KR101634350B1

KR101634350B1 - Single Cell-based Screening Method of Useful Enzyme Resources Using Mesh-integrated Microdroplet Array

Info

Publication number: KR101634350B1
Application number: KR1020130021247A
Authority: KR
Inventors: 이승구; 박제균; 엄유진; 권길광; 나유진; 최수림
Original assignee: 한국생명공학연구원; 한국과학기술원
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2016-06-28
Also published as: KR20140106933A

Abstract

본 발명은 단일세포의 활성을 분석하기 위해 분석하고자하는 세포를 단일 세포 단위로 함유할 수 있는 피코리터 수준의 미세액적 제조방법 및 메쉬-그리드가 도입된 미세 액적 마이크로웰 어레이를 이용하여 목적 유용 효소 활성의 탐색 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미세액적 제조 방법은 미세액적 제조 시 이차파쇄과정을 거치므로 단일세포 함유 미세액적의 생산효율을 증가시키고, 메쉬-그리드 기법을 이용한 미세액적(microdroplet) 마이크로 웰 어레이는 개방형 구조를 갖기 때문에 쉽게 액적을 포획하고 융합할 수 있으며 추가적인 조작과 다른 장치와의 연계할 수 있는 안정적 환경을 제공한다. 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소활성을 단일 세포 수준에서 고속 탐색하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라, 다양한 조건에서 미생물 간 상호작용을 연구하는 데에 적용될 수 있다. In order to analyze the activity of a single cell, the present invention relates to a method for preparing microcapsules at a picoliter level capable of containing cells to be analyzed on a single cell basis, And to a search method of enzyme activity. The micro-droplet production method according to the present invention increases the production efficiency of the micro-droplet containing micro-droplets because the micro-droplet production is subjected to a secondary disruption process in the micro-droplet production, and the micro-droplet microwell array using the mesh- Structure to capture and fuse liquid droplets easily and provide a stable environment for further manipulation and connection with other devices. Not only does it enable high-throughput screening of various microbial and metagenome-derived metabolism and enzyme activities at a single cell level, but can also be applied to study microbial interactions under a variety of conditions.

Description

[0001] The present invention relates to a single cell-based screening method and a method for screening a single cell-based target enzyme using the micro-

본 발명은 자연계에 존재하는 미생물커뮤니티 및 메타게놈 라이브러리 등 다양한 유전자원에서 원하는 대사 또는 효소 활성을 가지는 세포의 효율적 탐색 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 단일 미생물 세포를 포집한 피코리터 수준의 미세액적(microdroplet)을 제조하여 메쉬-그리드(mesh-grid)를 도입한 개방형 마이크로웰 어레이를 수행하고, 단일 세포 단위의 효소 활성 또는 세포 간 상호작용을 리포터 세포를 이용하여 분석함으로써, 원하는 단일세포수준에서 세포의 다양한 활성과 상호작용을 고효율, 고속 탐색하는 새로운 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for efficiently searching for a cell having a desired metabolic or enzymatic activity in various genetic resources such as a microorganism community and a meta genome library existing in nature. More specifically, micro-droplets of a picoliter level having a single microbial cell were prepared, and an open microwell array in which a mesh-grid was introduced was performed. The present invention relates to a novel method for high-throughput and rapid searching of various activities and interactions of cells at a desired single cell level by analyzing cell-cell interactions using reporter cells.

일반적으로 주위세포의 영향 없이 단일세포의 반응이나 분비물을 연구하거나 세포와 세포의 상호작용을 연구하기 위해서는 각 세포를 작은 부피로 분리하는 것이 필요하다. 지금까지 단일세포 분석에 일반적으로 사용되는 방법인 마이크로 플레이트는 한 구획 당 보통 최소 부피가 약 10μL 정도로 단일 세포 볼륨인 1pL 와 비교할 때 상대적으로 큰 부피이다. 이에 따라 반복적이고 비능률적인 희석 과정이 수반된다. 적은 숫자의 세포에서 효과적으로 세포의 활성을 유도하기 위해서는 단위 면적당 세포 수를 조절하는 것이 중요하고 이를 위해 미세구조물 (microfabrication)과 미세유체기술 (microfluidics)이 도입되었다(Lindstrom S. et. al., Lab Chip, 10, p33633372, 2010; Tadmor A. D. et. al., Science, 333, p5862, 2011; Boedicker J. Q. et. al., Angew. Chem.Int. Ed., 48, p59085911, 2009). 미세구조 어레이는 단위면적당 한 세포가 들어가기 위한 적당한 숫자의 구획을 대량으로 제공한다. 그러나 대장균과 같은 모양이 일정하지 않고 크기가 작은 세균을 단일세포 단위로 구분하여 분리하는 것은 용이하지 않으며 각각의 구획에 다른 약물 처리를 하고 그 세포를 다시 회복시키는 것 또한 어렵다. In general, it is necessary to separate each cell into small volumes in order to study the reaction or secretion of single cells or the interaction between cells and cells without the influence of surrounding cells. So far, the microplate, a commonly used method for single cell analysis, has a relatively small volume per compartment of about 10 μL, which is relatively large compared to a single cell volume of 1 μL. This leads to an iterative and inefficient dilution process. In order to effectively induce cell activity in a small number of cells, it is important to regulate cell numbers per unit area and microfabrication and microfluidics have been introduced for this purpose (Lindstrom S. et. Al ., Lab Chip, 10, p33633372, 2010; Tadmor AD et al, Science, 333, p5862, 2011;....... Boedicker JQ et al, Angew Chem.Int Ed, 48, p59085911, 2009). The microarchitecture array provides a large number of compartments of the appropriate number for one cell per unit area. However, it is not easy to isolate microbes such as Escherichia coli that are not uniform in shape and small in size, and it is also difficult to treat different compartments in each compartment and to recover the cells again.

이런 문제를 해결하기 위해 고안된 방법은 섞이지 않는 이상(two-phase) 유체로부터 미세액적을 형성하는 기법이다(Clausell-Tormos J. et. al., Chem. Biol., 15, p427437, 2008; Um E. et. al., Microfluid. Nanofluid., 5, p541549, 2008). 미세액적은 피코 혹은 나노 리터의 작은 액적 안에 다양한 생물활성물질을 포함할 수 있고 고체 웰과 달리 액적을 이동, 분리, 융합시키고, 시간간격에 따른 분획을 할 수 있으며, 경로를 선택할 수 있는 능동적인 시스템이다(Priest C. et. al., Appl. Phys. Lett., 89, 134101, 2006; Song H. et. al., Angew. Chem. Int. Ed., 45, 73367356, 2006; Um E. et. al., Lab Chip, 9, 207212, 2009). 생물학적 분석을 위해서는 단일세포를 포함한 액적을 안정적으로 형성 및 유지하는 것은 물론, 생물/효소 활성 유도 및 리포터 세포와의 상호작용을 위해 새롭게 유입되는 액적과 기존의 액적을 융합하는 과정이 필요하다. 또한, 추가적인 분석을 위해 미세액적 주변 오일의 조성 및 종류를 추가 또는 교환하는 과정이 필요하며, 이러한 조작단계는 쉽지 않기 때문에 미세액적기술을 용이하게 생물/효소 활성분석에 사용하는 데에는 한계점으로 작용해 왔다.The method designed to solve this problem is a technique for forming microcaval fluids from two-phase fluids (Clausell-Tormos J. et al ., Chem. Biol. , 15, p427437, 2008; et al ., Microfluid., Nanofluid. , 5, p541549, 2008). It is possible to include various bioactive materials in small picos or nano liter droplets, and it is possible to move, separate, and fuse liquid droplets differently from solid wells, to perform fractionation according to time intervals, (Priest C. et al., Appl. Phys. Lett., 89, 134101, 2006; Song H. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 45, 73367356, 2006; et al., Lab Chip, 9, 207212, 2009). For biological analysis, it is necessary to stably form and maintain a droplet containing a single cell, and to fuse a newly introduced droplet and an existing droplet to induce biological / enzymatic activity and interaction with a reporter cell. In addition, for further analysis, it is necessary to add or exchange the composition and kind of microcirculatory oil, and since this manipulation step is not easy, there is a limitation in using microcapsule technology for biological / enzyme activity analysis easily Has worked.

