but is not particularly limited thereto.

상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항진균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%일 수 있다.The saccharide, protein, lipid, vitamins, and minerals may be contained in the composition as long as the antifungal property of the composition is maintained, and the content of the saccharide, protein, lipid, vitamins and minerals is not limited as long as antimicrobial activity is maintained , Preferably 0.1 to 15% by weight, preferably 0.5 to 10% by weight, based on the total composition.

상기 세포치료제는 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라, 목적에 적합한 제형을 갖는 제제 일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. The cell therapeutic agent may be an agent having a formulation suitable for the purpose according to a conventional method in the pharmaceutical field. In addition, the composition may be formulated into a unit dosage form suitable for administration to a patient in the body according to a conventional method in the pharmaceutical field.

상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 항생 효과를 나타낼 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제형이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다.Such formulations include effective doses that can exhibit an antibiotic effect by one or several doses. As formulations suitable for this purpose, injectable forms such as injectable ampoules are preferred as parenteral dosage forms. The injectable ampoule may be mixed with an injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, mannitol, and Ringer's solution may be used as the injection solution.

상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용 가능한 통상의 불활성 담체, 일 예로, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.In addition to the above-mentioned active ingredients, the pharmaceutical preparations may contain one or more pharmaceutically acceptable conventional inert carriers, for example, a preservative, an anhydrous agent, a solubilizing agent or a stabilizer in the case of an injection, Base, excipient, lubricant or preservative, and the like.

이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 흉부 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다.The thus-prepared composition or pharmaceutical preparation of the present invention can be administered in the form of a mixture with other stem cells used for transplantation and other uses, or a mixture thereof with such stem cells, using the administration methods commonly used in the art . In addition, the above-mentioned administration is both non-surgical administration using a catheter and surgical administration such as implantation or transplantation after chest incision, but a non-surgical administration method using a catheter is more preferable.

상기 조성물의 유효성분인 중간엽 줄기세포 배양액의 1일 투여량은 배양액 1 ml에 대하여 중간엽 줄기세포를 1.0 x 10¹내지 1.0 x 10¹⁰ cell로 포함하는 것(cfu/ml)을 0.001 내지 1000ml/kg(체중)으로 투여 될 수 있다. 또한 중간엽 줄기세포를 투여하는 경우, 1.0 x 10¹내지 1.0 x 10¹⁰ cell/kg(체중)으로 투여할 수 있고, 투여 대상이 마우스 인 경우에는 바람직하게 1.0 x 10⁴내지 5.0 x 10⁵ cell/mouse로 투여 될 수 있다. 상기 1일 투여량은 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 상기 투여개체가 상이한 경우, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 투여개체의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정될 수 있다. The daily dose of the mesenchymal stem cell culture solution, which is an effective ingredient of the composition, is in the range of 0.001 to 1000 ml (cfu / ml) containing 1.0 x 10 ^l to 1.0 x 10 ¹⁰ cells of mesenchymal stem cells per 1 ml of the culture medium / kg (body weight). When the mesenchymal stem cells are administered, they can be administered at a dose of 1.0 x 10 ¹ to 1.0 x 10 ¹⁰ cells / kg (body weight). When the subject is a mouse, 1.0 x 10 ⁴ to 5.0 x 10 ⁵ cells / mouse. < / RTI > The daily dose may be administered in single or divided doses. In addition, when the administration subject is different, the actual dosage of the active ingredient may be determined in view of various factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the weight of the subject, age and sex.

또한, 본 발명의 항생 조성물은 동물 사료 첨가용 조성물 형태로 제공될 수 있다. 상기 줄기세포는 동물에서의 세균 감염성 질환의 예방 또는 개선 용도의 동물사료 첨가제로 사용될 수 있다. 상기 동물 사료 첨가용 조성물에 함유되는 유효성분인 줄기세포의 양은 크게 한정되지 않으나, 동물에서 상기 세균에 의한 감염성 질환을 예방 또는 개선하기에 적합한 양으로 포함될 수 있다. 상기 동물 사료 첨가용 조성물 에서는 유효성분 이외에 보조성분을 더 포함할 수 있고, 이는 그 종류에 제한되지 않고 통상적으로 이용되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 동물 사료 첨가용 조성물은 동물에 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 선택되는 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한 동물 사료에 직접 혼합하거나, 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 줄기세포가 포함된 동물 사료용 첨가용 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 바에 따라 단독 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.In addition, the antibiotic composition of the present invention can be provided in the form of a composition for animal feed addition. The stem cells can be used as animal feed additives for the prevention or improvement of bacterial infectious diseases in animals. The amount of the stem cells which is an effective ingredient contained in the composition for animal feed addition is not particularly limited, but may be included in an amount suitable for preventing or ameliorating an infectious disease caused by the bacterium in an animal. The composition for animal feed addition may further contain an auxiliary component in addition to the active component, and may include components that are commonly used without limitation. The composition for animal feed addition may be administered alone in combination with other feed additives that are administered to animals or selected from edible carriers. It can also be mixed directly with animal feed, or separately in feed, in separate oral formulations. The animal feed additive composition containing the stem cells of the present invention can be used alone or in divided daily intakes as is known in the art.

새로운 항생제의 발굴, 효과 검색, 생체 안정성, 유효성, 치료 효율 등을 확인하기 위해서는 많은 시간과 비용이 필요하지만, 본 발명의 줄기세포를 포함하는 조성물 또는 세균치료제는 특정한 병원균 만을 타겟으로 하는 항생제보다 넓은 범위의 염증성 질환을 조절할 수 있고, 항생제 내성을 유발하지 않으며, 인체에서 분리된 줄기세포를 원료로 하는 것이므로, 독성이 적어 부작용의 문제가 없는 장점이 있다.Although it takes a lot of time and cost to identify new antibiotics, search for effects, biostability, efficacy, treatment efficiency, etc., the composition or bacterium therapeutic agent containing the stem cells of the present invention is broader than antibiotics targeting only specific pathogens The present invention has the advantage that there is no problem of side effects because the stem cells isolated from the human body are used as raw materials because they can control the inflammatory diseases of the range and do not cause antibiotic resistance.

본 발명의 줄기세포를 포함하는 조성물 또는 세포치료제는 염증성 사이토카인의 초기 증가를 유도하고, iNOS의 발현 및 상기 큰 대식세포 내의 일산화질소의 합성을 증가시켜 항생 효과를 가지고, 염증성 폐질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 염증성 질환에 대한 원천기술을 제공해 줄 수 있어 의약 산업에서 유용하게 사용될 수 있다. The composition or cell treatment agent containing the stem cells of the present invention induces an initial increase of inflammatory cytokines and has an antibiotic effect by increasing the expression of iNOS and the synthesis of nitrogen monoxide in the large macrophages to prevent or prevent inflammatory lung diseases Which can be used in the pharmaceutical industry because it can provide the source technology for inflammatory diseases.

