KR101630820B1 - Pharmaceutical composition for blood vessel disease prevention or treatment comprising substance extracted from Hericium erinacium - Google Patents
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Abstract
본 발명은 노루궁뎅이버섯 유래 물질을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈관노화를 예방 또는 치료하는 활성을 갖는 노루궁뎅이버섯 유래 물질을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈관노화 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a vascular disease, which comprises a mushroom-derived material, and more particularly, to a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular disease, A pharmaceutical composition for therapeutic use, and a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis.
Description
본 발명은 노루궁뎅이버섯 유래 물질을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈관노화를 예방 또는 치료하는 활성을 갖는 노루궁뎅이버섯 유래 물질을 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 혈관노화 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a vascular disease, which comprises a mushroom-derived material, and more particularly, to a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular disease, A pharmaceutical composition for therapeutic use, and a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis.
혈관내피세포는 내피세포 유래성 산화 질소(nitric oxide, NO)와 프로스타노이드(prostanoid)를 유리하고, 혈관 활성과 관련된 호르몬을 활성화 혹은 분해하여 혈관 평활근의 기능을 조절함으로써 혈관을 수축 및/또는 이완시킬 수 있다.The endothelial cells of the vascular endothelium are advantageous for endothelial cell-derived nitric oxide (NO) and prostanoid, and can activate and degrade vascular activity-related hormones to regulate vascular smooth muscle function, thereby contraction and / Can be relaxed.
혈관내피세포의 텔로머라제(telomerase) 활성은 노화가 이루어짐에 따라 감소한다. 또한, 노화된 혈관내피세포에서는 NO의 생성, eNOS(endothelial nitric oxide synthase)의 발현 및 프로스타시클린(prostacyclin)의 생성이 감소하여 현격히 낮은 혈관의 수축력을 나타내며, PAI-1(type I plasminogen activator) 발현은 증가하여 혈전 생성이 촉진되고, Inter-Cellular Adhesion Molecule 1(ICAM-1), 인터루킨-1, 인터루킨-8과 같은 세포 부착 단백질 및 케모카인의 발현이 증가되어 염증 반응이 증가함에 따라 혈관이 좁아지게 된다. 실제로, 동맥경화 병변 조직의 혈관내피세포는 정상 조직의 세포에 비해 세포 노화 표지로 잘 알려진 SA-β-Gal(senescenceassociated beta-galactosidase) 활성이 증가되어 있다고 알려져 있다. 아울러, 동맥경화 병변 조직의 세포들은 정상 조직의 세포에 비해 텔로미어 단축 정도가 더 높다. 따라서 혈관내피세포의 노화를 억제, 지연시키면 그로 인한 심혈관 질환을 예방, 치료할 수 있을 것으로 여겨진다. The telomerase activity of vascular endothelial cells decreases with aging. In addition, in aging vascular endothelial cells, production of NO, expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and production of prostacyclin are decreased, resulting in a remarkably low contractile force of blood vessels. PAI-1 (type I plasminogen activator ) Expression is increased and thrombogenesis is promoted and the expression of cell adhesion proteins and chemokines such as Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1), interleukin-1 and interleukin-8 is increased, . In fact, the vascular endothelial cells of atherosclerotic lesion tissue are known to have increased SA-β-Gal (senescenceassociated beta-galactosidase) activity, which is well known as a cell senescence marker, compared to normal tissue cells. In addition, the cells of atherosclerotic lesions are more likely to have telomere shortening than normal tissue cells. Therefore, inhibition and delay of vascular endothelial cell senescence may prevent and treat cardiovascular diseases.
또한, 종래 기술 중 공개특허 10-2004-0050396(공개일자: 2004년06월16일)에는 천궁, 천궁의 분말, 천궁의 추출물로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 일산화질소 생성제 조성물 및 이를 이용한 약품 조성물를 기재하고 있다. In addition, in the prior arts disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-2004-0050396 (published on June 16, 2004), nitrogen monoxide (NO), which comprises at least one member selected from the group consisting of citrine, And a pharmaceutical composition using the same.
나아가, 공개특허 10-2013-0046115(공개일자: 2013년05월07일)에는 시링가레시놀을 유효 성분으로 포함하는 혈관 노화 억제용 조성물를 기재하고 있으며, 상기 조성물은 혈관 세포의 SIRT 1 발현을 증가시키고 텔로머라제를 활성화함으로써 우수한 혈관 노화 억제 효과를 나타낸다고 기재하고 있다.Furthermore, the patent document 10-2013-0046115 (published on May 07, 2013) discloses a composition for inhibiting angiogenesis, which comprises siring ginsenoside as an active ingredient, And activating telomerase exhibits excellent anti-aging effects.
더불어, 지금까지 혈관 노화를 지연시키는 방법 중 잘 알려진 방법으로는 칼로리 제한을 들 수 있다. 하지만 이는 실제 적용이 쉽지 않고 일상 생활의 불편을 야기한다는 점에서 다른 대안이 요구된다.In addition, a well known method of delaying blood vessel aging has been calorie restriction. However, this is not easy to apply and it causes discomfort in daily life.