지금까지 어레이 구조물은 액적을 안정적으로 유지하기 위하여 폐쇄형 미세채널 형식으로 고안되어 사용되어왔다. 그러나 이러한 폐쇄형 구조는 액적을 반복적으로 추가하거나 특정 액적을 선택하기에 용이하지 않은 문제가 있다. Until now, the array structure has been designed and used as a closed microchannel type to stably maintain droplets. However, such a closed structure has a problem that it is not easy to repeatedly add droplets or select a specific droplet.

미세구조물에서 다른 모듈로 액적을 이동시키며 유지하기 위한 방법으로 계면활성제가 사용되어왔다. 그러나 포획한 액적의 물리적 경계 없이 액적의 위치를 분석하는 동안 고정시키기가 어려운 문제가 있다. 액적은 압력이나 유속, 액적 개수와 같은 주위 환경에 민감하게 반응하기 때문에, 액적의 물리적 경계를 만들어 주기 위해서는 매우 섬세한 디자인을 필요로 하며, 이런 이유로 기능적인 모듈제작과 액적 조작을 복합적으로 수행하는 것은 용이하지 않다. Surfactants have been used as a method for transferring droplets from microstructures to other modules. However, there is a problem that it is difficult to fix the position of the droplet while analyzing the position of the droplet without the physical boundary of the captured droplet. Because the droplet is sensitive to the surrounding environment such as pressure, flow rate, and number of droplets, it requires a very delicate design in order to create the physical boundary of the droplet. For this reason, a complex combination of functional module fabrication and droplet manipulation It is not easy.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 단일세포를 함유하는 피코리터 수준의 미세액적을 제조하고, 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용하는 경우, 특정 효소 활성을 가지는 세포를 리포터 세포가 포함된 액적의 융합을 통하여 자연계의 미생물커뮤니티 혹은 메타게놈 세포의 직접적인 조작 없이 효율적으로 스크리닝할 수 있어, 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소활성을 단일세포 수준에서 고속탐색하고 다양한 조건에서 미생물 간 상호작용을 분석할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to solve the above problems. As a result, the present inventors have found that when a microcapsule having a picoliter level containing single cells is prepared and a micro-well microwell array into which a mesh-grid is introduced is used, Through the fusion of droplets containing reporter cells, it is possible to efficiently screen the microorganism and the meta genome-derived metabolism and enzyme activity at a single cell level, It was confirmed that microbial interactions can be analyzed under various conditions, and the present invention has been completed.

본 발명의 목적은 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소 활성을 단일 세포 수준에서 고속 탐색하고 다양한 조건에서 미생물간 상호작용을 분석하기 위하여 단일세포를 함유하는 피코리터 수준의 미세액적의 제조방법을 제공하는 데 있다. An object of the present invention is to provide a method for preparing microcrystalline microcapsules containing single cells in order to rapidly search for various microbial and metagenomic metabolism and enzyme activities at a single cell level and analyze microbial interactions under various conditions I have to.

본 발명의 다른 목적은 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 다양한 자원의 라이브러리에 직접 적용하여, 원하는 효소 활성을 가지는 세포를 리포터 세포와의 상호 작용을 통해 고효율, 고속 탐색하는 방법을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a method of directly applying a micro-well micro-well array in which a mesh-grid has been introduced to a library of various resources and thereby performing high-efficiency and high-speed searching of cells having desired enzyme activity through interaction with reporter cells .

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 주입부, 오일 주입부, T-junction 채널, pinched-flow 채널, 액적배출구 및 폐기물 배출구가 구비된 미세채널을 이용하여 (a) 오일 및 활성을 분석하고자 하는 세포를 상기 미세채널의 주입부에 각각 주입하는 단계; (b) T-junction 채널에서 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 생성시키는 단계; 및 (c) Pinched-flow 채널에서 상기 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 단일 세포를 함유한 작은 액적으로 파쇄시켜, 미세액적을 제조하는 단계를 포함하는 단일세포 함유 미세액적의 제조방법을 제공한다. In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for analyzing oil and activity using a microchannel provided with a cell injecting unit, an oil injecting unit, a T-junction channel, a pinched-flow channel, a droplet discharging port, Injecting cells into the injection port of the microchannel, respectively; (b) generating a large droplet containing a plurality of cells in a T-junction channel; And (c) disrupting a large droplet containing the plurality of cells in a Pinched-flow channel with a small droplet containing a single cell to produce a microdialyte, .

본 발명은 또한, (a) 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이상에 특정 효소 활성을 갖는 단일세포 함유 제1액적을 로딩한 다음, 각 웰 내부에 포획하는 단계; (b) 상기 마이크로웰 어레이상에 제1오일을 통과시켜 각 웰 내부로 포획되지 않은 액적을 제거하는 단계; (c) 리포터 세포를 함유하고 있는 제2액적을 상기 단일 세포 함유 제1액적이 포획되어 있는 각 웰 내부에 포획하는 단계; (d) 제2오일을 마이크로웰 어레이상에 통과시켜 제1액적과 제2액적을 융합시키는 단계; (e) 상기 융합된 액적 내 두 세포 간의 반응을 분석하는 단계; 및 (f) 상기 원하는 활성을 나타내는 두 세포가 함유된 액적을 회수하는 단계를 포함한 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용한 원하는 활성을 갖는 세포의 스크리닝 방법을 제공한다.(A) loading a first droplet containing a single cell having a specific enzyme activity over a microwell array into which a mesh-grid has been introduced, and then capturing the droplet within each well; (b) passing the first oil through the microwell array to remove droplets not captured into each well; (c) capturing a second droplet containing the reporter cells inside each well in which the first droplet containing the single cell is entrapped; (d) passing a second oil through the microwell array to fuse the first droplet and the second droplet; (e) analyzing the reaction between the two cells in the fused droplet; And (f) recovering a droplet containing two cells exhibiting the desired activity. The present invention also provides a method for screening cells having a desired activity using a micro-well micro-well array into which a mesh-grid is introduced.

본 발명에 따르면 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소활성을 단일세포 수준에서 고속 탐색하는 것을 가능하게 할 뿐만 아니라, 다양한 조건에서 미생물 간 상호작용을 연구하는데 유용하다.
The present invention not only enables high-throughput screening of various microorganism and metagenome-derived metabolism and enzyme activities at a single cell level, but is also useful for studying microbial interactions under various conditions.

도 1은 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용(가)과 활성 세포 함유 액적과 리포터 세포 함유 액적의 융합(나)을 도식적으로 표현한 것이다.
도 2는 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용을 분석한 것으로, 활성 세포로 사용한 TPL 생산 대장균이 리포터 세포인 녹색형광단백질 생산 대장균과 공동 액체 배양하였을 때의 형광발현 확인(가)과 고체 배지 상의 TPL 생산 활성 세포 콜로니와 녹색형광단백질 리포터 생산 세포 사이의 상호 작용을 형광현미경으로 분석한 것이다.
도 3은 단일 세포 함유 미세액적 제작에 관한 것으로, (가)는 단일 세포를 포함한 미세액적을 만드는 과정, (나)는 pinched flow 부분을 도식적으로 표현한 것이다. (다)는 액적 배출구에 모인 액적들의 volume 분포를 나타낸 그래프이고, (라)는 액적 배출구에 모인 액적들에 포함된 세포의 개수를 나타는 그래프이다.
도 4는 메쉬-그리드가 적용된 마이크로웰 어레이를 만드는 과정을 도식화 한 것으로, (가)소프트리소그래피를 이용하여 제작한 마이크로웰어레이 기판에, (나) 미세액적보다 작은 높이의 간격을 갖도록 하기 위한 스페이서를 제작하고, (다)와 (라) 메쉬-그리드를 배열하여 올려서 제작하고, (마)는 메쉬-그리드를 배열한 후 찍은 현미경 사진이며, (바)는 실험하기 전에 마이크로웰 어레이를 오일로 채우는 단계를 보여주는 그림이다.
도 5는 메쉬-그리드가 적용된 마이크로웰 주변에 생성된 미세유체채널 구조(가)와 각 웰 안에 트랩된 액적의 수를 나타내는 그래프(나) 이다.
도 6은 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이를 이용한 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용을 분석한 것으로, (가)는 녹색형광단백질 생산 세포를 함유하는 액적을 마이크로웰 어레이에 포획한 것이며, (나)는 (가)의 액적과 적색형광단백질 생산 세포 함유 액적을 융한 한 것이고, (다)는 TPL 생산 활성 세포 함유 액적과 녹색형광단백질 리포터 생산 세포 함유 액적을 융합하여 분석한 것이다.
도 7은 미세액적에 포획된 목적 단일세포를 30㎛ 유리 미세관(가)을 이용하여 마이크로웰로부터 채취하여 선택배지에서 배양하여 회수한 단일 콜로니(화살표)를 나타낸 것(나) 이다.Fig. 1 is a graphical representation of the interaction (a) between the active cell and the reporter cell and the fusion (b) between the active cell-containing droplet and the reporter cell-containing droplet.
FIG. 2 is an analysis of the interaction between active cells and reporter cells. It is confirmed that the TPL-producing Escherichia coli used as an active cell exhibits fluorescence expression when co-cultured with a green fluorescent protein-producing E. coli, which is a reporter cell, Fluorescence microscopy analyzes the interaction between production active cell colonies and green fluorescent protein reporter producing cells.
FIG. 3 is a microcellular preparation of a single cell. FIG. 3 (a) is a process of making microcapsules containing a single cell, and (b) is a schematic representation of a pinched flow portion. (C) is a graph showing the volume distribution of the droplets collected at the droplet outlet, and (d) is a graph showing the number of cells contained in the droplets collected at the droplet outlet.
FIG. 4 is a schematic diagram illustrating a process of making a microwell array using a mesh-grid. FIG. 4 (a) shows a microwell array substrate manufactured using soft lithography, (b) A spacer is prepared, (c) and (d) are arranged by arranging a mesh-grid, (e) is a microscope photograph taken after arraying the mesh-grid, and (f) As shown in FIG.
FIG. 5 is a graph (A) showing the microfluidic channel structure (A) generated around the microwell to which the mesh-grid is applied and the number of droplets trapped in each well.
FIG. 6 is an analysis of the interaction between active cells and reporter cells using a microwell array in which a mesh-grid is introduced, wherein (a) is a droplet capturing a droplet containing green fluorescent protein-producing cells in a microwell array, B) is a result of melting a droplet of (a) and a droplet containing a red fluorescent protein producing cell, and (c) is a result of analyzing a droplet containing a TPL producing active cell and a droplet containing a green fluorescent protein reporter producing cell.
FIG. 7 shows a single colony (arrow) recovered by culturing in a selective medium from a microwell using a 30 占 퐉 glass microtubule (A) to capture the target single cells captured in the microcapsule.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.

