KR101642042B1 - 티아졸리딘디온의 p35 및 p25 활성 변화에 대한 용도 - Google Patents

티아졸리딘디온의 p35 및 p25 활성 변화에 대한 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물, 가장 바람직하게는 트로글리타존 (troglitazone)의 p35의 활성을 감소능에 의한 CDK5 활성 감소 및 이에 따른 타우(tau) 인산화 감소 메커니즘 및 이의 이용에 관한 것으로, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)의 p35의 활성 저해 기능에 따른 질환의 치료 및 예방 등을 포함하는 다양한 용도에 관한 것이다.

Description

티아졸리딘디온의 p35 및 p25 활성 변화에 대한 용도{The Use of Thiazolidinediones for inhibiting p35 and p25 activity}
본 발명은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)의 타우(tau) 인산화 상에서의 작용 메커니즘에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)은 프로테오좀성 분해(proteasomal degradation)의 강화에 의해 p35 및 p25의 활성을 변화시킴으로써 CDK5 활성 또한 감소시켜 결과적으로 타우(tau) 인산화를 감소시키는 메커니즘 및 이의 용도에 관한 것이다.
티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 약물은 제2형 당뇨병 및 알츠하이머의 치료에 이용되는 약물로 알려져 있는 경구 혈당강하제로서 ‘글리타존(glitazones)'이라고도 하는데, 이 약물은 인슐린 저항성을 개선시킴으로서 혈당 강하 및 대사증후군의 여러 구성요소에 대한 작용들을 나타내며, 이러한 이유로 인하여 ’insulin sensitizers'라고도 한다. 주로 간, 지방조직, 근육과 같은 인슐린의 작용 부위에서 인슐린 저항성을 개선시키며 대사 증후군의 다른 임상양상에 대하여서도 좋은 효과를 보인다. 이러한 특성은 심혈관계 질환을 비롯한 당뇨병의 만성 합병증에 대한 효과를 기대해 볼 수 있게 한다.
TZD는 PPAR (peroxisome proliferators-activated receptor)로 불리는 핵 수용체를 통해 일차적인 효과를 나타낸다. PPAR에는 PPAR-α, PPAR-γ, 그리고 PPAR-δ의 세 종류가 존재한다. TZD는 이중 PPAR-γ와의 결합과 그로 인한 활성화를 통해 항당뇨성 기전을 나타낸다. 활성화된 PPAR은 이미 활성화된 특정 PPAR 아형에 대한 인식부위를 포함한 유전자의 전사를 증가시킨다. 또한 PPAR-γ의 활성화로 인해 생성되는 유전자는 지방세포 분화, 지방 항상성 유지, 그리고 인슐린 작용에 있어 중요한 조절인자이다. TZD는 포도당 운반유전자인 GLUT1과 GLUT4의 발현을 활성화하기도 한다.
이러한 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 약물 중에서, 트로글리타존 (troglitazone, TRO)은, 인슐린 저항성 (insulin resistance)을 가짐으로써 동물과 인간의 인슐린 감도를 향상시키는 경구 활성약물로서 [J.J. Nolan et al ., N. Engl. J. Med. 331 (1994) 1188-1193; A.R. Saltiel et al ., Diabetes 45 (1996) 1661-1669], 2형 당뇨병 및 알츠하이머 질환 치료제로 널리 알려져 있다 [상품명: 레쥴린 (rezuline)].
TRO는 리간드-활성 핵 수용체의 일종인 peroxisome proliferator-activated 수용체 γ (이하 'PPARγ'라 약칭함)에 결합하여 이를 활성화시킨다 [J.M. Lehmann et al ., J. Biol. Chem. 270(1995) 12953-12956; T.M. Willson et al ., J. Med. Chem. 39 (1996) 665-668]. 활성화된 PPARγ는 타겟 유전자의 전사를 조절하는데, 이는 지방 세포의 지방산과 지질 대사에 주로 연관되어 있으며, 지방 세포의 분화와 관련이있다 [B.M. Spiegelman et al ., Cell 87 (1996) 377-389]. 그러나, 최근의 연구에서는 TRO가 인간 흉부암 및 전립선암, 골수성 백혈병 (myeloid leukemia) 및 혈관분포성 평활근 세포 (vascular smooth muscle cell)의 성장 또한 저해한다는 것이 밝혀졌다 [E. Mueller et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 10990-10995; R.E. Law etal ., J. Clin. Invest. 98 (1996) 1897-1905; A. Sugimura et al ., Biochem. Biophys. Res. Commun. 261 (1999) 833-837; Y. Hattori et al ., Biochem. Biophys Res. Commun. 273 (2000) 1144-1149]. p21 Cip/WAF1 유도는 대장암 세포를 포함하는 많은 다른 세포 유형의 성장 억제와 밀접한 관련이 있으며 [S.Y. Archer, et al ., Proc. Natl. A cad. Sci. USA 95 (1998) 6791-6796; K. Nakano et al ., J. Biol. Chem. 272 (1997) 22199-22206], 이는 p53 종양 억제유전자 [W.S. El-Deiry et al ., Cell 75 (1993) 817-825] 또는 ERK (extracellular signal regulated kinase) 경로 [D. Woods et al ., Mol. Cell. Biol. 17 (1997) 5598-5611; A. Sewing et al ., Mol. Cell. Biol. 17 (1997) 5588-5597; Y. Liu et al ., Cancer Res. 56 (1996) 31-35]의 활성에 의존한다는 보고들이 존재한다.
