KR101631371B1 - 유기 연결자를 통해 생물활성분자를 공유결합시킨 바이오칩 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표면에 티타니아(titania) 코팅층이 형성된 전극; 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자(organic coupler); 및 생물활성분자;를 포함하는 바이오칩으로서, 상기 유기 연결자는 하나의 카르복시기를 통해 전극 표면 티타니아의 히드록시기와, 다른 하나 이상의 카르복시기를 통해 생물활성분자와 공유결합된 것인 바이오칩, 상기 바이오칩을 이용하여 표적 분자를 분석하는 방법, 상기 바이오칩을 이용하여 질환의 발병 여부에 대한 정보를 제공하는 방법, 표면에 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자가 결합된 티타니아 코팅층을 구비한 전극으로서, 상기 유기 연결자는 하나의 카르복시기를 통해 전극 표면 티타니아의 히드록시기와 공유결합된 것인 전극, 및 상기 전극의 제조방법에 있어서, 전극 상부에 티타니아 전구체 및 주형 고분자 혼합용액을 코팅하는 단계 및 공기흐름조건 하에 소성(calcination)하는 단계를 포함하는 메조포러스 티타니아 코팅층을 구비한 전극의 제조방법에 관한 것이다.

Description

유기 연결자를 통해 생물활성분자를 공유결합시킨 바이오칩{A biochip comprising covalently immobilized bioactive molecules through organic couplers thereon}
본 발명은 표면에 티타니아(titania) 코팅층이 형성된 전극, 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자(organic coupler), 및 생물활성분자를 포함하는 바이오칩; 상기 바이오칩을 이용하여 표적 분자를 분석하는 방법; 상기 바이오칩을 이용하여 질환의 발병 여부에 대한 정보를 제공하는 방법; 표면에 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자가 결합된 티타니아 코팅층을 구비한 전극; 및 전극 상부에 티타니아 전구체 및 주형 고분자 혼합용액을 코팅하는 단계와 공기흐름조건 하에 소성(calcination)하는 단계를 포함하는 메조포러스 티타니아 코팅층을 구비한 상기 전극의 제조방법에 관한 것이다.
사람들은 질병을 초기에 모니터링 함으로서 이를 극복하고 보다 오래 살기를 원하므로, 바이오센서와 같은 진단 시스템이 널리 연구되고 있다. 종래 상용화되고 있는 많은 진단 시스템은 항원-항체 면역반응 또는 리간드-수용체 상호작용에 기초한다. 그러나, 실제 사람에서 발병하는 질병의 어떠한 부분은 이러한 항원-항체 반응이나 리간드-수용체 반응에 의해 진단이 불가능할 수 있다. 또한, 미량 물질의 검출이 필요하다던가 특정 물질의 존재여부가 아닌 정량이 필요한 경우 감도가 높은 또는 정량적인 검출이 가능한 검출 시스템을 필요로 한다. 이와 같이 특정한 생물물질의 검출을 위한 방법으로 가장 널리 이용되고 있는 것이 형광물질을 표지하여 이로부터 방출되는 특정파장의 형광을 검출하는 것이다. 그러나, 이러한 형광을 이용하는 방법은 1) 관심물질에 형광체를 표지하는 과정을 필요로 하며, 2) 형광체는 시간이 지남에 따라 또는 빛에 노출에 의해 깜빡임이 나타나거나 아예 소광되어 버리는 단점이 있다. 따라서, 생체 내에서 발생하는 다수의 기전에 산화환원이 관여하며, 과산화물이 암, 당뇨, 알츠하이머병 및 파킨슨병 등의 질환의 주요 표지자로 작용할 수 있다는 사실에 주목하여, 이들 과정으로부터 또는 생성물로서 과산화물로부터 발생하는 전기화학적 신호 또는 검출하는 방법이 새로운 진단 방법으로 대두되고 있다.
시토크롬(cytochrome c; cyt c)는 과산화물(superoxide; O2 -) 및 산화질소(nitric oxide; NO)를 검출할 수 있는 전형적인 단백질로써, 암, 당뇨, 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 질환을 검출할 수 있는 신호를 제공한다. 이러한 cyt c-기반 소자에 있어서 가장 널리 사용되는 원리는 외부 분자와의 특이적인 상호작용에 대한 산화 및 환원 과정이 발생할 때 cyt c 분자의 전자이동을 모니터링하는 것이다. 따라서, 상호작용 즉, 검출 과정 동안 신뢰할 만한 신호를 얻기 위해서는 안정한 결합을 통해 cyt c 분자들을 전극에 고정하는 것이 매우 중요하다.
현재까지 보고된, 전극 상에 cyt c 분자를 결합시키기 위한 2가지 가장 합리적인 방법은 (1) 단순하고 경제적인, cyt c 분자와 고분자 결합제(polymeric binder) 혼합물로의 코팅에 의한 결합 및 (2) cyt c 분자는 아민(-NH2), 카르복시산(-COOH) 및 아미드 결합(-CONH-)과 같은 극성 작용기를 가지므로, cyt c 분자와 전극 표면 간의 전하 상호작용(charge interaction)에 의한 결합이다. 그러나, 이들 방법은 최소결합상태(minimal binding state, 예컨대, 물리적 흡착)를 제공할 뿐, 예컨대, 공유결합과 같은 근본적으로 강한 결합을 부여할 수는 없다.