상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 SA-β-Gal 활성을 저해함으로써 혈관노화를 억제하는 효과를 가지며, 이로 인해 혈관질환 예방 또는 치료용으로 사용하기 적합한 약학적 조성물 및/또는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하고자 한다.The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition and / or a pharmaceutical composition suitable for use in the prevention or treatment of vascular diseases, which has an effect of inhibiting the aging of blood vessels by inhibiting SA- And to provide a health functional food for preventing or improving vascular diseases.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases, which comprises a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 혈관질환은 당뇨병, 뇌혈관 장애, 심혈관 장애, 폐색성 동맥 경화증, 인지증, 죽상(粥狀) 동맥 경화증, 고혈압 및 비만으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질환을 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the vascular disease is one or more diseases selected from the group consisting of diabetes, cerebrovascular disorder, cardiovascular disorder, obstructive arteriosclerosis, dementia, atherosclerosis, hypertension and obesity . ≪ / RTI >
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 노루궁뎅이버섯에서 유래된 것일 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the compound represented by the general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be derived from a mushroom.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 혈관노화 억제용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, comprising the compound represented by the above-mentioned formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 노루궁뎅이버섯에서 유래된 것일 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be one derived from a mushroom of Aspergillus oryzae.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.Further, the present invention provides a health functional food for preventing or ameliorating a vascular disease comprising the compound represented by the above-mentioned formula (1) or a salt thereof as an active ingredient.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 노루궁뎅이버섯에서 유래된 것일 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be one derived from a mushroom of Aspergillus oryzae.
더불어, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 혈관노화 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for prevention or improvement of vascular aging comprising the compound represented by the formula (1) or a salt thereof as an active ingredient.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 노루궁뎅이버섯에서 유래된 것일 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be one derived from a mushroom of Aspergillus oryzae.
게다가, 본 발명은 노루궁뎅이버섯 및 C1 ~ C4 알코올을 혼합 및 추출하여 추출물을 제조하는 단계; 상기 추출물을 유기용매로 분획하여 분획물을 제조하는 단계; 및 상기 분획물을 크로마토그래피하여 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 수득하는 단계; 를 포함하고, 상기 유기용매는 핵산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 C1 ~ C4 알코올로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리 방법을 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for producing an extract, which comprises mixing and extracting Cucurbitaceae and a C 1 -C 4 alcohol to prepare an extract; Fractionating the extract with an organic solvent to produce a fraction; And chromatographing the fractions to obtain a compound represented by the following formula (1): Wherein the organic solvent comprises at least one member selected from the group consisting of a nucleic acid, methylene chloride, ethyl acetate, and a C 1 -C 4 alcohol.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유기용매는 메틸렌클로라이드 및 메탄올을 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the organic solvent may include methylene chloride and methanol.
본 발명은 SA-β-Gal 활성을 저해함으로써 우수한 혈관노화 억제 효과를 가지며, 이로 인해 혈관질환 예방 또는 치료용으로 사용하기 적합한 약학적 조성물 및/또는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 효과가 있다.The present invention provides a pharmaceutical composition suitable for use in the prevention or treatment of vascular diseases and / or a health functional food for preventing or ameliorating vascular diseases, which has an excellent anti-aging effect by inhibiting SA-beta-Gal activity, It is effective.
도 1은 본 발명의 화합물 1의 1H NMR 결과이다.
도 2는 본 발명의 화합물 1의 13C NMR 결과이다.
도 3은 본 발명의 화합물 1의 ESI-MS 스펙트럼 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 화합물 1의 IR 스펙트럼 분석 결과이다.
도 5는 실험예 2에서 화합물 1의 세포독성을 측정한 결과이다.
도 6은 실험예 3에서 화합물 1의 혈관노화 억제활성을 측정한 결과이다.
도 7은 실험예 3에서 화합물 1의 섬유아세포 노화 억제활성을 측정한 결과이다.
도 8은 실험예 3에서 화합물 1의 혈관노화 억제활성을 측정한 결과이다.
도 9는 실험예 3에서 화합물 1의 섬유아세포 노화 억제활성을 측정한 결과이다.1 shows the 1 H NMR results of
2 shows the 13 C NMR results of the
3 shows the results of ESI-MS spectrum analysis of
4 shows IR spectrum analysis results of
Fig. 5 shows the result of measuring cytotoxicity of
FIG. 6 shows the results of measuring the anti-angiogenic activity of
FIG. 7 shows the results of measuring the inhibitory activity of
Fig. 8 shows the results of measuring the anti-angiogenic activity of
FIG. 9 shows the results of measuring the fibroblast aging inhibitory activity of
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
상술한 바와 같이, 지금까지 혈관 노화를 지연시키는 방법 중 잘 알려진 방법으로는 칼로리 제한을 들 수 있다. 하지만 이는 실제 적용이 쉽지 않고 일상 생활의 불편을 야기한다는 점에서 다른 대안이 요구되는 실정이다.