도 1은 중간엽 줄기세포를 나타내는 도로, 도 1a는 생쥐 뼈 혹은 골수에서 유래된 다능성 중간엽 줄기세포를 보여주는 도이고, 도 1b는 순수하게 확립된 중간엽 줄기세포에서만 특이적으로 보이는 중간엽 줄기세포의 특징적 생물지표(CD marker)를 나타내는 도이며, 도 1c는 다양한 분화방법을 이용하여 본 발명에 사용된 동물 유래 중간엽 줄기세포의 분화능을 증명하고자 나타낸 중간엽 줄기세포의 분화를 나타내는 도이다.
도 2a는 폐렴균 중 하나인 M. abscessus를 생쥐에 감염시킨 후, 중간엽 줄기세포를 처리하여 생쥐의 생존률을 측정한 그래프이다.
도 2b는 중간엽 줄기세포의 항생능을 확인하기 위해 M. abscessus 감염 후 중간엽 줄기세포를 처리하고 4일 후, 생쥐의 폐에 존재하는 세균수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 그래프의 가로축은 폐(lung)에서 대조군(control)과 폐렴균 감염군(M. abscessus)을 나타내고, 그래프의 세로축은 각 조직에 존재하는 세균수(CFU)를 나타낸다.
도 2c는 중간엽 줄기세포의 항생능의 기전을 확인하기 위해 사이토카인을 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 중간엽 줄기세포의 항생능의 기전에 관여하는 염증성 세포를 유세포 분석기(Flow cytometer)를 통해 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 중간엽 줄기세포의 항생능의 기전을 확인하기 위해 큰대식세포내 M. abscessus 를 감염시킨 후 중간엽 줄기세포를 다양한 방법으로 처리 한 후 세포내 성장을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4a는 IFN-γ없는 상태에서 중간엽 줄기세포의 큰대식세포 내 균수 조절의 결과를 나타내고, 도 4b는 IFN-γ 10 ng/ml로 존재하는 경우, 중간엽 줄기세포의 큰대식세포 내 균수 조절의 결과를 나타낸다.
도 5는 자극에 의한 중간엽 줄기세포으 사이토카인 분석 결과를 나타내는 도로, A는 중간엽 줄기세포의 항생능의 기전을 분석하기 위해 큰대식세포내 M. abscessus 를 감염시킨 후 중간엽 줄기세포를 다양한 방법으로 처리 한 후 관련 사이토카인을 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, B는 LPS 자극에 대한 중간엽 줄기세포의 영향을 분석한 그림이다.
도 6은 중간엽 줄기세포의 항생능의 중요 작용 물질로 nitric oxide의 분비 분석한 그래프이다.
도 7은 M. abscessus 감염된 큰대식세포 내에서 중간엽 줄기세포에 의한 nitric oxide synthesis(iNOS) 합성증가 및 이에 따른 nitric oxide 의 생성을 확인한 도이다.
도 8은 중간엽 줄기세포와 큰대식세포내 상호작용을 분석한 그래프이다. A에서 가로축은 배양물의 혼합농도를 나타내는 것으로 중간엽 줄기세포의 배양물과 감염된(검은색) 또는 감염되지 않은(흰색) 대식세포 배양물을 1 : 10 및 1 : 5의 부피비로 각각 혼합한 것을 나타낸다. B에서 그래프의 가로축은 순서대로 감염되지 않은 대식세포(M), 감연된 대식세포(Infected M), 감염되지 않은 대식세포와 줄기세포 배양물(M +MSC)의 혼합 및 감염된 대식세포와 줄기세포 배양물(Infected M +MSC)의 혼합 실험군을 나타낸다.
도 9는 중간엽 줄기세포에 의한 M. abscessus 감염된 큰대식세포 내 일산화 질소(iNOS) 합성증가에 관련된 세포 내 신호전달기전을 분석한 도로, A는 핵과 세포질에서 p-p38, p-STAT-1, IkBa, CAPDH, p65, IRF-1, Lamin B 및 B-actin의 발현 정도를 각각 확인하는 것이고, 순서대로 Non은 줄기세포 미처리구, Inf는 감염된 대식세포, Inf+MSC는 감염된 대식세포에 줄기세포 처리한 구를 나타낸다. 또한 B에서 +는 조건이 각각 처리된 것을 의미하고, -는 해당 조건이 처리되지 않은 것을 나타내며, Bay 11-7082에서 +는 0.1 μM , ++은 1 μM 그리고 +++은 10 μM로 처리한 것을 나타낸다.Fig. 1 is a view showing mesenchymal stem cells, Fig. 1 (a) is a view showing pluripotent mesenchymal stem cells derived from mouse bone or bone marrow, Fig. 1 (b) is a view showing mesenchymal stem cells that are specifically found only in purely established mesenchymal stem cells FIG. 1C is a graph showing a characteristic of a stem cell (CD marker). FIG. 1C is a graph showing the differentiation of mesenchymal stem cells in order to demonstrate the differentiation ability of the animal-derived mesenchymal stem cells used in the present invention to be.
FIG. 2A is a graph showing the survival rate of mice treated with mesenchymal stem cells after infecting mice with M. abscessus , one of the pneumococci.
FIG. 2B is a graph showing the results of measurement of the number of bacteria present in the lungs of mice after 4 days from the treatment of mesenchymal stem cells after M. abscessus infection to confirm antibiotic activity of mesenchymal stem cells. The abscissa of the graph represents the control and the M. abscessus in the lung and the vertical axis represents the number of bacteria (CFU) present in each tissue.
2C is a graph showing the results of measurement of cytokine by ELISA to confirm the mechanism of antibiotic activity of mesenchymal stem cells.
FIG. 3 is a graph showing the results of analysis of inflammatory cells involved in the mechanism of antibiotic activity of mesenchymal stem cells through a flow cytometer. FIG.
FIG. 4 is a graph showing the results of analysis of intracellular growth after infecting M. abscessus in RANT mesothelial cells and treating mesenchymal stem cells with various methods in order to confirm antibiotic activity of mesenchymal stem cells. Fig. 4A shows the result of the control of the number of microbial cells in mesenchymal stem cells in the absence of IFN-y. Fig. 4B shows the results of control of mesenchymal stem cells in mesenchymal stem cells when present at 10 ng / ml of IFN- Results are shown.
FIG. 5 is a graph showing the results of cytokine analysis of mesenchymal stem cells by stimulation. In order to analyze the mechanism of antibiotic activity of mesenchymal stem cells, A was infected with M. abscessus in a rat macrophage, , And B is an analysis of the effect of mesenchymal stem cells on LPS stimulation.
6 is a graph showing secretion of nitric oxide as an important agonist of antibiotic activity of mesenchymal stem cells.
FIG. 7 is a graph showing the increase in nitric oxide synthesis (iNOS) synthesis by mesenchymal stem cells in the M. abscessus- infected RDA and nitric oxide production.
8 is a graph showing an analysis of interactions between mesenchymal stem cells and rat macrophages. In A, the abscissa represents the concentration of the culture, and the culture of mesenchymal stem cells and infected (black) or uninfected (white) macrophage culture were mixed at a volume ratio of 1:10 and 1: 5, respectively . The abscissa of the graph in Fig. B shows the succession of infected macrophages (M), infected macrophages (infected M), a mixture of uninfected macrophages and stem cell cultures (M + MSC) and infected macrophages and stem cells (Infected M + MSC).
FIG. 9 shows the results of analysis of intracellular signal transduction pathways involved in the increase of iNOS synthesis in M. abscessus infected mesenchymal stem cells by mesenchymal stem cells, and A shows p-p38, p-STAT-1, In order to confirm the expression level of IkBa, CAPDH, p65, IRF-1, Lamin B and B-actin, Inf is not an embryonic stem cell, Inf is infected macrophage, Inf + This indicates the phrase processed. In addition, + in B means that each condition is treated, - indicates that the condition is not processed, and + 0.1 μM in ++, 1 μM in ++ and 10 μM in +++ in Bay 11-7082 .

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention.