본 발명은 예를 들어 자연에서 분리한 활성 세포와 유전공학적으로 제조한 리포터 세포 사이의 상호 작용, 즉 전사활성물질의 확산에 의한 리포터발현(도 1의 (가))을 단일세포 수준에서 관찰하기 위한 것이다. 이를 위하여 본 발명에서는 활성 세포 함유 액적과 리포터 세포 함유 미세액적을 독립적으로 제조하고 개별 미세액적을 융합한 융합 미세액적(도 1의 (나))을 현미경으로 관찰하여 활성 세포의 특성을 판별하는 방법에 대한 것이다.The present invention is based on the observation that, for example, an interaction between an active cell isolated from nature and a reporter cell produced by genetic engineering, that is, expression of a reporter (Fig. 1 (a) . To this end, in the present invention, the characteristics of the active cells are discriminated by microscopic examination of the fusion microdialyte prepared by independently preparing the active-cell-containing droplet and the reporter cell-containing microdroplet, and fusing individual microdroplets (FIG. 1 It is about the method.

도 2는 미세액적에서 활성 세포 및 리포터 세포의 개별적 상호작용을 관찰하기에 앞서 액체배지(도 2의 (가)) 및 고체배지(도2의 (나))에서 실제 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용을 먼저 조사한 것이다. 즉 리포터 세포인 녹색형광단백질 생산 대장균은 활성 세포로 사용한 TPL 생산 대장균과 공동 액체 배양하였을 때에만 형광리포터 발현이 관찰되었고 그 외의 경우에서는 형광을 나타내지 않았다 (도 2의 (가)). 또한 고체 배지 상에서 TPL 생산 활성 세포 콜로니와 녹색형광단백질 리포터 생산 세포를 섞어서 도말한 경우 두 집락(콜로니)군의 물리적 접촉면에서만 리포터 세포의 형광 발현이 나타났다 (도 2의 (나)).FIG. 2 is a graph showing the effect of actual active and reporter cells in liquid medium (FIG. 2 (a)) and solid medium (FIG. 2 (b)) before observing the individual interactions of active and reporter cells in micro- The interaction was first investigated. In other words, fluorescent reporter expression was observed only when the green fluorescent protein-producing E. coli, which is a reporter cell, was cultured in a liquid medium with TPL-producing E. coli used as an active cell, and fluorescence was not observed in the other cases (FIG. In addition, fluorescence expression of the reporter cells was observed only on the physical contact surface of the two colonies (Fig. 2 (B)) when the TPL-producing active cell colonies and the green fluorescent protein reporter producing cells were mixed on the solid medium.

또한 미세액적의 제조에 있어서, 본 발명은 세포 주입부, 오일 주입부, T-junction 채널, pinched-flow 채널, 액적배출구 및 폐기물 배출구가 구비된 미세채널을 이용한 (a) 오일 및 활성을 분석하고자 하는 세포를 상기 미세채널의 주입부에 각각 주입하는 단계; (b) T-junction 채널에서 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 생성시키는 단계; 및 (c) Pinched-flow 채널에서 상기 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 단일 세포를 함유한 작은 액적으로 파쇄 시켜, 미세액적을 제조하는 단계를 포함하는 단일세포 함유 미세액적의 제조방법에 관한 것이다 (도 3). Also, in microcapsule production, the present invention provides a method for analyzing oil and activity using (a) a microchannel provided with a cell injection unit, an oil injection unit, a T-junction channel, a pinched-flow channel, a droplet outlet and a waste outlet Injecting cells into the injection port of the microchannel, respectively; (b) generating a large droplet containing a plurality of cells in a T-junction channel; And (c) disruption of a large droplet containing the plurality of cells in a Pinched-flow channel into small droplets containing a single cell to produce microcaval fluids, (Fig. 3).

본 발명에서 상기 단일 세포를 함유하는 미세액적의 제조를 위해 도 3에서와 같이 미세채널장치는 오일 흐름을 형성하기 위한 오일을 주입하는 오일 주입로 (oil inlet), 활성을 측정하고자 하는 세포를 주입하는 세포 주입로(cell loading), 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 생성하는 T-junction 채널, 상기 큰 액적을 단일 세포를 함유하는 작은 액적으로 파쇄 하는 Pinched-flow 채널, 최종적으로 단일 세포를 포함하는 액적을 마이크로웰 어레이로 보내는 배출구 (oulet) 및 폐기물 배출구(Waste)로 구성되었다. In the present invention, as shown in FIG. 3, the microchannel device includes an oil inlet for injecting oil to form an oil flow, a cell for injecting cells to measure activity, A T-junction channel that produces a large droplet containing a large number of cells, a Pinched-flow channel that breaks the large droplet into small droplets containing a single cell, and finally a single cell And an outlet (oulet) and a waste outlet (waste) for sending droplets to the microwell array.

본 발명에서 T-juction은 오일 유체와 세포가 혼합된 액체가 만나는 부분으로 약 직경 100μm의 비교적 큰 액적이 형성되는데, 이 액적은 보통 한 개 이상의 다수의 세포를 포함하게 된다. 상기 생성된 직경 100μm의 액적은 pinched-flow 채널을 통과하면서 직경이 약 30μm인 더 작은 액적으로 이차 파쇄 되며, 파쇄된 액적은 부피가 10~15pL로 세균과 같은 작은 크기의 세포도 단일세포로 함유할 수 있다. 기존의 미세공정 또는 미세유체조작에 의한 방법에서는 단일 세포로의 분리 효율이 30%가 채 되지 않으나, 본 발명에서와 같이 이차 파쇄 방법으로 액적을 제조하면 단일 세포를 함유하는 액적을 50% 정도의 수율로 수득할 수 있으며, 다수의 세포를 포함하는 액적의 비율을 16% 이하로 낮출 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 단계를 거쳐 제조된 최종 단일세포 함유 미세액적은 500μm의 유리 모세관을 이용하여 마이크로웰 어레이로 이동되어 단일세포 분석에 이용될 수 있다. In the present invention, T-juction is a portion where an oil fluid and a cell-mixed liquid meet, and a relatively large droplet having a diameter of about 100 μm is formed. The droplet usually contains one or more cells. The resulting 100 μm diameter droplet is secondly crushed into smaller droplets of about 30 μm in diameter while passing through a pinched-flow channel. The crushed droplets have a volume of 10 to 15 pL, and small-sized cells such as bacteria are also contained as single cells can do. In the conventional microfabrication process or microfluid manipulation, the efficiency of separation into single cells is not less than 30%. However, as in the present invention, when a droplet is manufactured by the second crushing method, , And it was confirmed that the ratio of droplets containing a plurality of cells can be lowered to 16% or less. The final single-cell-containing micropipette prepared through the above steps can be transferred to a microwell array using a glass capillary having a diameter of 500 mu m and used for single cell analysis.