그러나, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물, 특히 트로글리타존(Troglitazone) 화합물이 실제로 어떠한 메커니즘(기작)을 통해서 상기 질환들의 치료에 유용한지 여부는 정확하게 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)이 어떠한 작용 메커니즘에 의해 타우(tau) 인산화를 저해하는지 규명하고자 연구하던 중, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)이 프로테오좀성 분해(proteasomal degradation)의 강화에 의해 p35 및 p25의 활성을 변화시키고, 이에 의해 CDK5 활성 또한 감소시킴으로써 타우(tau) 인산화를 감소시킨다는 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물의 타우(tau) 인산화 상에서의 p35의 활성 억제 및 CDK5 활성 감소능과 관련된 분자적 메커니즘에 관한 것으로,
본 발명의 주요한 목적은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물 을 이용하는, p35의 발현 또는 활성 억제방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 p35 활성과 관련된 질환의 치료를 위해 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)과 병용하여 사용할 수 있는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물을 함유하는, p35 활성 관련 질환 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물 또는 이의 유도체를 처리하는 것을 포함하는, p35 발현 또는 활성 억제방법을 제공한다.
이 때, 상기 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물은 트로글리타존 (troglitazone), 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 화합물일 수 있고, 가잘 바람직하게는 트로글리타존 (troglitazone)이다.
Figure 112013096130827-pat00001

상기 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물은 p35 발현 또는 활성 억제를 통해 CDK5 활성도 억제하고, 나아가 타우(tau)-Thr231 인산화를 감소시킨다.
특히, 프로테오좀성 분해(proteasomal degradation)의 강화에 의해 p35의 발현 또는 활성이 억제되는데, 이러한 p35 발현 또는 활성 억제는
PPARγ(peroxisome proliferators-activated receptor γ) 신호 경로; 및
GSK3β(glycogen synthase kinase 3β), PKA(protein kinase A), PP2A(protein phosphatase 2A) 신호 경로에 대하여 독립적으로, 즉 비의존적으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 분자적 메커니즘에 기초하여,
(a) p35를 발현하는 세포에 트로글리타존 (troglitazone)을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에 후보물질을 추가로 처리하는 단계;
(c) p35의 발현 또는 결합 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 p35의 발현 또는 결합 수준을 더욱 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, p35 활성과 관련된 질환의 치료를 위해 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)과 병용하여 사용할 수 있는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공할 수도 있다. 이 때에도, CDK5의 발현 또는 결합 수준을 추가로 더 측정하여 비교할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분자적 메커니즘에 기초하여,
티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물을 함유하는, p35 활성 관련 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있고, 가장 바람직하게는 트로글리타존 (troglitazone)을 유효성분으로 한다.
이 때, 상기 p35 활성 관련 질환은, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물, 특히 트로글리타존(Troglitazone) 화합물 p35 활성 및 CDK5 활성 억제 기능에 의해 치료될 수 있는 어떠한 질환이라도 무방하다.
예를 들어, 비 인슐린 의존성 당뇨병, 비만증, 조울증, 정신분열증, 탈모, 유방암, 비 소세포 폐암, 갑상선암, T 또는 B-세포 백혈병, 골다공증, 말라리아, 암 화학요법에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증 및 바이러스 유발 종양으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 질환; 또는 알츠하이머병, FTD (Frontotemporal dementia), 피크병 (Pick's disease), 파킨슨병, 뇌졸중 또는 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된 퇴행성 신경질환일 수 있다.
이처럼, 본 발명은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물의 p35 활성 감소능에 따른 메커니즘의 여러가지 용도에 관한 것이다.
본 발명의 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물, 특히 트로글리타존(Troglitazone) 화합물의 p35 활성 감소능 및 CDK5 활성 감소능과 관련된 분자적 메커니즘은 p35 활성과 관련된 다양한 질환에 대한 치료 및 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 SH-SY5Y 세포에서 트로글리타존이 tau-Thr231 인산화를 감소시킴을 확인한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 2는 트로글리타존이 CDK5 활성을 감소시키고 p35를 하향 조절함을 확인한 결과이다.
도 3은 트로글리타존-매개된 tau-Thr231 인산화에서 p25의 이소성 발현(Ectopic expression)에 대한 영향을 관찰한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 4는 트로글리타존이 프로테오좀성 분해(proteasomal degradation)의 강화에 의해 p35 발현을 감소시킴을 보여주는 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 5는 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현에서의 트로글리타존-매개된 감소는 PPARγ 독립적임을 보여주는 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 6은 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)의 tau-Thr231 인산화 및 p35발현 저해능을 확인한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 7은 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현에서의 트로글리타존-매개된 감소는 GSK3β, PKA, 및 PP2A 신호 경로와 독립적임을 보여주는 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 8은 트로글리타존(Troglitazone)은 일차 배양한 대뇌 피질 신경세포에서 tau-Thr231 인산화 및 p35 분해 상에서 동일한 효과를 가짐을 확인한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 9는 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물 및 타우 인산화와 관련된 분자적 메커니즘에 대한 모식도이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"트랜스펙션(transfection)"은 배양동물 세포에 핵산(DNA, RNA 등)을 직접 도입하여 세포 내에서 유전형질을 발현시키는 방법을 의미한다. 이 방법으로 발암기구, 감염, 면역, 발생, 정보전달 등 의학, 생물학의 여러 가지 문제에 세포 수준에서 접근할 수 있게 되었다. 도입한 핵산은 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 것이 일반적인 방법이다. 도입한 유전자가 세포에서 안정화된 경우는 염색체에 끼어들어간 경우가 많았다. 핵산을 도입한 세포를 형질도입체라고 한다. 형질주입 효율이 매우 낮기 때문에 효율을 높이기 위해서 여러 가지 방법을 개발되었다. 그 중에서도 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법. 전기천공법, 재분포법(리포솜이라는 인공막과 DNA복합체를 만들게 하는 세포와 융합시키는 방법) 등이 있다.