이에, 본 발명자들은, 전극 표면 상에 생체 내에서 발생하는 산화환원 과정에서 발생하는 전기적 신호를 전달할 수 있는 단백질, DNA 등의 생체분자(biomolecules; 예컨대, cyt c 분자 또는 금속 함유 헴(heme) 단백질 등)를 보다 안정적으로 고정화하고자 예의 연구노력한 결과, 링커로서 2개 이상의 카르복시기를 작용기로 포함하는 유기 연결자(coupler), 예컨대, 피리딘 디카르복시산(pyridine dicarboxylic acid; PDA),을 이용하여 상기 생체분자를 공유결합시킴으로써 닻으로서의 역할을 통해 전극 표면에서 보다 나은 cyt c 분자의 고정화를 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다(도 1a 침조). 특히, 전극 상에 메조포러스 티타니아 코팅층이 형성된 경우, 각각의 티타니아의 기공에 1 내지 2개의 cyt c 분자를 함유할 수 있을 뿐만 아니라 티타니아 표면에 풍부하게 존재하는 Ti-OH 작용기를 이용하여 에스테르화 반응에 의해 PDA 연결자의 카르복시산기와 공유결합을 형성할 수 있으므로 조밀하고 안정적으로 cyt c 분자를 전극 표면에 고정시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 하나의 목적은 표면에 티타니아(titania) 코팅층이 형성된 전극; 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자(organic coupler); 및 생물활성분자;를 포함하는 바이오칩으로서, 상기 유기 연결자는 하나의 카르복시기를 통해 전극 표면 티타니아의 히드록시기와, 다른 하나 이상의 카르복시기를 통해 생물활성분자와 공유결합된 것인 바이오칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 표적 분자의 분석방법에 있어서, 상기 표적 분자는 표적 분자 자체 또는 이의 활성에 의한 생성물이 상기 바이오칩에 고정된 생물활성분자와 직간접적으로 결합하거나 반응하여 전기화학적 신호의 변화를 유발하는 것으로, 상기 바이오칩의 전기화학적 신호를 측정하는 제1단계; 표적 분자를 함유할 가능성이 있는 시료를 첨가한 후 상기 바이오칩의 전기화학적 신호를 측정하는 제2단계; 및 상기 제1단계 및 제2단계로부터 측정한 시료 첨가 전과 후 측정된 전기화학적 신호의 세기를 비교하는 제3단계를 포함하는 표적 분자의 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오칩을 이용하여 정상 개체로부터 분리한 시료의 전기화학적 신호를 측정하는 제1단계; 상기 바이오칩을 이용하여 질환이 발병하였을 것으로 의심되는 개체로부터 분리한 시료의 전기화학적 신호를 측정하는 제2단계; 및 상기 제1단계로부터 측정된 신호와 제2단계로부터 측정된 신호를 비교하여 유의적인 차이가 있을 경우 질환이 발병한 것으로 판단하는 제3단계를 포함하는, 질환의 발병 여부에 대한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표면에 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자가 결합된 티타니아 코팅층을 구비한 전극으로서, 상기 유기 연결자는 하나의 카르복시기를 통해 전극 표면 티타니아의 히드록시기와 공유결합된 것인 전극을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 메조포러스 티타니아 코팅층을 구비한 전극의 제조방법에 있어서, 전극 상부에 티타니아 전구체 및 주형 고분자 혼합용액을 코팅하는 제1단계; 및 공기흐름조건 하에 소성(calcination)하는 제2단계를 포함하는 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 표면에 티타니아(titania) 코팅층이 형성된 전극; 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자(organic coupler); 및 생물활성분자를 포함하는 바이오칩으로서, 상기 유기 연결자는 하나의 카르복시기를 통해 전극 표면 티타니아의 히드록시기와, 다른 하나 이상의 카르복시기를 통해 생물활성분자와 공유결합된 것인 바이오칩을 제공한다.
본 발명은 표적 분자의 존재 여부 및/또는 이의 활성을 검출하기 위한 바이오칩에 관한 것으로, 상기 표적 분자 또는 이의 활성에 의해 생성되는 물질과 직간접적으로 결합하거나 반응함으로써 전기화학적 신호를 효율적으로 발생시킬 수 있는 생물활성분자를 전극에 공유결합으로 고정시켜, 안정성 및 내구성이 증가된 바이오칩을 제공하는 것이 특징이다. 이때, 발생하는 전기화학적 신호의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있도록 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자를 통해 결합시킨다.
바람직하게, 상기 티타니아 코팅층은 메조포러스 형태일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 티타니아 코팅층은 평균직경 5 nm 내지 10 μm의 기공을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 티타니아 코팅층은 평균직경 5 nm 내지 500 nm의 기공을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 바람직하게, 상기 티타니아 코팅층의 평균 기공크기는 하나 이상의 생물활성분자를 내부에 포획할 수 있는 공간을 제공할 수 있으며, 많게는 수십 내지 수백 개의 생물활성분자가 하나의 기공 내에 포획되어 연결될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 평균직경 약 7 nm의 큐빅형 기공을 갖는 메조포러스 티타니아 코팅층을 전극 상에 형성하였다. 한편, 과산화물을 검출할 수 있는 생물활성분자로서 cyt c를 피리딘 디카르복시산(pyridine dicarboxylic acid; PDA)을 통해 티타니아에 결합시켰다. 이때, 상기 cyt c는 평균직경 약 3 nm의 크기를 갖는 단백질로, 따라서 상기 티타니아의 각각의 기공 내부에 1 내지 2개의 cyt c가 위치하여 안정적으로 고정될 수 있다.
바람직하게, 상기 유기 연결자의 카르복시기는 생물활성분자의 아민기에 직접 또는 링커를 통해 결합할 수 있다.
예컨대, EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)를 매개체로 이용한 일련의 반응을 통해 유기 연결자와 생물활성분자를 결합시킬 수 있다. 구체적으로, 자유 카르복시기를 EDC와 반응시켜 반응성이 높은 4-(N'-(3-(디메틸아미노)프로필)-N-에틸카밤이미도일옥시)카보닐로 전환한 후, 카르복시기는 EDU(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) urea)를 방출하면서 cyt c의 아민기와 아미드 결합(amide bond)을 형성하였다. 상기 일련의 반응은 예시일 뿐 본 발명의 범주가 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 상기 유기 연결자는, 독립적으로 티타니아 및 생물활성분자와 동시에 결합하기 위하여 2개 이상의 작용기를 포함하며, 전자를 전달할 수 있는 골격을 갖는 분자일 수 있다. 상기 유기 연결자의 비제한적인 예는 2개 이상의 카르복시기를 포함하는, C1 -12 알킬; C2 -12 알켄; C2 -12 알킨; 컨쥬게이트된 복수의 이중결합을 포함하는 폴리알켄; 방향족 화합물; 및 이들의 위치이성질체(position isomers 또는 regioisomers)를 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 유기 연결자는 피리딘 디카르복시산(pyridine dicarboxylic acid; PDA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 상기 생물활성분자는 DNA, RNA 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 생물활성분자는 천연적으로 금속을 함유하거나 금속을 함유하도록 개질된 것일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 생물활성분자는 시토크롬 a, 시토크롬 b, 시토크롬 c, 시토크롬 c 산화효소, 시토크롬 P450s, 리그니나아제(ligninase), 페록시다아제(peroxidase), 헤모글로빈(hemoglobin), 미오글로빈(myoglobin), 뉴로글로빈(neuroglobin), 사이토글로빈(cytoglobin), 레그헤모글로빈(leghemoglobin), FixL, CooA, 가용성 구아닐릴 사이클레이트(soluble guanylyl cyclase), 과산화수소분해효소(catalase) 및 내피산화질소합성효소(endothelial nitric oxide synthase; eNOS)로 구성된 군으로부터 선택되는 금속함유 헴 단백질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 1) 내재적으로 아민기를 포함하거나, 아민기를 갖도록 개질되어 유기 연결자의 카르복시기에 공유결합할 수 있고, 2) 표적 분자로부터의 전기화학적 신호를 감지하거나, 표적 분자와의 상호작용에 의해 전기화학적 신호를 발생하거나, 표적 분자의 활성에 의해 생성되는 생성물로부터의 전기화학적 신호를 감지할 수 있는 물질을 제한없이 사용할 수 있다.
