KR101634440B1

KR101634440B1 - AMPA 수용체 GluA1의 인산화 억제제를 포함하는 정신질환의 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101634440B1
Application number: KR1020140108781A
Authority: KR
Inventors: 최석우; 안보배
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-08-21
Filing date: 2014-08-21
Publication date: 2016-06-30
Also published as: KR20160023061A

Abstract

본원은 AMPA 수용체의 GluA1의 831번째 세린의 인산화 억제제를 포함하는 정신질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 스크리닝 방법을 제공한다. 본원에 따른 조성물은 AMPAR의 GluA1 서브유니트의 Ser831 잔기의 인산화의 특이적 저해를 통해 AMPA 수용체 활성을 직접적으로 조절하여, AMPA 수용체의 비정상적 활성과 관련된 다양한 정신질환을 예방/치료할 수 있으며, 특히 공포재발 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

AMPA 수용체 GluA1의 인산화 억제제를 포함하는 정신질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 {Pharmaceutical Composition Comprising Inhibitors of Phosphorylation of GluA1 Subunit of AMPA receptor for preventing or treating mental disorders}

AMPA 수용체 인산화 하위작용 억제를 이용한 AMPA 수용체 활성 조절을 통한 정신질환의 예방 또는 치료제 개발 기술에 관한 것이다.

최근, 보건복지부가 국립서울정신병원과 서울대 의대 등에 의뢰, 전국의 만18~64세 남녀 6,114명을 대상으로 실시한 '정신질환 실태 역학조사' 결과에 따르면 정신질환 평생 유병률 (과거 정신질환을 경험했거나 현재 겪고 있는 비율)이 약 31.4%인 것으로 나타났다. 이는 성인 3명 중 1명꼴로 평생에 한번 정도 정신건강 문제를 경험한다는 것을 보여준다. 특히, 조사에 따르면 강박장애와 외상 후 스트레스 장애 및 여러 공포증을 포함하는 불안 장애의 평생 유병률이 전체 질환 중 6.4%를 차지하는 것으로 나타났다.

외상 후 스트레스 장애 (PTSD, post-traumatic stress disorder)는 이의 동물모델로 널리 사용되는 공포조건화학습 (fear conditioning)을 통해 전통적으로 측좌핵과 편도체를 비롯한 변연계 (limbic system)가 매개하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 공포기억 재발에 전전두엽의 관련성이 대두되었고 (Moussawi et al., 2009, Nat.Neurosci., 12(2):182-9.), 또한 편도체와 전전두엽의 글루타메이트 분비 및 수용체 발현의 변화가 공포기억의 유지에 중요한 것이 알려져 있다.

외상 후 스트레스 장애 및 공포증 (phobia)의 치료도 공포기억 재발이 난관으로 드러나고 있다. 외상 후 스트레스 장애 및 공포증을 치료하기 위한 방법에는 인지재구성 (cognitive restructuring), 그룹치료 (group therapy), 노출치료 (exposure therapy), 항우울제 (selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs) 투여 등이 있으나, 증상 완화에 그치고 있으며 일시적이어서 효과적인 치료 방법의 개발이 절실하다.

이 중 노출치료는 공포기억이 형성된 상황이나 혹은 공포의 대상에 반복적으로 노출을 시킴으로써 공포감을 줄이는 치료법으로, 치료효과가 높아 보편적으로 사용되고 있다. 그러나 노출치료를 통하여 병세가 호전되더라도, 다른 시간, 장소, 상황 등에서 증상이 더 심각하게 재발 (relapse)하는 문제가 있다. 노출치료를 약물투여와 결부하여 노출치료의 효과를 증진하고 한계를 극복할 수 있는 방법을 찾으려는 노력이 계속 진행 중에 있다 (Ressler et al., 2004, Arch. Gen. Psychiatry, 61: 1136-44.).

하지만 현재 외상 후 스트레스 장애 및 공포증과 같은 불안 장애와 같은 정신질환을 치료할 수 있는 약물은 매우 제한적이며, 약효 또한 미비하고 일시적이다

AMPA 수용체는 신경계에서 글루타메이트에 의해 활성화되는 수용체로서, 시냅스를 통해 신경세포들이 교신하는 데 결정적 기여를 하며, 다양한 정신 질환의 원인으로 지목받고 있다 (Javitt, 2004, Molecular Psychiatry, 9, 984-997.; Beneyto et al., 2007, Neuropsychopharmacology, 32, 1888?1902.; Zarate and Manji, 2008, Exp Neurol, 211(1): 7-10.).

종래 정신질환 치료제 중에서 AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 수용체 활성을 조절하는 약물들은, AMPA 수용체 자체의 이온채널활성을 높이는 효현제 (potentiator/enhancer/partial agonist/stimulator) 계열이 대부분이었으며 예를 들면 CNQX, AMPA, Cl-HIBO,(S)-CPW 399,(S)-(-)-5-Fluorowillardiine, L-Quisqualic acid, CNQX, CP 465022, DNQX, Evans Blue tetrasodium salt, GYKI 47261, GYKI 52466, GYKI 53655, IEM 1925, Naspm, NBQX, Philanthotoxin 74, SYM 2206, UBP 282, YM 90K, ZK 200775, CX 546, Cyclothiazide, PEPA, S 18986, Aniracetam, IDRA 21, IEM 1460, IEM 1754, 1-BCP, Diazoxide, Piracetam 등을 포함한다.

하지만 이를 통해 단기적인 시냅스 활성 회복이나 질환 증상 완화가 가능했지만, 질환의 예방이나 치료는 불가능했다. 하지만 종래의 정신질환 치료제 중에서 AMPA 수용체 활성을 조절하는 약물은 단기적인 시냅스 활성 회복이나 질환 증상 완화가 가능했지만, 질환의 예방이나 치료는 불가능했다.

따라서 정신질환의 원인이 되거나 이에 동반되는 AMPA 수용체 활성이상을 조절하는 다양한 새로운 기전에 근거한 정신 질환 치료물질의 개발이 요구된다.

[선행문헌]

국제공개특허공보 WO 2012/033235 국제공개특허공보 WO 2014-078568

AMPA 수용체의 인산화 하위작용 억제를 통해 보다 효과적으로 AMPA 수용체 활성을 조절할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 수용체 (AMPAR)의 GluA1 서브유니트의 831번째 세린의 인산화 억제제를 포함하는 정신질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 일 구현예에서 본원의 인산화 억제제가 작용하는 AMPA 수용체는 4개의 서브유니트로 구성되는 사량체로, 두 개의 GluA1/2 헤테로다이머, 두 개의 GluA2/3 헤테로다이머 또는 두 개의 GluA1/GluA1 호모다이머를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 약학 조성물에 포함되는 상기 인산화 억제제는 AMPA 수용체의 GluA1 서브유니트의 831번째 Ser 인산화 부위를 모방한 펩타이드로, 이러한 펩타이드는 아스파르트산 (GluA1-831D) 또는 세린 (GluA1-831S)으로 변형된 831번째 잔기를 포함하는 약 10개 내지 약 20개 아미노산 길이의 펩타이드이다. 일 구현예에서 본원에 따른 조성물에 포함되는 인산화 억제제로 사용되는 펩타이드는 세포내 AMPA 수용체와 경쟁적 방식을 통해 작용하는 것으로, 이러한 방식을 통해 작용할 수 있는 한, 831번째 잔기에 해당하는 아미노산 이외의 서열은 GluA1의 상응하는 부위와 동일 또는 일부가 상이할 수 있다. 일 구현예에서 이러한 GluA1-831D 또는 GluA1-831S를 포함하는 펩타이드는 각각 LIPQQDINEAI(서열번호 1) 및 LIPQQSINEAI(서열번호 2)이다. 다른 구현예에서, 본원의 조성물에 포함되는 펩타이드는 세포투과성을 향상시키는 기와 컨쥬게이션될 수 있으며, 예를 들면 N-말단 부위에 Tat 펩타이드인 YGRKKRRQRRR (서열번호 3) (Y: 타이로신, G: 글라이신, K:라이신, R: 알지닌, Q: 글루타민)가 융합될 수 있다.