본 발명에 있어서, 상기 유체는 0.84g/mL의 밀도를 갖는 미네랄 오일인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.In the present invention, the fluid may be a mineral oil having a density of 0.84 g / mL, but the present invention is not limited thereto.

본 발명에서 상기 세포가 포함된 배양액은 세포를 1x10⁸~2x10⁸cells/mL의 비교적 고농도로 사용하여 미세채널 안의 세포들이 균등하게 분포되고 세균세포가 벽면에 붙지 않도록 하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the culture medium containing the cells may be characterized in that cells are distributed at a relatively high concentration of 1 x 10 ⁸ to 2 x 10 ⁸ cells / mL to uniformly distribute the cells in the microchannels and prevent the bacterial cells from adhering to the wall surface.

본 발명에 있어서, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 T-junction 채널과 Pinched-flow 채널 사이에 설치된 오일 주입부를 통해 오일을 주입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
In the present invention, as shown in FIG. 3, the method may further include the step of injecting oil through an oil injecting unit provided between the T-junction channel and the pinned-flow channel.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이상에 단일세포 함유 제1액적을 로딩한 다음, 각 웰 내부에 포획하는 단계; (b) 상기 마이크로웰 어레이상에 제1오일을 통과시켜 각 웰 내부로 포획되지 않은 액적을 제거하는 단계; (c) 상기 단일 세포와 다른 세포를 함유하고 있는 제2액적을 상기 단일 세포 함유 제1액적이 포획되어 있는 각 웰 내부에 포획하는 단계; (d) 제2오일을 마이크로웰 어레이상에 통과시켜 제1액적과 제2액적을 융합시키는 단계; (e) 상기 융합된 액적 내 두 세포 간의 반응을 분석하는 단계; 및 (f) 상기 원하는 반응을 보이는 두 세포가 함유된 액적을 회수하는 단계를 포함한 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용한 목적 활성을 갖는 세포의 탐색 방법에 관한 것이다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a micro-well, comprising: (a) loading a first droplet containing a single cell onto a microwell array in which a mesh-grid is introduced; (b) passing the first oil through the microwell array to remove droplets not captured into each well; (c) capturing a second droplet containing the single cell and other cells in each well in which the first droplet containing the single cell is captured; (d) passing a second oil through the microwell array to fuse the first droplet and the second droplet; (e) analyzing the reaction between the two cells in the fused droplet; And (f) recovering a droplet containing two cells exhibiting the desired response. The present invention also relates to a method for searching cells having a target activity using a micro-well micro-well array into which a mesh-grid is introduced.

본 발명에 있어서, 상기 제1액적과 제2액적은 상기 단일 세포를 포함한 미세액적의 제조방법으로 제작되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the first droplet and the second droplet may be fabricated by a microcapsule manufacturing method including the single cell.

본 발명에서 '목적활성을 갖는 세포'은 원하는 효소활성이나 원하는 대사경로를 가지는 세포를 의미한다.In the present invention, a cell having a desired activity means a cell having a desired enzyme activity or a desired metabolic pathway.

본 발명에 있어서, 상기 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이는 구조적으로 도 4에서와 같이 평면 금속의 그리드가 스페이서가 양쪽 끝에 부착된 PDMS (polydimethylsiloxane) 마이크로웰 기판 위에 놓여진 구조이다. 도 4에서 나타낸 바와 같이 PDMS기판은 soft lithography과정을 통해 다수의 웰을 갖는 마이크로웰 어레이 형태로 성형 되고 그 위에 스페이서를 양쪽 끝에 부착하며 금속성 메쉬-그리드를 현미경하에서 마이크로웰 어레이에 부착된 스페이서 위에 고정하였다. In the present invention, the microwell array into which the mesh-grid is introduced is structured such that a grid of flat metal is structurally placed on a PDMS (polydimethylsiloxane) microwell substrate having spacers attached to both ends thereof. As shown in FIG. 4, the PDMS substrate is formed through a soft lithography process in the form of a microwell array having a plurality of wells, a spacer is attached on both ends thereof, and a metallic mesh-grid is fixed on a spacer attached to the microwell array under a microscope Respectively.

본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 높이가 25μm이며 2500rpm으로 60초간 PDMS로 스핀코팅을 하여 얇은 막 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the spacer may have a thin film structure by spin coating with PDMS for 25 seconds at 2500 rpm for 60 seconds.

본 발명에 있어서, 상기 메쉬-그리드는 금속성이며 크기가 2mmㅧ2mm이고 너비가 43μm인 900개의 웰을 포함한 것을 특징으로 할 수 있고, 메쉬-그리드의 가장 바람직한 예는 상업적으로 구입할 수 있는 금속성 400-메쉬 투과전자현미경 그리드 (400-mesh transmission electron microscopy grid, Electron Microscopy Science PA, USA).)이나, 이에 국한되는 것은 아니다.According to the present invention, the mesh-grid may be characterized by comprising 900 wells which are metallic and have a size of 2 mm 2 mm and a width of 43 μm. The most preferred example of the mesh-grid is a commercially available metallic 400- But are not limited to, a 400-mesh transmission electron microscopy grid (Electron Microscopy Science PA, USA).

본 발명에서 상기 마이크로웰은 너비와 깊이가 각각 40μm이며 웰 간격은 23μm인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the microwell may have a width and a depth of 40 μm, and a well interval of 23 μm.

본 발명에 있어서, 상기 단일 세포를 함유하는 미세액적은 직경 500μm 유리 미세관을 이용하여, 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이로 이동시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.In the present invention, the microcapsules containing the single cells may be characterized in that they are transferred to a mesh-grid microwell array using glass microtubules having a diameter of 500 mu m, but the present invention is not limited thereto.

본 발명에서, 상기 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이는 도 3에서 나타낸 바와 같이, 스페이서에 의해 메쉬-그리드와 어레이 기판 사이에 공간이 형성되며 유체로 채워지게 될 때 유체의 대량 흐름 대신 얇은 오일 필름 형태의 유체 흐름을 유지하게 하여 미세채널구조를 갖게 한다. 계속적인 오일의 흐름으로 마이크로웰에 액적이 포획되는 것을 방해하는 거품이 제거된다. 도 5에서처럼, 메쉬-그리드와 기판 사이의 공간을 형성하여 자유롭게 유체의 흐름을 형성하고, 액적 이동이 원활하게 하여 액적이 웰 안으로 배열될 수 있게 하였다. 메쉬-그리드를 사용하지 않는 기존의 방법은 액적이 마이크로웰의 외부의 대량적인 오일 흐름을 따라 휩쓸려 흐르게 되고 마이크로웰로 향하는 유체의 수직속도 w는 거의 제로에 가까워 액적이 좁은 웰 안으로 들어가기에 용이하지 않으나, 본 발명은 도 5에서와 같이 w를 증가시켜 액적이 마이크로웰에 안정하게 포획되게 한다. 또한 메쉬-그리드와 PDMS 어레이 사이의 공간이 액적의 크기보다 작아 액적이 오일의 흐름을 따라 그리드를 통과할 때 웰 안으로 쉽게 포획될 수 있다. 웰 안으로 포획되지 못한 액적은 제1오일이 통과되면서 제거된다. In the present invention, the mesh-grid microwell array has a space formed between the mesh-grid and the array substrate by spacers, as shown in Fig. 3, instead of a mass flow of fluid when filled with fluid, Thereby maintaining the fluid flow to have a microchannel structure. Continuous flow of oil removes bubbles that prevent droplets from being trapped in the microwells. As shown in FIG. 5, a space is formed between the mesh-grid and the substrate to form a fluid flow freely, and the droplet movement is smooth so that droplets can be arranged in the well. Conventional methods that do not use a mesh-grid allow the droplet to be swept along a massive oil flow outside of the microwell and the vertical velocity w of the fluid toward the microwell is close to zero, which is easy to enter into the narrow droplet However, the present invention increases w as shown in FIG. 5 so that droplets are stably trapped in the microwell. Also, since the space between the mesh-grid and the PDMS array is smaller than the size of the droplet, droplets can easily be trapped into the well as they pass through the grid along the flow of oil. A droplet that has not been trapped in the well is removed as the first oil passes.