"억제제 또는 저해제(inhibitor)"는 목적하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 억제제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다.
"질환(disorder)"이라는 용어는 본 발명의 유전자도입 동물 모델을 사용하여 동정되는 분자를 이용하여 치료하는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 어떤 상태이다. 이것은 포유류를 의문의 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 조건들을 포함한 만성과 급성 질환들 또는 질병들을 포함한다. 본 명세서에서 다루어질 질환들은 p35 및 p25의 활성과 관련된 질환들이다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
"상승작용"이라는 용어는, 각 성분이 병용(조합) 투여될 때 발생되는 효과가, 단일 성분으로서 단독으로 투여될 때 발생되는 효과의 합보다 더 큰 것을 말한다(Chou and Talalay, Adv. Enzyme. Regul. , 22:27-55, 1984).
"병용 투여(administered in combination)"라는 용어는 화합물 또는 성분이 대상 동물에 함께 투여되는 것을 의미한다. 각 화합물 또는 성분이 함께 투여된다는 것은 원하는 치료 효과를 얻기 위해서, 각 성분을 동일한 시간에 또는 임의의 순서로 또는 상이한 시간에 순차적으로 투여될 수 있음을 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물은 인슐린 저항성 (insulin resistance)을 가짐으로써 동물과 인간의 인슐린 감도를 향상시키는 약물로써 종래 2형 당뇨병 및 알츠하이머 질환 치료에 유용함이 알려져 있으나, 실제로 어떠한 메커니즘(기작)을 통해서 상기 질환들의 치료에 유용한지 여부는 정확하게 알려진 바가 없다.
본 발명은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물의 생리적 기작 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 트로글리타존 (troglitazone)이 p35 및/또는 p25의 활성을 효과적으로 저해함을 본 발명자들이 처음 규명하였다.
구체적으로는, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물이 프로테오좀성 분해(proteasomal degradation)를 촉진시켜 p35/p25 발현 및 활성을 감소시키고, 이에 의해 CDK5 활성을 감소시킴으로써, 결과적으로 타우(tau) 인산화를 감소시키는 메커니즘 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서는 하기 트로글리타존(troglitazone), 로지글리타존(rosiglitazone) 및 피오글리타존(pioglitazone) 등의 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물을 모두 포함하나, 가장 바람직하게는 트로글리타존(troglitazone)에 대한 것이다:
Figure 112013096130827-pat00002

이하에서 별도의 설명이 없는 한, 상기 화합물들은, 화합물 그 자체, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 및 프로드럭을 모두 포함하는 개념으로 사용된다.
본 발명의 대표적인 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물은 하기와 같은 메커니즘에 따라 타우(tau) 인산화를 억제한다. 일 구체예로, 트로글리타존(Troglitazone)의 타우(tau) 인산화 상에서 분자적 메커니즘을 예에 의해 를 억제한다. 이와 관련된 분자적 메커니즘에 대해 도 9에서 도식화하여 나타내었다.
(1) 트로글리타존(Troglitazone)은 tau-Thr231 인산화를 감소시킨다.
SH-SY5Y 세포에서 트로글리타존(Troglitazone)은 tau-Thr231 인산화를 감소시킨다. 트로글리타존(Troglitazone)이 전체 tau 발현의 변화 없이 용량 및 시간 의존적으로 tau-Thr231 인산화를 감소시킨다. 그러나, 트로글리타존(Troglitazone)은 Thr212, Ser262, 및 Ser396와 같은 다른 경우에서의 tau의 인산화 상태를 변경시키지 않는다.
(2) 트로글리타존(Troglitazone)은 CDK5 활성을 감소시키고 p35를 하향-조절한다.
트로글리타존(Troglitazone)은 용량 및 시간 의존적으로 p35 관련 키나아제의 활성을 현저히 감소시키고, 이는 CDK5 키나아제 활성의 감소로 이어진다.
본 발명의 일 실시예에서는, p35의 현저한 감소 수준(그러나 CDK5는 아님)을 트로글리타존-처리된 세포 상 p35 IP에서 확인함으로써, CDK5 활성 상에서 트로글리타존(Troglitazone)의 저해 효과가, 이러한 감소된 p35 수준 때문임을 발견하였다. 또한, p25의 이소성 발현(Ectopic expression)은 tau-Thr231 인산화에서 트로글리타존(Troglitazone) 매개된 감소를 뒤집는 효과를 가진다는 사실을 발견함으로써, 트로글리타존(Troglitazone)이 p35의 활성도 저해를 통해 tau의 인산화를 억제함을 알 수 있었다.