본원에 따른 조성물은 범불안장애, 공포증, 공황장애, 강박장애 및 외상후스트레스장애를 포함하는 불안장애; 우울장애 및 양극성 장애를 포함하는 기분장애; 술, 담배 또는 마약을 포함하는 중독성 물질에 중독되는 물질관련장애을 포함하는 인지적장애와 같은 정신질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 일 구현예에서는 본원에 따른 조성물은 범불안장애, 공포증, 공황장애, 강박장애 및 외상후스트레스장애를 포함하는 불안장애인, 정신질환 예방 또는 치료에 사용된다.

다른 양태에서 본원은 AMPA 수용체 GluA1의 831번째 세린 잔기의 인산화를 억제할 수 있는 물질을 GluA1 단백질, 또는 GluA2가 결여된 AMPAR 또는 이를 발현하는 세포에 처리하는 단계; 및 상기 물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여 상기 GluA1 단백질의 Ser831 잔기에서의 인산화가 억제되는 경우, 이를 공포재발 억제제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 정신질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포는 HEK293, (BHK)-570, CGNH-89, HNSCC, NG-108, NG-108, N1E, NB41A3, Neuro2a, SKNBE2, CHP212, SKNDZ, IMR32, SKNAS, SKNFI, D341, D283, Daoy, PFSK1, TE671 또는 일차 히포캠퍼스 뉴런 세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 AMPA 수용체는 이로 제한하는 것은 아니나, 4개의 서브유니트로 구성되는 사량체로, 두 개의 GluA1/2 헤테로다이머, 두 개의 GluA2/3 헤테로다이머 또는 두 개의 GluA1/GluA1 호모다이머이다.