본 발명에 있어서, 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이는 80% 이상의 웰 안에 미세액적을 안정적으로 포획하여 추가적인 미세액적의 조작 및 다른 장치와의 연계가 가능한 안정적인 환경을 제공하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the mesh-grid microwell array can be characterized by stably trapping micro-fluidic wells in more than 80% of the wells to provide a stable environment in which additional micro-fluid manipulation and connection with other devices are possible.

본 발명에 있어서, 상기 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이는 기존의 고체로 된 덮개가 있는 밀폐형 구조인 마이크로웰 어레이와 달리 매쉬-그리드를 이용한 개방형 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the microwell array into which the mesh-grid is introduced may be characterized in that it has an open structure using a mesh-grid, unlike a microwell array which is a hermetically sealed structure having a conventional solid cover.

본 발명에서 상기 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이는 개방형 구조를 제공하기 때문에 상기 제2액적을 제1액적이 포획되어 있는 각 웰 내부에 포획하여, 복잡한 유체 병합 채널을 통합하거나 전극과 같은 활성 구성 요소를 사용하지 않고 화학적 구성물질 분리 방법 (chemical demulsification)을 이용하여 제1액적과 쉽게 융합할 수 있다. 상기 제1액적이 마이크로웰 안에 안정적으로 위치하게 되면 제2 액적을 흘려보내 제1액적이 위치한 마이크로웰 안으로 위치시킨다. 포획된 두 액적을 융합시키기 위해 제1오일과 상태가 다른 상기 제2오일을 이용하는데 주변 오일상태의 변화로 인해 평형상태가 변하면 마이크로웰 안의 두 액적이 융합되며, 전체 웰의 83%에서 1:1 융합이 일어나 기존의 방법에 비하여 효율적임을 확인하였다.In the present invention, since the mesh-grid microwell array provides an open structure, the second droplet can be trapped within each well in which the first droplet is trapped, thereby integrating complex fluid merging channels or providing active components such as electrodes It can be easily fused with the first droplet by using a chemical demulsification method without using it. When the first droplet is stably positioned in the microwell, the second droplet is caused to flow into the microwell where the first droplet is located. In order to fuse two trapped droplets, the second oil is used in a state different from that of the first oil. When the equilibrium state changes due to the change of the oil condition around the two droplets in the microwell are fused, 83% 1 fusion was found to be more efficient than the conventional method.

본 발명에서 상기 제1오일은 0.84g/mL의 밀도를 갖는 미네랄 오일이고, 상기 제2오일로는 물에 불용성이며 수용성 미세액적에 영향을 주지 않고 바람직하게는 40% (v/v) 옥탄올을 포함하는 미네랄 오일을 사용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. In the present invention, the first oil is a mineral oil having a density of 0.84 g / mL, and the second oil is insoluble in water and preferably has 40% (v / v) octanol But are not limited to, mineral oil.

본 발명의 일에 있어서, 상기 제1액적 및 제2액적에 사용되는 유체는 제1오일 또는 제2오일보다 밀도가 높은 유체를 이용할 수 있으며, 상기 제1액적에 포함되어 있는 세포는 특정 효소의 생산능력이 있는 세포이고, 상기 제2액적에 포함되어 있는 세포는 특정효소의 산물에 반응하여 형광을 나타내는 리포터 세포인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. In one aspect of the present invention, the fluid used for the first droplet and the second droplet may use a fluid having a density higher than that of the first oil or the second oil, And the cell contained in the second droplet is a reporter cell that exhibits fluorescence in response to a product of a specific enzyme. However, the present invention is not limited thereto.

본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 융합된 액적 내 두 세포간의 반응을 분석하기 위한 방법으로, 특정 효소(TPL; tyrosine phenol lyase) 활성을 갖는 대장균과 TPL 효소 활성을 감지하여 형광단백질을 발현하는 리포터를 갖는 대장균을 이용하였다. 상기 제1액적의 활성 세포는 TPL을 발현하는 대장균세포이나, 단지 TPL 효소 활성에 국한하지 않고 세포 내 대사나 세포간 상호작용 등 필요한 활성을 나타내는 세포이다. 리포터 세포는 상기 제2액적에 함유된 TPL의 생산물인 페놀을 감지하여 형광을 나타내는 세포이나, 형광에 국한하지 않고 발광, 항생제 내성 등 활성 탐색이 가능한 여러 가지 리포터 세포를 나타낸다. 두 세포를 각각 포함한 액적을 제조하여 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이를 이용하여 융합시킨 후 세포간의 상호 반응을 형광측정 장치로 측정할 수 있다. 도 6에서와 같이 TPL을 생산하는 세포를 포함하는 액적과 리포터 세포를 포함하는 액적을 융합시킨 웰에서만 형광이 감지되어 효소 활성을 갖는 세포를 탐색 할 수 있었다. In another embodiment of the present invention, a method for analyzing the reaction between two cells in the fused droplet is provided, wherein E. coli having a specific enzyme (TPL; tyrosine phenol lyase) activity and a TPL enzyme Escherichia coli having a reporter was used. The first droplet active cell is a TPL-expressing Escherichia coli cell, but is not limited to TPL enzyme activity but exhibits necessary activities such as intracellular metabolism or intercellular interactions. Reporter cells are cells that exhibit fluorescence by detecting phenol, which is a product of TPL contained in the second droplet, but various reporter cells capable of searching for activity such as luminescence and antibiotic resistance without being limited to fluorescence. Liquid droplets containing two cells are prepared and fused using a mesh-grid microwell array, and then the interaction between cells can be measured with a fluorescence measuring device. As shown in FIG. 6, fluorescence was detected only in wells in which droplets containing TPL-producing cells and droplets containing reporter cells were fused, and thus cells having enzyme activity could be detected.

본 발명에 있어서, 상기 단일세포를 포함하는 미세액적의 회수는 30μm 직경의 유리 미세관을 이용하여 액적을 마이크로웰 어레이로부터 선택적으로 꺼내고, 이를 고체배지에 배양하여 원하는 세포를 콜로니 형태로 키울 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the microcapsules containing the single cells may be recovered by selectively removing the droplets from the microwell array using a glass microtubule having a diameter of 30 mu m, culturing the droplets in a solid medium to grow the desired cells in a colony form . &Lt; / RTI >

실시예Example

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

효소활성 세포와 리포터 세포의 제조 및 상호작용 분석Preparation and interaction analysis of enzyme-activated cells and reporter cells

메쉬-그리드 기법이 도입된 어레이를 특정효소를 생산하는 대장균을 포함하는 액적을 리포터 세포가 포함된 다른 액적과 융합시켜 단일세포 반응 검사에 적용 시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 특정 효소(TPL; tyrosine phenol lyase) 활성을 갖는 대장균과 TPL 효소 활성을 감지하여 형광단백질을 발현하는 리포터를 갖는 대장균을 이용하였다(Lee et. al. FEBS J., 273, p55645573, 2006). TPL을 생산하는 세포를 포함하는 액적과 리포터 세포를 포함하는 액적을 융합시켜 TPL 효소 활성을 분석 할 수 있는지를 확인하고자 하였다 (도 1).In order to confirm that the array incorporating the mesh-grid technique can be applied to single cell reaction tests by fusing droplets containing E. coli producing specific enzymes with other droplets containing reporter cells, a specific enzyme (TPL; tyrosine phenol lyase activity and a reporter expressing a fluorescent protein by detecting TPL enzyme activity (Lee et al., FEBS J., 273, p55645573, 2006). To confirm whether TPL enzyme activity can be analyzed by fusing a droplet containing TPL-producing cells and a droplet containing reporter cells (FIG. 1).