[실시 예 1] [Example 1] Mycobacterium abscessusMycobacterium abscessus 의 배양 및 농축 항원 준비 Culture and preparation of concentrated antigen

M. abscessus의 표준균주(ATCC 19977)를 10% OADC enrichment(Difco, Detroit, MI, USA)를 포함하는 Middlebrook 7H9 배지(pH 6.8)(Difco)를 사용하여 3 ~ 4일 동안 37 ℃에서 정치 배양하였다. 배양액을 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 수집한 후 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4)로 3회 세척하였다. 각각 pH 5.0, 6.0 및 7.5로 산도를 맞춘 변형된 Watson-Reid(mWR) 액체 배지(per liter: L-asparagine 5 g; D-glucose 10 g; glycerol 63 ml; ammonium hydrogen citrate 2 g; ferric ammonium citrate 75 mg; KH₂PO₄ 2 g; NaCl 2 g; MgSO₄7H₂O 1 g; ZnSO₄7H₂O 10 mg; CaCl₂2H₂O 20 mg; CoCl₂6H₂O 2mg)에 M. abscessus를 접종한 후 대기압(O₂ 21%)과 낮은 산소 분압(O₂ 13%, 5% CO₂)에서 14일까지 정치 배양하였다. 산도는 염산과 암모니아수를 이용하여 적정하였다. 대기압 배양 조건은 T-75 flask(Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)에 mWR 배지를 넣은 후 균을 접종하여 37℃ 항온기(Forma Scientific, Marietta, OH, USA)에서 배양하였고, 낮은 산소 분압 조건은 산소 분압 조절 항온기(Forma) 내에서 질소 가스로 산소 분압을 조절하여 13% O₂ 조건으로 배양하였다. The standard strain of M. abscessus (ATCC 19977) was incubated for 3 to 4 days at 37 ° C with Middlebrook 7H9 medium (pH 6.8) (Difco) containing 10% OADC enrichment (Difco, Detroit, MI, USA) Respectively. The culture was centrifuged at 13,000 rpm for 30 minutes, and then washed three times with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4). A modified Watson-Reid (mWR) liquid medium (5 g, L-asparagine 10 g; D-glucose 10 g; glycerol 63 ml; ammonium hydrogen citrate 2 g; ferric ammonium citrate _{_{75 mg; KH 2 PO 4 2}} g; the CoCl ₂ 6H M. abscessus to _{2 O 2mg); NaCl 2 g} ; MgSO 4 7H 2 O 1 g; ZnSO 4 7H 2 O 10 mg; CaCl 2 2H 2 O 20 mg After inoculation, the cells were incubated for 14 days at atmospheric pressure (O ₂ 21%) and low oxygen partial pressure (O ₂ 13%, 5% CO ₂ ). Acidity was titrated with hydrochloric acid and ammonia water. The atmospheric pressure was maintained at 37 ° C in a thermostat (Forma Scientific, Marietta, OH, USA) by inoculating the mWR medium with T-75 flask (Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) Oxygen partial pressure was controlled with a nitrogen gas in a thermostat (Forma) and cultured under 13% O ₂ condition.

M. abscessus를 pH 5.0, 6.0 및 7.5로 산도를 적정한 mWR 액체 배지에 접종하여 37℃, 21% O₂ 및 13% O₂ 조건에서 14일 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 13,000 rpm 초원심분리를 통해 침전된 균을 제거하고 배양 상층액을 얻은 후 0.22 ㎛ membrane filter(Millipore, Bedford, MA, USA)로 여과 멸균하였다. YM3 membrane filter(Millipore)를 이용해 초미세여과법(ultrafiltration)으로 10 ml 이하로 농축하였고 최종적으로 60,000 rpm, 10 ℃에서 3시간 동안 초원심분리한 후 상층액을 얻어서 수용성 단백질만을 수집하여 소량씩 분주한 후 정량한 다음 사용 전까지 -70 ℃에 보관하였다.
M. abscessus was inoculated into pH-adjusted mWR liquid medium at pH 5.0, 6.0 and 7.5, and cultured at 37 ° C, 21% O ₂ and 13% O ₂ for 14 days. After the culture was completed, the precipitated bacteria were removed by centrifugation at 13,000 rpm, and the culture supernatant was collected and filtered with a 0.22 μm membrane filter (Millipore, Bedford, MA, USA). The supernatant was collected by centrifugation at 60,000 rpm and 10 ° C for 3 hours, and the supernatant was collected to collect only the water-soluble proteins. And then stored at -70 ° C until use.

[실시예 2] C57BL/6 생쥐의 대퇴골, 경골 추출 및 중간엽 줄기세포의 분리[Example 2] Extraction of femur, tibia and mesenchymal stem cell of C57BL / 6 mice

멸균된 핀셋과 수술용 가위를 이용하여 안락사를 수행한 C57BL/6 생쥐의 근육으로부터 대퇴골(femur)과 경골(tibia)만을 오염되지 않게 분리하였다. 이 후, 3단계의 세척과정을 거쳐 얻어진 대퇴골과 경골로부터 26G의 주사기를 이용하여 조심스럽게 뼈와 골수를 분리한 다음, 세포 배양배지에 26G의 주사기를 이용하여 세포 집성(aggregation)을 막아서 모으고 1500 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리하여 얻어진 상층액은 제거하고 수거된 세포 펠렛을 중간엽 줄기세포 배양배지(페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 Dulbeco's modified eagles medium/F12 GlutaMax, DMEM/F12)에서 부유시킨 후, 조직배양 접시(tissue culture dish)와 조직배양 플라스크(tissue culture flask)에 넣어 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 세포 배양배지를 교체하여 부유성 세포는 제거하고 정상적으로 부착된 세포를 계대배양을 거쳐 중간엽 줄기세포만을 배양하고자 하였다.
Only the femur and tibia were isolated from the muscles of the c57BL / 6 mice that were euthanized by using sterilized tweezers and surgical scissors. Thereafter, the bone and bone marrow were carefully separated from the femur and tibia obtained from the femur and tibia through a three-step washing process, and then the cell aggregation was blocked using a 26G syringe on the cell culture medium. and centrifuged at rpm for 5 minutes. The supernatant obtained by centrifugation was removed and the collected cell pellet was resuspended in Dulbeco's modified eagles medium / F12 GlutaMax supplemented with mesenchymal stem cell culture medium (penicillin, streptomycin, 10% FBS (fetal bovine serum) , DMEM / F12), and then cultured in a tissue culture dish and a tissue culture flask at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator. After 24 hours, the cell culture medium was changed to remove the floating cells, and the normal adherent cells were subcultured to cultivate only mesenchymal stem cells.

[실시예 3] 중간엽 줄기세포의 배양[Example 3] Culture of mesenchymal stem cells

실시예 2에서 배양된 초대배양(Passage 0) 중간엽 줄기세포가 대략 70 ~ 80% 정도 배양되면 0.25% Trypsin/EDTA로 소화하여 세포를 모은 다음 동결하여 액체질소에 보관하였다. 액체질소에 보관된 세포는 37 ℃ 중탕기(water bath)에서 용해하고, 실시예 1에서 사용된 중간엽 줄기세포 배양배지에서 배양하면서 배양용기의 70 ~ 80% 정도 배양되면 실시예 1과 같은 방법으로 소화하여 배양된 세포를 모은 후, 다음 계대로 배양하는 방식으로 20대 이상 배양하였다. 배양된 줄기세포를 역상 현미경(Phase contrast image)으로 관찰한 결과는 도 1a에 나타내었다. When approximately 70-80% of the primary cultured (Passage 0) mesenchymal stem cells cultured in Example 2 were cultured, the cells were collected by digestion with 0.25% Trypsin / EDTA and then frozen and stored in liquid nitrogen. The cells stored in liquid nitrogen were dissolved in a 37 ° C water bath and cultured in the mesenchymal stem cell culture medium used in Example 1 and cultured in the same manner as in Example 1 when 70-80% After the digested and cultured cells were collected, they were cultured for 20 or more in the following manner. The result of observing the cultured stem cells with a phase contrast image is shown in Fig.