본원에 따른 AMPAR의 GluA1 서브유니트의 Ser831 잔기 인산화의 특이적 저해를 통해 AMPA 수용체 활성을 직접적으로 조절하여, AMPA 수용체의 비정상적 활성과 관련된 다양한 정신질환을 예방/치료할 수 있으며, 특히 공포재발 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 재발 유도 자극에 의해 T-LAn 시냅스에서 시냅스 효능이 맥락 특이적으로 향상된다는 결과를 나타내는 것으로 각 그래프는 다음과 같다: a는 래트를 사용한 행동실험 결과를 합한 것으로 7일째 ABB-톤 그룹 (n = 39 래트), ABC-맥락 그룹 (n = 54 래트) 및 ABC-톤 그룹 (n = 43 래트)에서 톤 제시 전에 나타난 공포행동 (프리징) 퍼센트이고 (F2,133 = 1.905, P = 0.1529, one-way ANOVA), 오른쪽 그래프는 래트를 사용한 행동실험 결과를 합한 것으로 7일째 ABB-톤 그룹 (n = 39 래트) 및 ABC-톤 그룹 (n = 54 래트)에서 톤 제시 동안에 나타난 프리징 퍼센트를 나타낸다 (t91 = 27.42, P < 0.05, unpaired t test). *P < 0.05; b는 나이브 그룹, 공포소거 그룹, ABB-톤 그룹, ABC-맥락 그룹 및 ABC-톤 그룹에서 자극세기-반응성을 측정하여 시냅스 효용을 관찰한 결과이다. ABC-톤 그룹, 즉 공포재발그룹에서 동일 자극에 대한 반응이 가장 큰 것으로 관찰되었다 (F4,45 = 7.701, P < 0.0001; 나이브, 3.57 ± 0.63 pA μA^-1, n = 8 셀 (8 래트); 공포소거 그룹, 3.05 ± 0.56 pA μA^-1, n = 9 셀 (9 래트); ABB-톤 그룹, 3.10 ± 0.64 pA μA^-1, n = 8 셀 (8 래트); ABC-맥락 그룹, 3.13 ± 0.44 pA μA^-1, n = 7 셀 (7 래트); ABC-톤 그룹, 7.15 ± 0.84 pA μA^-1, n = 14 (13 래트); 모든 4개의 쌍에 대한 P < 0.01 (one-way ANOVA with Newman-Keuls post-test). 전 세포 기록으로 측정한 일련의 저항성은 그룹간 차이가 없었다 (나이브, 17.62 ± 0.82 MΩ; 공포소거 그룹, 16.93 ± 0.63 MΩ; ABB-톤 그룹, 16.64 ± 0.78 MΩ; ABC-맥락 그룹, 17.57 ± 0.70 MΩ; ABC-톤 그룹, 17.39 ± 0.44 MΩ); c는 공포소거 그룹, 재발후공포소거 그룹 및 짧은 재발 그룹에서 자극세기-반응성을 측정한 결과이다. 짧은 재발 그룹에서 시냅스 효용이 증가하였으며, 재발후공포소거그룹에서 시냅스 효용이 감소되었다 (F2,21 = 8.297, P = 0.0026; 공포소거 그룹, 3.02 ± 0.57 pA μA^-1, n = 8 셀 (8 래트); 짧은 재발 그룹, 7.17 ± 1.02 pA μA^-1, n = 7 셀 (7 래트); 재발후공포소거 그룹, 3.77 ± 0.68 pA μA^-1, n = 7 셀 (7 래트); 모든 2개의 쌍에 대한 P < 0.01 (one-way ANOVA with Newman-Keuls post-test). 도 1b,c의 대표 트레이스 그래프는 인풋 자극 35μA 에 대한 4회의 반응의 평균값이며, 에러바는 s.e.m.이고, b 및 c의 스케일바는 20ms 및 100pA를 나타낸다.
도 2는 재발 유도 자극이 맥락 특이적 방식으로 T-LAn 시냅스에서 AMPAR 매개 mEPSC의 진폭을 향상시키는 결과로 각 그래프는 다음과 같다: (a) 왼편은 Sr2+ 의 존재 하에 유발된 mEPSC의 누적 진폭 분포이고 (나이브, n = 8 셀 (8 래트); 공포소거 그룹, n = 7 셀 (7 래트); ABB-톤 그룹, n = 11 셀 (11 래트); ABC-맥락 그룹, n = 4 셀 (4 래트); ABC-톤 그룹, n = 11 셀 (11 래트); 셀당 300 회, ABC-톤 그룹 대 기타 대조군 그룹에 대한 P < 0.01, Kolmogorov-Smirnov test, 오른편은 Ca2+ 또는 Sr2+ 존재 중에서 유발된 EPSC의 샘플 트레이스이며, 스케일바는 50 ms and 10 pA를 나타내고, 나타낸 트레이스는 디스플레이의 향상을 위해 디지털 가우시안 필터로 처리되었다; (b) 왼편은 Sr2+ 존재 중에서 유발된 mEPSCs의 평균 진폭으로, ABC-톤 그룹에서 진폭이 향상되었다 (F4,40 = 6.037, P = 0.0008; 나이브, 12.66 ± 0.36 pA; 공포소거, 12.12 ± 0.42 pA; ABB-톤, 11.67 ± 0.35 pA; ABC-맥락, 11.95 ± 0.75 pA; ABC-톤, 14.37 ± 0.57 pA; *P < 0.05, one-way ANOVA with Newman-Keuls post-test)이고, 오른편은 Sr2+ 존재 중에서 유발된 mEPSCs의 평균 프리퀀시 (나이브, 6.04 ± 0.92 Hz; 공포소거, 5.68 ± 0.55 Hz; ABB-톤, 6.19 ± 1.03 Hz; ABC-맥락, 6.97 ± 0.96 Hz; ABC-톤, 6.29 ± 1.11 Hz; F4,40 = 0.1257, P = 0.9722, one-way ANOVA)이다. 에러바는 s.e.m.을 나타낸다.
도 3은 재발 유도 자극이 맥락-특이적 방식으로 T-LAn 시냅스에서 GluA2-결여 AMPA 수용체 활성을 향상시키는 것을 보여주는 결과로 공포 재발 유도 자극이 AMPA 수용체 조성 변화를 일으켰는지 확인하기 위하여, RI(rectification index)를 측정하였으며, (a)는 시냅스 AMPA 전류의 RI가 4가지 대조군 (F4,31 = 5.292, P = 0.0028; 나이브, 2.64 ± 0.09, n = 8 셀 (7 래트); 공포소거 그룹, 2.69 ± 0.15, n = 5 셀 (5 래트); ABB-톤 그룹, 2.83 ± 0.13, n = 6 셀 (5 래트); ABC-맥락 그룹, 2.83 ± 0.04, n = 5 셀 (4 래트); ABC-톤 그룹, 3.30 ± 0.15, n = 8 셀 (6 래트) 과 비교하여 ABC-톤 그룹에서 증가하였음을 보여주는 결과로서, 높은 RI 값은 시냅스 내 GluA2-lacking AMPA 수용체의 비율이 증가했음을 의미한다. 모든 4 쌍에서 *P < 0.05 Newman-Keuls post-test one-way ANOVA가 사용되었다. 역전위는 5개의 군에서 유의적으로 변하지 않았다 (F4,31 = 0.6574, P = 0.6268; 나이브, 15.0 ± 0.0 mV; 공포소거 그룹, 15.0 ± 0.0 mV; ABB-톤 그룹, 14.67 ± 0.21 mV; ABC-맥락 그룹, 15.0 ± 0.0 mV; ABC-톤 그룹, 14.38 ± 0.63 mV); (b-f)는 GluA2-결여 AMPA 수용체의 억제제인 NASPM을 처리하여 공포 재발 그룹에서 GluA2-lacking AMPA 수용체의 비율이 증가했음을 확인한 결과로, NASPM이 ABC-톤 그룹에서 다른 4개의 대조군과 비교하여 유의적으로 큰 정도로 AMPAR-매개 EPSCs를 억제하였음을 보여주는 결과 (나이브, n = 5 셀 (5 래트); 공포소거, n = 7 셀 (6 래트); ABB-톤 = 5 셀 (5 래트); ABC-맥락 = 5 셀 (5 래트); ABC-톤 = 7 셀 (7 래트))이며, d-AP5 (50 μM)가 레코딩 용액에 포함되었다; (g)는 결과를 요약한 것이다 (F4,28 = 4.573, P = 0.0069; *P < 0.05 ABC 톤 vs 모든 다른 그룹 Newman-Keuls post-test one-way ANOVA 사용), 에러바는 s.e.m.을 나타낸다.
도 4는 공포재발 유도 자극이 LAn 시냅스표면에서 GluA1 Ser831 인산화를 향상시킨다는 것을 나타내는 결과로, (a)에서 윗부분은 면역블랏 결과이고, 아래부분은 대조군 (나이브 및 공포소거 그룹)과 비교하여 ABC-톤 그룹에서 Ser831의 인산화가 향상되었음을 보여주는 결과이다. 세 개의 그룹에서 Ser845인산화 및 표면 GluA1의 양에 유의한 차이는 없었다 (나이브, n = 3 (9 래트); 공포소거 그룹, n = 3 (9 래트); ABC-톤 그룹, n = 3 (9 래트)); (b)에서 위부분은 면역블랏 결과이고, 아래부분은 기타 대조군들에서 표면 GluA1의 양 및 Ser831 인산화 수준에 있어 유의한 차이가 없음을 나타내는 결과이다 (나이브, n = 3 (9 래트); ABB-톤 그룹, n = 3 (9 래트); ABC-맥락 그룹, n = 3 (9 래트); GluA1-p831/GluA1, F2,8 = 0.2664, P = 0.7747, one-way ANOVA; GluA1, F2,6 = 0.1273, P = 0.8828, one-way ANOVA). 에러바는 s.e.m.을 나타낸다.
