KR101635552B1

KR101635552B1 - 표면적이 큰 니켈 산화물 나노구조체 및 이를 이용한 우레아제-기반 바이오센서

Info

Publication number: KR101635552B1
Application number: KR1020150040181A
Authority: KR
Inventors: 유효종; 두이 메이 히엔
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2015-03-23
Publication date: 2016-07-01
Anticipated expiration: 2035-03-23

Abstract

2단계 가열공정을 통하여 균일한 나노구조체의 다중층 형태의 니켈-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs)를 성공적으로 제조하였고, 이 입자의 크기를 줄임으로써 표면적을 더 크게 하기 위해 성장 공정에서 크기 조절제로서 피리딘과 아세트산을 가하였다. 그 결과물로 얻어진 배위 폴리머 나노입자는 제어된 온도에서 하소하여 규칙적인 다중층 형태와 높은 결정도를 나타내는 니켈 산화물 나노구조체(mL-NiOs)를 제조하였다. 또한, mL-NiOs의 BET 데이타는 잘 제어된 동공 크기(10 nm)와 비교적 높은 표면적(112 m²/g)을 나타내어 다양한 응용 가능성을 보여주었다. 합성된 mL-NiOs는 요소 탐지를 위해 우레아제 고정용으로 효과적인 기질로서 작용하는 ITO 전극 상에 성공적으로 증착시켰다. 이와 같이 제조된 바이오전극(Ur/NiO/ITO/glass)은 순환전류(CV)를 이용하여 요소 센싱에 이용할 수 있다. 제조된 전극은 높은 민감도를 나타내었고, 요소 농도와 전류 간에 직선 상관관계를 나타내었다.

Description

표면적이 큰 니켈 산화물 나노구조체 및 이를 이용한 우레아제-기반 바이오센서{Nickel Oxide Nanostructures with High Surface Area and Its Application for Urease-based Biosensor}

본 발명은 표면적이 큰 니켈 산화물 나노구조체와 그 제조방법 및 이를 이용한 우레아제-기반 바이오센서에 관한 것으로서, 2단계 가열공정을 통하여 균일한 나노구조체의 다중층 형태의 니켈-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs)를 성공적으로 제조하였고, 이 입자의 크기를 줄임으로써 표면적을 더 크게 하기 위해 성장 공정에서 크기 조절제를 가하였다. 그 결과물로 얻어진 배위 폴리머 나노입자는 제어된 온도에서 하소하여 규칙적인 다중층 형태와 높은 결정도를 나타내는 니켈 산화물 나노구조체(mL-NiOs)를 제조하였다. 또한, 합성된 mL-NiOs는 요소 탐지를 위해 우레아제 고정용으로 효과적인 기질로서 작용하는 ITO 전극 상에 성공적으로 증착시켰다.

바이오센싱은 최근 의학적 진단부터 환경오염물질 탐지까지 수많은 응용분야로 인해 대단한 관심을 끌고 있다. 바이오센서는 신호 탐지를 위해 적절한 변환기와 짝을 이루는 분자 인식요소로서 효소를 이용하며, 따라서 비효소 센서에 비하여 아주 높은 특이성과 민감성 및 좀더 짧은 반응시간을 나타낸다[1]. 어떤 인간 장기의 기능적 결함의 지시자로서 다양한 중요한 분석대상물질(예컨대, 포도당, 콜레스테롤 및 요소 등)을 정량적으로 탐지하기 위하여 전류적정 방식의 바이오센서를 개발하려는 노력들이 광범위하게 시도되고 있다. 이들 중 소변과 혈액을 포함하는 인간 혈청에서 요소 농도를 정량적으로 모니터하는 것은 신장 또는 간 기능의 이상을 진단하는데 있어서 임상학적 중요성이 매우 크다.

그러나, 바이오센서의 실제 적용은 종종 주의를 기울여야할 필요가 있는 중요한 이슈 즉, 효소의 내재적 특성으로 인해 전극 상에 효소를 고정화하는데 있어서 낮은 조작 안정성과 조작의 어려움 같은 문제들로 인해 종종 방해받는다. 더욱 중요한 점은 단백질의 생물학적 산화환원반응 과정에서 생기는 전자가 전극으로 전달되는 과정이 효소의 산화환원지점 이외 부분의 절연성에 의해 방해를 받는다는 점이다. 다행히도 적절한 기질(matrix)에 효소를 포획하는 것이 그러한 단점을 극복할 수 있는 수월한 방법임이 증명되고 있다[2]. 나아가, 효과적인 바이오센서를 제조하기 위하여 원하는 바이오분자를 고정하는데 적합한 고체상 지지체를 선택하는 것이 필수적이다. 지금까지 개발된 다양한 재료들 중 금속 산화물 나노물질은 생체적합성, 비독성, 강한 흡착력 및 빠른 전자전달능력으로 인해 이상적인 후보자로 보인다 [3].

최근에는 예컨대 반데르바알스 결합, 소수성 상호작용, 수소결합 및 정전기적 인력 등의 물리적 흡착방법을 통하여 금속 산화물 기질 상에 효소를 효과적으로 고정하는 방법이 보고되었는데, 이 방법은 용이하고, 효소 활성을 보존할 수 있다[2,4,5,6]. 기본적으로, 효소의 등전점(pI)과 지지체의 영전하점(point of zero charge; pzc)이 매우 중요한 요소라고 생각해야 한다[2]. 이 논문에서 니켈 산화물 나노입자는 우레아 효소-기반 바이오센서를 합성하는 기질 물질로 이용되는데, 이는 낮은 pI(pI=5) 값을 갖는 우레아제를 고정하는데 있어서 니켈 산화물 나노입자의 예외적으로 높은 영전하(pzc=10.7) 값이 유리하여 강한 정전기적 결합이 가능하기 때문이다[3,7]. 뿐만 아니라, 큰 표면적과 비등방성 형태를 갖는 나노다공성 물질은 효소 분자가 효과적으로 흡착할 수 있는 활성 부위로서 기능하는 낮은 배위 원자를 항상 높은 밀도로 갖고 있음이 밝혀졌다[2,8]. 따라서, 비등방성 형태와 조절 가능한 동공 크기 및 높은 표면적을 갖는 나노구조체의 금속 산화물 공학은 효소-기반 바이오센서 제조에 중요한 역할을 한다[9].