도 1a에서 보는 바와 같이, 뼈 혹은 그 골수로부터 제조된 세포를 역상현미경(Phase contrast image)으로 관찰한 결과, 배양된 세포는 플라스틱에 안전하게 부착하여 자라며, 배양 상태에 따라 둥근 형태 또는 방추체 모양으로 단층으로 세포군을 형성하고 있어, 지방 및 기타 다른 조직유래의 중간엽 줄기세포와 형태상 매우 흡사함을 확인하였다. As shown in FIG. 1A, the cells prepared from the bone or bone marrow were observed with a phase contrast image. As a result, the cultured cells were attached to the plastic and adhered to each other. It was confirmed that the cells were very similar in morphology to mesenchymal stem cells derived from fat and other tissues.

이와 같이 본 발명에서 제조된 중간엽 줄기세포의 특성을 분석하고자 다양한 생쥐 항체(CD29, CD34, CD44, CD90, CD105, CD117)를 이용하여 중간엽 줄기세포 확립의 정확성을 재차 확인하였다. 자세히 서술하면, 본 발명에서 배양된 줄기세포가 지금까지 알려진 중간엽 줄기세포 특이 표면 마커(CD44)를 발현하는지의 여부를 확인하기 위해 유세포 분석기를 이용하여 형광 활성 세포(flourescence-activated cell)에 대한 유세포 분석 실험을 수행하였다. 즉, 배양된 세포가 배양용기의 70 ~ 80%로 자라면 0.25% Trypsin/EDTA로 소화해 단일세포로 만든 다음, 중간엽 줄기세포 배양배지와 1X PBS로 순차적으로 세척하고 생쥐의 중간엽 줄기세포 특이 표면 마커인 CD44에 대한 항체(FITC 결합)로 30분간 반응한 후, PBS로 3회 세척하였다. 준비된 염색 세포 샘플은 유세포 분석기를 이용하여 표면 마커의 발현 여부를 확인한 결과, 95% 이상의 세포가 CD44를 발현하고 있음을 확인할 수 있었으며, 그 결과는 도 1b에 나타내었다. In order to analyze the characteristics of the mesenchymal stem cells prepared in the present invention, the accuracy of mesenchymal stem cell establishment was confirmed again by using various mouse antibodies (CD29, CD34, CD44, CD90, CD105, CD117). In order to confirm whether or not the stem cells cultured in the present invention express known mesenchymal stem cell-specific surface markers (CD44), a flow cytometric analysis was performed using a flow cytometry analyzer Flow cytometry experiments were performed. In other words, if the cultured cells grew to 70-80% of the culture vessel, they were digested with 0.25% trypsin / EDTA to make single cells, and then sequentially washed with the mesenchymal stem cell culture medium and 1X PBS. After reacting with a surface marker CD44 antibody (FITC binding) for 30 minutes, the plate was washed three times with PBS. The prepared stained cell samples were analyzed for expression of surface markers using flow cytometry. As a result, it was confirmed that 95% or more cells express CD44, and the results are shown in FIG. 1B.

또한, 본 발명에 사용된 중간엽 줄기세포의 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로서의 기능을 유지하는지를 확인하고자 다양한 분화방법인, 지방세포(adipogenic), 골세포(osteogenic) 및 연골세포(chondrogenic)로의 분화(differentiation)를 통해 분화능(differential ability)을 증명하고, 분화능을 유지하는 계대 내에서만 본 발명에 적용하였으며, 그 결과를 도 1c에 나타내었다. In order to confirm whether the mesenchymal stem cells used in the present invention maintain their function as multipotent stem cells, various differentiation methods such as adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells, And the results are shown in Fig. 1 (c). The results are shown in Fig. 1 (c).

1) 지방세포로의 분화: 줄기세포를 cm² 당 2 x 10⁴으로 조직배양 디쉬에 넣고 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 줄기세포 배양배지에 0.1 mM b-메르캅토에탄올을 첨가하여 배양하였다. 2-3일에 한번씩 새로운 배양액으로 교체해 주었으며 조직배양 디쉬에 100% 가량 배양되면, 지방분화유도용 배지(Lonza, USA)로 교체해 준 다음 4일마다 새로운 분화배지로 교체해 주면서 21일 동안 분화를 유도시켰다. 그 후, 4% 포르말린으로 세포를 10분 동안 고정하고, 1X PBS로 3회 이상 세척하였다. 이렇게 분화된 세포의 지방을 Oil red O stain kit(Novaultra^TM, USA)를 이용하여 염색하였다. 간단히 기술하자면 다음과 같다. 포르말린으로 고정된 세포에 pre-stain solution으로 5분간 처리한 다음 solution을 제거한 후, 미리 60 ℃에 데워둔 Oil red O solution으로 10분간 처리하였다. 이를 물로 3회 세척한 후 hematoxylin solution으로 30초간 염색하고 물로 3분 이상 세척한 다음 역상현미경(Phase contrast image)로 붉게 염색된 지방을 확인하였다.
1) Differentiation into adipocytes: Stem cells were cultured in a tissue culture dish at 2 × 10 ⁴ per cm ² in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C., supplemented with 0.1 mM b-mercaptoethanol. After replacing the medium with a fresh medium for induction of lipid differentiation (Lonza, USA), 100% of the medium was replaced with a new culture medium every 2 to 3 days. . Cells were then fixed with 4% formalin for 10 minutes and washed 3 times with 1X PBS. The differentiated cells were stained with oil red o stain kit (Novaultra ^TM , USA). A brief description is as follows. Formalin-fixed cells were treated with a pre-stain solution for 5 minutes, then the solution was removed and treated with an oil red O solution preheated to 60 ° C for 10 minutes. After washing 3 times with water, it was stained with hematoxylin solution for 30 seconds, washed with water for 3 minutes or more, and reddish-stained fat was confirmed by phase contrast image.

2) 뼈세포로의 분화: 줄기세포를 cm² 당 3.1 x 10³으로 조직배양 디쉬에 넣고 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 줄기세포 배지에 0.1 mM b-메르캅토에탄올을 첨가하여 배양하였다. 2-3일에 한 번씩 새로운 배양액으로 교체해 주었으며 조직배양 디쉬에 100% 가량 배양되면, 뼈분화유도용 배지(Lonza, USA)로 교체해 준 다음, 4일마다 새로운 분화배지로 교체해 주면서 21일 동안 분화를 유도시켰다. 그 후, 4% 포르말린으로 세포를 10분 동안 고정하고, 1X PBS로 3회 이상 세척하였다. 이렇게 분화된 세포는 Alzarin red stain kit(Novaultra^TM, USA)를 이용하여 분화된 세포의 칼슘을 염색하였다. 간단히 기술하자면 다음과 같다. 포르말린으로 고정된 세포에 Alzarin red solution으로 5분간 처리한 다음 이를 증류수로 3회 세척한 후, 역상현미경(Phase contrast image)로 붉은 오렌지색으로 칼슘이 염색된 것을 확인하였다.
2) Differentiation into bone cells: Stem cells were added to a tissue culture dish at 3.1 × 10 ³ per cm ² and cultured at 37 ° C. in a 5% CO ₂ incubator by adding 0.1 mM b-mercaptoethanol to the stem cell culture medium. After replacing the medium with new medium for induction of bone differentiation (Lonza, USA), 100% of the medium was replaced with a fresh culture medium every 2-3 days. After replacing with a new differentiation medium every 4 days, Lt; / RTI > Cells were then fixed with 4% formalin for 10 minutes and washed 3 times with 1X PBS. The differentiated cells were stained with calcium of differentiated cells using Alzarin red stain kit (Novaultra ^TM , USA). A brief description is as follows. Formalin-fixed cells were treated with Alzarin red solution for 5 minutes, washed three times with distilled water, and then confirmed to have a red orange color stained with a phase contrast image.