도 5는 공포학습된 래트에서 LAn 시냅스의 시냅스 효용 및 GluA1 인산화가 학습된 톤 제시에 의해변하지 않는다는 것을 나타내는 결과로, (a)는 공포학습-맥락 그룹 및 공포학습-톤 그룹 (공포학습-톤, 8.50 ± 1.01 pA μA^-1, n = 16 셀 (12 래트); 공포학습-맥락, 8.23 ± 0.94 pA μA^-1, n = 21 셀 (17 래트); t35 = 0.1957, P = 0.846, unpaired t test)에서 자극-반응성을 측정한 결과이며, 대표트레이스는 인풋 자극 35 μA에서 유발된 4회 반응의 평균 결과이다; (b)에서 왼편은 면역블랏 분석 결과이고, 오른편은 공포학습-톤 및 공포학습-맥락 그룹에서 LAn 시냅스 표면 GluA1의 양 및 Ser831 인산화 수준에 있어 유의한 차이가 없음을 나타내는 결과 (공포학습-톤 그룹, n = 3 (9 래트); 공포학습-맥락 그룹, n = 3 (9 래트); t2 = 0.5171, P = 0.6566 for GluA1-p831/GluA1, unpaired t test; t2 = 0.2586, P = 0.8201 for GluA1-p845/GluA1, unpaired t test)로, 에러바는 s.e.m.을 나타낸다.
도 6은 공포재발시 편도체 시냅스효용이 보다 쉽게 강화되는 이유가 직전의 공포소거학습에 의해 T-LAn 시냅스강화 역치가 낮아졌기 때문이라는 실험결과로 (a)는 T-LAn 시냅스에서 어떤 처리도 하지 않은 기저 트랜스미션을 나타내고 (n = 9 셀 (7 래트), t8 = 0.9112, P = 0.39, paired t test); (b-d)는 단일 버스트 (4회 자극 펄스)와 후시냅스 탈분극 패어링 자극이 공포소거그룹에서만 시냅스 강화효과를 가져오는 것을 나타내는 결과로, 패어링되지않은-공포소거 또는 나이브 대조군에서는 이러한 현상이 나타나지 않았다 (자극 후 20분에서 30분까지의 평균 반응: 나이브, 95.38 ± 3.86% of baseline, n = 7 셀 (6 래트), t6 = 1.197, P = 0.2766; unpaired-공포소거, 101.8 ± 5.24%, n = 7 셀 (7 래트), t6 = 1.638, P = 0.1624; 공포소거, 128.2 ± 6.83% of baseline, n = 5 셀 (5 래트), t4 = 4.126, P = 0.0145; paired t test). 이를 역치가 낮은 시냅스 강화현상 (low-threshold potentiation)으로 명명하였다; (e)는 공포재발이 역치가 낮은 시냅스 강화를 차단시키는 것을 나타내는 결과이다. ABC-톤 그룹에서 Low-threshold potentiation이 유도되지 않았으며, 이는 공포재발과 low-threshold potentiation이 같은 메커니즘을 공유한다는 것을 의미한다 (최초 10 min: 공포소거 그룹, 125.4 ± 1.88% , n = 8 셀 (7 래트); ABC-톤 그룹, 103.2 ± 4.09%, n = 6 셀 (5 래트); t12 = 5.390, P = 0.0002, unpaired t test; 마지막 10 min: 공포소거 그룹, 129.7 ± 6.31%; ABC-톤 그룹, 97.80 ± 4.53%; t12 = 3.840, P = 0.0024, unpaired t test). 기술한 패어링 트레이스는 유도된 처리 전 및 후의 4회 트레이스의 평균이고, 에러바는 s.e.m.을 나타내고 스케일 바는 10 ms 과 50 pA를 나타낸다.
도 7은 GluA1_D 펩타이드가 낮은 역치 시냅스 강화현상 (low-threshold potentiation)만을 저해하며, LTP 또는 공포 조건화에는 영향을 미치지 않는다는 결과이다. (a)는 공포소거 래트의 편도체 절편에 GluA1_D 펩타이드를 처리시에 낮은 역치 시냅스 강화현상이 억제되지만, 대조군 GluA1_A 펩타이드는 영향이 없음을 나타내는 결과이고 (GluA1_A, 122.7 ± 6.37%, n = 13 셀 (12 래트); GluA1_D, 103.6 ± 3.79%, n = 9 셀 (9 래트)), 나타낸 트레이스는 패어링 전 및 패어링 20분 후에 수득한 EPSCs의 중첩 평균으로 스케일 바는 10 ms 및 100 pA를 나타낸다; (b,c)는 공포소거 래트의 편도체 절편에 GluA1_A 펩타이드 (b) 또는 GluA1_D 펩타이드 (c)를 처리하는 것이 기저 시냅스 트랜스미션에는 유의한 효과가 없음을 나타낸다 (GluA1_A 펩타이드, 106.2 ± 6.02 of baseline, n = 4 셀 (4 래트), t3 = 1.026, P = 0.3806, paired t test; GluA1_D 펩타이드, 98.34 ± 4.69% of baseline, n = 10 셀 (9 래트), t9 = 0.3549, P = 0.7309, paired t test); (d)는 GluA1_D 펩타이드가 나이브 래트의 조직에서 T-LAn 시냅스 LTP에 영향을 미치지 않음을 나타내며, 이러한 강화는 잘 알려진 CaMKII 억제제인 AC3 펩타이드에 의해 저해되었다 (매체, n = 5 셀 (5 래트); GluA1_D 펩타이드 그룹, n = 5 셀 (5 래트); AC3 그룹, n = 5 셀 (5 래트); F2,12 = 5.945, P = 0.0161; P < 0.05, AC3 그룹 대 매체 또는 GluA1_D 펩타이드 그룹, Newman-Keuls post-test one-way ANOVA 사용); (e)에서 왼편은 나이브 래트의 LAn에 GluA1_D 펩타이드 마이크로주입이 공포 조건화에 영향을 미치지 않음을 보여주는 결과이다 (나이브, n = 15 래트 and Tat-GluA1_D 펩타이드 그룹, n = 13 래트; 공포학습 이후 3시간, t26 = 0.2052, P = 0.84, unpaired t test; 공포학습 이후 24시간, t26 = 0.8937, P = 0.38, unpaired t test); 오른편은 인젝터 캐뉼라 팁을 도식적으로 나타낸 것이며, 에러바는 s.e.m.을 나타낸다.
도 8은 LAn으로의 세포투과성 GluA1_D 펩타이드의 마이크로인젝션이 공포재발을 억제하는 것을 나타내는 결과이다. (a)에서 왼편은 공포학습 후 톤에 대해 반응한 공포반응 (프리징) 수준이다. 이 단계에서 펩타이드는 주입되지 않았고, 그룹간의 프리징 수준에서 유의한 차이는 없었다 (F2,48 = 0.4628, P = 0.6324, one-way ANOVA); 오른편은 LAn에 공포재발 60분 전에 Tat-GluA1_D 펩타이드를 투여한 결과 공포재발이 약화되었음을 나타내는 결과이며, vehicle, GluA1_A 대조군에서는 정상적인 공포재발이 관찰되었다 (Tat-GluA1_A 펩타이드, 63.94 ± 6.82%, n = 15 래트; Tat-GluA1_D 펩타이드, 39.92 ± 6.23%, n = 23 래트; vehicle, 69.55 ± 4.22%, n = 11 래트; F2,48 = 6.371, P = 0.0036; **P < 0.01 Tat-GluA1_D 펩타이드 vs 기타 그룹, Newman-Keuls post-test one-way ANOVA). (b)는 캐뉼라 팁의 위치를 도식적으로 나타낸 것이고 (왼편, Tat-GluA1_D 펩타이드; 중간, Tat-GluA1_A 펩타이드; 오른편, vehicle), (c)는 형광 dansyl-tat-GluA1_D 펩타이드 (1.5 nmol)를 이용하여, 펩타이드의 LAn내 확산을 관찰한 결과이다. 마이크로인젝션 1시간 이후 컨포칼 현미경으로 관찰한 결과, LAn 내부 펩타이드의 확산을 관찰하였다. 흰색 화살표는 인젝터 캐뉼라의 말단을 나타내고, 오른편은 개별 LAn 뉴런으로의 펩타이드 전달을 고배율로 관찰한 결과이다. 흰색 점선은 편도체 서브핵의 경계를 나타낸다 (LAn, lateral nucleus of amygdala; Ce, central nucleus of amygdala; BLA, basolateral nucleus of amygdala); (d)는 Tat-GluA1_D 펩타이드가 공포학습의 기억에는 유의한 효과가 없음을 나타내는 결과이다. 나이브 래트의 LAn에 펩타이드 또는 vehicle을 주사한 결과, 그룹 간 공포반응 (프리징)이 차이가 없었다 (vehicle 그룹, n = 6 래트; Tat-GluA1_D 펩타이드 그룹, n = 5 래트; t9 = 0.5306, P = 0.6085, unpaired t test). (e)는 Tat-GluA1_D 펩타이드 마이크로인젝션이 래트의 운동능력 및 불안을 변화시키지 않았다는 것을 오픈필드 테스트를 통해 관찰한 결과이다 (펩타이드 또는 vehicle 마이크로인젝션은 시험 전 90분에 수행되었으며, 25 pmol의 펩타이드는 시험 60분전에 마이크로인젝트되었음; Tat-GluA1_D, n = 9 래트; vehicle, n = 7 래트; 중앙에 머무른 퍼센트 시간, t14 = 0.7262, P = 0.4797, unpaired t test; 이동 거리, t14 = 0.4758, P = 0.6416, unpaired t test). 오픈 필드테스트는 공포소거 래트에서 수행되었으며, 에러바는 s.e.m.을 나타낸다.