금속-유기물 구조 또는 배위 폴리머는 유기연결자로 단단한 금속 함유 빌딩블록을 정연한 망상조직으로 조립함으로써 적절하게 구축되며, 이들은 강한 결합으로 서로 지지한다[10,11,12]. 다른 적용분야를 위해서 다양한 위상, 구조적 골격 및 동공 또한 합리적인 연결자 디자인을 통해 제작할 수 있다[13]. 최근, 배위 폴리머가 주로 열분해를 통하여 계층적으로 다공성인 나노물질의 합성에 특별히 적합한 주형으로 이용될 수 있다고 보고되었다[14,15,16,17,18,19,20,21].

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본 발명은 생체적합성, 비독성, 강한 흡착력 및 빠른 전자전달능력을 나타내며, 분석대상물질을 탐지하는 효소를 충분히 증착시킬 수 있는 금속 산화물 나노구조체를 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명은 상기와 같이 우수한 물성을 가진 금속 산화물 나노구조체를 이용한 금속 산화물 전극을 제공하려는 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 금속 산화물 전극을 이용하여 분석대상물질을 탐지할 수 있는 효소를 증착한 바이오전극을 제공하려는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 다중층 형상의 균일한 니켈-기반 배위 폴리머 입자 나노구조체(mL-NiCPPs)를 제조하였다. 이러한 비등방성 형상 제조시 요점은 두 단계로 합성반응을 진행하는 것인데, 첫 번째 단계는 높은 온도(본 발명의 실시예에서는 130℃로 진행함)에서 이차빌딩유닛을 제조한 후 낮은 온도로 이차 빌딩유닛이 자기조립되도록 하는 성장단계를 거쳐 다중층 니켈-기반 배위 폴리머 입자 나노구조체(mL-NiCPPs)를 제조하였다.

주목할 점은 성장 단계에서 다중층 니켈-기반 배위 폴리머 입자 나노구조체(mL-NiCPPs)의 평균 크기는 피리딘이나 아세트산과 같은 크기조절제를 가해 줌으로써 더 줄일 수 있다는 점이다. 얻어진 다중층 니켈-기반 배위 폴리머 입자 나노구조체(mL-NiCPPs)는 공기 중에서 제어된 온도로 하소하여 높은 다공성을 가지며, 표면적이 현저히 증가된 다중층 니켈 산화물 나노입자(mL-NiOs)를 얻을 수 있다. 이례적으로 높은 표면적, 균일한 동공 크기 및 본질적으로 높은 영전하(pzc)로 인해, 제조된 다중층 니켈-기반 배위 폴리머 입자 나노구조체(mL-NiCPPs)는 요소 탐지용 우레아제-기반 NiO 바이오센서 제조에 이용되었는데, 이 바이오센서는 광범위한 농도 범위에서 높은 민감성과 아주 우수한 선형 상관성을 나타내었다.

본 발명은

(가) Ni(II) 화합물과 벤젠-1,4-다이카복시산(benzene-1, 4-dicarboxylic acid)을 120~140℃로 교반하여 반응시키는 단계;

(나) 크기조절제를 (가)에서 얻은 반응 혼합물에 가하여 70~90℃로 유지하고 반응이 완결되도록 하는 단계;

(다) (나)에서 얻은 반응 산물을 세척하고 건조하여 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자((multilayered nickel-based coordination polymer particles; mL-NiCPPs)를 합성하는 방법에 관한 것이다.

(가) 단계에서 반응온도가 120℃ 미만이면 고분자 반응이 진행되지 않으며, 140℃를 초과하면 비경제적이다. (나) 단계에서 온도가 70℃ 미만이면 반응 진행속도가 너무 느리고, 90℃를 초과하면 균일한 형태의 입자를 얻는데 어려움이 있다.

또한, 본 발명은 상기 크기조절제가 아세트산, 벤조익산과 같이 한 개의 카복시기를 갖는 분자량 50~200달톤의 화합물 및 피리딘 중 1종 이상임을 특징으로 하는 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자를 합성하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되며, 평균 두께 200~400㎚의 플레이트가 적층된 다중층 입자이며, BET 표면적 5.0~8.0㎡/g인 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 평균 두께 200~400 ㎚의 플레이트가 적층된 다중층 입자이며, BET 표면적 5.0~8.0㎡/g인 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자를 300~400℃에서 5~10시간 동안 하소하여 다공성 다중층 NiO 나노구조체(multilayered NiO nanostructures; mL-NiOs)를 합성하는 방법에 관한 것이다.