특히, 상기 트로글리타존(Troglitazone)의 p35 발현 및 활성 감소능은 프로테오좀성 분해(proteasomal degradation)의 강화에 따른 것이다.
p35이 프로테오좀성 분해에 의해 조절되는 점(Patrick et al. 1998) 및 트로글리타존(Troglitazone)이 사이클린 D1의 유비퀴틴-의존성 프로테오좀성 분해를 매개하고 있는 점(Wei et al. 2008)은 이미 알려져 있는 사실이므로, 본 발명의 일 실시예에서는 공지된 프로테오좀성 저해제 MG-132 또는 락타시스틴을 사용하여 이러한 저해제들이 tau-Thr231 인산화의 감소 및 p35 단백질의 하향 조절 모두에 대해 현저하게 역으로 뒤집는 결과를 보임을 확인하였다.
즉, 트로글리타존(Troglitazone)은 프로테오좀성 분해(proteasomal degradation)의 강화에 의해 p35 발현 및 활성을 감소시키는 것이다.
(3) 트로글리타존(Troglitazone)-매개된 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현감소는 PPARγ 신호 경로; 그리고 GSK3β, PKA, 및 단백질 포스파타아제 2A 신호 경로에 대하여 독립적이다.
티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)은 핵 내 전사인자를 구성하는 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ)에 결합하여 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이 전사인자는 TZD가 결합하는 PPAR-γ와 레티노이드 ㅎ화합물이 결합하는 RXR(retinoid X receptor)로 구성되어 있으며, TZD가 PPAR-γ에 결합하게 되면 전사인자가 활성화되어 특정 결합 부위(Peroxisome Proliferator Response Element, PPRE)를 가진 유전자에 결합하게 되고 그 유전자의 전사를 촉진하거나 억제함으로서 작용을 나타나게 되는 것이다.
그러나, 본 발명자들은 tau-Thr231 인산화 및 p35 분해 상에서 트로글리타존(Troglitazone)의 저해 효과는 PPARγ-독립적 신호 경로에 의해 매개됨을 확인하였다. 즉, 트로글리타존(Troglitazone)-매개된 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현감소는 PPARγ에 비-의존적이다.
또한, 본 발명의 트로글리타존(Troglitazone)-매개된 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현 감소능은, tau 인산화의 조절에 중요한 역할을 하는 다른 단백질인 GSK3β, PKA, 및 PP2A(protein phosphatase 2A) 신호 경로에 대해서도 독립적이다.
(4) 다른 TZDs, 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)도 tau-Thr231 인산화 및 p35발현을 저해한다.
티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계의 다른 화합물인 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)도 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현에 대해 저해능을 가진다.
다만, 트로글리타존(Troglitazone)의 경우와 비교하여 볼 때, 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)은 트로글리타존(Troglitazone)과 동일한 억제 효과를 수득하기 위해 보다 높은 용량이 요구된다는 점에서 차이가 있다. 그러므로, 본 발명에서 가장 바람직한 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물은 트로글리타존(Troglitazone)이다.
이처럼, 본 발명의 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물, 특히 트로글리타존(Troglitazone)에 따른 타우 인산화 억제 메커니즘은 p35 및 p25의 활성 감소능에 의한 CDK5 활성 감소에 의한 것으로, 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다.
따라서, 본 발명은 이러한 메커니즘 발견에 기초하여 p35의 활성 감소능 및 CDK5 활성 감소능을 가지는 감소티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물, 특히 트로글리타존(Troglitazone) 화합물 및 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
일 구체적인 태양으로 본 발명은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물, 특히 트로글리타존(Troglitazone) 화합물 또는 이의 유도체를 이용하여 p35 활성을 억제시키는 방법 및 CDK5 활성을 억제시키는 방법; 그리고 나아가 타우(tau) 인산화를 저해하는 방법을 제공한다.
다른 구체적인 태양으로 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물을 함유하는 p35/p25 활성 및 CDK5 활성과 관련된 질환 치료용 조성물을 제공한다.
상기 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물은 피오글리타존(pioglitazone), 로지글리타존(rosiglitazone), 및 트로글리타존(Troglitazone)등에서 선택될 수 있고, 트로글리타존(Troglitazone)을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 치료 및 예방 대상이 될 수 있는 질환은 p35/p25 활성 및 CDK5 활성과 관련된 질환으로써, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물, 특히 트로글리타존(Troglitazone) 화합물 p35/p25 활성 및 CDK5 활성 억제 기능에 의해 치료될 수 있는 어떠한 질환이라도 무방하다.