가장 바람직하게, 상기 생물활성분자는 시토크롬 c(cytochrome c; cyt c)일 수 있다. 시토크롬 c는 시토크롬 c 패밀리에 속하는 단백질로, 미토콘드리온의 내막에 느슨하게 결합된 작은 헴 단백질이다. 수용성이며, 전자전달사슬의 주된 구성요소이다. 산화 및 환원반응을 수행할 수 있으나, 산소와 결합하지는 않는다. 시토크롬 c의 헴 그룹은 bc1 복합체 즉, 코엔자임 Q-시토크롬 c 환원효소 복합체로부터 전자를 받아 시토크롬 산화효소 복합체에 전달한다. 또한 시토크롬 c는 세포사멸의 개시에 관여하는 것으로 알려져 있다. 히드록시화 및 방향족 산화 등의 반응을 촉매할 수 있으며, 다양한 전자공여체의 산화에 의해 과산화효소(peroxidase) 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 시토크롬 c는 과산화물 또는 일산화질소를 검출할 수 있는 단백질이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 표적 분자의 분석방법에 있어서, 상기 표적 분자는 표적 분자 자체 또는 이의 활성에 의한 생성물이 본 발명의 바이오칩에 고정된 생물활성분자와 직간접적으로 결합하거나 반응하여 전기화학적 신호의 변화를 유발하는 것으로, 상기 바이오칩의 전기화학적 신호를 측정하는 제1단계; 표적 분자를 함유할 가능성이 있는 시료를 첨가한 후 상기 바이오칩의 전기화학적 신호를 측정하는 제2단계; 및 상기 제1단계 및 제2단계로부터 측정한 시료 첨가 전과 후 측정된 전기화학적 신호의 세기를 비교하는 제3단계를 포함하는 표적 분자의 분석방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 제1단계는 표적 분자를 포함하지 않는 바이오칩으로부터 전기화학적 신호를 측정하는 단계로, 이로부터 측정된 신호를 바탕신호로 간주하여 이후 표적 분자 첨가시 나타나는 변화를 가늠하는 기준으로 사용할 수 있다. 즉, 제1단계로부터 측정되는 신호는 기재, 전극 및 코팅물질 등이 나타낼 수 있는 고유의 신호로 이를 바탕신호로 이용함으로써 이들 물질로부터의 신호를 시료로부터의 신호와 구분하여 보다 정밀한 검출을 가능하게 할 수 있다.
바람직하게, 상기 제3단계는 동일한 조건에서 제1단계와 제2단계를 수행하여 획득한 신호에 대해 수행할 수 있다. 상기 동일한 조건은 동일한 시료를 제외하고는 동일한 조성의 용매 또는 완충액, 동일한 조건의 바이오칩을 이용하여 동일한 전압 및 전류 등의 조건에서 전기화학적 신호를 측정하는 것을 의미할 수 있다. 전술한 바와 같이, 제1단계로부터 측정된 신호를 바탕신호로 하여 제2단계로부터 측정된 신호의 변화 여부 및 정도를 가늠하게 되므로, 시료 이외의 다른 조건은 동일하게 함으로써 분석의 정확도를 높일 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 분석방법을 이용하여 표적 분자의 존재여부, 활성, 함량 또는 이들 중 둘 이상을 측정할 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 표적 분자는 표적 분자 자체 또는 이의 활성에 의한 생성물이 본 발명의 바이오칩에 고정된 생물활성분자와 직간접적으로 결합하거나 반응하여 전기화학적 신호의 변화를 유발하는 물질이다. 따라서, 표적 분자를 함유하지 않은 시료의 경우 제1단계 및 제2단계로부터 측정된 신호는 동일할 것으로 예측할 수 있다. 한편, 표적 분자를 함유한 시료의 경우 제1단계로부터 측정된 신호에 비해 제2단계로부터 측정된 신호가 증가 또는 감소할 수 있으며, 그 정도는 시료 중에 존재하는 표적 분자의 양에 비례할 수 있다.
바람직하게, 상기 표적 분자는 과산화물(superoxide; O2 -), 일산화질소 라디칼(NO radical), 산화효소 또는 환원효소일 수 있다. 전술한 바와 같이, 바이오칩 상에 고정된 생물활성분자, 예컨대 시토크롬 c는 과산화물 또는 일산화질소 라디칼 등을 직접 검출할 수 있다. 한편, 산화효소 또는 환원효소는 이에 상응하는 특이적인 기질 존재시, 활성을 나타내며 그 활성의 산물로서 전기적인 활성을 띠는 산화종 또는 환원종을 생성할 수 있다. 이때, 상기 생성되는 전기적 활성의 산화종 또는 환원종은 상기 생물활성분자에 의해 감지될 수 있다.
다만, 산화효소 또는 환원효소는 이에 상응하는 특이적인 기질이 존재하는 경우에 활성을 나타내므로, 분석하고자 하는 표적 분자가 산화효소 또는 환원효소인 경우 이에 상응하는 기질을 추가로 첨가하여 표적 분자인 산화효소 또는 환원효소의 활성을 유도할 수 있다.
즉, 표적 분자로서 산화효소 또는 환원효소를 분석하는 경우, 표적 분자의 분석은 상기 산화효소 또는 환원효소와 이에 상응하는 기질 간의 반응에 의해 발생하는 전기화학적 신호 또는 상기 반응으로부터 생성되는 활성이온종에 의해 발생하는 신호를 검출함으로써 달성될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 바이오칩을 이용하여 정상 개체로부터 분리한 시료의 전기화학적 신호를 측정하는 제1단계; 상기 바이오칩을 이용하여 질환이 발병하였을 것으로 의심되는 개체로부터 분리한 시료의 전기화학적 신호를 측정하는 제2단계; 및 상기 제1단계로부터 측정된 신호와 제2단계로부터 측정된 신호를 비교하여 유의적인 차이가 있을 경우 질환이 발병한 것으로 판단하는 제3단계를 포함하는, 질환의 발병 여부에 대한 정보제공방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 질환은 암, 당뇨, 알츠하이머병 또는 파킨슨병일 수 있다. 즉, 본 발명의 바이오칩을 이용한 전기화학적 분석방법에 의해 상기 질환의 발병 여부를 진단할 수 있다. 그러나, 본 발명의 정보제공방법을 이용하여 진단할 수 있는 질환은 이에 제한되는 것은 아니며, 전기화학적 신호를 나타내는 물질을 방출 또는 소모하는 것을 특징으로 하는 질환을 모두 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 전기화학적 신호는 시료 중에 존재하는 과산화물과 같은 활성 이온종에 의해 발생되는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 질환들은 과산화물을 방출하는 또는 과산화물의 분해가 저해되어 축적되는 것이 특징으로, 따라서, 이들 질환의 환자로부터 분리한 시료 예컨대, 혈액, 뇨, 땀, 침 등은 정상 개체로부터 분리한 시료에 비해 높은 함량으로 과산화물을 함유할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 표면에 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자가 결합된 티타니아 코팅층을 구비한 전극으로서, 상기 유기 연결자는 하나의 카르복시기를 통해 전극 표면 티타니아의 히드록시기와 공유결합된 것인 전극을 제공한다.