본원은 AMPA 수용체의 GluA1 서브유니트의 Ser831 잔기의 인산화를 억제하여, AMPA 수용체 비정상적 활성을 막음으로써 정신 질환을 조기에 예방, 그 진행을 중지시키거나 치료할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

이에, 한 양태에서 본원은 AMPA 수용체의 GluA1의 831번째 세린의 인산화 하위작용 억제제를 포함하는 정신질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 질환의 치료는 질환과 관련된 증상을 감소시키거나, 중증도를 경감하거나 또는 진행을 억제하는 것을 의미하며, 예방은 질환 발생의 억제 또는 발병의 지연을 의미한다.

AMPA 수용체는 신경계에서 글루타메이트에 의해 활성화되는 수용체로서, 시냅스를 통해 신경세포들이 교신하는 데 결정적으로 기여하고 있다. AMPA 수용체는 막단백질로, Golgi/ER 등에서 조합되어 엔도좀 등을 거쳐서 시냅스로 수송된다. AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)는 이 수용체를 선택적으로 자극하는 효현제 (agonist)의 이름이며, AMPA 수용체, NMDA 수용체, Kainate 수용체가 모여 글루타메이트성 이온채널 수용체 (ionotropic glutamate receptor)군을 이룬다. 학습과 기억 (learning and memory) 등에 의해 시냅스에 존재하는 AMPA 수용체는 정량적/정성적으로 조절되며 이것이 시냅스의 세기 (synaptic efficacy)를 조절하는 중요한 기작임이 알려져 있다. AMPA 수용체는 GluA1-4 (GluR1-4)까지의 서브유닛이 모인 사량체로 이루어져 있으며, 일반적으로 GluA2를 포함하는 GluA1/2 헤테로머 또는 GluA2/3 헤테로머 형태로 많이 존재한다. 특이적으로 중독, 공포증 등의 정신질환 또는 학습 이후 GluA2가 포함되지 않은 AMPA 수용체가 증가하는 경우가 있는데, 이 경우 GluA1/1 호모머의 형태로 주로 존재하며 칼슘을 통과시키는 특성을 나타낸다.

본원에 따른 조성물은 GluA1 서브유니트이 포함되는 한 다양한 구성의 사량체로 이루어진 AMPAR에 작용할 수 있으며, GluA1/2 헤테로머 또는 GluA2/3 헤테로머, GluA1/GluA1 호모머에 작용할 수 있다.

AMPA 수용체 인산화의 결과 AMPA 수용체가 인산화되면, 수용체에 의한 신경전달세기가 강화되거나 (channel conductance enhancement), AMPA 수용체의 시냅스 부위 재배열 (lateral diffusion 등) 및 수용체-세포내 단백질 상호작용이 촉진되며, AMPA 수용체의 비정상적 활성은 다양한 정신 질환의 원인으로 작용한다 (Javitt, 2004, Molecular Psychiatry, 9, 984-997.; Beneyto et al., 2007, Neuropsychopharmacology, 32, 1888-1902.; Zarate and Manji, 2008, Exp Neurol., 211(1): 7-10.)

본원에 따른 조성물은 정신 질환의 원인으로 작용하거나 동반되는 AMPA 수용체의 비정상적 활성을 AMPA 수용체 Ser831 인산화 하위작용을 특이적으로 조절하여 AMPA 수용체 활성을 조절함으로써 정신질환을 조기에 예방하거나 증상을 완화할 수 있다. 본원에 따른 조성물이 작용하는 AMPA 수용체의 831번째 Ser을 포함하는 서열은 예를 들면 GenBank 번호 CAA41491 (glutamate receptor GLUR1, Homo sapiens)을 참조할 수 있으며, 이를 포함하는 주변서열은 GFCLIPQ S IMEAIRTSTLP (서열번호 4) (밑줄친 부분이 831번째 Ser에 해당함)로 표시된다.

AMPA 수용체 활성은 인산화에 의해 주로 조절되므로, 이러한 방식으로 AMPA 수용체 인산화 하위작용을 억제하면 AMPA 수용체의 과활성 및 세포내 신호전달을 방지하여 이와 관련된 다양한 정신질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 따라서 AMPA 수용체의 Ser831번째의 인산화를 억제할 수 있는 본원 조성물은 다양한 정신질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본원에서 용어 “정신질환”은 기분, 사고 및 행동에 영향을 미치는 정신건강과 관련된 증상으로, 통상적으로 뇌의 문제로 발생하며 크게, 정신증과 신경증으로 나뉜다. 전자는 정신분열증, 우울증 등을 예로 들 수 있으며, 후자는 전환장애, 강박장애를 예로 들 수 있다. 이러한 정신질환은 범불안장애, 공포증, 공황장애, 강박장애 및 외상후스트레스장애를 포함하는 불안장애; 우울장애 및 양극성 장애를 포함하는 기분장애; 신체화장애, 전환장애, 통증장애, 건강염려증 및 신체변형장애를 포함하는 신체형장애; 해리성 기억상실증, 해리성 정체감장애를 포함하는 해리성장애; 정신분열증 및 분열정동장애 및 망상장애를 포함하는 정신증적장애; 분열성 성격장애, 경계성 성격장애, 강박성 성격장애를 포함하는 성격장애; 성장애 및 성정체감 장애; 술, 담배 또는 마약을 포함하는 중독성 물질에 중독되는 물질관련장애; 신경성 식욕부진증 및 신경성 폭식증을 포함하는 섭식장애; 수면곤란증 및 수면이상증을 포함하는 수면장애; 정신지체, 학습장애, 운동기술장애, 의사소통장애 및 전반적 발달장애를 포함하는 소아기 및 청소년기장애; 간헐성 폴발성장애, 도박증, 방화증 또는 발모증을 포함하는 충동통제장애; 적응장애; 또는 섬망, 치매 및 기억상실장애를 포함하는 인지적 장애를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에서 본원의 조성물은 불안장애의 예방 또는 치료에 사용된다. 불안 장애는 병적인 불안으로 인하여 과도한 심리적 고통을 느끼거나 현실적인 적응에 심각한 어려움을 겪는 경우를 말한다. 불안 장애에는 범불안장애 (generalized anxiety disorder), 공포증 (phobia)(특정 공포증, 사회공포증, 광장공포증), 공황장애 (panic disorder), 강박장애 (obsessive-Compulsive Disorder) 및 외상 후 스트레스 장애 (post traumatic stress disorder, PTSD) 등을 포함한다.

또다른 구현예에서 본원의 조성물은 외상 후 스트레스 장애 및 공포증에 대한 노출치료 기간 중에 또는 그 후에 투여되었을 경우, 노출치료 후 발생되는 치명적인 부작용인 공포 기억 재발을 차단할 수 있다.

따라서 AMPA 수용체의 Ser831의 인산화 하위작용을 억제할 수 있는 공지된 다양한 물질이 본원 조성물에 포함될 수 있으며, 당업자라면 본원의 효과를 고려하여 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.

일 구현예에서 AMPA 수용체의 Ser831의 인산화를 억제할 수 있는 물질은 AMPA 수용체의 GluA1의 831번째 인산화 부위를 모방한 펩타이드를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서 AMPA 수용체의 GluA1의 831번째 인산화 부위를 모방한 펩타이드는 본원 실시예에 기재된 것과 같은 GluA1-831D 및 GluA1-831S을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 펩타이드를 포함하는 다양한 길이의 펩타이드가 사용될 수 있으며, 예를 들면 10-20개 아미노산 길이이다. 일 구현예에서 LIPQQD⁸³¹INEAI, LIPQQS⁸³¹INEAI이며, 상기 펩타이드의 각 문자는 아미노산을 단문자로 표시하는 것으로, 각 문자가 나타내는 아미노산은 당업계에 공지되어 있으며, L은 루이신, I는 아이소루이신, P는 프롤린, Q는 글루타민, D는 아스파르트산, N은 아스파라진, E는 글루탐산, A는 알라닌, S는 세린을 나타낸다.