반응 온도가 너무 낮고 반응시간이 충분하지 않으면 하소가 충분히 이루어지지 않아 다중층 NiO 나노구조체의 제조가 원활하지 않으며, 반응 온도가 너무 높거나 반응시간이 너무 길어지면 비경제적이다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되며, BET 표면적 100~130㎡/g이고 평균 동공 크기 10nm임을 특징으로 하는 다공성 다중층 NiO 나노구조체(multilayered NiO nanostructures; mL-NiOs)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

(가) 다공성 다중층 NiO 나노구조체를 현탁하고 초음파처리하여 증착 용액을 제조하는 단계;

(나) 두 개의 동일한 ITO(indium-Tin Oxide) 전극을 상기 (가)의 증착 용액에 담그고 직류를 흘려주어 NiO/ITO 전극을 제조하는 단계; 및

(다) 제조한 NiO/ITO 전극을 세척하는 단계;를 포함하는 니켈 산화물/ITO 전극을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 다공성 다중층 NiO 나노구조체가 상기 방법으로 제조됨을 특징으로 하는 니켈 산화물/ITO 전극을 제조하는 방법에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은

(가) 상기 방법으로 제조된 니켈 산화물/ITO 전극을 분석대상물질을 탐지하는 효소 용액에 담그는 단계; 및

(나) 상기 (가) 단계 이후 전극을 헹구는 단계;를 2회 이상 수행하여 효소-기반 NiO/ITO 바이오전극을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 분석대상물질을 탐지하는 효소가 우레아제임을 특징으로 하는 효소-기반 NiO/ITO 바이오전극을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 바이오센서의 효소로서 우레아제를 이용한 전극을 제조하여 실험하였으나, 본 발명의 효소-기반 NiO/ITO 바이오전극에는 다양한 효소 예컨대, 포도당 산화효소(glucose oxidase)를 이용한 혈중 포도당 탐지, 요산분해효소(uricase)를 이용한 체액 내 요산(uric acid) 탐지 및 카탈레이즈(catalase)를 이용한 H₂O₂ 불균화반응 탐지 등 다양한 효소를 이용한 바이오센서를 제조할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되며, 요소 농도 0.99~11.50mM 범위에서 직선의 상관관계를 나타내며, 민감도 20~25μA/mM·㎠인 우레아제-기반 NiO/ITO 바이오전극에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 두 단계를 거쳐 제조된 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자 및 이를 하소하여 제조한 다공성 다중층 NiO 나노구조체는 표면적이 매우 높아 다양한 분야에 응용이 가능하다.

또한, 본 발명에 의하여 제조된 다중층 NiO 나노구조체를 ITO 전극에 전기영동증착법으로 증착시킴으로써 전극 안정성이 증대되고 훨씬 많은 다중층 NiO 나노구조체가 ITO 상에 증착되었다.

뿐만 아니라, 본 발명에 의해 제조된 니켈 산화물/ITO 전극에 분석대상물질을 탐지할 수 있는 효소 중 우레아제를 증착한 결과, 제조된 우레아제-기반 니켈산화물/ITO 전극은 높은 민감도를 나타내었고, 요소 농도와 전류 간에 직선 상관관계를 나타내어 바이오센서로서 우수한 효과를 나타내어 다양한 바이오센서에 본 발명 방법의 응용가능성을 보여주었다.

도 1은 하소법(calcination)을 이용하여 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(multilayered nickel-based coordination polymer particles; mL-NiCPPs)로부터 다공성 다중층 NiO 나노구조체(multilayered NiO nanostructures; mL-NiOs)를 합성하는 방법을 도시한 것이다.
도 2는 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs)의 SEM 사진(a와 b); 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs)의 하소로 얻은 다중층 NiO 나노구조체(mL-NiOs)의 SEM 사진(c와 d); (e) 다중층 NiO 나노구조체(mL-NiOs)의 분말 X-레이 회절 패턴.
도 3 (a)는 (i)다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs) (-□-)의 N₂ 흡착 등온선과 (ii) 다중층 NiO 나노구조체(mL-NiOs) (-○-)의 N₂ 흡착 등온선; (i) mL-NiCPPs (실선) 및 (ii) mL-NiOs (점선)의 동공 크기 분포 커브.
도 4는 (a) 130℃ (130-Ni-CPPs) 및 (b) 80℃ (80-Ni-CPPs)에서 한 단계 방법으로 제조한 Ni-CPPs의 SEM 사진; 그리고 (c) (i) 130-Ni-CPPs (-□-)와 (ii) 80-Ni-CPPs (-○-)의 N₂ 흡착 등온선.
도 5(a)는 크기조절제 없이 제조한 Ni-CPPs의 SEM 사진이다. (b) 크기조절제 없이 제조한 Ni-CPPs의 N₂ 흡착 등온선이다.
도 6은 다른 스캔 속도(50 ~ 200 mV/s)로 딥 코팅과 EPD법을 이용하여 제조한 NiO/ITO 전극의 산화 피크 전류(~ 0.8V에서) 히스토그램이다.
도 7은 외부 크기조절제 없이 PBS 완충액 (10 mM; pH 7; NaCl 7 %_ww) 내에서 기록한 (i) ITO; (ii) NiO/ITO; (iii) Ur-NiO/ITO 전극의 CV(Cyclic voltammogram). 스캔 속도는 100 mV/s.
도 8은 50~200 mV/s의 다른 스캔 속도로 PBS 용액(10 mM, pH 7) 내의 우레아제-NiO/ITO 전극에서 기록된 CV(Cyclic voltammograms)이다. 안에 들어있는 그림은 (스캔속도)^1/2의 함수로서 산화환원 짝 Ni(OH)₂/NiOOH)에 대응하는 음극(I_a) 및 양극(I_c)의 전류를 나타낸다.
도 9는 요소 농도(0.99 - 11.50 mM)의 함수로서 우레아제-NiO/ITO 바이오전극의 신호반응을 나타낸다. 안에 들어있는 그림은 요소 농도에 대한 Ni(OH)₂/NiOOH 산화환원 짝 (~0.9 V에서)에 대응하는 피크 산화전류를 나타낸다.
도 10은 전기영동증착법을 통한 NiO/ITO 전극 제조의 개요도이다.
도 11은 일반적으로 사용하는 3전극 셀(conventional three-electrode cell)에서 우레아제 탐지 실험을 수행하는 것을 나타내는 개요도이다.
도 12는 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs)의 주사전자현미경 사진이다.
도 13은 본 발명의 첫 번째 단계 열처리(130℃, 30 min) 이전 (커브 i)의 용액 A의 UV-Vis 스펙트럼, 첫 번째 단계 열처리 이후 (커브 ⅱ)의 용액 A의 UV-Vis 스펙트럼 및 두 단계 열처리 이후 (커브 ⅲ)의 용액 A의 UV-Vis 스펙트럼 (a); 첫 번째 단계에서 열처리(130℃, 30 min) 이전 (커브 i)과 이후 (커브 ⅱ)의 용액 B의 UV-Vis 스펙트럼(b).
도 14는 스캔 속도를 50 ~ 300 mV/s 범위 내에서 변화시키면서 PBS 완충액(10 mM; pH 7; NaCl 7%_ww)에서 침지코팅법을 이용하여 제조한 NiO/ITO 전극에서 기록된 CV 값이다.
도 15는 PBS 완충액(10 mM, pH 7; NaCl 7%_ww)에서 100 ~ 200 mV/s의 스캔 속도로 전기영동증착을 이용하여 제조한 NiO/ITO 전극에서 기록된 CV이다. 삽입 그림은 (스캔 속도)^1/2를 함수로 하여 양극(I_a) 및 음극(I_c) 전류를 도시한 것이다.
도 16은 PBS 완충액(10 mM, pH 7; NaCl 7%_ww)에서 제조한 NiO/ITO 전극의 CV가 낮은 전위(~ 0.4 V)에서 α-Ni(OH)₂/Ni 짝에 해당하는 산화환원 피크를 나타내지 않음을 보여준다.
도 17은 Ur-NiO/ITO 바이오전극 상에서 일어나는 전극 반응의 개요도이다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재 범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