바람직하게, 상기 유기 연결자는 타측의 하나 이상의 자유 카르복시기를 통해 아민기를 포함하는 생물활성분자와 결합할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 메조포러스 티타니아 코팅층을 구비한 전극의 제조방법에 있어서, 전극 상부에 티타니아 전구체 및 주형 고분자 혼합용액을 코팅하는 제1단계; 및 공기흐름조건 하에 소성(calcination)하는 제2단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 티타니아 전구체로는 TiCl4를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 상기 주형 고분자는 폴리에틸렌옥사이드-기반 비이온성 다원 블록공중합체(polyethylene oxide-based nonionic multiblock copolymer)일 수 있다. 바람직하게, 상기 주형 고분자는 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜(polyethylene glycol-polypropylene glycol; PEG-PPG), 폴리-d-(-)(3-히드록시부티레이트)-폴리에틸렌옥사이드(poly-d-(-)(3-hydroxybutyrate)-polyethylene oxide; PHB-PEO), 폴리이소부티렌-폴리에틸렌옥사이드(polyisobutylene-polyethylene oxide; PIB-PEO) 또는 폴리(스티렌-b-2-비닐피리딘-b-에틸렌옥사이드)(poly(styrene-b-2-vinylpyridine-b-ethylene oxide; PS-b-P2VP-b-PEO) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 바람직하게, 상기 주형 고분자로 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜 블록공중합체 예컨대, 플루로닉 F-127을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 주형 고분자는 전극 상에 티타니아 코팅층 형성시 일정한 형상을 형성하며, 이후 소성 과정에 의해 제거될 수 있으므로 해당 형성을 갖는 티타니아 코팅층을 제조하기 위하여 코팅층 제조시 티타니아 전구체와 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예컨대, 주형 고분자를 이용하여 상기 과정을 수행함으로써 메조포러스 나노 큐빅구조와 같은 기공 구조를 갖는 티타니아 층을 제공할 수 있다.
바람직하게, 상기 제2단계는 300 내지 500℃에서 1 내지 12시간 동안 수행할 수 있다. 상기 소성 과정을 통해, 주형 고분자를 제거할 수 있다. 그러나, 상기 소성 공정의 조건은 이에 제한되지 않으며, 주형 고분자의 종류 및 반응 조건 등에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 표면에 메조포러스 티타니아(mesoporous titania) 코팅층이 형성된 전극, 2개 이상의 카르복시기를 포함하는 유기 연결자(organic coupler) 및 생물활성분자를 포함하는 바이오칩은 상기 유기 연결자를 통해 전극 표면에 코팅된 티타니아에 생물활성분자를 공유결합시키므로, 장기간 보관하거나 여러번 반복하여 사용하여도 신호 변화가 적은 안정적이고 내구성이 높은 바이오칩을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 표면에 결합된 생물활성분자의 밀도를 조절할 수 있으므로 시료의 정성 및 정량분석에 활용할 수 있을 뿐만 아니라 미량 시료의 분석에도 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 PDA의 화학적 구조, 메조포러스 티타니아(mesoporous titania; MT) 코팅층의 표면 형태 및 PDA와 MT 및 PDA와 cyt c 간의 반응을 나타낸 도이다. 구체적으로 (a)는 PDA의 화학적 구조(the number in the PDA denotes the position of dicarboxylic acids)를, (b)는 메조포러스 티타니아 필름(d = 7.3 nm)의 TEM 이미지 및 SAXS 프로파일(하단)을, (c)는 PDA-MT 및 PDA-cyt c의 반응에 대한 개략도를 나타낸다(cyt c 크기 ~ 3.4 nm).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 O1s 및 N1s XPS 스펙트럼을 나타낸 도이다. (a)는 ITO-글래스 기재 상에 코팅된 메조포러스 티타니아(MT) 필름 및 PDA-결합 MT 필름(MT/PDA)의 O1s XPS 스펙트럼을, (b)는 ITO-글래스 기재 상에 코팅된 MT 필름, PDA-결합 MT 필름 및 cyt c-고정된 PDA 결합 MT 필름(MT/PDA/cyt c)의 N1s XPS 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, MT 필름-코팅된 ITO-글래스 기재 및 PDA-결합 MT 필름(MT/PDA)의 C1s XPS 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, (a) 50 mM cyt c를 포함하는 5 mM 인산완충용액(pH 7.4)에서 P-2,4-DA-결합 MT 필름 상에 cyt c의 고정반응(25℃에서 4시간)을 개시한 후 4℃에서 보관 시간에 따른 순환전압전류도(cyclic voltammogram; CV)(OX: 산화, RED: 환원) 및 (b) 산화피크전류(oxidation peak current; Ipa) 및 환원피크전류(reduction peak current; Ipc)를 보관시간의 함수로 나타낸 도이다. CV는 0.2 M 인산완충용액(pH 7.4)에서 50 mV/s의 주사속도로 수행하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 4가지 다른 PDA에 따른 cyt c-고정된 PDA-결합 MT 필름의 (a) 광학적 흡수 스펙트럼 및 (b) 순환전압전류도(OX: 산화, RED: 환원)를 나타낸 도이다. CV 측정은 0.2 M 인산완충용액(pH 7.4)에서 50 mV/s의 주사속도로 수행하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, cyt c와 PDA-결합 MT 샘플 간의 고정화 반응을 위해 동일한 cyt c 용액에 담근 후 세척한 비코팅 ITO-글래스 기재(ITO) 및 MT 필름-코팅된 ITO-글래스 기재(ITO/MT)의 광학적 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 0.2 