다른 구현예에서 이러한 펩타이드는 세포 투과성을 향상시키는 펩타이드와 같은 기와 컨쥬게이션 된 것으로 예를 들면 Cell-membrane transduction domain of the human immunodeficiency virus-type 1 Tat protein, YGRKKRRQRRR, Schwarze et al., 1999, Science, 1569-72; Trojan peptide penetratin/antennapedia, Binder and Lindblom, 2004, Biophys J, 332-43; polyarginine (R7-R9) peptides, Fuchs and Raines, 2004, Biochemistry, 2438-44.; N-myristoylation, Bergman et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol, 453-6)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서는 Tat 펩타이드가 사용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 AMPA 수용체 GluA1의 831번째 세린 잔기의 인산화를 억제할 수 있는 물질을 GluA1 단백질, 또는 GluA2가 결여된 AMPAR 또는 이를 발현하는 세포에 처리하는 단계; 상기 물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여 상기 GluA1 단백질의 Ser 831 잔기에서의 인산화가 억제되는 경우, 이를 공포재발 억제제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 정신질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

다른 측면에서 또한 본원은 GluA1 AMPAR을 발현하는 세포 또는 동물에 정신질환을 유도하는 단계; 상기 정신질환이 유도된 세포 또는 동물에 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 정신질환이 유도된 세포 또는 동물에서 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, AMPA 수용체 GluA1의 831번째 세린 잔기의 인산화를 억제하는 화합물을 후보 화합물로 선별하는 단계를 포함하는, 정신질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서 정신질환은 앞서 언급한 바와 같다.

상기 방법에서 GluA1 서브유니트 AMPA 수용체를 발현하는 세포는 내재적으로, 또는 유전자 전달이입 등의 방법에 의하여 이를 발현할 수 있으며 이를 통해 시냅스/스파인 또는 이에 준하는 구조를 형성할 수 있는 세포로 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, HEK293, (BHK)-570, CGNH-89, HNSCC, NG-108, NG-108, N1E, NB41A3, Neuro2a, SKNBE2, CHP212, SKNDZ, IMR32, SKNAS, SKNFI, D341, D283, Daoy, PFSK1, TE671, 또는 일차 히포캠퍼스 뉴런 세포가 사용될 수 있다. 이들 세포를 세포배양 플레이트에 배양한 후, 여기에 시험물질을 첨가한 후, 일정 시간 후에 대조군 (시험물질을 처리하지 않은 경우)와 비교하여, AMPA 수용체의 Ser 831의 인산화를 억제하는 시험물질을 후보 물질로 선별할 수 있다. 일 구현예에서 상기 세포는 특히 AMPA 수용체를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 이를 과발현한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 AMPA 수용체를 발현하는 세포나 동물, 특히 포유류, 더욱 특히 래트, 마우스에 정신질환 또는 정신질환과 유사한 증상 이 유도될 수 있다. 질환을 유도하는 방법은 공지되어 있으며, 병인이 되는 물질을 처리하거나 관련있는 유전 변이를 인위적으로 유도하여 다양한 정신질환을 유도할 수 있다.

본원의 "시험물질"은 AMPA 수용체의 인산화를 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자 (예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.

본원에 따른 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오 분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공할 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.

본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 농도와 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 AMPA 수용체 인산화의 억제 또는 감소를 가져오는 물질을 후보 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

본원의 방법에서 시험물질에 의한 AMPA 수용체 인산화 억제는 단백질의 인산화 여부를 측정할 수 있는 다양한 공지의 방법 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법으로 측정될 수 있다.

본원의 치료제는 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 치료제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여 (예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형태로 투여할 수 있으며, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 0.1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 공지된 AMPA 수용체 인산화 억제제의 투여량을 적용할 수 있다.

본원의 약학조성물은 상술한 AMPA 수용체 인산화 억제제 이외에 질환에 따라서 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 치료제는 정신질환의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 신경세포에서 AMPA 수용체의 인산화 억제를 통한, 정신질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료적으로 유효한 양의 AMPA 수용체 인산화 억제제를 질환의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본원에서 사용한 "대상체"라는 용어는 질환의 예방, 치료, 관찰 또는 실험 대상인 동물, 특히 포유류, 더욱 특히는 인간이다.

본원에서 사용한 "치료학으로 유효량"이라는 용어는, 치료를 원하는 질병 또는 질환의 예방 또는 증상의 경감, 진행의 억제, 중증도의 감소 등을 포함하여 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 결정될 수 있는 대상체에서 생물학적 또는 의약적 반응을 유도해내는 AMPA 수용체 인산화 억제제를 포함하는 약학조성물의 양을 의미한다.

본원에 따른 AMPA 수용체의 인산화 억제제를 포함하는 약학 조성물의 치료적 유효량은 약 0.01 내지 100mg/Kg 특히 약 0.01 내지 약 50mg/Kg, 더욱 특히 약 0.01 내지 약 25mg/Kg 더더욱 특히 약 0.01 내지 약 5mg/Kg/투여량일 것이다. 따라서 투여량은 대상체의 조건 예를 들면 연령, 체중 및 식이, 제제의 강도, 질환 상태의 진행, 및 투여 방식 및 시간 및 구체적인 AMPA 수용체 인산화 억제제에 따라 가변적일 것이다. 투여될 최적의 투여량은 당해 기술분야의 통상을 지식을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본원의 조성물은 경구 또는 비경구 투여된다. 본 발명의 방법에 따라, 본 발명의 조성물은 치료가 진행되는 동안 전 또는 일부 기간에 걸쳐 상이한 시간에 개별적으로, 또는 동시에 투여될 수 있다. 특히 본원의 조성물은 매일 1회 투여로 투여될 수 있거나, 매일 투여되는 총량은 연속 전달 또는 매일 2회, 3회 또는 그 이상으로 나누어 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법

행동실험: 공포조건화학습 (Fear conditioning) 및 공포소거 (Extinction), 공포재발 (Renewal)

공포조건화학습은 실험용 흰색 래트 (3-5주) 소리자극 (조건자극, 2.8kHz, 30초, 85dB)과 전기 자극 (1.0mA foot shock, 1초)을 동시에 들려주는 시행을 100초 간격으로 3회 시행하였다. 보다 강한 학습을 위해 이를 2일 반복하였다. 공포기억의 형성정도는 공포조건화 학습 이후 실험동물에 소리자극만을 주었을 때 나타나는 공포행동, 프리징(freezing)을 측정하여 정량화하였다. 프리징 반응은 호흡 이외의 모든 움직임이 없는 상태를 의미하며, 숙련된 연구자가 처치조건에 대한 사전정보없이 측정하였다. 공포소거학습은 공포조건화학습이 이루어진 환경 외에 새로운 환경에서 소리자극만을 반복적으로 들려줌으로 이루어졌다. 1일 100초 간격으로 15-20번의 소리를 들려주며, 이를 3일 반복하였다. 공포재발은 공포소거학습이 이루어진 환경 외에 다른 환경에서 소리자극만을 들려줌으로 진행하였다.

약리학 (In vivo pharmacology) 실험 / 약물 미세주입 (cannula 이식수술)

본 실험에 사용한 펩타이드는 (Peptron, 펩트론)에서 합성하였다. 래트의 뇌 특정부분, 또는 전역에 약물/펩타이드 등을 처리하고 학습과 기억에 미치는 영향을 실험하기 위한 것으로, 마취된 흰색 래트의 편도체 (좌표, A.P.:-2.8mm, L:5.0mm, DV:7.0mm)에 약물주입용 캐뉼라를 삽입, 고정하였다. 캐뉼라 삽입 후 적어도 5일간의 회복기를 거쳤다. 약물주입은 캐뉼라에 폴리에틸렌 튜브를 연결시키고 이를 다시 10μl 용 해밀턴 주사기에 연결시켜서 주입하였다. 행동실험 30분 전에 지정된 약물 (0.5 μl)을 캐뉼라를 통해 주입하였다. 테스트가 끝난 후 조직학적인 방법 (뇌절편 절단 및 염색)을 통해 캐뉼라가 꽂혀있던 자리를 확인하였다.