시약

니켈 (II) 질산염 6수화물 (Ni(NO₃)₂.6H₂O, 97%, Sigma-Aldrich), 벤젠-1,4-다이카복시산(benzene-1, 4-dicarboxylic acid; C₈H₆O₄, 98%, Sigma-Aldrich), 피리딘(pyridine; C₅H₅N, 99.8%, Burdick & Jackson), 아세트산 (CH₃COOH, 99.7%, Junsei), 우레아제(urease, from Canavalia ensiformis (Jack bean), 34310 units/G solid, Sigma-Aldrich), 인산나트륨 2염기 2수화물(sodium phosphate dibasic dihydrate; HNa₂O₄P. 2H₂O, 99%, Sigma-Aldrich), 인산나트륨 1염기 단일수화물(sodium phosphate monobasic monohydrate, H₂NaO₄P. H₂O, 99%, Sigma-Aldrich), DMF 및 에테르는 입수한 그대로 이용하였다. 모든 저장용액은 각 반응 전 바로 제조하였다. 사용에 앞서 모든 유리용기는 왕수로 세척하였고, 이온제거수로 충분히 헹구었다. 약자: H₂BDC = 벤젠-1,4-다이카복시산(benzene-1, 4-dicarboxylic acid).

다중층 Ni -기반 배위 폴리머 입자( mL - NiCPPs ) 합성

본 발명의 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs) 합성방법은 두 단계로 구성된다. 첫 번째 단계에서는 16 ㎖의 0.1 M Ni(NO₃)₂.6H₂O (1.8 mmol)와 24 ㎖의 0.1 M H₂BDC (2.4 mmol)를 둥근 플라스크 안에서 130℃로 30분간 서서히 교반하였다. 반응 혼합물의 색깔은 녹색에서 점차 황녹색으로 변하였다. 두 번째 단계에서는 600 ㎕의 1.55 M 피리딘 (0.93 mmol)과 450 ㎕의 8.7 M 아세트산 (3.92 mmol)을 반응 혼합물에 가하였다. 최종 혼합물은 80℃로 24시간 유지하여 반응이 완결되도록 하여 녹색의 콜로이드 용액을 얻었다. 녹색 산물은 DMF로 두 번 반복하여 세척하고 에틸 에테르로 네 번 반복 세척한 후 80℃로 12시간 동안 건조하였다.

다중층 NiO 나노구조체( mL - NiOs ) 합성

제조된 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs)를 공기 중에서 350℃로 여섯 시간 동안 다중층 NiO 나노구조체(multilayered NiO nanostructures; mL-NiOs)를 가열한 다음 상온으로 식혔다. 결과물은 흑색이었고, 이는 다중층 NiO 나노구조체(mL-NiOs)가 합성되었음을 나타낸다.

우레아제 -고정 바이오전극 ( Ur - NiO / ITO ) 제조

NiO/ITO 전극을 제조하기 위해, 10 ㎎의 다중층 NiO 나노구조체(mL-NiOs)를 10 ㎖의 톨루엔에 현탁하고 10분간 초음파처리하였다. mL-NiOs는 전기영동증착(electrophoretic deposition) 방법을 이용하여 전기적으로 ITO 전극에 증착하였다. mL-NiOs의 전기적 증착에 앞서, ITO 전극은 산소 플라즈마로 30초간 세척하였다(에너지= 100 W, 압력 = 0.41 torr). 두 개의 동일한 ITO 전극을 증착용액에 담그고(1 ㎝ 간격을 둠) 한 시간 동안 Agilent N5751A DC 전원장치로 90 V의 일정 직류를 흘려주었다(도 10). 얻어진 NiO/ITO 전극은 에탄올과 물로 순서대로 헹구었다.