예를 들어, 비 인슐린 의존성 당뇨병, 비만증, 조울증, 정신분열증, 탈모, 유방암, 비 소세포 폐암, 갑상선암, T 또는 B-세포 백혈병, 골다공증, 말라리아, 암 화학요법에 의해 유발된 호중성 백혈구 감소증 및 바이러스 유발 종양으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 질병; 또는 퇴행성 신경질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 상기 퇴행성 신경질환은 예를 들어, 알츠하이머병, FTD (Frontotemporal dementia), 피크병 (Pick's disease), 파킨슨병, 뇌졸중 또는 다발성 경화증 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 유효성분으로 상기 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또 다른 태양으로, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물의 p35 활성 억제능 및 CDK5 활성 억제능을 이용하여, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)과 병용하여 사용할 수 있는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.
p35/p25 활성 및 CDK5 활성과 관련된 질환의 치료에 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물을 사용함에 있어서, 치료의 효과를 더욱 상승(향상)시킬 수 있는 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 스크리닝 방법은
(a) p35 또는 p25을 발현하는 세포에 트로글리타존 (troglitazone)을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에 후보물질을 추가로 처리하는 단계;
(c) p35 또는 p25의 발현 또는 결합 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 p35 또는 p25의 발현 또는 결합 수준을 더욱 변화시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 후보물질은 핵산, 단백질, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 발현 수준은 유전자의 전사 활성 수준을 측정하거나 발현된 단백질량을 측정할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 전사활성 수준은 루시퍼라제 분석법(Luciferase Assay)을 이용하는 것이 바람직하고, 단백질량은 웨스턴블랏(Western blot) 분석법을 이용하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 결합은 면역침강(immunoprecipitation) 방법에 의해 측정될 수 있다. 면역침강은 예를 들면, 문헌에 있는 방법에 의해 수행될 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988). SDS-PAGE는 면역침강된 단백질들의 분석에 일반적으로 사용되고, 결합된 단백질은 적합한 농도의 겔(gel)을 이용하여 단백질의 분자량에 의해 분석될 수 있다.
이처럼, 본 발명은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD) 화합물, 가장 바람직하게는 트로글리타존 (troglitazone)의 p35의 활성 감소능에 의한 CDK5 활성 감소 및 이에 따른 타우(tau) 인산화 감소 메커니즘 및 이의 이용에 관한 것으로, 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)의 p35의 활성 저해 기능에 따른 다양한 용도를 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
1. 재료
트로글리타존(Troglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone) 을 Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입하고, 피오글리타존(pioglitazone)은 Adipogen International, Inc. (San Diego, CA,USA)로부터 구입하였다.
GW9662, 오카다 산(okadaic acid) 및 LiCl는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하고, MG-132 및 락타시스틴은 각각 Calbiochem (Darmstadt, Germany) 및 Enzo Life Sciences Inc. (Farmingdale, NY, USA)에서 구입하였다. ATP는 PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA,USA)로부터 수득하였다. 정제된 히스톤 H1 단백질 및 로스코비틴은 Calbiochem로부터 구입하고 H-89은 Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA)에서 구입하였다. 단백질 A 아가로즈는 Thermo Scientific Inc. (Rockford, IL, USA)에서 수득하였다.
p-tau-Thr212, p-tau-Thr231, p-tau-Ser262, 및 tau에 대한 항체들은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하고, p-tau-Ser396에 대한 항체는 Cell Signaling Technology Inc. 에서 구입하였다. CDK5 및 p35에 대한 항체들은 Santa Cruz Biotechnology (La Jolla, CA, USA)에서 구입하고, β-actin에 대한 항체는 Sigma-Aldrich Co.에서 수입하였다. 세포 배양에 사용한 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium), MEM(Eagle’s minimal essential medium), Dulbecco’s phosphate-buffered saline, FBS(fetal bovine serum), 페니실린 및 스트렙토마이신 항생제, L-글루타민, 트립신-EDTA 용액 및 플라스틱을 Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 모든 다른 화학물질들은 가장 순도가 높은 것을 사용하였다.
2. SH - SY5Y 세포 배양, 약물 처리 및 트랜스펙션
SH-SY5Y 신경아종 세포(neuroblastoma cells)들을 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하고 10% FBS 보충된 DMEM 배지에서 37℃, 대기 중 5% CO2 에서 유지시켰다. 70% 컨플루언스까지 성장시킨 SH-SY5Y 세포들을 1% FBS 보충된 DMEM에서 규정 시간 동안 추가로 배양하였다. 일부 실험에서, 세포들에 다양한 농도의 약물 또는 화학 물질들을 처리하였다.
트랜스펙션 실험을 위해, bovine p25 (Cho et al. 2010)를 인코딩하는 pcDNA3.1 포유류 발현 벡터-함유 cDNAs를, Lipofectamine 2000 (Invitrogen)를 이용하여 60분 배양 디쉬에서 70% 컨플루언스까지 성장시킨 세포에 트랜스펙션하였다. 대조군 실험을 위해, 동일 카피 수의 pcDNA3.1 포유류 발현 벡터를 사용하였다.
3. 랫트 일차 대뇌 피질성 뉴런 배양( Rat primary cortical neuron culture )
일차 대뇌 피질성 뉴런(신경세포)을 Sprague-Dawley 랫트의 배아 18일 피질을 분리하여 얻었다(Kwon et al. 2011). 모든 실험 공정들은 승인된 건국 대학교의 실험 동물 윤리 위원회에 의해 승인된 실험 공정 및 프로토콜에 의해 수행하였다.
각 실험에서 8주령의 임신한 암컷 Sprague-Dawley 랫트(n = 2) (250-300 g)을 Orient Bio Inc. (Seoul, South Korea) 로부터 구입하여 사용하였고, 조정된 온도 (22±1℃) 및 습도 (50±10%)에서 12시간씩 번갈아 빛-어둠 싸이클 상에서 살게 하였다. 음식 및 물은 실험에 걸쳐 임의로 공급하였다.