엑스비보 전기 생리학 실험

인비보 상태에서 편도체를 통해 일어나는 시냅스 강화/약화를 인비트로에서 재현하기 위해 소리 자극 대신에 축삭 (input axons)의 인위적 전기적 자극을 이용하며, 자극에 반응하는 시냅스 효율을 실시간으로 측정하였다. 편도체 뇌절편의 경우 시상부 (thalamus)로부터 유입되는 시상 섬유 (thalamic fiber)를 전기자극하며, 편도체 시냅스 반응을 세포외필드기록 (extracellular field recording) 또는 전세포패치클램프 (whole-cell patch clamp recording)를 이용하여 측정하였다.

Rectification index 측정

전기생리학적 기법으로 공포학습전후에 GluA2-결핍 AMPA 수용체의 시냅스 삽입 (synaptic insertion)을 관찰하였다. 이를 위해서 GluA2-결핍 AMPA 수용체들이 inward rectification을 보이는 성질을 이용하여 AMPA 수용체의 I-V곡선 기울기의 변화로 관찰하였다. 여기서 확인된 변화를 토대로, GluA2-결핍 AMPA 수용체의 블락커인 NASPM (1-Naphthyl acetyl spermine), PhTX (Philanthotoxin) (Sigma)등의 약물을 처리하여 GluA1 전류를 확인하였다.

시냅스 표면 AMPA 수용체의 생화학적 정량

실험동물의 뇌 조직절편에서 시냅스 표면을 추출하여 특정 단백질의 양을 알기 위해 수행하는 본 분석을 수행하였다. 주로 단백질의 발현 여부를 알기 위해 사용하였다. 학습이 끝난 래트의 뇌를 적출한 후 400 μm 두께로 조직절편을 제작하고, 바이오티닐화 방법을 이용하여 시냅스 표면의 AMPA 수용체를 표지하였으며, GluA1, Ser831, Ser845에 대한 항체를 사용하여 단백질의 양을 측정하였다.

실시예 1 T-LAn 시냅스 효능 향상과 재발 관련성

시상-편도체 시냅스 (T-LAn)는 편도체가 정보를 받는 주요 input 시냅스로서, 편도체 뉴런 활성을 조절하며 공포 반응에 관여한다고 알려져 있다. 그러므로 공포 재발이후 해당 시냅스에서 변화를 관찰하였다.

T-LAn 시냅스는 LAn의 주요 흥분 인풋 시냅스 중의 하나이다. T-LAn 시냅스 효능 향상과 재발의 관련성은 전세포 볼티지 클램프 레코딩을 이용하여 나이브 및 훈련된 래트에서 분석하였다. 결과는 도 1에 기재되어 있으며, 이는 재발 프로토콜에 의해 대조군과 비교하여 실험군에서 T-LAn 시냅스가 강화되었으며, 공포 재발과 T-LAn 시냅스 효능 향상이 밀접하게 관련되어 있음을 나타내는 것이다. 또한 도 1c에 나타난 바와 같이 위와 같은 공포 재발과 T-LAn 시냅스 효능 향상의 연관성은 재발된 공포의 소거로 인한 것이 아닌 것으로 나타났다. 아울러 공포 재발과 T-LAn 시냅스 효능 향상의 관련성이 전시냅스 또는 후시냅스 변화인지 여부를 판단하기 위해 도 2의 실험을 수행하였다. 도 2에 기재된 바와 같이 5개 행동실험 그룹의 뇌절편에서 T-LAn 시냅스의 mEPSC (miniature AMPAR-mediated excitatory postsynaptic currents)를 측정한 결과, mEPSC의 평균 진폭 분포가 ABC 톤 그룹에서 오른쪽으로 유의적으로 치우쳐 있는 것으로 나타났다 (도 2a, 2b). 이러한 결과는 후시냅스 변화가 공포 재발과 T-LAn 시냅스 효능 향상과 관련된 것임을 나타낸다.

다음으로 GluA2가 결여된 AMPAR의 향상된 활성과 연관된 AMPAR-매개 EPSC의 rectification index (RI)를 조사하였다. 결과는 도 3에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 LAn 시냅스에서 RI는 대조군과 비교하여 ABC 톤 그룹에서 유의적으로 더 높은 것으로 나타났으며, 대조군에서는 차이가 없었다. 나아가 GluA2가 결여된 AMPAR의 선택적 블락커인 NASPM (1-naphthyl acetyl spermine)을 사용한 실험 결과 AMPAR-mediated EPSC는 대조군과 비교하여 ABC 톤 그룹에서 유의적으로 더 큰 정도로 억제되는 것으로 나타났다 (도 3b 내지 g 참조). 이러한 결과는 LAn 시냅스에서 GluA2 결여 AMPAR의 활성이 재발 후 향상되었음을 나타낸다.

실시예 2 공포 재발에서 GluA1의 831번째 세린의 인산화 향상

공포재발과 관련된 분자 현상을 규명하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 실험방법에 기재된 바와 같이 생화학적 표면 바이오티닐화 기술을 사용하여 LAn 시냅토좀의 표면 단백질을 Kim, J. et al. Amygdala depotentiation and fear extinction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 20955-20960 (2007)에 기재된 바와 같이 분리한 후 다섯 개의 그룹 즉, 나이브, 공포소거, ABB-톤, ABC-맥락 및 ABC-톤 그룹에서 GluA1의 인산화를 측정하였다.

결과는 도 4에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 시냅스 표면의 GluA1의 Ser831의 인산화가 나이브 및 공포소거 그룹과 비교하여 ABC-톤 그룹에서 현저하게 증가한 것으로 나타났고 (F2,8 = 28.35, P = 0.0009, one-way ANOVA; P < 0.05 for ABC-tone vs 나이브 대조군 또는 공포소거 군, Newman-Keuls post-test, 도 4a 참조). 이 경우 표면 GluA1의 발현에는 변화가 없었다 (F2,8 = 0.5929, P = 0.5821;. 또한 나이브와 공포소거 그룹간에 차이는 없었다 (P > 0.05, Newman-Keuls post-test). 또한 도 4 b에 나타난 바와 같이 ABB-톤 그룹과 ABC-맥락 그룹은 나이브 대조군과 비교하여 차이가 없었다 (F2,8 = 0.2665, P = 0.7747). 또한 Ser845의 인산화에도 4개의 그룹 (공포소거, ABB-톤, ABC-맥락 및 ABC-톤) 에서 나이브 그룹과 비교하여 변화가 없었다 (GluA1-p845/GluA1, F2,8 = 0.1354, P = 0.8760; 도 4a; GluA1-p845/GluA1, F2,8 = 1.568, P = 0.2832; 도 4b). 이러한 결과는 공포 재발이 Ser831과 관련되어 있으며, Ser845의 인산화와는 관련이 없음을 나타내는 것이다.

실시예 3 톤 CSt 효과 배제

GluA1 인산화가 공포 재발과 관련이 있음을 보다 명확하게 입증하기 위하여, 위에서 관찰한 현상이 공포 반응을 일으키는 톤 CSt에 의한 것이 아님을 실험하였다. 이를 위해 공포학습된 래트에 공포 CSt 톤을 제시하는 경우 LAn 시냅스 강도가 변하는지를 관찰 하였다. 공포학습된 래트는 두 가지 그룹으로 나누었다. 하나의 그룹은 7일째에 톤을 들려준 래트 (공포학습-톤 그룹)이고 다른 그룹은 7일째에 톤 없이 맥락 (공포학습-맥락 그룹)에 노출되었다. 위의 두 그룹의 공포학습된 래트를 공포소거 맥락 (맥락 B)에 노출하였으나, CSt 톤은 제시하지 않았다. 7일째 시험 후 즉시 래트를 희생하여 조직 절편을 실험방법에서와 같이 조사하였다.