3) 연골세포로의 분화: 줄기세포를 cm² 당 1.6 x 10⁷으로 조직배양 디쉬에 0.1mM b-메르캅토에탄올을 첨가한 줄기세포배지 5 ㎕의 방울로 넣고 4시간 동안 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였으며, 연골 분화 배지(Lonza, USA)를 첨가하고 4일마다 새로운 분화배지로 교체해 주며 21일 동안 분화를 유도시켰다. 그 후, 4% 포르말린으로 세포를 10분 동안 고정하고, PBS로 3회 이상 세척하였다. 이렇게 준비된 세포는 Alcian blue stain kit(Novaultra^TM, USA)를 이용하여 분화된 세포의 프로테오글리칸(proteoglycan)을 염색하였다. 간단히 기술하자면, Alcian blue solution으로 30분간 처리하고, 증류수로 3회 이상 충분히 세척하고 solution을 제거한 후, nuclear fast red solution으로 5분 동안 처리하고 이를 증류수로 1분 이상 충분히 세척한 후, 역상현미경(Phase contrast image)로 proteoglycan이 파랗게 염색된 것을 확인하였다.
3) Differentiation into chondrocytes: Stem cells were plated at a density of 1.6 x 10 ⁷ per cm ² into 5 μl of a stem cell culture medium supplemented with 0.1 mM b-mercaptoethanol in a tissue culture dish and incubated for 4 hours at 37 ° C in 5% CO ₂ incubator, and chondrogenic differentiation medium (Lonza, USA) was added and replaced with new differentiation medium every 4 days and induced differentiation for 21 days. The cells were then fixed with 4% formalin for 10 minutes and washed three more times with PBS. The prepared cells were stained with proteoglycan of differentiated cells using Alcian blue stain kit (Novaultra ^TM , USA). In brief, treat with Alcian blue solution for 30 minutes, thoroughly wash with distilled water more than 3 times, remove solution, treat with nuclear fast red solution for 5 minutes, thoroughly wash with distilled water for more than 1 minute, Phase contrast image), indicating that proteoglycan was stained blue.

[실시예 4] 세균 감염 및 중간엽 줄기세포 생쥐 접종실험 [Example 4] Inoculation experiment with bacterial infection and mesenchymal stem cells

본 발명에 사용된 중간엽 줄기세포의 M. abscessus에 대한 항생능을 확인하고자 마우스 모델에 M. abscessus를 감염시킨 후 항생능을 확인하였다. 먼저, C57BL/6 mouse에 M. abscessus를 2 x 10⁷ cell/mouse로 조절하여 정맥 내로 감염시켰다. 감염 후 24시간이 지난 후, 중간엽 줄기세포를 1.0 x 10⁵ 및 2.5 x 10⁵ cell/mouse로 정맥 주사한 다음, 생쥐의 생존율을 확인하였다. 그 결과는 도 2a에 나타내었다. To confirm antibiotic activity against M. abscessus of the mesenchymal stem cells used in the present invention, the mouse model was infected with M. abscessus and then antibiotic activity was confirmed. First, C57BL / 6 mice were infected intravenously with 2 × 10 ⁷ cells / mouse of M. abscessus . Twenty-four hours after infection, mesenchymal stem cells were injected intravenously at 1.0 × 10 ⁵ and 2.5 × 10 ⁵ cells / mouse and the survival rate of the mice was confirmed. The results are shown in FIG.

도 2a에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 군(WT)은 M. abscessus 감염 후 15일이 경과 시 생쥐 총 5마리 중 4마리가 사망하였으나, 중간엽 줄기세포를 처리한 실험군, MSC low(1.0 x 10⁵ cell/mouse) 및 MSC high(2.5 x 10⁵ cell/mouse), 모두에서 생쥐의 생존률이 높았으며, 높은 수의 중간엽 줄기세포 투여한 처리군에서 항생 효과가 더욱 효과적이었음을 확인하였다. As shown in FIG. 2A, in the untreated group (WT), four out of five mice died after 15 days of infection with M. abscessus , but MSC low (1.0 x 10 ⁵ cells / mouse) and MSC high (2.5 x 10 ⁵ cells / mouse), the survival rate of the mice was high and the antibiotic effect was more effective in the treatment group treated with a high number of mesenchymal stem cells .

또한, 중간엽 줄기세포 투여에 따른 균의 조절을 확인하고자 생쥐의 폐에서 균수를 조사하였다. 그 결과는 도 2b에 나타내었다.
In order to confirm the regulation of the microbial stem cells by the administration of mesenchymal stem cells, the number of bacteria in the lungs of the mice was examined. The result is shown in FIG. 2B.

도 2b에 나타낸 바와 같이, 감염 후 6일째, 대조군(control, infection only)에서는 폐에서 대략 6.81(Log10 CFU/g of Tissue) 정도의 균이 검출된 반면, 중간엽 줄기세포를 처리한 군(MSC, 2.5 x 10⁵ cell/mouse)에서는 폐에서 4.9(Log10 CFU/g of Tissue) 정도의 균이 검출됨으로써 중간엽 줄기세포의 항생효과를 확인하였다. As shown in FIG. 2B, in the control group (control, infection only), about 6.81 (Log 10 CFU / g of Tissue) was detected in the lungs on the 6th day after infection, whereas MSC , 2.5 x 10 ⁵ cells / mouse), the antibiotic effect of mesenchymal stem cells was confirmed by detecting bacteria of about 4.9 (Log 10 CFU / g of Tissue) in the lung.

본 발명에서는 M. abscessus(hypervirulent rough type strain) 감염 시 중간엽 줄기세포가 생쥐 폐의 여러 사이토카인 분비에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자, M. abscessus 감염 후 중간엽 줄기세포를 처리하고 4일 후, 마우스 기관지폐포세척액(BALF)을 추출하여 ELISA를 수행하였다. 실험은 대조군(infection only), 중간엽 줄기세포를 1.0 x 10⁵ cell/mouse로 처리한 실험군(MSC low) 및 2.5 x 10⁵ cell/mouse로 실험군(MSC high)으로 실시하였고, 그 결과는 도 2c에 나타내었다.In order to investigate the effect of mesenchymal stem cells on the secretion of various cytokines in the lungs of M. abscessus (hypervirulent rough type strain) infection, mesenchymal stem cells were treated after M. abscessus infection and after 4 days, Mouse bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was extracted and subjected to ELISA. Experiments were carried out in the control (infection only), MSC low (1.0 × 10 ⁵ cells / mouse) and MSC high (2.5 × 10 ⁵ cells / mouse) 2c.

도 2c에 나타낸 바와 같이, 감염 후 4일째 IFN-gamma, TNF-alpha, IL-12 p70 및 MCP-1 의 사이토카인은 중간엽 줄기세포 투여에 의해 증가하였고, IL-10은 오히려 감소하였으며, IL-6, IL-17, IL-4와 같은 사이토카인들의 변화는 관찰되지 않았다. 이 결과는 모든 감염 조건하에서 중간엽 줄기세포가 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 것이 아니라, 특이적 조건하에서 염증성 사이토카인의 증가를 야기하고 있음을 의미한다. 따라서 중간엽 줄기세포는 M. abscessus 감염 시 염증성 사이토카인의 초기 증가를 유도함을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 2C, the cytokines of IFN-gamma, TNF-alpha, IL-12 p70 and MCP-1 were increased by mesenchymal stem cell administration at day 4 after infection, -6, IL-17, and IL-4. This result implies that the mesenchymal stem cells do not inhibit the secretion of inflammatory cytokines under all infection conditions, but cause an increase in inflammatory cytokines under specific conditions. Thus, mesenchymal stem cells were found to induce an initial increase of inflammatory cytokines in M. abscessus infection.