도 1에서와 같이, 효소 생산세포는 tyrosine phenol-lyase (TPL)를 발현하는 대장균세포(XL1-Blue/pTrc99a-TPL)로 L-tyrosine의 가수 분해 반응에 의한 페놀, pyruvate 및 암모니아를 생산하도록 유전자 조작을 수행하였다. 리포터 세포는 TPL의 반응 산물인 페놀을 슈도모나스속 유래 페놀-촉매 전사유도체인 DmpR에 의해 감지하여 리포터 형광 단백질의 발현을 활성화하도록 설계된 유전자 조작 대장균 세포를 사용하였다(도 1, Lee et. al. FEBS J., 273, p55645573, 2006).As shown in FIG. 1, the enzyme-producing cells were transformed into E. coli cells (XL1-Blue / pTrc99a-TPL) expressing tyrosine phenol-lyase (TPL) to produce phenol, pyruvate and ammonia by hydrolysis of L- tyrosine Operations were performed. The reporter cells used genetically engineered E. coli cells designed to activate the expression of reporter fluorescent proteins by detecting phenol, the reaction product of TPL, by the phenol-catalyzed transcription derivative of Pseudomonas sp. DmpR (Fig. 1, Lee et al. J., 273, p55645573, 2006).

다음으로 TPL 생산 활성 세포와 리포터 세포 간의 상호 작용을 lab scale로 분석하기 위해 37ㅀC에서 1mM tyrosine이 보충된 M9 액체 배지(1x M9 salt, 0.4 % acetate, 2 mM MgSO4. 0.1 mM CaCl₂, 0.01 % thiamine, 1 mM Tyrosine, 10 uM PLP, 50 ug/ml Ampicillin)로 16시간 동안 공동 진탕 배양을 한 후, EGFP 필터 세트(ex: 488 nm, em: 530/20) 조건에서 형광 플레이트 리더 (VictorTM 51 V, Perkin-Elmer, MA)를 사용하여 형광을 측정하였다. 그 결과, 도 2의 (가)에서와 같이, TPL 생산 활성 세포나 리포터 세포를 단독으로 배양한 경우에는 형광이 측정되지 않았지만, TPL 생산 활성 세포와 리포터 세포가 동시에 존재하는 배양체에서는 높은 형광이 측정되었다(도2의 가). In order to analyze the interaction between TPL-producing and reporter cells on a lab scale, M9 liquid medium (1 × M9 salt, 0.4% acetate, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl ₂ , 0.01 The cells were cultured for 16 hours in a shaking incubator with 10% thiamine, 1 mM Tyrosine, 10 μM PLP and 50 μg / ml Ampicillin. The cells were incubated with a fluorescent plate reader (Victor ™ 51 V, Perkin-Elmer, MA). As a result, fluorescence was not measured when the TPL production active cells or the reporter cells were cultured alone as in FIG. 2 (a), but in the cultures in which the TPL production active cells and the reporter cells existed simultaneously, (Fig. 2 (A)).

이러한 결과는 고체 배지 상에서 활성 세포와 리포터 세포의 단일 콜로니에서도 관찰 할 수 있었다. 고체배지 상에서 효소 발현 세포와 리포터 세포 사이의 효소 활성 감지를 확인하기 위해 M9 고체배지(1x M9 salt, 0.4 % acetate, 2 mM MgSO4. 0.1 mM CaCl2, 0.01 % thiamine, 1 mM Tyrosine, 10 uM PLP, 50 ug/ml Ampicillin, 10 ug/ml Tetracycline, 1.5 % agar)에서 실험을 진행하였다. 항생제내성 실험에 사용하기 위해 TPL 유전자가 pET 플라스미드에 삽입된 대장균 DH5α에 ACYC184 플라스미드를 삽입하여 tetracycline 저항성을 부여하였다. 그리고 리포터 세포는 pUC19 플라스미드에 형광 리포터 단백질 뒤에 tetracycline 내성 유전자를 삽입하여, 감지물질이 세포 내부로 들어오면 형광과 항생제내성 두 가지 반응을 동시에 확인할 수 있게 하였다. 두 종류의 세포들을 각각 LB에 전배양 한 후 원심분리와 부유화과정을 통하여 M9 버퍼로 1회 세척한 뒤, 리포터 세포를 위에 준비한 고체배지에 약 10⁴정도 되게 희석하여 도말하였다. 그리고 그 위에 TPL 효소 생산 세포 배양 희석액을 떨어뜨린 뒤, 30 ℃에서 48시간 배양하였다. 배양한 고체배지는 형광현미경(AZ100M, nikon, 일본)을 이용하여 형광을 관찰하였다. These results were also observed in single colonies of active and reporter cells on solid medium. To confirm the detection of enzyme activity between the enzyme-expressing cells and the reporter cells on solid medium, M9 solid medium (1 x M9 salt, 0.4% acetate, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, 0.01% thiamine, 1 mM Tyrosine, 10 uM PLP, 50 ug / ml Ampicillin, 10 ug / ml Tetracycline, 1.5% agar). The ACYC184 plasmid was inserted into E. coli DH5α, a TPL gene inserted into the pET plasmid, for tetracycline resistance for use in antibiotic resistance experiments. The reporter cells inserted the tetracycline resistance gene into the pUC19 plasmid followed by a fluorescent reporter protein, allowing the detection of fluorescence and antibiotic resistance simultaneously when the substance enters the cell. Two types of cells were pre-incubated in LB, washed once with M9 buffer through centrifugation and suspension, and reporter cells were diluted to about 10 ⁴ in solid medium prepared above. Then, the TPL enzyme-producing cell culture diluent was dropped thereon and cultured at 30 ° C for 48 hours. Fluorescence was observed using a fluorescent microscope (AZ100M, nikon, Japan) for the cultured solid medium.

그 결과, 도 2의 (나)와 같이 TPL 생산 세포의 콜로니 주변으로 리포터 세포의 마이크로콜로니들이 자라면서 형광을 내는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 TPL 활성으로 인한 효소 생산물이 고체 배지로 확산되어, 리포터 세포들이 tetracycline 저항성을 가지게 되어, 자라면서 형광을 나타내는 것으로 예상된다. 이 실험 결과를 통해, 이종의 균주 간에 효소활성을 리포터 세포의 형광 및 항생제내성 발현 등으로 확인할 수 있음을 확인하였다.
As a result, it was observed that the microcolonies of the reporter cells grew around the colony of TPL-producing cells as shown in (B) of FIG. 2, and fluorescence was observed. This suggests that the enzyme production due to TPL activity diffuses into the solid medium, causing the reporter cells to become tetracycline resistant and display fluorescence as they grow. From these results, it was confirmed that the enzymatic activity among heterologous strains can be confirmed by the fluorescence of reporter cells and the expression of antibiotic resistance.

단일 세포를 함유한 Single cell-containing 미세액적의Tax negative 제조 Produce

단일 미생물 세포를 포함하는 미세액적 생성은 각각의 독립적 미세채널 장치로부터 생성된다. 도 3의 (가)에서와 같이 미세채널장치는 오일을 주입하기 위한 오일 주입로(oil inlet), 활성을 측정하고자 하는 세포를 주입하는 세포 주입로(cell loading), 세포와 오일이 혼합되어 다수의 세포를 함유하는 큰 액적을 생성시키는 T-junction 채널, 작은 액적으로 이차 파쇄시키는 Pinched-flow 채널, 최종적으로 제조된 단일 세포를 함유한 액적을 내보내는 배출구(oulet) 및 폐기물 배출구로 구성되어 있다. 이러한 미세액적 생성 장치는 상기 미세채널구조를 갖는 기판 2개를 부착하여 채널 통로를 만드는데 각각의 기판은 PDMS(polydimethyl- siloxane)재질로 이루어져 있다.Microvolume production, including single microbial cells, is generated from each independent microchannel device. As shown in (a) of FIG. 3, the micro channel device includes an oil inlet for injecting oil, a cell loading for injecting cells to measure activity, , A T-junction channel that produces large droplets containing cells of the cell, a pinched-flow channel that secondary shreds into small droplets, an oulet that discharges droplets containing the finally produced single cells, and a waste outlet. In this microcavity production device, two substrates having the microchannel structure are attached to form a channel channel. Each substrate is made of PDMS (polydimethyl-siloxane) material.

다음으로, 오일 주입부에 오일을 주입하는데, 오일로는 0.84g/mL의 밀도를 갖는 미네랄 오일을 사용하였다. 분석할 세포가 포함된 배양액은 세포 주입로를 통하여 주입되는데 세포배양액은 비교적 높은 농도인 1x 10⁸~2x10⁸cells/mL로 주입되었다. 이와 같이 높은 농도의 세포배양액을 사용하면 세균세포가 벽면에 붙는 현상에 구애받지 않고, 미세채널 안의 세포들을 균등하게 분포시킬 수 있는 것으로 확인되었다.Next, oil was injected into the oil injection portion, and mineral oil having a density of 0.84 g / mL was used as the oil. The culture medium containing the cells to be analyzed was injected through a cell line, and the cell culture medium was injected at a relatively high concentration of 1 × 10 ⁸ to 2 × 10 ⁸ cells / mL. Using such a high concentration of cell culture medium, it was confirmed that cells in the microchannel could be distributed evenly regardless of the phenomenon that the bacterial cells adhered to the wall.