M 인산완충용액(pH 7.4)에서 50 mV/s의 주사속도로 측정한, ITO/MT, ITO/MT/P-2,4-DA 및 ITO/MT/P-2,4-DA/cyt c의 순환전압전류 곡선을 나타낸 도이다. ITO/MT 샘플 및 ITO/MT/P-2,4-DA 샘플로부터는 REDOX 특성이 나타나지 않았다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 0.2 M 인산완충용액(pH 7.4)에서 50 mV/s의 주사속도로 측정한, cyt c-고정된 PDA-결합 MT 필름(MT/PDA/cyt c)의 순환전압전류 곡선을 나타낸 도이다. (A)와 (B)는 각각 5 mM 인산완충용액(pH 7.4)과 탈이온수로 세척한 MT/PDA/cyt c 필름과 5 mM 인산완충용액(pH 7.4)에서 5분 동안 초음파 처리 후 5 mM 인산완충용액(pH 7.4)과 탈이온수로 세척한 MT/PDA/cyt c 필름에 대한 곡선을, (C)는 cyt c 용액(5 mM 인산완충용액에 50 mM 농도로 용해시킴: pH 7.4)에 담근 후 5 mM 인산완충용액(pH 7.4)과 탈이온수로 세척한 PDA-결합 MT 필름에 대한 곡선을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, (a) cyt c-고정된 PDA-결합 MT 필름(MT/PDA/cyt c)(데이터의 혼잡을 피하기 위해 단지 5개 곡선만을 나타냄)의 순환전압전류도 및 (b) 순환 횟수에 따른 상기 (a)에서 산화(OX) 및 환원(RED) 피크의 전류 세기 변화(variation)를 나타낸 도이다. CV 측정은 0.2 M 인산완충용액(pH 7.4)에서 50 mV/s의 주사속도로 수행하였다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, (a) 크산틴 및 크산틴 산화효소(XOD) 존재시 과산화물(superoxide; O2 -) 생성(a-1) 및 cyt c와 과산화물 사이의 반응(a-2 및 a-3) 및 (b) cyt c-고정된 P-2,4-DA-결합 MT 필름(MT/P-2,4-DA/cyt c)에 대한 순환전압전류도를 나타낸 도이다. 구체적으로, (b1)은 크산틴 및 크산틴 산화효소 부재시, (b2)는 크산틴 존재시 및 (b3) 크산틴 및 크산틴 산화효소 모두 존재시(OX; 산화, RED; 환원) 측정된 결과를 나타낸다. CV 측정은 0.2 M 인산완충용액(pH 7.4)에서 50 mV/s의 주사속도로 수행하였다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, cyt c 고정된 P-2,4-DA-결합 MT 필름(MT/P-2,4-DA/cyt c)의 순환전압전류도를 나타낸 도이다. 구체적으로, 크산틴 및 크산틴 산화효소를 포함하지 않는 경우(검은색 실선), 크산틴을 포함하는 경우(초록색 점선) 및 크산틴 및 크산틴 산화효소를 모두 포함하는 경우(빨간색 쇄선)를 나타내었다. CV 측정은 0.2 M 인산완충용액(pH 7.4)에서 50 mV/s의 주사속도로 수행하였다. 모든 용액은 질소 기체로 퍼징하여 인산완충용액 중의 산소를 제거하였다. 상기 조건에서 산화환원 피크 전류(redox peak current)는 거의 변화하지 않았으며, 이는 산소 부재시 크산틴 및 크산틴 산화효소 수용액에서 과산화물 분자가 생성되지 않았음을 나타내는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 물질 및 제조
메조포러스 티타니아(mesoporous titania; MT) 막을 코팅하기에 앞서, 인듐-주석 산화물(indium-tin oxide; ITO)-코팅된 유리기판(10 Ω/m2)을 아세톤과 이소프로판올로 세척하고 질소를 흘려주어 건조시켰다. 상기 세척한 ITO-유리기판 상부에, 티타니아 전구체(titania precursor, TiCl4)와 주형 고분자(template polymer, Pluronic F-127)의 혼합용액(에탄올 용매)을 코팅하고 130℃에서 24시간 동안 소프트베이크하였다. 이후, 공기흐름조건 하에 450℃에서 5시간 동안 고분자 주형을 제거하는 소성공정(calcination process)을 수행함으로써 메조포러스 큐빅 티타니아 나노구조를 형성하였다(도 1b). 이후 소성공정 동안 남아있는 유기 불순물을 제거하기 위하여 샘플을 아세톤과 이소프로판올로 다시 세척하였다. 상기 세척한 MT로 코팅된 ITO-유리기판을 유기 연결자인 PDA 분자(30 mM)와 매개체로서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC, 70 mM)를 포함하는 용액에 침지시켰다. MT 내의 히드록시기(-OH)와 PDA 내의 EDC로 수식된 카르복시기(-COOH) 사이의 에스테르화 반응을 30℃에서 8시간 동안 수행하였다(도 1c). 이후 반응하지 않은 PDA 분자 및 여분의 ECD 매개체를 제거하기 위하여, PDA-결합된 MT 샘플을 N,N-디메틸포름아마이드(N,N-dimethylformamide; DMF)로 세척하였다. 이후, 상기 세척한 PDA-결합된 MT-코팅된 ITO-유리기판을 cyt c 용액(5 mM PBS에 50 mM 농도로 cyt c를 용해시킴: pH 7.4)에 침지시켜, MT 표면에 결합된 PDA 분자의 타측에 존재하는 EDC로 수식된 카르복시기(-COOH)와 cyt c에 존재하는 아민기(-NH2) 사이의 아미드화 반응을 수행하였다. 상기 커플링(아미드화) 반응은 25℃에서 4시간 동안 수행하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 아미드화 반응은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 우레아(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) urea; EDU)를 방출하였다. 아미드화 반응 후, cyt c를 고정한 샘플을 4℃에서 24시간 동안 보관하여 cyt c와 PDA 분자 사이의 고정화가 완료되도록 하였다. cyt c-고정된 샘플을 5 mM PBS(pH 7.4) 및 탈이온수로 세척하여 반응하지 않고 PDA-결합된 MT 표면에 물리적으로 부착된 cyt c 분자를 제거하였다. 0.15 mM 크산틴 산화효소(xanthine oxidase; XOD, Sigma-Aldrich)를 첨가시 과산화물(superoxide, O2 -) 분자를 형성할 수 있도록, 0.15 mM 크산틴(xanthine, Sigma-Aldrich)을 포함하는 0.2 M PBS(pH 7.4)에 cyt c가 고정된 메조포러스 티타니아 필름이 코팅된 전극을 침지시켜 전기화학적 측정을 수행함으로써 실제 생체분자 검출을 위한 소자로서의 활용 가능성을 확인하였다.