간단히 설명하면, 피질(뇌막에서 떨어져있는)을 기계적으로 분리하고, 20 mM 글루코스 보충된 MEM(Eagle’s minimal essential medium) 배양 배지에서 flame-polished Pasteur pipette을 이용하여 부드럽게 단일세포로 정제하였다(triturated).
그 후 세포들을, 5% FBS, 5% horse 혈청 및 2 mM 글루타민으로 보충된 배양 배지에서 50 ㎍/mL poly-D-lysine으로 코팅된 플레이트 상에 씨딩하였다. 추가로, 상기 배양물을 습한 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 유지시켰다.
순수한 신경세포성 배양을 위해, 2μM cytosine-β-arabinofuranoside를 배양 2일 후 첨가하고 (Kwon et al. 2011), 배양된 신경세포들을 8일째 실험에 사용하였다.
4. 웨스턴 블랏 분석
다양한 화학물질의 부존재 또는 존재에서 트로글리타존(Troglitazone)을 처리한 후 세포들을 용해 버퍼(lysis buffer) [20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 mM β-glycerophosphate, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, and 19 Protease Inhibitor CocktailTM (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)]에서 용해시켰다.
용해물에서 동량의 단백질 (~20 μg)을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에의해 분리하고, 전기영동적으로 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 옮겼다.
전기적으로 트랜스퍼한 블랏들을 적절한 항체들을 이용하여 단백질 발현양을 측정하였다: tau (1 : 2000 dilution), p-tau-Thr231 (1 : 1000 dilution), p35/25 (1 : 500 dilution), 및 actin (1 : 100 000 dilution)에 대한 항체 및 상응하는 2차 항체 이용.
그리고, 화학발광 시약(ECL solution; Amersham, DE, USA)을 이용하여 발색시킨 후 LAS 기계(LAS3000, Fuji)를 이용해 밴드를 확인 후 정량하였다.
5. 면역침강법( Immunoprecipitaion )
SH-SY5Y 세포들에 20 μM 트로글리타존(Troglitazone) 또는 용매인 DMSO[dimethylsulfoxide] 을 24시간 동안 처리하고, 용해 버퍼에 용해시킨 후, 용해물을 10분 동안 12000 g에서 원심분리하였다. 상층액 (400 μg of protein)을 4 μL의 anti-CDK5 또는 anti-p35 항체를 이용하여 면역침강시켰다. 대조군 실험으로써, 4 μL의 비-면역 혈청(non-immune serum)(정상 래빗 IgG)을 사용하였다. 면역침강물을 용해 버퍼로 3회 세척하고 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
6. In vitro 키나아제 활성 분석
4 μL 의 anti-CDK5 또는 anti-p35 항체를 이용하여 면역침강한 후, 면역침강물을 용해 버퍼로 2회 세척하고 키나아제 분석 버퍼 [20 mM HEPES (pH 7.4), 5 mM MgCl2, and 1 mM dithiothreitol]로 2회 세척하였다. 대조군 실험으로써, 면역침강물을, 4 μL 의 비-면역 혈청을 이용하여 용해물로부터 수득하였다. 각 면역침강물을 25 μL의 키나아제 분석 버퍼에 재현탁하고, 기질로써 2 μCi [γ-32P]ATP 및 2 μg 히스톤 H1을 첨가함으로써 키나아제 분석을 수행하였다. 30℃에서 60분 동안 배양한 후, Laemmli 샘플 버퍼를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다.
상기 샘플들을 5분 동안 끓이고 10% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행한 후, 겔을 건조시켜 -80°C에서 X-ray 필름에 노출시켰다. 키나아제 활성은 이미지 분석 프로그램(ImageJ;NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 수득한 밴드의 밀도를 측정함으로써 정량화하였다.
7. 통계학적 분석
모든 결과들을 평균 ± SD로 나타냈고, n은 실험의 횟수를 의미한다.
In vitro 키나아제 분석에서 2 값(point) 사이의 통계학적으로 유의미함은 Student’s t-test를 이용하여 평가하였다. 다양한 용량 또는 시간 값 사이의 통계학적 유의미함은 SPSS 패키지 프로그램(PASW Statistics 18, Quarry Bay, Hong Kong)을 이용하여 먼저 일어난 것으로 DUNCAN 분석 및 one-way ANOVA에 의해 결정하였다. 2개의 변수보다 많은 그룹 사이에서의 통계학적 유의미함은 two-way ANOVA에 의해 결정하였다. 모든 차이들은 p < 0.05에서 유의미한 것으로 간주한다.
실시예 1 : 트로글리타존(Troglitazone)에 의한 tau - Thr 231 인산화 감소
SH-SY5Y 세포에서 tau 인산화에 미치는 트로글리타존(Troglitazone)의 영향을 조사하였다.
그 결과를 도 1에 도시하였다.