우레아제-기반 NiO/ITO (Ur-NiO/ITO) 바이오전극은 NiO/ITO 전극을 우레아제 용액 (5 mg/mL, in 10 mM PBS buffer, pH 7)에 담가 제조하였다. 이 단계는 느슨하게 결합된 효소 분자를 제거하기 위해 물로 헹군 다음 다섯 번 반복 수행하였다. 전극은 상온에서 밤새 건조한 후 사용에 앞서 PBS 완충액 (10 mM, pH 7)에서 4℃로 저장하였다.

특성규명

나노입자는 Hitachi S-4800 주사전자현미경 (SEM)으로 촬영하였다. 흡광 스펙트럼은 UV-Vis spectra spectrometer (UVIKON XS)로 기록하였다. 용액의 pH는 Orion 420 A+ pH meter로 측정하였다. 분말 X-선 회절(Powder X-ray diffraction; PXRD)은 RIGAKU Ultima IV diffractometer를 이용하여 초점을 맞춘 빔에서 Cu Kα 방사 (파장 1.541 Å)를 이용하여 30-90° 범위 내에서 0.09°/min의 지속적인 스캔 속도로 수행하였다. 우레아제 센싱 실험을 포함하는 순환전류(cyclic voltammetry; CV) 실험은 일반적으로 사용하는 3전극 셀(conventional three-electrode cell)에서 CHI 605B Electrochemical Workstation (CH Instruments, Inc.)을 이용하여 주위 온도 약 25℃로 수행하였다 (도 11) . CV 실험 동안 전위창은 -0.2 V ~ 1.1 V 범위로 설정하였다. 실험에 앞서, 전해질 용액(NaCl 7 % _WW in PBS buffer, pH 7)은 질소로 30분간 버블링하여 가스를 제거하였다. 백금 와이어와 Ag/AgCl 전극은 각각 상대전극(counter electrode)과 참고 전극(reference electrode0으로 이용하였다. CV 실험은 PBS 완충액 (10 mM; pH 7; NaCl 7%_ww) 내에서 스캔 속도를 변화시켜가며 수행하였다. 시료의 동공부피 (pore volume), 동공크기, 표면적 등은 BELSORP-mini II (BEL Japan, Inc.)를 이용하여 기체흡착(gas adsorption)을 이용해 분석하였다. 시료는 측정에 앞서 395 K에서 12시간 가열하여 기체제거의 과정을 거쳤다. 표면적은 낮은 압력영역 (P/P₀ = 0.1 ~ 0.3)에서 Brubauer-Emmett-Teller (BET) 식을 이용하여 결정하였다. 동공 크기분포와 전체 동공부피는 탈착곡선을 통해 Barrett-Joyner-Halenda (BJH) 식을 이용해 계산하였다.

결과

다중층 NiO 나노구조체(mL-NiOs) 합성법은 도 1에 나타내었다. 다중층 Ni-CPPs (mL-NiCPPs)는 Ni(NO₃)₂.6H₂O 반응으로부터 DMF 내에서 크기조절제(아세트산 및 피리딘)를 이용하여 두 단계 방법으로 제조하였고, 350℃에서 6시간 동안 하소하여 NiO 상(phase)으로 점차 전환하여 다공성 다중층 니켈 산화물 나노구조체(mL-NiOs)를 얻었다.

다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(nickel-based coordination polymer particles; mL-NiCPPs)와 다공성 다중층 NiO 나노구조체(multilayered NiO nanostructures; mL-NiOs)의 주사전자현미경 사진은 도 2와 도 12에 나타내었다. 흥미롭게도, 다중 위상을 나타내는 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs)는 약 300 ㎚의 평균 두께를 가진 수많은 플레이트로부터 조립된다(도 2a, b 및 도 12). 하소 후 얻어진 mL-NiOs는 표면이 거칠고 모서리가 많은 원래의 비등방성 다중층 구조를 여전히 유지하는 것이 주목할 만하다 (도 2c, d). X선회절 분석 (도 2e) 결과로부터 mL-NiCPPs 전구체가 완벽하게 니켈 산화물 (reference code 01-078-0643 [22])로 변환되었음을 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 모든 회절 피크는 뚜렷하고 선명하여 얻어진 mL-NiOs의 결정도가 높음을 말해준다.

mL-NiCPPs 제조의 요점은 높은 온도(130℃)에서 30분간 이차 빌딩 유닛(secondary building units; SBUs) 형성을 활성화한 다음 이차 빌딩 유닛의 조립으로 같은 형태의 다중층 모양을 만드는 것이다. 실험을 통해서 반응 혼합물의 색이 녹색에서 황녹색으로 점차 변하는 것이 관찰되었는데, 이는 이차 빌딩 유닛이 형성되었음을 나타낸다. 이차 빌딩 유닛 생성을 밝히기 위해 A 용액(DMF, Ni(NO₃)₂ 및 H₂BDC)과 B 용액(DMF와 Ni(NO₃)₂)의 UV-Vis 스펙트럼 (도 13)을 130℃로 30분간 열처리하기 전과 후에 기록하였다. UV-Vis 스펙트럼에 나타난 것과 같이, 열처리 전에는 용액 A(도 13a의 커브(i))와 용액 B(도 13b의 커브(i)) 모두에서 400 nm 및 700 nm의 흡광피크 두 개가 유사하게 관찰되었다. 그러나, 열처리 이후에 용액 A의 UV-Vis 스펙트럼(도 13a의 커브 (ii))에서는 용액 B(도 13b의 커브 (ii))에서 관찰되지 않는 새로운 피크가 360 nm에서 발견되었다. 이 새로운 피크는 Ni² ⁺와 H₂BDC 사이의 배위반응으로 생긴 이차 빌딩 유닛 생성 때문인 것으로 보인다. 본 발명자들은 또한 반응이 완료된 후 용액 A의 UV-Vis 스펙트럼을 기록한 결과 (도 13a의 커브(ⅲ)), 360 nm의 흡광 피크가 눈에 띄게 감소하였음을 발견하였으며, 이는 이차 빌딩 유닛이 폴리머화되어 배위 폴리머 화합물을 생성하였음을 암시하는 것이다.