결과는 도 5a에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 톤 CSt로 인해 공포학습-톤 그룹과 공포학습-맥락 그룹에서 인풋-아웃풋 관계에서 유의적 변화가 나타나지 않았다. 또한 CSt 톤이 공포학습-맥락 그룹과 비교하여 공포학습-톤 그룹에서 GluA1 인산화 변화가 나타나지 않았음을 관찰하였다 (도 5b). 이러한 결과는 공포 톤 CSt이 재발과 연관되어 있을 때만 시냅스 효능과 GluA1 Ser 인산화의 빠른 향상을 유도함을 나타낸다.

실시예 4 공포 재발에 필요한 낮은 강화 역치값과 Ser831 인산화와의 연관성

본원에서는 재발은 LAn 시냅스 효능의 강화와 밀접하게 관련되어 있음을 규명하였다. 하지만 공포 재발은 편도체 시냅스 가소성에 필요한 자극과 비교하여 훨씬 약한 자극에 의해 유발된다. 이는 공포학습된 공포의 소거로 인해 후속 재발의 시냅스 강화에 필요한 역치값이 낮아지기 때문인 것으로 생각되며, 이를 위해 도 6에 기재된 바와 같은 실험을 수행하였다. 우선 전시냅스 자극 및 후시냅스 탈분극의 패어링에 의해 유도되는 낮은 역치 시냅스 강화 현상 (low-threshold potentiation)이 행동실험그룹별로 다르게 나타나는지를 조사하였다. 결과는 도 6b 내지 6d에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 패어링 프로토콜 (40ms 후시냅스 탈분극과 100Hz에서 4회 자극 펄스 패어링)을 적용에 의해 공포소거 그룹에서는 즉각적이고 지속적인 강화 현상이 나타났으나, 나이브와 비패어링 그룹에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 공포학습의 소거로 인해 LAn 시냅스 강화에 필요한 역치값이 낮추어 진다는 것을 의미한다. 나아가 도 6e에 나타난 바와 같이, 재발 후에는 이러한 값이 더 낮아지는 것을 나타내며, 패어링 프로토콜 적용시 공포소거 그룹 보다 ABC 톤 그룹에서 상당히 더 적은 강화가 발생하였다. 재발에 의한 낮은 역치 시냅스 강화의 패쇄 (occulsion)은 공포 재발이 역치가 낮은 시냅스 강화와 기전을 공유함을 나타낸다.

다음으로는 공포 재발과 역치가 낮은 시냅스 강화에 있어서 Ser831의 인산화의 중요성을 분석하였다. 이를 위해 11mer인 펩타이드 단편을 사용하였다. 이 단편은 GluA1 서브유니트의 카복시 테일의 831번째 세린 (Serine, Ser 또는 S) 잔기의 인산화가 신호전달에서 다운스트림에 미치는 영향을 분석하기 위한 것이다. 펩타이드 단편은 위의 Ser 대신에 인산화를 모방한 아스파르트산 (Aspartate, Asp 또는 D) 또는 인산화가 될 수 없는 알라닌 (Alanine, Ala, A)을 포함한다. 전자는 GluA1_D (LIPQQD⁸³¹INEAI), 그리고 후자는 GluA1_A (LIPQQA⁸³¹INEAI)로 표시하였다. 결과는 도 7a에 기재되어 있다. GluA1_D 펩타이드 (300 μg/ml)는 GluA1_A 펩타이드와 비교하여 낮은 역치값 시냅스 강화를 억제하였으며 (t20 = 2.298, P = 0.0325, unpaired t test 도 7a), 반면 두 펩타이드 모두 기저 트랜스미션 값에는 영향이 없었다 (도 7b, c). 이러한 결과는 GluA1_D 펩타이드가 GluA1 서브유니트의 인산화된 Ser831의 카복시말단과 경쟁하는 것을 나타낸다. 또한 도 7d 및 7e에 나타난 바와 같이 GluA1_D 펩타이드는 CaMKII 및 PKC 기질의 인산화에는 영향이 없으며, 따라서 이들 효소의 일반적 억제제로서 작용하지 않는 것을 나타낸다.

이러한 결과는 LAn 뉴론에서 GluA1 서브유니트의 Ser831 인산화가 장기간 강화가 아닌, 낮은 역치값 시냅스 강화에 필요한 것임을 증명하는 것이다.

실시예 5 Ser 831 인산화 억제에 의한 공포 재발 억제

GluA1_D 펩타이드에 의한 공포 재발 억제 여부를 분석하였다. 이를 위해 세포투과성 펩타이드 (Tat-GluA1_D 펩타이드 또는 Tat-GluA1_A 펩타이드 (대조군); 25pmol, 재발을 위한 톤 제시 60분 전에 투여)를 공포 소거된 쥐의 LAn 으로 마이크로인퓨전 하였다. 결과는 도 8에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 Tat-GluA1_D 펩타이드에 의해 공포 재발 (ABC 재발)이 억제되었으나, 대조군 (매체 및 Tat-GluA1_A 펩타이드 처리군)에서는 영향이 없었다 (P > 0.05, Newman-Keuls post-test; 도. 8a).

나아가 Tat-GluA1_A 펩타이드에 의한 이러한 효과가 공포 재발에 특이적인지 여부를 시험하였다. 공포학습된 래트의 LAn으로 Tat-GluA1_A 펩타이드를 주입한 경우 매체 대조군과 비교하여 학습된 공포의 재발에 영향이 없었다 (P > 0.05, unpaired t test; 도 8d). 나아가 도 8e에 나타난 바와 같이, Tat-GluA1_A 펩타이드는 불안수준이나 운동성에는 영향이 없는 것으로 나타났으며, 공포가 소거된 래트의 LAn으로의 Tat-GluA1_A 펩타이드의 주입은 매체 대조군과 비교하여 오픈 필드에서 탐색 행동에 영향을 미치지 않았다.

이러한 결과는 GluA1의 Ser831번의 인산화가 공포 조건화가 아닌, 공포 재발에 중요하다는 것을 나타내는 결과이며, 또한 가소성 및 학습에 있어서의 특이적 역할을 의미하는 것이다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Pharmaceutical Composition Comprising Inhibitors of Phosphorylation of GluA1 Subunit of AMPA receptor for preventing or treating mental disorders <130> DP201407008P <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Ile Pro Gln Gln Asp Ile Asn Glu Ala Ile 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Ile Pro Gln Gln Ser Ile Asn Glu Ala Ile 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Phe Cys Leu Ile Pro Gln Ser Ile Met Glu Ala Ile Arg Thr Ser 1 5 10 15 Thr Leu Pro

Claims

AMPA 수용체의 GluA1 서브유니트의 831번째 세린의 인산화 부위를 모방한 펩타이드인 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 LIPQQDINEAI를 포함하는 공포 재발 억제용 약학 조성물.
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AMPA 수용체의 GluA1의 서브유니트의 831번째 세린 잔기의 인산화를 억제할 수 있는 물질을 GluA1 단백질 또는 GluA2가 결여된 AMPAR 또는 이를 발현하는 세포에 처리하는 단계; 및
상기 물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여 상기 GluA1 서브유니트의 Ser831 잔기에서의 인산화가 억제되는 경우, 이를 공포재발 억제제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 정신질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 세포는 HEK293, (BHK)-570, CGNH-89, HNSCC, NG-108, NG-108, N1E, NB41A3, Neuro2a, SKNBE2, CHP212, SKNDZ, IMR32, SKNAS, SKNFI, D341, D283, Daoy, PFSK1, TE671, 또는 일차 히포캠퍼스 뉴런 세포인, 정신질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 AMPA 수용체는 4개의 서브유니트로 구성되는 사량체로, 두 개의 GluA1/2 헤테로다이머, 또는 두 개의 GluA1/GluA1 호모다이머인, 정신질환의 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.