트로글리타존(Troglitazone)이 전체 tau 발현의 변화 없이 용량 및 시간 의존적으로 tau-Thr231 인산화를 감소시킴을 확인하였다(도 1a 및 b). 24시간 동안 20 lM 트로글리타존(Troglitazone) 를 처리하면 현저하게 tau-Thr231 인산화를 감소시켰다(대조군의 30-40%), 이후 이어지는 모든 실험들을 이러한 조건을 이용하여 수행하였다. 트로글리타존(Troglitazone)는 Thr212, Ser262, 및 Ser396와 같은 다른 경우에서의 tau의 인산화 상태를 변경시키지 않았다.
실시예 2 : 트로글리타존(Troglitazone)에 의한 CDK5 활성 감소 및 p35 하향-조절( down - regulation )
CDK5이 tau의 과인산화(hyper-phosphorylation), 특히 병원성 상태에서(AD 포함) 과인산화를 매개하고 tau가 Thr231 잔기에서 CDK5에 의해 인산화된다고 알려져있어(Hanger et al. 1998, 2009), 본 발명자들은 트로글리타존(Troglitazone)이 CDK5 키나아제 활성을 억제함을 확인하고자 하였다.
그 결과, 도 2a에 도시한 바와 같이, CDK5 면역침강법(IP)을 이용한 in vitro 키나아제 분석은 트로글리타존(Troglitazone) (20 μM을 24시간 동안 처리함)이 CDK5 키나아제 활성을 현저히 억제함을 보여주었다.
나아가, 트로글리타존(Troglitazone)-처리된 세포에서 p35-관련 키나아제의 활성에서도 현저한 감소가 나타남을 확인하였다. 이는 CDK5 키나아제 활성에서 트로글리타존(Troglitazone)-유도된 감소에서 p35가 중요한 역할을 함을 시사한다(도 2a).
대조군 세포와 비교하여, p35의 현저한 감소 수준(그러나 CDK5는 아님)이 트로글리타존-처리된 세포 상 p35 IP에서 확인되었고, 이는 CDK5 활성 상에서 트로글리타존(Troglitazone)의 저해 효과가 감소된 p35 수준 때문임을 시사한다.
즉, 트로글리타존(Troglitazone)은 용량 및 시간 의존적으로 p35 발현을 드라마틱하게 감소시켰다(도 2b 및 c).
세포에서, 트로글리타존(Troglitazone)은 완벽하지는 않아도 매우 현저하게 tau-Thr231 인산화를 감소시켰다. 이는 모든 CDK5 활성이 본 발명의 조건에서 저해됨을 의미하는 것은 아니다(도. 2a).
추가로, 트로글리타존(Troglitazone)-처리된 세포에서 잔여(residual) CDK5 활성을 평가하기 위해, residual CDK5 활성을 억제시키는 특이적 CDK5 저해제, 로스코비틴(roscovitine)을 사용하였고, 그 결과, 로스코비틴이 트로글리타존(Troglitazone)-저해된 tau-Thr231 인산화를 더 감소시킴을 확인하였다.
실시예 3: p25 의 이소성 발현( Ectopic expression )
나아가, 본 발명자들은 p35 발현에서 트로글리타존(Troglitazone) 유도된 감소는 tau-Thr231 인산화의 감소를 야기하는지 여부를 직접적으로 확인코자 하였다.
bovine p25를 인코딩하는 cDNA를 세포 내로 트랜스퍼하였다.
그 결과, p25는 CDK5와 관련되어 있는 p35의 활동적인 분리된 형태(active, cleaved form)으로, 더 긴 활성화 시간을 보였다. 이러한 결과는 p25의 이소성 발현은 tau-Thr231 인산화에서 트로글리타존(Troglitazone)-유도된 감소를 현저히 역으로 뒤바꿈을 보여준다 (도. 3).
즉, p25의 이소성 발현(Ectopic expression)은 tau-Thr231 인산화에서 트로글리타존(Troglitazone) 매개된 감소를 억제함을 확인하였다.
실시예 4 : 프로테오좀성 분해( proteasomal degradation )의 강화에 따른 p35 발현을 감소
p35이 프로테오좀성 분해에 의해 조절되는 점(Patrick et al. 1998) 및 트로글리타존(Troglitazone)이 사이클린 D1의 유비퀴틴-의존성 프로테오좀성 분해를 매개하고 있는 점(Wei et al. 2008)은 이미 보고되어 있다.
이러한 사실에 근거하여, 본 발명자들은 공지된 프로테오좀성 저해제 MG-132 또는 락타시스틴을 사용하여 트로글리타존(Troglitazone)이 p35의 세포성 수준을 감소시키는 메커니즘을 규명코자 하였다
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, SH-SY5Y 세포에서 이러한 저해제들은 현저하게 tau-Thr231 인산화의 감소 및 p35 단백질의 하향 조절 모두에 대해 역으로 뒤집는 결과를 보였다.
즉, 트로글리타존(Troglitazone)은 프로테오좀성 분해(proteasomal degradation)의 강화에 따른 기작에 의해 p35 발현을 감소시킴을 확인하였다.
실시예 5 : p35 발현에서의 트로글리타존(Troglitazone)의 PPAR γ 의존성 여부
TZDs는 세포 타입 또는 사용된 농도에 의존하여 PPARγ-의존적 또는 독립적 방법에 있어서 영향을 끼치기 때문에(Ondrey 2009; Blanquicett et al. 2008), 본 발명자들은 트로글리타존(Troglitazone)에 의해 유도된 효과가 PPARγ 의존적인지에 대해 조사하였다
그 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, GW9662, 특이적 비가역 PPARγ 안타고니스트(antagonist)는 관찰된 효과를 변화시키지 않았고, 이는 , tau-Thr231 인산화 및 p35 분해 상에서 트로글리타존(Troglitazone)의 저해 효과가 PPARγ-독립적 신호 경로에 의해 매개됨을 시사한다.