주입된 오일과 세포배양액은 상기 T-juction에서 혼합되어 먼저 다수 세포를 함유한 약 직경 100μm의 비교적 큰 액적이 만들어진다. 생성된 큰 액적은 Pinched-flow 채널로 이동되어 이차적으로 파쇄되어 직경이 약 30μm이고 부피가 10-15pL이며, 단일세포를 함유한 미세액적이 제조되었다(도 3의 (다)). 상기 액적의 이차파쇄는 Pinched-flow 채널의 직경과 오일 흐름속도에 기인하는데, 도 3의 (나)에서와 같이 Pinched-flow 채널의 직경(W₂)은 다른 채널의 직경(W₁=120μm)에 비교하여 20μm로 좁으며, Pinched-flow 채널쪽에서 측정되는 오일 흐름 속도(Qd)가 다른 채널 부위의 오일 흐름 속도(Qo= 20μL/h)에 비하여 40μL/h로 높게 설정되었기 때문에 큰 액적은Pinched-flow 채널을 통과하면서 작은 액적으로 파쇄되게 된다. 최종적으로 제조된 단일세포를 함유하고 있는 미세액적은 생성된 총 액적의 50%정도로 기존의 방법으로 얻은 단일세포 함유 미세액적 수득률(30%)에 비하여 크게 향상된 결과를 얻었다(도 3의 라).
The injected oil and the cell culture liquid are mixed at the T-juction to make a relatively large droplet of about 100 탆 in diameter containing a plurality of cells first. The resulting large droplets were transferred to a pinched-flow channel and then crushed secondarily to give microcapsules containing single cells with a diameter of about 30 μm and a volume of 10-15 pL (FIG. 3 (c)). The droplets secondary crushing is Pinched-flow channel diameter and the oil flow in due to the speed, the diameter of Pinched-flow channel, as shown in (b) of Figure 3 of (W ₂₎ is the diameter of the other channel (W ₁ = 120μm) And the oil flow rate Qd measured at the pinched-flow channel side was set at 40 μL / h higher than the oil flow rate at the other channel portion (Qo = 20 μL / h) -flow channel and is broken into small droplets. The microfluid containing the finally prepared single cell was about 50% of the total generated droplet, which was greatly improved as compared with the microfluidic yield (30%) obtained by the conventional method (Fig. 3) .

1. One. 메쉬Mesh 그리드가 도입된 Grid introduced 마이크로웰Microwell 어레이의 제작과 Fabrication of arrays 액적의Droplet 포획 capture

1-1. 메쉬 그리드가 도입된 마이크로웰 어레이의 제작1-1. Fabrication of microwell array with mesh grid

구조적으로 메쉬그리드가 첨가된 마이크로웰 어레이는 도 4에서와 같이 평면 금속의 그리드가 스페이서가 양쪽 끝에 부착된 PDMS(polydimethylsiloxane) 마이크로웰 기판 위에 놓여진 구조이다. 도 4의 (가)에서 나타낸 바와 같이 PDMS기판은 소프트 리소그래피(soft lithography)과정을 통해 다수의 웰을 갖는 마이크로웰 어레이 형태로 성형 되는데, 전체 2mmㅧ2mm 크기이며 45μm 너비의 웰 900개가 포함되어 있다. 기판 위에 스페이서를 양쪽 끝에 부착하는데, 스페이서는 25μm 높이를 갖으며 2500rpm으로 60초간 PDMS로 스핀코팅을 하여 얇은 막 구조를 갖는다(도 4의 (나)). 다음으로, 도 4의 (다)∼(바)와 같이 마이크로웰 어레이에 부착된 스페이서 위에 메쉬-그리드를 현미경하에서 정렬하여 고정시키고 메쉬-그리드와 마이크로웰 사이의 공간을 오일로 채운다. A microwell array structurally added with a mesh grid is a structure in which a grid of flat metal is placed on a PDMS (polydimethylsiloxane) microwell substrate having spacers attached to both ends, as shown in Fig. As shown in FIG. 4 (a), the PDMS substrate is formed in the form of a microwell array having a plurality of wells through a soft lithography process. The PDMS substrate includes 900 wells each having a size of 2 mm × 2 mm and a width of 45 μm . Spacers were attached to both ends of the substrate with a height of 25 mu m. Spin coating was performed by PDMS at 2500 rpm for 60 seconds (Fig. 4 (b)). Next, the mesh-grid is aligned and fixed under a microscope on the spacer attached to the microwell array as shown in (c) to (f) of FIG. 4, and the space between the mesh-grid and the microwell is filled with oil.

본 실시예에서 사용된 메쉬-그리드는 상업적으로 구입할 수 있는 금속성 400-메쉬 전자현미경 그리드(400-mesh transmission electron microscopy grid, Electron Microscopy Science, USA)이다. 오일로는 0.84g/mL의 밀도를 갖는 미네랄 오일을 사용하였으며, 각 마이크로웰 어레이의 웰은 너비와 깊이가 40μm이며, 각각의 웰은 23μm 간격으로 떨어져 있도록 제작되었다.
The mesh-grid used in this example is a commercially available metallic 400-mesh transmission electron microscopy grid (Electron Microscopy Science, USA). Mineral oil having a density of 0.84 g / mL was used as the oil, and the wells of each microwell array were 40 μm wide and 40 μm deep, and each well was spaced 23 μm apart.

1-2. 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이에서 액적의 포획 1-2. Capture of droplets in a microwell array with mesh-

조립된 메쉬-그리드 마이크로웰 어레이는 스페이서에 의해 메쉬-그리드와 어레이 기판사이에 공간이 형성되며 유체로 채워지게 될 때 유체의 대량 흐름 대신 얇은 오일 필름 형태의 유체 흐름을 유지하게 하여 미세채널구조 구조를 갖게 한다. 계속적인 유체흐름으로 마이크로웰에 액적이 포획되는 것을 방해하는 거품이 제거된다. 도 3에서처럼, 메쉬-그리드와 기판사이의 공간은 자유로운 오일의 흐름을 형성하고 액적의 이동이 원활하게 하여 웰 안으로 액적이 쉽게 포획될 수 있게 도와준다. 기존의 메쉬-그리드를 사용하지 않는 마이크로웰 어레이는 액적이 외부 오일의 대량 흐름에 휩쓸려 흐르며, 웰로 향하는 유체의 수직속도 W는 거의 제로에 가깝게 되어 웰 안으로 포획되는 것이 용이하지 않았다. 본 발명의 메쉬-그리드가 적용된 경우 마이크로웰 주변에 미세유체채널 구조가 생기게 되어 유체의 흐름으로 액적을 밀어넣는 힘(w)이 증가하게 되고, 메쉬-그리드로 인해 생기게 되는 간격 s 보다 액적의 크기가 크면 밖으로 빠져나가기 보다 웰 안으로 트랩 되려고 하기 때문에 액적이 마이크로웰 어레이 안으로 안정하게 포획되는 것을 돕는다(도 5의 가).The assembled mesh-grid microwell array has a space formed by the spacers between the mesh-grid and the array substrate and allows fluid flow in the form of a thin oil film instead of a mass flow of fluid when filled with fluid, . The bubbles are removed that prevent the droplet from being trapped in the microwell with continuous fluid flow. As shown in FIG. 3, the space between the mesh-grid and the substrate forms a free flow of oil and facilitates the movement of the droplets to facilitate droplet capture into the well. In a microwell array that does not use the conventional mesh-grid, the droplet is swept away by the mass flow of the external oil, and the vertical velocity W of the fluid toward the well is nearly zero, and it is not easy to be trapped in the well. When the mesh-grid of the present invention is applied, a microfluidic channel structure is formed around the microwell, so that the force (w) pushing the droplet into the flow of the fluid is increased, and the droplet size The larger it tends to be trapped into the well rather than escaping to help stably trap the droplet into the microwell array (Fig. 5A).