As described above, a well-known method for delaying blood vessel aging up to now is calorie restriction. However, this is not easy to apply and it causes discomfort in everyday life. Therefore, another alternative is required.
이에 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함으로써, 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 SA-β-Gal 활성을 저해함으로써 우수한 혈관노화 억제 효과를 가지는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.Accordingly, the present invention has been made to solve the above-mentioned problems by providing a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases, which comprises a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. There is an effect of providing a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases having an excellent anti-aging effect by inhibiting SA-beta-Gal activity.
[화학식 1][Chemical Formula 1]
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases comprising the compound represented by the above-mentioned formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 통상적으로 제조 및/또는 구입할 수 있는 것이라면 그 유래를 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 노루궁뎅이버섯에서 유리된 것일 수 있다.The compound represented by the general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is not particularly limited as long as it can be usually prepared and / or purchased, but it may preferably be one which has been liberated from the mushroom.
또한, 상기 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 상기 화학식 1의 화합물을 포함할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 동결건조되어 있고, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사 등과 같이 투여를 위한 약제학상 허용되는 제제를 형성하도록 재구성될 수 있는 그러한 약제 또는 그의 염이 포함될 수 있다.In addition, the pharmaceutically acceptable salt thereof may include the compound of the formula (1). Further, the pharmaceutical compositions may be lyophilized and include such agents or salts thereof that can be reconstituted to form pharmaceutically acceptable agents for administration, such as by intravenous, intramuscular or subcutaneous injection.
더불어, 상기 혈관질환은 통상적으로 혈관의 노화 및/또는 탄력 저하에 의해 발병할 수 있는 질병이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 당뇨병, 뇌혈관 장애, 심혈관 장애, 폐색성 동맥 경화증, 인지증, 죽상(粥狀) 동맥 경화증, 고혈압 및 비만으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질환을 포함할 수 있다.
In addition, the vascular disease is not particularly limited as long as it is a disease that can usually be caused by aging and / or a decrease in elasticity of blood vessels. Preferably, the vascular disease is diabetes, cerebrovascular disorder, cardiovascular disorder, Atherosclerosis, hypertension, and obesity. ≪ Desc /
게다가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 혈관노화 억제용 약학적 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis, comprising the compound represented by the above-mentioned formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 통상적으로 제조 및/또는 구입할 수 있는 것이라면 그 유래를 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 노루궁뎅이버섯에서 유리된 것일 수 있다.The compound represented by the general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is not particularly limited as long as it can be usually prepared and / or purchased, but it may preferably be one which has been liberated from the mushroom.
또한, 상기 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 상기 화학식 1의 화합물을 포함할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 동결건조되어 있고, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사 등과 같이 투여를 위한 약제학상 허용되는 제제를 형성하도록 재구성될 수 있는 그러한 약제 또는 그의 염이 포함될 수 있다.
In addition, the pharmaceutically acceptable salt thereof may include the compound of the formula (1). Further, the pharmaceutical compositions may be lyophilized and include such agents or salts thereof that can be reconstituted to form pharmaceutically acceptable agents for administration, such as by intravenous, intramuscular or subcutaneous injection.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally. In the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, And the like. When administered orally, the protein or peptide is extinguished and the oral composition should be formulated to coat the active agent or protect it from degradation from above. The pharmaceutical composition may also be administered by any device capable of transferring the active agent to the target cell.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001 ~ 100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 혈관질환 예방 또는 치료하는 데 충분한 양 및/또는 혈관노화 억제에 충분한 양을 의미한다.
The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as the formulation method, the administration method, the age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and responsiveness of the patient, Usually, a skilled physician can readily determine and prescribe dosages effective for the desired treatment or prophylaxis. According to a preferred embodiment of the present invention, the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001 to 100 mg / kg. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to prevent or treat vascular disease and / or an amount sufficient to inhibit angiogenesis.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, suppositories, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, sucrose), lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, simple diluents commonly used, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included .
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 예방제 또는 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual prophylactic agent or a therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.Further, the present invention provides a health functional food for preventing or ameliorating a vascular disease comprising the compound represented by the above-mentioned formula (1) or a salt thereof as an active ingredient.
더불어, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 혈관노화 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for prevention or improvement of vascular aging comprising the compound represented by the formula (1) or a salt thereof as an active ingredient.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염은 통상적으로 제조 및/또는 구입할 수 있는 것이라면 그 유래를 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 노루궁뎅이버섯에서 유리된 것일 수 있다.
The compound represented by the formula (1) or a salt thereof is not particularly limited as long as it can be usually prepared and / or purchased, but preferably it may be one which has been liberated from the mushroom.
상기 건강기능성 식품의 종류에는 통상적으로 제조 및/또는 판매되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다. The kind of health functional food is not particularly limited as long as it is usually produced and / or sold. For example, dairy products such as meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums and ice cream, soups, drinks, tea, drinks, alcoholic beverages, And can be used in the form of pills, powders, granules, infusions, tablets, capsules or beverages, all of which include health functional foods in the conventional sense.