다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs)와 다중층 NiO 나노구조체(mL-NiOs)의 N₂ 흡착 등온선은 도 3a에 나타내었다. mL-NiOs의 BET 표면적 대략의 값은 112㎡/g으로서, 이는 mL-NiCPPs의 BET 표면적인 6.5㎡/g에 비해 현저히 높다. mL-NiOs의 이와 같은 상당한 표면적 증대는 하소 공정에 의한 유기 연결체 제거에 의한 것이 분명하다. mL-NiOs의 흡광 양상이 mL-NiCPPs에서는 관찰되지 않는 뚜렷한 이력현상(hysteresis)을 나타내는 것도 관찰되어, 약 10 nm의 작은 동공 크기에 해당하는 새로운 다공성 물질(mesoporous) 시스템(도 3b의 커브 (ⅱ))이 생성되었음을 말해준다. 본 발명의 다중층 NiO 나노구조체(mL-NiOs)의 BET 표면적(112㎡/g)과 동공 크기(약 10nm)는 최고 수준이다. 표 1은 현재까지 보고된 NiO 나노입자들의 데이타와 본 발명의 데이타를 비교한 것이다.

표면적을 늘리는데 있어서 본 발명의 두 단계 가열공정의 우수성을 확인하기 위하여 니켈-기반 배위 폴리머 입자(Ni-CPPs) 전구체를 이용하여 단일 단계 방법으로 다른 두 종류의 NiO 시료를 제조하고, 그들의 예상 BET 표면적 값을 평가기준으로 이용하였다. 자세히 설명하면, 130℃(130-Ni-CPPs)와 80℃(80-Ni-CPPs)에서 24시간 동안 반응 혼합물(동일한 양의 Ni² ⁺, H₂BDC 및 크기조절제를 사용함)을 가열하여 단일 단계로 Ni-CPPs를 제조하였다. 도 4a와 4b는 각각 130℃와 80℃에서 만든 Ni-CPPs의 SEM 사진이다. 보는 바와 같이 130-Ni-CPPs는 육각형의 판상이지만, 80-Ni-CPPs의 경우는 막대와 같은 입자였다. 덧붙여, 80-Ni-CPPs는 4일 후에야 만들어지는 것이 관찰되었으며, 이는 낮은 반응 온도가 형성속도를 늦추기 때문인 것으로 보인다. 이러한 두 개의 비교시료를 350℃로 여섯 시간 동안 하소하였고, N₂ 흡착 등온선(도 4c)으로부터 예측한 해당 표면적 값은 2단계 가열방법으로 제조한 mL-NiCPPs에서 가열 변환된 mL-NiOs의 값보다 현저히 낮았다(특히, 80-Ni-CPPs :25 m²/g, 130-Ni-CPPs: 35 m²/g).

본 발명의 두 단계 방법은 LaMer diagram[23,24]에 기초한 것인데, 여기에서 첫 번째 단계로 빠른 핵형성이 일어난다. 이후 두 번째 단계에서 열역학적으로 유리한 결정화가 일어나서 규칙적이고 균일한 mL-NiCPPs가 형성된다. 결과적으로, 표면적이 증가한 mL-NiCPPs가 전환하여 만들어진 mL-NiOs도 역시 큰 표면적을 나타낸다.

소위 크기조절제(modulator)라고 불리는 한 자리 리간드는 금속 센터에서 유기연결자와 경쟁 리간드로 기능할 수 있어서 결정 성장속도를 조절하고 결정 크기를 섬세하게 조율할 수 있다는 점도 보고되었다[25,26,27]. Ni-CPPs의 크기에 미치는 크기조절제의 영향을 알아보기 위하여 Ni-CPPs에 크기조절제를 가하지 않은 시료를 준비하였다. 도 5a는 제조한 Ni-CPPs의 주사전자현미경 사진이다. 보는 바와 같이, 크기조절제를 이용하지 않고 제조한 Ni-CPPs는 약 15 ㎛의 더 큰 크기를 나타내었다. 또한, N₂ 흡착 등온선과 같이, 크기조절제를 이용하지 않고 제조한 입자는 표면적이 현저히 감소하였다 (도 5b, 18.5 ㎡/g).