또한, 이러한 염증성 사이토카인의 증가가 감염 부위의 염증성세포의 침윤(infiltration) 차이에 의한 것인지 확인하고자, 감염 후 4일째 기관지 폐포(bronchoalveolar lavage, BAL)세포를 분리하고 유세포 분석기를 통하여 면역세포를 분석하였다. 먼저, 모아진 BAL 세포를 PBS로 2회 세척 및 원심 분리하였다. 그 다음, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-F4/80, anti-Gr1, anti-CD3, anti-CD4 와 anti-CD8 등의 특정 항체를 처리하여 30분간 상온에 방치하였다. 그 다음 PBS로 수회 세척한 후 유세포 분석기를 통해 면역세포를 분석하였다. 그 결과는 도3에 나타내었다. In addition, to determine whether the increase in inflammatory cytokines is due to the infiltration of inflammatory cells at the site of infection, bronchoalveolar lavage (BAL) cells were isolated 4 days after infection, and immunocytes were analyzed using flow cytometry Respectively. First, the collected BAL cells were washed twice with PBS and centrifuged. Then, specific antibodies such as anti-CD11b, anti-CD11c, anti-F4 / 80, anti-Gr1, anti-CD3, anti-CD4 and anti-CD8 were treated and left at room temperature for 30 minutes. After washing several times with PBS, immune cells were analyzed by flow cytometry. The results are shown in Fig.

도 3에 나타낸 바와 같이, 중간엽 줄기세포 투여 시, 수지상 세포, 폐포 대식세포(alveolar macrophage), 작은 대식세포(small macrophage)와 단핵구(monocyte)의 수가 대조군(infection only) 보다 증가하였다. 또한, CD3+/CD4+ T 세포와 CD3+/CD8+ T 세포 역시 증가하는 패턴을 보였다.
As shown in Fig. 3, the number of dendritic cells, alveolar macrophages, small macrophages and monocytes was increased in comparison with infection only when mesenchymal stem cells were administered. In addition, CD3 + / CD4 + T cells and CD3 + / CD8 + T cells also showed increasing patterns.

[실시예 5] 큰대식세포 내 [Example 5] M. abscessusM. abscessus 성장에 중간엽 줄기세포가 미치는 영향 검색 Search for effects of mesenchymal stem cells on growth

큰대식세포는 IFN-γ자극 시 자식작용(autophagy), 일산화질소(nitric oxide), 활성산소종(reactive oxygen species, ROS), 항균 펩타이드(anti-microbial peptide) 등의 증가로 세포 내 세균을 제거(clearance)한다. 이 중에서 일산화질소는 대표적인 큰대식세포 내 균 제거에 관여하는 물질로 알려져 있어, 큰대식세포를 이용하여 항생효과에 중간엽 줄기세포가 미치는 영향을 확인 하였다. Rat mesothelial cells have been shown to remove intracellular bacteria by increasing autophagy, nitric oxide, reactive oxygen species (ROS), and anti-microbial peptide during IFN-γ stimulation clearance). Among them, nitric oxide is known to be involved in the removal of bacteria in representative macrophages, confirming the effect of mesenchymal stem cells on the antibiotic effect by using macrophages.

상기 실험을 통해 중간엽 줄기세포는 마우스 감염모델에서 M. abscessus 감염 시 염증성 사이토카인 및 침윤(infiltration)된 염증성 세포의 증가를 야기하였다. 이러한 결과로 중간엽 줄기세포가 M. abscessus의 성장을 억제하는 것으로 사료되었다. 따라서, 관련된 기작을 찾기 위해 in vitro 에서 큰대식세포 내 기생세균에 대한 중간엽 줄기세포의 영향을 in vitro 에서 확인하고자, in vitro 내에서 큰대식세포의 분화를 유도하여 실험에 사용하였다. 이에 골수 세포(bone marrow cell)에 M-CSF를 100 ng/ml로 처리 하여 4일 동안 배양하여 큰대식세포를 획득하였다. Through these experiments, mesenchymal stem cells have been shown to increase inflammatory cytokines and infiltrating inflammatory cells in M. abscessus infection in a mouse model of infection. These results suggest that mesenchymal stem cells inhibit the growth of M. abscessus . Therefore, we investigated the effect of mesenchymal stem cells on parasitic bacilli in vitro in vitro in order to investigate the mechanism involved. M-CSF was treated with 100 ng / ml of bone marrow cells for 4 days to obtain rat macrophages.

획득한 큰대식세포에 M. abscessus를 감염시키고(MOI=1), 감염된 중간엽 줄기세포를 직접 또는 transwell(0.4 ㎛)에 공배양(co-culture) 하거나 중간엽 줄기세포의 조건 배지(condition media)를 처리하여 큰대식세포 내 균수 조절에 중간엽 줄기세포의 효과를 검색하였다. 또한, 적응면역의 주요한 요인(key factor)인 IFN-γ 유무에 따른 간엽줄기세포의 효과를 검색하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. The infected mesenchymal stem cells were co-cultured directly or transwell (0.4 ㎛), or conditioned media of mesenchymal stem cells were infected with M. abscessus (MOI = 1) To investigate the effect of mesenchymal stem cells on the control of bacterial counts in the rat macrophages. In addition, the effect of mesenchymal stem cells on the presence or absence of IFN-γ, which is a key factor of adaptive immunity, was searched and the results are shown in FIG.

도 4에 나타낸 바와 같이, 간엽줄기세포를 직접(D:direct) 또는 Transwell을 이용한 공배양(T:indirect)에서 IFN-γ 가 없을 시 약간의 균의 감소가 보였으나 통계적 의의는 없었다(도 4a). 하지만, IFN-γ 10 ng/ml)이 존재 시, 직접 배양 했을 때 가장 큰 균성장 억제능을 보였으며, Transwell을 이용한 공배양시에도 절반정도의 균성장 억제능을 확인하였다. 또한, 간엽줄기세포의 배양액(약 89~90% confluent, condition media: CM)을 처리한 결과에서도 비슷한 결과를 얻었다(도 4b).
As shown in FIG. 4, there was no statistical significance in the absence of IFN-γ in the direct (D: direct) or transwell (T: indirect) culture of mesenchymal stem cells ). However, in the presence of IFN-γ (10 ng / ml), direct growth inhibition showed the greatest growth inhibition effect, and half-fold inhibition of bacterial growth was also observed when co-cultured with Transwell. Similar results were obtained in the treatment of mesenchymal stem cell culture (about 89 ~ 90% confluent, condition media: CM) (Fig. 4B).