본 발명의 건강 음료 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 식품학적으로 허용 가능한 그의 염을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. The health beverage composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains the compound represented by the above-mentioned formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, but there is no particular limitation to the liquid ingredient, and various flavors or natural carbohydrates, ≪ / RTI > Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrins; And sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As natural flavors other than those described above, natural flavors (such as tau martin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin)) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) have.
상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.In addition to the above, the health functional food of the present invention may contain various kinds of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavies (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, And salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like.
그밖에 본 발명의 건강기능성 식품들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
In addition, the health functional foods of the present invention may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks. These components may be used independently or in combination.
더불어, 본 발명은 본 발명은 노루궁뎅이버섯 및 C1 ~ C4 알코올을 혼합 및 추출하여 추출물을 제조하는 단계; 상기 추출물을 유기용매로 분획하여 분획물을 제조하는 단계; 및 상기 분획물을 크로마토그래피하여 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 수득하는 단계; 를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리 방법을 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for producing an extract, comprising the steps of: preparing an extract by mixing and extracting Cucurbitaceae mushroom and C 1 -C 4 alcohol; Fractionating the extract with an organic solvent to produce a fraction; And chromatographing the fractions to obtain a compound represented by the following formula (1): And a method for separating the compound represented by the formula (1).
상기 유기용매는 통상적으로 천연물 유래 단일 성분 분리를 위해 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 핵산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 C1 ~ C4 알코올로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메틸렌클로라이드 및 메탄올을 포함할 수 있다.
The organic solvent is not particularly limited as long as it is usually used for separating a single component originating from a natural product. Preferably, the organic solvent may include at least one selected from the group consisting of nucleic acids, methylene chloride, ethyl acetate and C 1 -C 4 alcohol , More preferably methylene chloride and methanol.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, these examples are intended to further illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
[[ 실시예Example ]]
실시예Example 1. One. 노루궁뎅이버섯Mushroom mushroom 유래 물질 추출 및 분획 Extraction and fractionation of derived material
1-1. 1-1. 노루궁뎅이Spindle 버섯의 추출물 제조 Extract manufacture of mushroom
특별히 부위별로 구별함이 없이 자실체 전체를 가지고 건조된 노루궁뎅이 버섯(구매처: 포천버섯개발) 3㎏을 적당한 크기로 분쇄한 후, 80%메탄올 20ℓ를 가하고, 상온에서 24시간씩 2회 반복 추출하였고, 여과지로 여과하였으며, 이를 감압농축하여 300g의 추출물을 수득하였다.
Three kilograms of dried mushroom (Pocheon mushroom), which was dried with the entire fruiting body, was pulverized to an appropriate size, 20 liters of 80% methanol was added, and extracted twice at room temperature for 24 hours , Filtered through a filter paper, and concentrated under reduced pressure to obtain 300 g of an extract.
1-2. 1-2. 노루궁뎅이Spindle 버섯 추출물로부터 유기 용매 Organic solvent from mushroom extract 분획물의Fraction 제조 Produce
상기 실시예 1-1에서 제조한 노루궁뎅이 버섯의 추출물 300g을 증류수 2ℓ에 현탁하고, 헥산을 2ℓ 추가 현탁한 후 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올로 차례로 분배하였고, 각각 분배된 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올을 증발 및 농축시켜 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 제조하였다.
300 g of the extract prepared from Example 1-1 was suspended in 2 L of distilled water, 2 L of hexane was further suspended, and the suspension was divided into hexane, methylene chloride, ethyl acetate and butanol, , Ethyl acetate and butanol were evaporated and concentrated to give hexane, methylene chloride, ethyl acetate and butanol fractions.
1-3. 유기용매 1-3. Organic solvent 분획물로부터From the fraction 활성 activation 분획물Fraction 및 화합물의 제조 And preparation of compounds
상기 실시예 1-2에서 얻어진 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 실리카겔 칼럼을 사용한 크로마토그래피를 이용하여 또 다른 분획물을 얻었다. 즉, 헥산-에틸아세테이트 혼합용매(v/v = 99% : 1%, 50% : 50%), 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용매(v/v = 98% : 2%, 50% : 50%)로 구성되는 단계별 농도 구배 용매시스템을 적용하여 각각 노루궁뎅이 버섯 헥산 분획물 6개(HEH1 ~ HEH6), 노루궁뎅이버섯 메틸렌클로라이드 분획물 9개(HEM1 ~ HEM9), 노루궁뎅이 버섯 에틸아세테이트 분획물 5개(HEE1 ~ HEE5)의 분획물을 얻었다. 분획물 중 HEH2, HEM2, HEM6, HEM7, HEE3가 아세틸콜린 에스터라아제에 농도 의존적으로 저해활성을 나타냄을 확인하여 활성 분획물을 얻었다.