ITO 전극 상에서 NiO 변환기의 안정성은 전류 재생능 및 바이오전극의 재사용 가능성과 직접적으로 연관되어 있기 때문에 상당히 중요하다. 따라서, 증착 방법은 그와 같은 도전들을 극복하기 위해 간단하고, 안정적이고 또 광범위하게 응용할 수 있어야 한다. 최근, 전도성 기질 상에 반도체[28], 금속[29], 절연[30] 박막 및 금속-유기물 골격[31] 입자를 제조하기 위해 전기영동증착법(electrophoretic deposition; EPD)이 광범위하게 이용되고 있다. 여기에서, NiO/ITO 전극은 침지코팅(dip coating)과 전기영동증착법과 같은 다른 기술들을 이용하여 제조되었고, 순환 전압전류곡선(cyclic voltammograms: CVs)이 기록되어 이들의 전기화학적 작용을 예비적으로 비교할 수 있었다. 도 14와 15는 각각 침지코팅방법과 전기영동증착법으로 제조된 NiO/ITO 전극의 CV를 나타낸다. 도 10은 전기영동증착법으로 NiO/ITO 전극을 만드는 방법의 개요도이다. 각기 다른 스캔 속도로 0.8V(vs Ag/AgCl)에서 산화피크전류를 비교하는 막대그래프가 도 6이다. 전기영동증착법으로 제조한 NiO/ITO 전극의 산화전류가 침지코팅법으로 제조한 전극의 산화전류보다 현저히 높은데, 이는 전기영동증착법을 이용하면 전극 안정성이 증대되고 훨씬 많은 mL-NiOs가 ITO 상에 증착되기 때문이다. 따라서, 이후 바이오전극 제조에서 mL-NiOs를 ITO 전극 상에 증착하는데 전기영동증착법을 이용하였다.

도 7은 PBS 완충액(10 mM; pH 7; NaCl 7 %_ww) 내에서 스캔속도 100 mV/s로 ITO, NiO/ITO 및 Ur-NiO/ITO 전극의 CV를 나타낸 것이다. ITO 전극의 CV(도 7(i))는 전극 상에 산화환원 짝이 없기 때문에 산화 또는 환원 피크를 전혀 나타내지 않았다. NiO/ITO 전극(도 7(ⅱ))은 반대로 0.45V 및 0.85V 근처에 위치하는 두 개의 산화환원 짝을 나타낸다. NiO 전극은 대개 Ni(OH)₂/NiOOH 가역적 산화환원 짝에서 발생하는 산화 및 환원피크만을 나타낸다고 보고된바 있다(수학식 1)[32,33,7,34,35]. 그러나, 본 발명에서는 NiO/ITO 전극이 두 개의 구별되는 산화환원 짝을 나타내는데, 이것은 두 개의 다른 전자전달단계에 해당하는 것일 가능성이 있다. 첫 번째로, 높은 전위(약 0.8V)에서의 산화환원반응은 잘 알려진 Ni(OH)₂/NiOOH 짝[36]에 대응되는 것이고, 반면 낮은 전위(약 0.4V)의 비정상적인 짝은 아마도 α-Ni(OH)₂가 금속 니켈로 환원되기 때문인 것으로 보인다(수학식 2)[36,37]. 반대로, α-Ni(OH)₂상(phase)은 탈수에 의해 비가역적으로 β-Ni(OH)₂로 변환될 수 있고[38], 이것은 금속 니켈로 환원될 수 없다. 이 현상은 NiO/ITO 전극의 CV가 때로 α-Ni(OH)₂/Ni (에 해당하는 산화환원 피크를 나타내지 않는다는 사실을 설명해줄 수 있다(도 16). 따라서, 가역성과 일관성으로 인해 이후 Ni(OH)₂/NiOOH 산화환원 짝만이 NiO/ITO 및 Ur-NiO/ITO 전극에 대해서 논의된다. Ur-NiO/ITO 바이오전극(도 7(ⅲ))에 대해서는 NiO/ITO 전극의 160μA와 비교하여 산화 피크가 현저히 감소한 50μA으로 나타났다. 이와 같은 극적인 감소는 효소의 비도체성에 의한 내재적 장애(intrinsic hindrance) 때문이며, 이는 우레아제가 고정되었음을 나타낸다.

<수학식 1>

<수학식 2>

도 8은 다른 스캔 속도(50 ~ 200 mV/s)로 기록된 Ur-NiO/ITO 바이오전극의 CV를 나타낸다. 스캔 속도가 높아질수록 Ni(OH)₂/NiOOH 산화환원 짝에 해당하는 양극 및 음극 피크가 각각 양전위 및 음전위로 약간만 이동하는 것을 볼 수 있고, 이는 NiO 층의 저항 때문인 것으로 보이는데[39], 이것은 바이오전극의 빠른 전자 전달을 보여준다. 산화환원 피크 전류가 스캔 속도의 제곱근, v ¹ ^/2 과 비례한다(도 8의 삽입그림)는 것도 발견할 수 있는데, 이는 확산-제어 전자전달과정(diffusion-controlled electron transfer process)임을 보여준다(수학식 3과 4)[40, 41].

<수학식 3>

<수학식 4>

Ur-NiO/ITO 바이오전극 상의 전자활성종(electroactive species; I*)의 표면농도는 다음의 수학식 5와 같이 평가한다[7].

<수학식 5>

상기 식에서, n은 전이된 전자의 수, F는 파라데이 상수(Faraday constant)(96485 C mol^-1), R은 기체 상수(gas constant)(8.314 J mol^-1 K^-1), S는 바이오전극의 표면적 (1cm²), v는 스캔 속도, 그리고 T는 온도(300K)이다. 하나의 전자가 전이되는 것을 가정하면, 전자활성종(I ^* )의 표면 농도는 6.96 ×10^-8 mol cm^-2값이 얻어진다.

요소 농도에 대한 함수로서 Ur-NiO/ITO 바이오전극의 반응은 CV 기술을 이용하여 연구하였다(도 9). 생화학적 반응이 일어나는 동안, 고정된 우레아제 (Ur)는 요소를 중탄산수소(hydrogen bicarbonate, HCO₃ ^-)와 암모늄 이온(NH₄ ⁺)으로 분해하는 반응을 촉매하고 이 과정에서 효소 활성을 결정하는 우레아제의 SH기가 동시에 산화된다(도 17에 묘사됨)[42,43]. 이 생화학적 반응도중 생성된 전자들은 Ni³ ⁺/Ni² ⁺ 산화환원 짝을 통해 전극으로 이동하는데, 이는 NiO 기질(matrix)의 효과적인 전자전달 특성 및 가역성으로 인한 것이다.