즉, tau-Thr231 인산화 및 p35 발현에서의 트로글리타존(Troglitazone)-매개된 감소는 PPARγ 독립적임을 확인하였다.
실시예 6: 다른 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones,TZD)계 화합물의 경우
본 발명자들은 다른 TZDs, 즉, 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)도 역시 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현을 억제하는지 여부를 확인코자 하였다
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, SH-SY5Y 세포에서 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)은 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현을 용량 의존적 방법으로 억제하였다
그러나, tau-Thr231 인산화 및 p35 발현 상에서의 이러한 약물들의 효과는 트로글리타존(Troglitazone)의 경우와 비교하여 볼 때, 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)은 트로글리타존(Troglitazone)과 동일한 억제 효과를 수득하기 위해 보다 높은 용량이 요구된다는 점에서 차이가 있었다.
실시예 7 : tau 인산화의 조절에 이용되는 다른 키나아제와의 의존성
GSK3β(glycogen synthase kinase 3β) 및 PKA(protein kinase A), 및 PP2A(protein phosphatase 2A)와 같은 단백질 포스파타아제 등의 여러 키나아제들이 tau 인산화의 조절에 중요한 역할을 함이 잘 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 이러한 신호 경로(signaling pathway) 역시 tau-Thr231 인산화에서 트로글리타존(Troglitazone)-매개된 감소에 관여하는지 여부를 조사하였다
도 7a 및 b에 나타난 바와 같이, LiCl(GSK3β저해제) 및 H-89( PKA 저해제)는 기저 tau-Thr231 인산화를 p35 수준의 변화 없이 감소시켰다
또한, 이러한 두 화학물질의 각각의 처리는 트로글리타존(Troglitazone)-저해된 tau-Thr231 인산화를 더 억제시켰다 이러한 결과는 GSK3β 또는 PKA 둘 중 어떠한 것도 tau-Thr231 인산화의 트로글리타존(Troglitazone)-매개된 저해에 관여하지 않음을 시사한다.
언급한 두 화학물질과 달리, 오카다 산(okadaic acid)(PP2A 저해제)은 기저 tau-Thr231 인산화 및 p35 수준을 증가시켰다. 다만, 오카다 산은 트로글리타존(Troglitazone)의 관찰된 효과를 뒤바꾸지는 않았는데(도 7c), 이는 PP2A 신호 경로가 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현 상에서의 트로글리타존(Troglitazone)의 저해 효과를 매개하지 않음을 의미한다.
실시예 8: 일차 대뇌 피질 뉴런( primary cortical neurons )에서의 트로글리타존( Troglitazone ) 효과
마지막으로 본 발명자들은 SH-SY5Y 세포주에서 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현 상 트로글리타존(Troglitazone) 의 효과가 일차 뉴런세포에서도 역시 나타나는지를 확인코자 하였다
그 결과, 다양한 용량의 트로글리타존(Troglitazone) (0, 10, 20, 40, and 80 μM) 을 3시간 동안 일차 뉴런에 처리하여 동일한 억제 효과가 나타남을 확인하였다(도 8a).
또한, MG-132 (5 μM), 락타시스틴 (50 μM), 또는 GW9662 (5 μM)의 존재 또는 부존재 하에 일차 뉴런에 60 μM 트로글리타존(Troglitazone)을 처리하였다.
그 결과 도 8b 및 c에 도시한 바와 같이, MG-132 및 락타시스틴 모두 일차 대뇌 피질 뉴런에서 트로글리타존(Troglitazone)-저해된 tau-Thr231 인산화 및 p35 발현을 현저하게 역행시켰다. 그러나, GW9662(특이적 비가역 PPARγ 안타고니스트(antagonist))는 트로글리타존(Troglitazone)에 의해 저해된 tau-Thr231 인산화 및 p35발현을 전혀 변화시키지 않았다(도 8d).
이와 같은 결과를 통해, 일차 대뇌 피질 뉴런에서도 트로글리타존(Troglitazone)은 tau-Thr231 인산화 및 p35 분해 상에서 동일한 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

Claims (15)

  1. 시험관 내에서 하기 트로글리타존 (troglitazone), 피오글리타존(pioglitazone) 및 로지글리타존(rosiglitazone)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 세포주에 처리하는 것을 포함하는, p35 발현 또는 활성 억제방법:
    Figure 112015020316787-pat00014

  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 방법은 CDK5 활성을 억제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 방법은 타우(tau)-Thr231 인산화를 감소시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 방법은 프로테오좀성 분해(proteasomal degradation)의 강화에 의해 p35 발현 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 방법은
    PPARγ(peroxisome proliferators-activated receptor γ) 신호 경로; 및
    GSK3β(glycogen synthase kinase 3β), PKA(protein kinase A), PP2A(protein phosphatase 2A) 신호 경로에 대하여 독립적인 것을 특징으로 하는 방법.
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