The hexane, methylene chloride, ethyl acetate and butanol fractions obtained in Example 1-2 above were subjected to chromatography using a silica gel column to obtain another fraction. (V / v = 99%: 1%, 50%: 50%) and a methylene chloride-methanol mixed solvent (v / v = 98%: 2%, 50%: 50%) in a hexane-ethyl acetate mixed solvent (HEH1 to HEH6), 9 (HEM1 to HEM9), and 5 (HEE1 to HEE5, respectively) fractions of the herbaceous mushroom ethyl acetate fractions, ). Active fractions were obtained by confirming that HEH2, HEM2, HEM6, HEM7 and HEE3 in the fraction showed inhibitory activity in a concentration dependent manner on acetylcholinesterase.
1-4. 활성 1-4. activation 분획물로부터From the fraction 단일화합물의 분리 Separation of single compounds
상기 실시예 1-3의 활성 분획물들 중 노루궁뎅이 버섯 메틸렌클로라이드 분획물로서 HEM2을 HPLC를 통해 분석하여 화합물 1을 분리 정제하였다.
Among the active fractions of Examples 1-3, HEM2 was analyzed by HPLC as a fraction of Mulberry Mushroom Methylene Chloride, and
비교예Comparative Example 1. One.
노루궁뎅이 버섯 추출물로서, 하기 화학구조로 결정되는 화합물을 본 비교예로 하였다.As the extract of Aspergillus oryzae, the compound determined by the following chemical structure was regarded as the present comparative example.
비교예Comparative Example 2. 2.
노루궁뎅이 버섯 추출물로서, 하기 화학구조로 결정되는 화합물을 본 비교예로 하였다.As the extract of Aspergillus oryzae, the compound determined by the following chemical structure was regarded as the present comparative example.
비교예Comparative Example 3. 3.
노루궁뎅이 버섯 추출물로서, 하기 화학구조로 결정되는 화합물을 본 비교예로 하였다.As the extract of Aspergillus oryzae, the compound determined by the following chemical structure was regarded as the present comparative example.
비교예Comparative Example 4. 4.
노루궁뎅이 버섯 추출물로서, 하기 화학구조로 결정되는 화합물을 본 비교예로 하였다.As the extract of Aspergillus oryzae, the compound determined by the following chemical structure was regarded as the present comparative example.
비교예Comparative Example 5. 5.
노루궁뎅이 버섯 추출물로서, 하기 화학구조로 결정되는 화합물을 본 비교예로 하였다.As the extract of Aspergillus oryzae, the compound determined by the following chemical structure was regarded as the present comparative example.
실험예Experimental Example
1: 화합물 1의 구조분석. 1: Analysis of the structure of
상기 실시예 1-4에서 분리된 화합물 1의 분자량 및 분자식을 LC/MS 분광기(제조사: Thermo finnigan LCQ deca plus)를 사용하여 결정하고, 핵자기공명(NMR) 분석기(Verian 500 MHz)를 통하여 1H NMR, 13C NMR 스펙트럼을 얻어, 분자구조를 결정하였다. 1H NMR 결과는 도 1에, 13C NMR 결과는 도 2에, ESI-MS 스펙트럼 분석 결과는 도 3에, IR 스펙트럼 분석 결과는 도 4에 나타냈다.The Example 1-4
그 결과 화합물 1의 하기 화학구조를 결정하였다.As a result, the following chemical structure of
화합물 1: Compound 1:
1) 물성 : 백색 분말(white powder) (녹는점 182 ~ 184 ℃)1) Properties: White powder (melting point 182 ~ 184 ℃)
2) 분자량 : 428 g/mol2) Molecular weight: 428 g / mol
3) 분자식 : C28H4403 3) Molecular formula: C 28 H 44 0 3
4) 1H NMR (500MHz, CDCl3), δ 6.51(1H, d, J = 8.5Hz, H-7), 6.24 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6), 5.24 (1H, dd, J = 15.0, 8.0 Hz, H-23), 5.16(1H, dd, J = 15.0, 8.0 Hz, H-22), 3.99 (1H, m, H-3), 1.03 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-21), 0.94 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-28), 0.88 (3H, s, H-19), 0.86 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-26), 0.83 (3H, s, H-18), 0.81 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-27), 13C NMR (125MHz, CDCl3), δ 135.6 (C-6), 135.4 (C-22), 132.5 (C-23), 130.9 (C-7), 82.3 (C-5), 79.6 (C-8), 66.6 (C-3), 56.4 (C-17), 51.9 (C-14), 51.3 (C-9), 44.7 (C-13), 43.0 (C-24), 39.9 (C-20), 39.5 (C-12), 37.2 (C-4), 37.1 (C-10), 34.9 (C-1), 33.2 (C-25), 30.3 (C-2), 28.8 (C-16), 23.6 (C-11), 21.0 (C-21), 20.8 (C-15), 20.1 (C-26), 19.8 (C-27), 18.3 (C-19), 17.7 (C-28), 13.0 (C-18). 4) 1 H NMR (500MHz, CDCl 3), δ 6.51 (1H, d, J = 8.5Hz, H-7), 6.24 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6), 5.24 (1H, dd , J = 15.0, 8.0 Hz, H-23), 5.16 (1H, dd, J = 15.0, 8.0 Hz, H-22), 3.99 (1H, m, H-3), 1.03 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-21), 0.94 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-28), 0.88 (3H, s, H-19), 0.86 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-26) , 0.83 (3H, s, H-18), 0.81 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-27), 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ),? 135.6 (C-23), 132.9 (C-23), 130.9 (C-7), 82.3 (C-5), 79.6 ), 51.3 (C-9), 44.7 (C-13), 43.0 (C-24), 39.9 , 34.9 (C-1), 33.2 (C-25), 30.3 (C-2), 28.8 20.1 (C-26), 19.8 (C-27), 18.3 (C-19), 17.7 (C-28), 13.0 (C-18).