도 9와 같이, 양극 및 음극 피크 전류는 외부 매개자를 사용하지 않아도 PBS 완충액 내의 요소 농도(0.99 ~ 11.50 mM)가 증가할수록 계속하여 증가한다. 요소 농도와 양극 피크전류 간의 표준화 곡선(calibration curve) 또한 아주 우수한 정비례 관계를 나타내며, 아래의 회귀방정식에 따른다:

<수학식 6>

본 발명의 Ur-NiO/ITO 바이오전극은 생리학적 범위(1.33 ~ 3.33 mM)를 포함하여 정비례관계를 나타낸다. 예상 민감도 21.64 μA mM^-1 cm^-2는 mL-NiOs의 비등방성, 높은 표면적 및 다공성으로 인해 비교적 높게 나타나는데, 이는 결론적으로 효소의 효율적 포획을 가능하게 한다. 본 발명에 의한 Ur-NiO/ITO 바이오전극의 감지 능력은 종래 보고된 바이오전극들과 비교하여 표 2에 나타내었다. 비록 본 발명에 의한 바이오전극의 민감도가 참고문헌 [40] 및 [42]의 것보다 약간 낮으나, 본 발명의 mL-NiOs는 온화한 조건 하에서 합성될 수 있으므로 좀 더 수월하고 경제적으로 바이오전극을 제조할 수 있을 것으로 예상된다.

결론적으로, 본 발명자들은 니켈-기반 다중층 배위 폴리머 입자(mL-NiCPPs)와 다중층 니켈 산화물 나노구조체(mL-NiOs)를 성공적으로 합성하였다. 본 발명의 다중층 니켈 산화물 나노구조체(mL-NiOs)는 높은 결정도, 높은 비표면적(112 m²/g) 및 미세한 동공 크기(10 nm)를 나타낸다. 본 발명의 다중층 니켈 산화물 나노구조체(mL-NiOs)를 전기영동증착법을 통해 ITO 전극에 성공적으로 증착하여 NiO/ITO 전극을 제조하였다. 이 NiO/ITO 전극에 우레아제 효소를 고정함으로써 우레아제-기반 NiO/ITO (Ur-NiO/ITO) 바이오전극을 제조하였고, 이를 요소 탐지에 응용하였다. 제조된 전극은 높은 민감도를 나타내며, 전류와 요소 농도 사이에는 정비례 관계를 보였다.

Claims

(가) Ni(II) 화합물과 벤젠-1,4-다이카복시산(benzene-1, 4-dicarboxylic acid)을 120~140℃로 교반하여 반응시키는 단계;
(나) 크기조절제를 (가)에서 얻은 반응 혼합물에 가하여 70~90℃로 유지하고 반응이 완결되도록 하는 단계;
(다) (나)에서 얻은 반응 산물을 세척하고 건조하여 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자(multilayered nickel-based coordination polymer particles; mL-NiCPPs)를 합성하는 방법.
청구항 1에 있어서,
크기조절제는 카복시기를 갖는 분자량 50~200달톤의 화합물 및 피리딘 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자를 합성하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2의 방법으로 제조되며,
평균 두께 200~400 ㎚의 플레이트가 적층된 다중층 입자이며, BET 표면적 5.0~8.0㎡/g인 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자.
평균 두께 200~400 ㎚의 플레이트가 적층된 다중층 입자이며, BET 표면적 5.0~8.0㎡/g인 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자를 300~400℃에서 5~10시간 동안 하소하여 다공성 다중층 NiO 나노구조체(multilayered NiO nanostructures; mL-NiOs)를 합성하는 방법.
청구항 4의 방법으로 제조되며,
BET 표면적 100~130㎡/g이고 평균 동공 크기 10nm임을 특징으로 하는 다공성 다중층 NiO 나노구조체(multilayered NiO nanostructures; mL-NiOs).
(가) 다공성 다중층 NiO 나노구조체를 현탁하고 초음파처리하여 증착 용액을 제조하는 단계;
(나) 두 개의 동일한 ITO(indium-Tin Oxide) 전극을 상기 (가)의 증착 용액에 담그고 직류를 흘려주어 NiO/ITO 전극을 제조하는 단계; 및
(다) 제조한 NiO/ITO 전극을 세척하는 단계;를 포함하는 니켈 산화물/ITO 전극을 제조하는 방법.
청구항 6에 있어서,
상기 다공성 다중층 NiO 나노구조체는 평균 두께 200~400 ㎚의 플레이트가 적층된 다중층 입자이며, BET 표면적 5.0~8.0㎡/g인 다중층 Ni-기반 배위 폴리머 입자를 300~400℃에서 5~10시간 동안 하소하여 제조됨을 특징으로 하는 니켈 산화물/ITO 전극을 제조하는 방법.
(가) 청구항 6 또는 청구항 7의 방법으로 제조된 니켈 산화물/ITO 전극을 분석대상물질을 탐지하는 효소 용액에 담그는 단계; 및
(나) 상기 (가) 단계 이후 전극을 헹구는 단계;를 2회 이상 수행하여 효소-기반 NiO/ITO 바이오전극을 제조하는 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 분석대상물질을 탐지하는 효소는 우레아제임을 특징으로 하는 효소-기반 NiO/ITO 바이오전극을 제조하는 방법.
청구항 9에 의해 제조되며,
요소 농도 0.99~11.50mM 범위에서 직선의 상관관계를 나타내며, 민감도 20~25μA/mM·㎠인 우레아제-기반 NiO/ITO 바이오전극.