[실시예 6] [Example 6] M. abscessusM. abscessus 가 감염된 큰대식세포의 사이토카인 분비에 중간엽 줄기세포가 미치는 영향 검색Effect of Mesenchymal Stem Cells on the Secretion of Cytokines from Rat Inflamed Rat Phagocytes

앞선 실험에서 간엽줄기세포는 IFN-γ 존재 시 M. abscessus의 큰대식세포내 성장을 억제시켰다. 이에 관련된 사이토카인을 확인하기 위하여, transwell을 이용한 공배양 시스템을 이용하였다. 즉, 큰대식세포를 24 well cell culture plate에 2x10⁵ cell로 조절하여 세포를 부착시킨 후 24시간 동안 10% FBS 및 1% 항생제(antibiotics)를 포함한 DMEM에 배양하였다. 그 다음, M. abscessus를 1x10⁵ cell(MOI=0.5)로 감염 시킨 다음 4시간 동안 방치 한 후 100 ㎍/ml 아미카신(amikacin)을 2 시간 동안 처리 한 후 PBS로 수회 세척하여 세포 외 균을 제거하였다. 그 다음, 0.4 ㎛ 포어 크기(pore size)의 Transwell에 MSC를 2x10⁴ cell로 조절하여 24시간 동안 배양하였다. 이때, 실험 조건에 따라 IFN-γ 5 ng/mL로 처리하였다. 상기 실험의 결과를 도 5에 나타내었다. In the previous experiment, mesenchymal stem cells inhibited the growth of M. abscessus in the presence of IFN-γ. In order to identify the cytokines involved, a co-culture system using transwell was used. Rats were cultured in DMEM containing 10% FBS and 1% antibiotics for 24 h after regulating the cells with 2 × 10 ⁵ cells in a 24-well cell culture plate. Then, M. abscessus was infected with 1 × 10 ⁵ cells (MOI = 0.5), left for 4 hours, treated with 100 μg / ml amikacin for 2 hours, washed several times with PBS, . Then, MSC was adjusted to 2 x 10 ⁴ cells in a 0.4 μm pore size Transwell and cultured for 24 hours. At this time, IFN-γ was treated with 5 ng / mL according to experimental conditions. The results of the above experiment are shown in Fig.

도 5에 나타낸 바와 같이, IFN-γ가 없을 시 IL-6를 제외한 TNF-a, IL-12p70, IL-10 등의 사이토카인은 큰 변화가 관찰되지 않았다. 하지만, IFN-γ가 존재 시, IL-6 및 IL-12p70의 분비가 증가하였다(도 5a). 반면 LPS 자극에서는 간엽줄기세포가 염증성사이토카인 TNF-a와 IL-12p70의 발현은 크게 억제 하였으며, IL-10은 증가시켰다. 반면, IL-6의 변화는 관찰되지 않았다(도 5b).
As shown in FIG. 5, no significant change in cytokines such as TNF-a, IL-12p70 and IL-10 except for IL-6 was observed in the absence of IFN-y. However, in the presence of IFN-y, secretion of IL-6 and IL-12p70 was increased (Fig. 5A). In contrast, in LPS stimulation, mesenchymal stem cells significantly suppressed the expression of inflammatory cytokines TNF-a and IL-12p70, and increased IL-10. On the other hand, no change in IL-6 was observed (Fig. 5B).

[실시예 7] 중간엽 줄기세포의 [Example 7] Preparation of mesenchymal stem cells M. abscessusM. abscessus 억제기작 규명 Identification of inhibition mechanism

중간엽 줄기세포의 항균작용의 주요한 요인(key factor)을 찾기 위해 일산화질소(NO)를 조사하였다. 이를 확인하기 위해 M. abscessus 가 감염된 큰대식세포에 IFN-γ 유무 및 중간엽 줄기세포 유무에 따른 NO를 측정하였다. 이때, 중간엽 줄기세포와 큰대식세포와의 상호작용을 알아보기 위해, 큰대식세포를 직접(direct) 또는 transwell 및 조건배지 배양물(condition media, CM)을 사용하였다. 그 결과, IFN-γ 없을 시 아무런 변화를 관찰 할 수 없었다. 하지만, IFN-γ 존재 시 M. abscessus 감염만으로 약간의 nitric oxide의 증가를 보였으나 중간엽 줄기세포를 이를 크게 증폭시켜 주는 것으로 확인됨. 이는 직접 공배양 했을 때 가장 극명한 효과를 보였다(도 6).Nitric oxide (NO) was investigated to find the key factor in the antimicrobial activity of mesenchymal stem cells. To confirm this, we measured the presence of IFN-γ and NO according to the presence of mesenchymal stem cells in RDA cells infected with M. abscessus . At this time, in order to investigate the interaction between mesenchymal stem cells and the rat macrophages, the macrophage cells were directly or transwelled and condition media (CM) were used. As a result, no change was observed in the absence of IFN-y. However, in the presence of IFN-γ, only a slight increase in nitric oxide was seen with M. abscessus infection, but it was confirmed that it significantly amplified mesenchymal stem cells. This was the most pronounced effect when direct co-cultivation (Fig. 6).

큰대식세포 내 일산화질소 생성은 iNOS에 의해 조절된다고 알려져 있다. 이에 본 발명에서는 중간엽 줄기세포에 iNOS의 발현양이 증가하는지 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. Production of nitric oxide in the rat macrophages is known to be regulated by iNOS. Accordingly, it was confirmed in the present invention that the expression level of iNOS in the mesenchymal stem cells was increased, and the result is shown in FIG.

도 7에 나타낸 바와 같이, 중간엽 줄기세포가 iNOS의 mRNA및 단백질 양을 크게 증가 시키는 것을 확인 하였다(도 7a). 또한, iNOS 저해제(inhibitor)인 NMMA를 처리한 경우 일산화질소의 생성이 떨어지는 것을 확인 하였다(도 7b). 뿐만 아니라, 면역형광염색을 통해 중간엽 줄기세포가 M. abscessus가 감염된 큰대식세포내 iNOS를 크게 증가시킴을 확인하였고(도 7c), iNOS 저해제(inhibitor) 존재 하에는 중간엽 줄기세포의 항균능이 작용하지 않음을 밝혔다(도 7d). As shown in Fig. 7, mesenchymal stem cells significantly increased the amount of mRNA and protein of iNOS (Fig. 7A). In addition, it was confirmed that the production of nitrogen monoxide was reduced when the iNOS inhibitor NMMA was treated (Fig. 7B). In addition, the immunofluorescence staining confirmed that mesenchymal stem cells significantly increased iNOS in the mesangial cells infected with M. abscessus (Fig. 7c). In the presence of the iNOS inhibitor, the mesenchymal stem cells exhibited antimicrobial activity (Fig. 7d).

이에 본 발명에서는 iNOS 발현증가에 따른 일산화질소의 증가가 큰대식세포와 중간엽 줄기세포와의 상호작용에 의한 것 인지 확인하고자, 중간엽 줄기세포의 조건배지 배양물을 M. abscessus로 감염된 큰대식세포의 조건배지 배양물 또는 감염되지 않은 큰대식세포의 조건배지 배양물 각각과 1 : 5 부피비와 1 : 10의 부피비로 각각 혼합한 후, 일산화 질소의 생성을 확인 하였고, 그 결과를 도 8A에 나타내었다. 또한, 감염되지 않은 큰대식세포의 조건배지 배양물과 M. abscessus로 감염된 큰대식세포의 조건배지 배양물 각각과 중간엽 줄기세포의 배양물을 1 : 10의 부피비로 혼합하고, 후 24시간 동안 배양하고, 대식세포, 감염된 대식세포, 감염되지 않은 대식세포와 줄기세포 혼합 배양물, 감염된 대식세포와 줄기세포의 혼합 배양물 각각에서 일산화 질소의 생성을 확인 하였다. 그 결과를 도 8B에 나타내었다. Therefore, in order to confirm whether the increase of nitrogen monoxide by increasing iNOS expression is due to the interaction of mesenchymal stem cells with mesenchymal stem cells, the medium culture medium of mesenchymal stem cells was cultured in M. abscessus- Conditioned culture medium or conditioned medium of uninfected Raw phagocyte was mixed with each of 1: 5 volume ratio and 1: 10 volume ratio, respectively, and then the production of nitrogen monoxide was confirmed. The results are shown in FIG. 8A. In addition, conditioned medium culture of uninfected rat macrophages and conditional medium culture of RDA cells infected with M. abscessus and medium culture of mesenchymal stem cells were mixed at a volume ratio of 1:10, and cultured for 24 hours , Macrophages, infected macrophages, uninfected macrophages and stem cell mixed cultures, mixed cultures of infected macrophages and stem cells, respectively. The results are shown in Fig. 8B.