5) ESI-MS) data at m/z 451 [M+Na]+ (calcd. for C28H4403 Na: 451)5) ESI-MS) data at m / z 451 [M + Na] + (calcd for C 28 H 44 0 3 Na:. 451)
6) 화합물에 대한 구조분석기술6) Structure analysis technology for compounds
1H NMR spectrum 을 통하여 6개의 메틸기(methyl groups)(δH = 1.03, 0.94, 0.88, 0.86, 0.83, and 0.81), 4개의 메틸렌 양성자 신호(methylene proton signals)(δH = 6.51, 6.24, 5.24 5.16)을 나타내었다. The methyl groups (δH = 1.03, 0.94, 0.88, 0.86, 0.83, and 0.81) and the four methylene proton signals (δH = 6.51, 6.24, 5.24, and 5.16) Respectively.
* 13C NMR spectrum을 통하여 28개의 탄소 신호를 발견했으며 7개의 메틸렌 탄소(methylene carbons)(δC = 39.5, 37.2, 34.9, 30.3, 28.8, 23.6 및 20.8), 5개의 메틴 탄소(methine carbons)(δC = 56.4, 51.9, 43.0, 39.9 및 33.2), 4개의 쿼터너리 탄소(quaternary carbons)(δC = 82.3, 79.6, 44.7 및 37.1), 6개의 메틸 탄소(methyl carbons)(δC = 21.0, 20.1, 19.8, 18.3, 17.7 및 13.0), 4개의 올레피닉 탄소(olefinic carbons)(δC = 135.6, 135.4, 132.5 및 130.9)을 확인하였다.
* 13 C NMR spectra revealed 28 carbon signals and 7 methylene carbons (δC = 39.5, 37.2, 34.9, 30.3, 28.8, 23.6 and 20.8) and 5 methine carbons = 56.4, 51.9, 43.0, 39.9 and 33.2), 4 quaternary carbons (delta C = 82.3, 79.6, 44.7 and 37.1), 6 methyl carbons (delta C = 21.0, 20.1, 18.3, 17.7 and 13.0) and four olefinic carbons (? C = 135.6, 135.4, 132.5 and 130.9).
준비예Preparation Example 1. 세포 배양 1. Cell culture
직경 100 ㎜ 배양 접시에 10%의 송아지 태아 혈청(fetal bovine calf serum, 웰진, 대구, 대한민국)와 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, 웰진, 대구, 대한민국)으로 Lonza (Walkersvill, MD, USA)에서 구입한 인간 섬유아세포를 1 ×105개로 분주하였다. 이후 37 ℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 3일 동안 배양하여 배양접시의 80 ~ 90%로 세포가 배양되면 2.5 × 트립신-에틸렌디아민사아세트산(EDTA; ethylenediaminetetraacetic acid) 용액 1 ㎖로 처리하여 세포를 분리하였다. 이후 분리한 세포의 일부는 송아지 태아 혈청과 DMEM을 포함하는 배양 접시에 계대배양하여 유지하였으며, 일부는 실험에 사용하였다. (Dulbecco's modified Eagle's medium, Wuljin, Daegu, Korea) and 10% fetal bovine calf serum (Weljin, Daegu, Korea) Human fibroblasts were divided into 1 × 10 5 cells. Then, the cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 3 days. When cells were cultured in 80-90% of the culture dish, the cells were treated with 1 ml of 2.5 × trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) . Some of the isolated cells were maintained on subculture in calf fetal serum and DMEM, and some of them were used in the experiment.
이후 실험에 사용한 세포는 아드리아마이신 처리를 위하여, 세포 배양액을 제거하고 배양된 세포를 수득하여 1% penicillin-streptomycin 용액(웰진, 대구, 대한민국)이 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후 500 nM 아드리아마이신(일동제약, 서울, 대한민국)을 4시간 동안 처리하였다.The cells used for the experiment were washed twice with DMEM medium containing 1% penicillin-streptomycin solution (Weljin, Daegu, Korea) for removal of the cell culture medium for treatment with adriamycin, (Myondong Pharmaceutical, Seoul, Korea) for 4 hours.