실시예 1: 측정
MT 필름의 나노구조를 고해상도 투과전자현미경(high resolution transmission electron microscope; HRTEM, JEM-2010, JEOL)으로 확인하는 한편, 포항 가속기 실험실(Pohang Accelerator Laboratory; PAL, POSTECH, Korea)에 있는 CuKα(λ = 1.608 Å) 방사선을 구비한 작은 각 X-선 산란(small-angle X-ray scattering; SAXS) 시스템을 이용하여 MT 필름의 평균 기공크기를 측정하였다. EDC 매개체를 통한 PDA(-COOH)와 MT(-OH) 간의 반응을 X-선 광전자분광법(X-ray photoelectron spectroscopy; XPS, ESCALAB 250, VG Scientifics)을 이용하여 분석하였다. 일정전위기(potentiostat, 263A, Princeton Applied Research)를 사용하여50 mV/s의 주사속도로 0.2 M PBS(pH 7.4)에서 cyt c-고정된 샘플의 전기화학적 특성 및 과산화물(O2 -) 검출을 측정하였다. 상기 완충용액에 크산틴 및 이의 산화효소를 첨가하여 과산화물 검출 실험을 수행하였다. ITO-코팅된 유리를 작업전극(working electrode)으로 사용하는 한편, Ag/AgCl(포화 KCl) 및 Pt 선을 각각 기준전극(reference electrode) 및 상대전극(counter electrode)으로 사용하였다. 안정성을 확인하기 위하여, 0.2 M PBS(pH 7.4)에 장착한 cyt c-고정된 전극에 대해 동일한 전위기를 사용하여 240회 순환까지 순환전압전류(cyclic voltammetry; CV) 곡선을 연속적으로 측정하였다.
도 1b에 나타난 바와 같이, ITO-글래스 기재 상에 코팅된 메조포러스 티타니아(mesoporous titania; MT) 필름으로부터 잘-조직된 메조포러스 큐빅 나노구조(m3m; d-간격=12.08 nm; SAXS 프로파일로부터의 단위셀변수(unit cell parameter; a)=13.95 nm)를 측정하였다. 큐빅 홀의 크기는 약 7.3 nm로, 이는 티타니아 격벽의 결정 격자(crystal lattice)가 측정치 0.4 nm의 격자 간격으로 잘 정렬되었음을 나타낸다. 커플링제(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드; 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC)를 이용한 에스테르화 반응에 의해, MT 필름의 표면에 PDA 연결자(coupler)를 공유결합시키고, MT 필름에 결합된 PDA 분자의 미반응 카르복시산 작용기에 cyt c 분자의 아미드화 반응을 수행하였다(도 1c). cyt c의 분자 크기가 약 3.4 nm임을 고려할 때, 각 큐빅 홀 내에는 하나 또는 2개의 cyt c 분자가 삽입될 수 있으므로, 이는 상당량의 cyt c 분자가 MT 필름의 큐빅 홀 내로 삽입되었음을 나타내는 것이다.
MT 표면에 대한 PDA의 에스테르화 반응은, Ti-OH 작용기를 대신하는 에스테르 작용기(Ti-O-C=O)의 존재에 따른 감소된 극성으로 인해 야기되는, 보다 낮은 에너지 영역으로의 티타니아 (Ti-O) O1s XPS 스펙트럼의 이동에 의해 확인하였다(도 2a). 이는 PDA-결합 MT 필름의 경우에서 N1s XPS 피크(피리딘 고리에서 C-N 결합)의 형성으로부터 재차 확인하였다(도 2b). 반면, 아미드 N1s XPS 피크(cyt c)는 cyt c-고정된 PDA-결합 MT 필름에 대해 보다 높은 결합 에너지 영역에서 확인되었다. 또한, PDA-MT 및 PDA-cyt c의 반응에 대한 C1s XPS 피크 또한 위의 결과를 뒷받침하였다(도 3).
상기 제조예 1에 개시한 바와 같이, MT 필름에 결합된 PDA 연결자에 대한 cyt c의 고정화 반응은 25℃에서 4시간 동안 초기화한 후, 4℃에서 추가로 24시간 동안 반응시켜 완성하였다. 상기 추가적인 고정화 시간(예컨대, 24시간)은 4℃에서 50 mM cyt c를 포함하는 5 mM 인산완충용액(pH 7.4) 내에서 PDA-결합 MT 필름 샘플의 저장 시간을 변화시키면서 간략한 실험으로부터 결정하였다. 이때, 연결자로는 P-2,4-DA를 사용하였다. 도 4a에 나타난 바와 같이, cyt c의 환원 및 산화 피크 모두는, 1시간으로부터 24시간까지 저장 시간을 증가시킴에 따라, ΔEp의 미미한 변화(marginal change)의 존재에 있어서 점진적으로 증가하였다. 산화피크전류(oxidation peak current; Ipa) 및 환원피크전류(reduction peak current; Ipc) 모두 6시간까지 상대적으로 가파르게 증가하였으며, 이후로부터 24시간까지는 완만한 기울기를 나타내었다(도 4b 및 표 1).
시간(h) Ipa(μA) Ipc(μA) Epa(mV) Epc(mV) ΔEp(mV)
1 0.052 0.052 68 43 25
3 0.075 0.063 79 39 40
6 0.117 0.121 71 43 28
12 0.125 0.140 79 39 40
24 0.168 0.198 71 39 32
4℃에서 24시간 동안 보관 후 측정한 환원 및 산화피크전류의 피크 세기는 1시간 동안 보관 후 측정한 값에 비해 각각 ∼280% 및 ∼220% 만큼 증가하였다. 구체적으로 살펴보면, 전술한 바와 같이, 산화·환원피크전류는 약 6시간까지의 저장시간 동안 가파르게 증가하였으며, 이를 초과하는 저장시간 동안에도, 그 정도가 다소 감소하기는 하였지만, 지속적으로 증가하였다. 이는 초기 약 6시간 동안 cyt c의 고정화가 빠르게 진행되며, 이후에도 다소 느리기는 하나 추가적인 cyt c의 고정화가 진행됨을 나타내는 것이다. 이를 토대로, 고정화 반응이 충분히 진행되어 미반응 유기 연결자가 잔류하는 것을 최소화하기 위하여, cyt c의 고정화 시간을 24시간으로 설정하였다. 아울러, 4℃ 용액에서 장시간 저장하는 경우 cyt c의 불활성화가 발생할 가능성이 있으므로 상기 고정화 시간 즉, 4℃ 용액에 침지시켜 저장하는 시간은 24시간을 넘지 않도록 하였다.