본 발명의 메쉬-그리드를 적용한 마이크로웰 어레이 웰 안에 포획된 액적의 수는, 마이크로웰의 너비가 40㎛ 일 경우, 90% 이상이 40㎛ 직경을 갖는 액적이 마이크로웰 안에 하나 트랩된 것을 확인할 수 있었다(도 5의 나).
The number of droplets trapped in the well of the microwell array to which the mesh-grid of the present invention was applied was found to be 90% or more when the width of the microwell was 40 μm, and droplets having a diameter of 40 μm were trapped in the microwell (Fig. 5B).

메쉬Mesh -그리드가 도입된 - Grid introduced 마이크로웰Microwell 어레이를 이용한 활성 세포와 리포터 세포의 상호 작용 분석 Analysis of interaction between active and reporter cells using arrays

메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이를 이용한 활성 세포와 리포터 세포의 상호작용을 분석하기 위하여, 우선 실시예 1의 방법으로 제조된 활성 세포와 리포터 세포가 단계적으로 액적 내에 포획/융합 되는지를 녹색형광단백질과 적색형광단백질을 발현하는 세포들을 이용하여 현미경으로 분석하였다. In order to analyze the interaction between the active cells and the reporter cells using the microwell array in which the mesh-grid was introduced, it was first determined whether the active cells and the reporter cells produced by the method of Example 1 were trapped / Proteins and red fluorescent protein - expressing cells were analyzed by microscopy.

그 결과, 도 6의 (가)에서 보는 바와 같이, 녹색형광단백질을 발현하는 세포를 갖는 제1액적을 메쉬-그리드 마이크로웰에 약 50%의 높은 수득률로 포획할 수 있었다. 또한, 상기의 녹색형광단백질 함유 제1액적을 적색형광단백질을 발현하는 세포를 포획한 액적과 융합하여 관찰한 결과, 녹색형광단백질과 적색형광단백질이 융합되어 동시에 발현된 웰을 확인할 수 있었다(도 6의 나). 이는 서로 다른 2개의 액적이 융합되어 각 액적의 특성 및 활성이 융합된 하나의 액적에서 발현되고, 관찰 가능함을 확인한 결과이다. As a result, as shown in Fig. 6 (a), the first droplet having the cells expressing the green fluorescent protein could be captured in the mesh-grid microwell at a high yield of about 50%. The first droplet containing the green fluorescent protein was observed by fusing with the droplet capturing the cells expressing the red fluorescent protein. As a result, it was confirmed that the green fluorescent protein and the red fluorescent protein were fused and the well was simultaneously expressed 6 of b). This is the result of confirming that two different droplets are fused and the characteristics and activity of each droplet are expressed in one fused droplet and can be observed.

다음은 특정 효소 활성을 갖는 활성 세포와 리포터 세포의 상호작용을 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이를 이용하여 확인하였다. 활성 세포로는 TPL을 생산하는 대장균 세포(XL1-Blue/pTrc99a-TPL)를 사용하였으며, 리포터 세포는 TPL의 반응 산물인 페놀을 슈도모나스속 유래 페놀-촉매 전사유도체인 DmpR에 의해 감지하여 리포터 형광 단백질의 발현을 활성화하도록 설계된 유전자 조작 대장균 세포를 사용하였다. 활성 세포 함유 제1액적과 리포터 세포 함유 제2액적을 각각 제조한 다음, 2개의 액적을 융합하여 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 6의 (다)에서 보는 바와 같이, 일부 마이크로웰에서 녹색형광이 관찰 되었는데, 이는 TPL 생산 활성 세포 함유 제1액적과 녹색형광단백질 생산 리포터 세포 함유 제2액적이 융합하여 활성 세포의 TPL 활성을 리포터 세포의 DmpR이 감지하여 녹색형광단백질을 발현을 활성화 한 것이다. 이러한 결과는 본 발명의 메쉬-그리드가 도입된 미세액적 마이크로웰 어레이를 이용하여 미생물커뮤니티 및 메타게놈 등 다양한 자원에 직접 적용하여, 세포 간 상호 작용 분석 뿐만 아니라, 원하는 효소 활성의 고속 탐색에도 효율적으로 사용 가능함을 보여 준 것이다.Next, the interaction between the active and reporter cells having a specific enzyme activity was confirmed using a microwell array into which a mesh-grid was introduced. As the active cells, E. coli cells (XL1-Blue / pTrc99a-TPL) producing TPL were used. Reporter cells were detected by DMPR, a phenol-catalyzed transcription derivative of Pseudomonas spp., Which is a reaction product of TPL, Lt; RTI ID = 0.0 > E. coli < / RTI > cells were used. A first droplet containing an active cell and a second droplet containing a reporter cell were prepared, and then two droplets were fused and observed under a microscope. As a result, as shown in FIG. 6 (C), green fluorescence was observed in some microwells because a first droplet containing a TPL production active cell and a second droplet containing a green fluorescent protein reporter cell fused to form an active cell TMP activity was detected by DmpR of reporter cells and activated green fluorescence protein expression. These results are directly applicable to a variety of resources such as microbial communities and metagenomes using the microdroplet microwell array incorporating the mesh-grid of the present invention, and can be used not only for analyzing intercellular interactions but also for efficiently searching for high- As shown in Fig.

아울러, 상기의 TPL 생산 활성 세포가 있는 마이크로웰의 액적을 30㎛의 유리 미세관으로 회수 분석하였다. 도 7의 (가)에서처럼 직경 30㎛의 유리 미세관으로 형광이 관찰되는 액적을 채취하여, 암피실린이 포함된 고체배지에 배양하여 활성 세포를 확인하였다. 그 결과, 암피실린에 내성을 갖도록 설계한 TPL 생산 대장균이 자라는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 나). 이러한 결과는, 다양한 미생물 및 메타게놈 유래 대사 및 효소 활성을 메쉬-그리드가 도입된 마이크로웰 어레이를 이용하여 단일 세포 수준에서 분석 및 고속 탐색할 수 있을 뿐만 아니라, 유리 미세관 등의 간단한 도구 및 방법으로 유용 목적 활성 세포를 간단히 채취, 회수 가능함을 보여준 것이다.
In addition, the droplet of the microwell containing the above-mentioned TPL-producing active cells was collected and analyzed by a 30 占 퐉 glass microtubule. As shown in Fig. 7 (A), a droplet in which fluorescence was observed with a glass microtube having a diameter of 30 mu m was sampled and cultured in a solid medium containing ampicillin to confirm active cells. As a result, it was confirmed that TPL-producing Escherichia coli grown to have resistance to ampicillin grows (Fig. 7B). These results indicate that not only metabolic and enzymatic activities derived from various microorganisms and metanee genomes can be analyzed and rapidly detected at a single cell level using a microwell array into which a mesh-grid is introduced, but also simple tools and methods such as glass microtubules , Which is useful for the purpose of simple collection and recovery of active cells.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시의 일예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments. It will be obvious. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims

A method for preparing microcapsules containing two cells using microchannels comprising the steps of:
(a) a first droplet containing cells and oil to be analyzed for activity in a microchannel equipped with a cell injecting section, an oil injecting section, a T-junction channel, a pinched-flow channel, a droplet discharging port and a waste discharging port, Injecting each of the ions into an injection portion of a channel;
(b) generating a large droplet containing a plurality of cells in a T-junction channel; And
(c) disrupting the large droplet containing the plurality of cells in a pinned-flow channel into small droplets containing single cells to produce a first microdialyte;
(d) preparing a second microcapsule containing the cells different from the first microcavity through steps (a) to (c);
(e) fusing a first microcaval and a second microcaval;
(f) analyzing the reaction between two cells in the fused droplet; And
(g) recovering droplets containing the two cells.

2. The method according to claim 1, wherein the cell contained in the first micro-fluid is a specific metabolic circuit or a cell having a specific enzyme activity, and the cell contained in the second micro-fluid is a product of the specific metabolic circuit or a specific enzyme activity Lt; RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >

The method according to claim 1, wherein the step (g) is carried out by selectively obtaining a droplet using a micro-glass tube, and culturing the droplet in a selective medium to obtain a desired cell.

The method of claim 1 wherein the cell density is injected in the step (a) is characterized in that the 1x10 ^⁸ ~ 2x10 ⁸ cells / mL.

The method as claimed in claim 1, wherein the oil is injected through an oil injection unit provided between a T-junction channel of the microchannel and a pinched-flow channel.

The method of claim 1, wherein the oil is a mineral oil.

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