또한, 직경 100 ㎜ 배양 접시에 내피세포배양배지(Endotherial cell Growth Media)인 EGM-2(Lonza, Walkersvill, MD, USA)으로 Lonza에서 구입한 제대혈관세포를 배양한 것을 제외하고는 상기 인간 섬유아세포 배양과 동일한 방법으로 배양 및 수득하고, 아드리아마이신 처리하였다.The human fibroblast cells were cultured in a 100-mm diameter culture dish, except that umbilical vein cells purchased from Lonza were cultured with EGM-2 (Lonza, Walkersville, MD, USA) as an endothelial cell growth medium Cultured and harvested in the same manner as the culture, and treated with adriamycin.
상기 세포의 계대배양을 수행하면서 세포의 분열횟수를 population doublings(PDs)을 측정하여 구하였다. PD는 PD = log2F/log2I (F, final cell number; I, initial cell number)식을 사용하여 구하였으며, 인간 섬유아세포는 PD < 35, 제대혈관내피세포는 PD < 30의 세포를 아드리아마이신 처리에 사용하였으며, 복제노화가 유도된 늙은 세포는 인간 섬유아세포는 PD > 75, 제대혈관내피세포는 PD > 50의 세포를 사용하였다.
The number of cell divisions was determined by measuring population doublings (PDs) while subculturing the cells. PD was obtained by using the formula of PD = log 2 F / log 2 I (F, final cell number), and human fibroblasts were PD <35 cells and cord blood cells were PD <30 cells Adriamycin was used for the treatment of old age cells, and cells with PD> 75 for human fibroblasts and PD> 50 for umbilical cord blood were used.
실험예Experimental Example 2: 세포독성 측정 2: Cytotoxicity measurement
준비예 1에서 아드리아마이신 처리한 제대혈관내피세포에 1 ㎖의 2.5×트립신-EDTA를 처리하여, 제대혈관내피세포를 배양접시에서 분리하였다. 이후 분리한 세포를 50 ㎖ 튜브의 EGM-2 배양액에는 제대혈관내피세포가 10,000개/㎖가 되도록 분주한 후, 96-웰 배양용기의 각 웰(well)에 100 ㎕씩 분주하여, 각 웰당 제대혈관내피세포는 1,000개씩 분주하였다. In Preparative Example 1, adriamycin-treated cord blood cells were treated with 1 ml of 2.5 x trypsin-EDTA, and the cord blood cells were separated from the culture dish. Then, the separated cells were dispensed in a 50 ml tube of EGM-2 culture solution so that cells in the umbilical cord blood were 10,000 cells / ml, and 100 쨉 l were dispensed into each well of a 96-well culture container. The cells in the tube were divided into 1,000 cells.
이후 24 시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하여 각 웰에 EGM-2배양액을 100 ㎕ 첨가하였다.Then, the cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 24 hours, and 100 μl of EGM-2 culture was added to each well.
이후 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide; DMSO), n-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 5 mM, 라파마이(Rapamycin) 500 mM, 실시예 1-4에서 추출한 화합물 1 또는 비교예 1 내지 5의 화합물을 첨가하였다. 상기 실시예 1-4의 화합물 1 및 비교예 2의 화합물은 1 ㎍/㎖ 첨가하였다.Then, 5 mM dimethyl sulfoxide (DMSO), 5 mM N-acetylcysteine, 500 mM Rapamycin,
이후 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포의 성장 정도를 MTT 방법으로 확인하였다. 상기 MTT 방법은 구체적으로, 96 웰 배양용기의 각 웰에 0.1% MTT 용액(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)을 50 ㎕씩 넣고 3 시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 반응시켰다. 이후 배양액과 MTT용액을 제거하고 디메틸 셀폭사이드(dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 첨가하여 형성된 결정을 녹였다. 이후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 550 ㎚에서 흡광도를 측정하여 처리하였다. 측정 결과는 도 5에 나타냈다.
After incubation for 3 days in a 5
도 5에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1-4에서 수득한 화합물 1은 제대혈과내피세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.
As shown in Fig. 5, it was confirmed that
실험예Experimental Example 3: 혈관노화억제 활성 측정 3: Measurement of anti-aging activity of blood vessels
준비예 1에서 아드리아마이신 처리한 제대혈관내피세포 및 섬유아세포에 1 ㎖의 2.5×트립신-EDTA를 처리하여, 제대혈관내피세포 또는 섬유아세포를 배양접시에서 분리하였다. 이후 분리한 세포를 12 웰 배양용기 또는 24 웰 배양용기에 세포를 분주하였다. In Preparative Example 1, adriamycin-treated cord blood cells and fibroblasts were treated with 1 ml of 2.5 x trypsin-EDTA, and the cord blood cells or fibroblasts were separated from the culture dish. The cells were then divided into 12-well culture dishes or 24-well culture dishes.