도 8에 나타낸 바와 같이, 감염된 큰대식세포의 조건배지에 미리 자극 받은 중간엽 줄기세포의 조건배지는 감염되지 않은 큰대식세포의 조건배지를 첨가한 중간엽 줄기세포의 조건배지 보다 더 높은 일산화질소의 발현을 유도하였다. 이때, 앞선 조건과 마찬가지로 IFN-γ 10 ng/ml)이 포함되었다. 상기 실험을 통해 감염된 큰대식세포와 중간엽 줄기세포가 서로 상호작용하여 큰대식세포 내 일산화질소 의 발현을 조절함을 확인하였고, 중간엽 줄기세포 자체에서는 일산화질소의 생성이 관찰되지 않았음(도 8B). As shown in Fig. 8, conditioned medium of mesenchymal stem cells pre-stimulated in the conditioned medium of infected RDA cells expresses higher expression of nitrogen monoxide than conditioned medium of mesenchymal stem cells supplemented with condition medium of uninfected RDA cells Lt; / RTI > At this time, IFN-γ (10 ng / ml) was included as in the previous condition. In the above experiment, it was confirmed that the infected RANTES cells and the mesenchymal stem cells interact with each other to regulate the expression of nitric oxide in the rat mesenchymal cells, and no formation of NO was observed in the mesenchymal stem cells themselves (FIG. 8B) .

또한 본 발명에서는 일산화질소의 생성 기작을 확인하고자 하였다. 일산화질소 생성 기작에는 p38, STAT-1, IRF-1 또는 NFkB 등이 중요하게 작용한다고 알려져 있으므로, 웨스턴 블랏(western blot)으로 확인하였다. 즉, 큰대식세포를 24 well 세포 배양 접시(cell culture plate)에 2x10⁵ cell로 조절하여 세포를 부착시킨 후 24시간 동안 10% FBS 및 1% 항생제(antibiotics)를 포함한 DMEM에서 배양하였다. 그 다음, M. abscessus를 1x10⁵ cell(MOI=0.5)로 감염 시킨 다음 4시간 동안 방치 한 후 100 ug/ml 아미카신(amikacin)을 2 시간 동안 처리 한 후 PBS로 수회 세척하여 세포 외의 균을 제거하였다. 그 다음, 혈청프리(serum free) DMEM에 4시간 동안 방치한 후 0.4 ㎛ pore size의 Transwell에 MSC를 2x10⁴ cell로 조절하여 1시간 동안 배양하였다. 이때, 실험 조건에 따라 IFN-γ 5 ng/mL로 처리하였다. 배양이 끝난 후, Transwell 및 세포 배양액을 제거한 후 PBS로 수회 세척한 후 1x 웨스턴 블랏 샘플 완충액(western blot sample buffer) 100 ㎕를 well에 직접 넣어 시료(sample)를 획득 한 후 12% SDS page에 전기영동 하였다. 그 다음, PVDF membrane에 transfer하여 웨스턴 블랏을 실시 하였다. In the present invention, a method of generating nitrogen monoxide was also examined. Since it is known that p38, STAT-1, IRF-1 or NFkB plays an important role in the production of nitrogen monoxide, it was confirmed by western blotting. Rats were cultured in DMEM containing 10% FBS and 1% antibiotics for 24 hours after adhering the cells to 2 × 10 ⁵ cells in a 24-well cell culture plate. Subsequently, M. abscessus was infected with 1 × 10 ⁵ cells (MOI = 0.5) and allowed to stand for 4 hours. Then, 100 μg / ml amikacin was treated for 2 hours and washed several times with PBS to remove extracellular bacteria . Then, the cells were allowed to stand for 4 hours in serum-free DMEM, and the MSCs were adjusted to 2 × 10 ⁴ cells in a transwell of 0.4 μm pore size and cultured for 1 hour. At this time, IFN-γ was treated with 5 ng / mL according to experimental conditions. After the incubation, the cells were washed with PBS, and then 100 μl of 1x western blot sample buffer was added directly to the wells. The samples were then transferred to a 12% SDS page. Respectively. Then, the membrane was transferred to a PVDF membrane and subjected to Western blotting.

세포 분획실험은 선행 조건과 동일하게 실험한 후, 세포를 회수하여 PBS로 세척한 후 0.1% NP-40를 포함한 PBS를 첨가하여 5 차례 피펫팅 한 후 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 세포질 분획, pellet을 핵 분획으로 사용하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. Cells were collected and washed with PBS, and PBS containing 0.1% NP-40 was added thereto. The cells were then pipetted 5 times and centrifuged. After centrifugation, the supernatant was used as the cytoplasmic fraction and the pellet as the nuclear fraction. The results are shown in Fig.

도 9에 나타낸 바와 같이, p38과 STAT-1 및 IRF-1의 변화는 관찰되지 않았다. 하지만, NF-kB의 저해 요소(inhibitory factor)인 IkBa의 하강(degration)이나 p65의 핵내 이동(nuclear translocation)이 중간엽 줄기세포 처리 시 증가됨을 확인하였다(도 9a). 뿐만아니라, NFkb 신호전달 억제제(signal inhibitor)인 Bay 11-7082를 각각 0.1, 1 및 10 μM 농도로 24시간 동안 처리한 경우, 농도 의존적으로 일산화질소의 생성이 억제됨을 확인하였다(도 9b). 그러나 Bay 11-7082를 각각 0.1, 1 및 10 μM 농도로 처리하고, 3일 동안 배양한 경우, 중간엽 줄기세포의 대식세포 내 M. abscessus 성장 억제효과가 저하되어, 10 μM 인 경우 대조군과 비슷한 수준의 세포 내 M. abscessus의 성장(intracellular growth)률을 보였다(도 9c). 따라서 NFkb 신호전달이 줄기세포의 항생능과 관련이 있음을 확인하였다.As shown in Fig. 9, no change in p38, STAT-1 and IRF-1 was observed. However, it was confirmed that the degration of IkBa, which is an inhibitory factor of NF-kB, and the nuclear translocation of p65 are increased during mesenchymal stem cell treatment (Fig. 9A). In addition, when NFkb signal inhibitor Bay 11-7082 was treated at concentrations of 0.1, 1 and 10 μM for 24 hours, it was confirmed that the production of nitrogen monoxide was inhibited in a concentration-dependent manner (FIG. 9B). However, when Bay 11-7082 was treated at 0.1, 1 and 10 μM concentrations for 3 days, the effect of inhibiting the growth of M. abscessus in macrophage of mesenchymal stem cells was lowered. In the case of 10 μM, Level intracellular growth of M. abscessus (Figure 9c). Therefore, it was confirmed that NFkb signaling is related to antibiotic activity of stem cells.

Claims

An antibiotic composition for Mycobacterium abscessus containing stem cells as an active ingredient.

The antibiotic composition for Mycobacterium abscessus according to claim 1, wherein the stem cells are mesenchymal stem cells.

The method according to claim 1,
The stem cells are composed of a compact bone, a bone marrow, an adipose tissue, an umbilical cord blood, an ear, a lung, a skin and a combination thereof Wherein the stem cell is a mesenchymal stem cell derived from any one selected from the group consisting of: < RTI ID = 0.0 > (I) < / RTI >

The method according to claim 1,
Wherein the stem cells are any one selected from the group consisting of stem cells, cultures of the stem cells, concentrates of the cultures, dried products of the cultures or concentrates, and combinations thereof, wherein the stem cells are selected from the group consisting of Mycobacterium abscessus Mycobacterium abscessus) .

delete

Mycobacterium abscessus Antibody cell therapy agent with stem cells as an active ingredient.