상기 고정화 조건을 적용하여, 각기 다른 PDA 이성질체를 이용하여 제조한 모든 샘플에 대해 cyt c 고정화 반응을 수행하였다. 도 5a에 나타난 바와 같이, 이들 샘플은 소렛 밴드(Soret band), β 밴드 및 α 밴드와 같은 cyt c의 3가지 특징적인 광학적 흡수 피크를 나타내었다. 이와 같은 결과는 모든 PDA 이성질체는 상이한 위치에 작용기 즉, 카르복시기를 포함하던지 그 위치와 무관하게 다수의 cyt c를 고정시킬 수 있음을 나타내는 것이다. cyt c와 PDA-결합 MT 샘플 간의 고정화 반응을 위해 사용한 것과 동일한 cyt c 용액에 담근 후 세척하여 PDA를 포함하지 않는 대조군 샘플(MT-코팅된 ITO 글래스 기재)을 준비하였다. 상기 대조군 샘플에 대해서는 아무런 cyt c 피크가 관찰되지 않았다. 한편, 각기 다른 PDA 이성질체를 사용한 경우에는 PDA 이성질체의 종류와 무관하게 모든 샘플에 대해 특징적인 cyt c 흡수 피크가 측정되었다(도 6). 특히, cyt c-고정된 PDA 결합 MT 샘플의 순환전압전류(cyclic voltammetry; CV) 곡선(도 5b)을 고려할 때, 2,4-위치의 PDA 이성질체(P-2,4-DA)가 cyt c 고정에 있어서 다른 이성질체에 비해 보다 효율적인 것으로 나타났다(모든 샘플에 대해 동일한 CV 측정 조건을 적용하였음). 그러나, 다른 샘플들도 눈에 띠는 산화 및 환원 피크를 나타내었으며, 이는 다른 PDA 이성질체들도 추가적인 최적화가 이루어진다면 유망한 잠재력을 갖는 연결자로서의 후보물질임을 나타내는 것이다. 다시 말해, 이와 같은 결과는, 본 발명의 PDA와 같이 전자를 전달할 수 있는 능력을 갖는 예컨대, 전자 공명이 가능한 방향족 고리를 포함 분자라면 유기 전달자로서 사용가능함을 나타내는 동시에, 각각 티타니아와 단백질에 결합하는 작용기인 2개 이상의 카르복시기의 상대적인 위치 예컨대, 작용기 간의 이격된 거리 등에 따라 보다 효율적인 전자 전달이 가능함을 나타내는 것이다. 상기 측정을 통해 결과로 얻은 전기화학적 변수들을 표 2(도 7 및 8)에 요약하였다. 산화 및 환원 피크 간의 작은 전위차(potential gap)(ΔEp=24 내지 32 mV)에 주목할 필요가 있으며, 이는 PDA 연결자를 통한 cyt c의 안정한 결합에 의해 우수한 전기화학적 가역성을 부여할 수 있음을 나타내는 것이다. ΔEp 값이 고정된 cyt c의 양(산화환원 피크전류세기와 관련됨)을 반영하지 않는다는 사실을 고려할 때, 다른 PDA 이성질체의 사용에 따른 상이한 ΔEp 값은, 확인을 위해서는 추가적인 별도의 연구를 필요로 하지만, PDA 이성질체의 화학적 구조에 의한 cyt c 분자의 상이한 배향(또는 위치)에 기인할 수 있다.
커플러 Ipa(μA) Ipc(μA) Epa(mV) Epc(mV) ΔEp(mV)
P-2,4-DA 0.198 0.168 71 39 32
P-2,5-DA 0.090 0.100 64 39 25
P-2,6-DA 0.073 0.060 68 39 29
P-3,5-DA 0.079 0.082 61 37 24
본 발명의 cyt c-고정된 PDA-결합 MT 샘플의 안정성(내구성)을 확인하기 위하여, 240 사이클까지 연속적으로 CV 곡선을 측정하였다. 도 9a에 나타난 바와 같이, CV 곡선의 형태에 있어서는 미미한 차이(marginal variations)가 존재하였으나, 전체적인 순환 과정 동안 안정적으로 유지되었다. 보다 구체적인 연구를 위하여, 산화 및 환원 전류 피크의 크기를 순환 횟수의 함수로 도시하였다. 도 9b에 나타난 바와 같이, 산화 피크 크기는 90 사이클에서 약 10% 만큼 변화한 반면, 환원 피크 크기는 동일한 순환 횟수에서 약 15%의 변화가 측정되었다. 상기 순환 횟수 즉, 90회 순환 이후, 피크는 3% 미만의 변화를 나타내며 안정화되었다(산화에 대해 1.7% 및 환원에 대해 2.7%). 이와 같은 우수한 안정성은, cyt c 분자를 강하게 고정할 수 있는 MT 표면에 있는 나노홀의 추가적인 효과가 존재하는 경우, PDA 연결자에 의한 cyt c 분자와 MT 표면 사이의 공유결합의 형성에 주로 기인할 수 있다. 이와 같은 결과는 본 발명의 PDA 연결자가 사실상 cyt c 단백질의 안정화된 고정에 기여하며, PDA-결합 MT 기재가 생체물질의 검출 및 진단을 위한 내구성있는 플랫폼으로서 활용 가능함을 나타내는 것이다.
마지막으로, 과산화물(O2 -) 검출 테스트를 통해, 실질적인 바이오메디컬 소자로서, 본 발명의 cyt c-고정된 PDA-결합 MT 필름의 응용 가능성을 간략히 확인하였다. 도 10a에 나타난 바와 같이, cyt c-고정된 PDA-결합 MT 필름 존재시 크산틴 분자를 포함하는 완충액 용액(0.2 M PBS, pH 7.4)에 크산틴 산화효소(xanthine oxidase; XOD)를 첨가함으로서 과산화물 분자가 생성되었다. 도 10a에 나타난 반응 개략도에 따르면, 생성된 과산화물 분자와 cyt c-고정된 PDA-결합 MT 필름 간의 반응에 의해 뚜렷한 산화·환원 전류가 형성될 수 있을 것이며, 이와 일치하도록, XOD-첨가된 용액에서 현저히 증가된 산화·환원 피크(∼35% 증가)가 측정된 반면, XOD 분자 첨가 전에는 아무런 산화·환원 피크 변화도 관찰되지 않았다(도 10b). 도 11에 나타난 바와 같이, 질소 기체 주입에 의한 산소분자 제거 후 과산화물의 무생성으로 인해 cyt c-고정된 PDA-결합 MT 필름에서 산화환원 피크는 거의 변화하지 않았다. 이와 같은 결과는 본 발명의 cyt c-고정된 PDA-결합 MT 필름이 암, 당뇨, 알츠하이머병 및 파킨슨병의 진단을 위한 주요 표지자 중 하나인 과산화물의 검출에 성공적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

Claims (25)

  1. 표면에 티타니아(titania) 코팅층이 형성된 전극; 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자(organic coupler); 및 생물활성분자;를 포함하는 바이오칩으로서,
    상기 유기 연결자는 하나의 카르복시기를 통해 전극 표면 티타니아의 히드록시기와, 다른 하나 이상의 카르복시기를 통해 생물활성분자와 공유결합된 것인 바이오칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 티타니아 코팅층은 메조포러스 형태인 것인 바이오칩.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 티타니아 코팅층은 평균직경 5 nm 내지 10 μm의 기공을 포함하는 것인 바이오칩.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 티타니아 코팅층의 평균 기공크기는 하나 이상의 생물활성분자를 내부에 포획할 수 있는 것인 바이오칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유기 연결자의 카르복시기는 생물활성분자의 아민기에 직접 또는 링커를 통해 결합된 것인 바이오칩.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유기 연결자는, 2개 이상의 카르복시기를 포함하는, C1 -12 알킬; C2 -12 알켄; C2 -12 알킨; 컨쥬게이트된 복수의 이중결합을 포함하는 폴리알켄; 방향족 화합물; 및 이들의 위치이성질체(position isomers 또는 regioisomers)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 바이오칩.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유기 연결자는 피리딘 디카르복시산(pyridine dicarboxylic acid; PDA)인 것인 바이오칩.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 생물활성분자는 DNA, RNA 또는 폴리펩타이드인 것인 바이오칩.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 생물활성분자는 천연적으로 금속을 함유하거나 금속을 함유하도록 개질된 것이 특징인 바이오칩.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 생물활성분자는 시토크롬 a, 시토크롬 b, 시토크롬 c, 시토크롬 c 산화효소, 시토크롬 P450s, 리그니나아제(ligninase), 페록시다아제(peroxidase), 헤모글로빈(hemoglobin), 미오글로빈(myoglobin), 뉴로글로빈(neuroglobin), 사이토글로빈(cytoglobin), 레그헤모글로빈(leghemoglobin), FixL, CooA, 가용성 구아닐릴 사이클레이트(soluble guanylyl cyclase), 과산화수소분해효소(catalase) 및 내피산화질소합성효소(endothelial nitric oxide synthase; eNOS)로 구성된 군으로부터 선택되는 금속함유 헴 단백질인 것인 바이오칩.
  11. 표적 분자의 분석방법에 있어서,
    상기 표적 분자는 표적 분자 자체 또는 이의 활성에 의한 생성물이 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 바이오칩에 고정된 생물활성분자와 직간접적으로 결합하거나 반응하여 전기화학적 신호의 변화를 유발하는 것으로,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 바이오칩의 전기화학적 신호를 측정하는 제1단계;
    표적 분자를 함유할 가능성이 있는 시료를 첨가한 후 상기 바이오칩의 전기화학적 신호를 측정하는 제2단계; 및
    상기 제1단계 및 제2단계로부터 측정한 시료 첨가 전과 후 측정된 전기화학적 신호의 세기를 비교하는 제3단계를 포함하는 표적 분자의 분석방법.
  12. 제11항에 있어서,
    표적 분자의 존재여부, 활성, 함량 또는 이들 중 둘 이상을 측정하는 것인 분석방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 표적 분자는 과산화물(superoxide; O2 -), 일산화질소 라디칼(NO radical), 산화효소 또는 환원효소인 것인 분석방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 표적 분자가 산화효소 또는 환원효소인 경우 이에 상응하는 기질을 추가로 첨가하는 것인 분석방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 산화효소 또는 환원효소와 이에 상응하는 기질 간의 반응에 의해 발생하는 전기화학적 신호 또는 상기 반응으로부터 생성되는 활성이온종에 의한 신호를 검출하는 것인 분석방법.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 바이오칩을 이용하여 정상 개체로부터 분리한 시료의 전기화학적 신호를 측정하는 제1단계;
    상기 바이오칩을 이용하여 질환이 발병하였을 것으로 의심되는 개체로부터 분리한 시료의 전기화학적 신호를 측정하는 제2단계; 및
    상기 제1단계로부터 측정된 신호와 제2단계로부터 측정된 신호를 비교하여 유의적인 차이가 있을 경우 질환이 발병한 것으로 판단하는 제3단계를 포함하는,
    질환의 발병 여부에 대한 정보제공방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 질환은 암, 당뇨, 알츠하이머병 또는 파킨슨병인 것인 정보제공방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 전기화학적 신호는 시료 중의 과산화물에 의한 것인 정보제공방법.
  19. 표면에 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자가 결합된 티타니아 코팅층을 구비한 전극으로서,
    상기 유기 연결자는 하나의 카르복시기를 통해 전극 표면 티타니아의 히드록시기와 공유결합된 것인 전극.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 유기 연결자는 타측의 하나 이상의 자유 카르복시기를 통해 아민기를 포함하는 생물활성분자와 결합하는 것인 전극.
  21. 메조포러스 티타니아 코팅층을 구비한 제19항의 전극의 제조방법에 있어서,
    전극 상부에 티타니아 전구체 및 주형 고분자 혼합용액을 코팅하는 제1단계;
    공기흐름조건 하에 소성(calcination)하는 제2단계; 및
    상기 전극을 2개 이상의 카르복시기를 포함하되 전자를 전달할 수 있는 유기 연결자를 포함하는 용액에 침지시키는 제3단계;를 포함하는 제조방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 티타니아 전구체는 TiCl4인 것인 제조방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 주형 고분자는 폴리에틸렌옥사이드-기반 비이온성 다원 블록공중합체(polyethylene oxide-based nonionic multiblock copolymer)인 것인 제조방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 주형 고분자는 폴리에틸렌글리콜-폴리프로필렌글리콜(polyethylene glycol-polypropylene glycol; PEG-PPG), 폴리-d-(-)(3-히드록시부티레이트)-폴리에틸렌옥사이드(poly-d-(-)(3-hydroxybutyrate)-polyethylene oxide; PHB-PEO), 폴리이소부티렌-폴리에틸렌옥사이드(polyisobutylene-polyethylene oxide; PIB-PEO) 및 폴리(스티렌-b-2-비닐피리딘-b-에틸렌옥사이드)(poly(styrene-b-2-vinylpyridine-b-ethylene oxide; PS-b-P2VP-b-PEO)로 구성된 군으로부터 선택되는 이원 또는 삼원 블록공중합체인 것인 제조방법.
  25. 제21항에 있어서,
    제2단계는 300 내지 500℃에서 1 내지 12시간 동안 수행되는 것인 제조방법.
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