구체적으로, 50 ㎖ 튜브에 10% 우태아혈청과 1% penicillin-streptomycin 용액 (웰진, 대구, 대한민국)가 포함된 DMEM 배양액에 준비예 1에서 수득한 섬유아세포을, EGM-2 배양액에는 준비예 1에서 수득한 제대혈관내피세포를 넣어 24 웰 배양용기의 각 웰에 세포와 배양액을 분주하였다. 최종적으로 12 웰 배양용기에는 각 웰당 섬유아세포는 5000개, 제대혈관내피세포는 7000개씩 분주하였고, 24 웰 배양용기에는 각 웰당 섬유아세포는 3000개, 제대혈관내피세포는 5000개씩 분주하였다. Specifically, the fibroblasts obtained in Preparation Example 1 were added to a DMEM culture medium containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin solution (Weljin, Daegu, Republic of Korea) in a 50 ml tube and in Preparation Example 1 for EGM- The cells and the culture medium were dispensed into each well of a 24-well culture container by placing the cells in the umbilical cord blood obtained. Finally, 5,000 fibroblasts per cell and 7,000 cells per umbilical cord were dispensed into a 12-well culture vessel. In a 24-well culture container, 3000 cells were injected per well and 5000 cells were injected into the umbilical cord blood.
이후 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 이후 각 웰에 10% 우태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액 또는 EGM-2 배양액을 갈아준 후, 시약을 처리하였다. The cells were cultured in a 5
상기 시약은 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide; DMSO), n-아세틸시스테인(N-acetylcysteine; NAC) 5 mM, 라파마이(Rapamycin) 500 mM, 실시예 1-4에서 추출한 화합물 1 또는 비교예 1 내지 5의 화합물을 첨가하였다. 상기 실시예 1-4의 화합물 1 및 비교예 1 내지 5의 화합물은 0.1 ㎍/㎖ 또는 1 ㎍/㎖ 첨가하였다.The above reagents were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), 5 mM N-acetylcysteine (NAC), 500 mM Rapamycin,
시약 첨가 이후 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포를 인산완충액으로 2번 세척하고, 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 1분간 고정한 후 고정액을 제거하였다. 이후 SA-b-gal 염색 용액(40 mM 시트르산/인산염(citric acid/phosphate)[pH 5.8], 5 mM 페로시안화칼륨(potassium ferrocyanide), 5 mM 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) 1 ㎎/㎖)을 12 웰 배양용기에는 각 웰 당 1000 ㎕ 또는 24 웰 배양용기에는 500 ㎕를 첨가하였다. After incubation for 3 days at 37 ° C in a 5
이후 SA-b-gal 염색 용액을 첨가한 배양용기를 은박지로 싸서 37 ℃에서 16 시간 동안 반응시키고, 인산완충용액(PBS)로 2번 세척한 후, 1% 에오진 용액(eosin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 1분간 염색하였다. 상기 염색 도중 결정이 생겼을 경우 DMSO로 결정을 녹여 제거하였다. 상기 염색 이후 인산완충용액으로 2회 세척 한 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하여 혈관세포 노화에 대한 효과를 조사하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 50 ~ 100개의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 백분율 (%)로 표시하였다. 광학현미경 관찰 결과 중 제대혈관내피세포는 도 6에, 섬유아세포는 도 7에 나타냈으며, 측정한 백분율 결과 중 제대혈관내피세포는 도 8에, 섬유아세포는 도 9에 나타냈다.
Subsequently, the culture container to which the SA-b-gal staining solution was added was wrapped in silver foil and reacted at 37 ° C for 16 hours, washed twice with phosphate buffered saline (PBS) , St. Louis, MO, USA) for 1 minute. When crystals were formed during the dyeing, crystals were dissolved by DMSO. After the staining, the cells were washed twice with phosphate buffer, and then blue-stained cells were observed under an optical microscope to examine the effect on vascular cell senescence. The degree of SA-β-gal activity was expressed in percentage (%) by measuring the number of cells stained blue in the cytoplasm among 50-100 cells in total. Among the results of the optical microscope observation, the cells in the umbilical cord blood were shown in Fig. 6, the fibroblasts in Fig. 7, and the percentage of the measured cells in the cord blood was shown in Fig. 8 and the fibroblasts in Fig.
도 6 및 도 8에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 화합물 1을 처리한 세포는 DMSO만을 처리한 세포에 비해 파란색으로 염색된 세포 수가 현저히 적었으며, 특히, 실시예 1의 화합물 1을 1 ㎍/㎖로 처리한 세포는 약 40% 가량 SA-b-Gal 활성이 감소하였으며, 이는 종래 공지된 혈관노화 활성 물질인 NAC 및 rapamvcin과 유사한 혈관노화 억제 활성을 확인한 것이다.As can be seen in Figures 6 and 8, the cells treated with
이를 토대로 본 발명의 화합물 1은 혈관내피세포 노화를 억제하여 혈관질환을 예방 또는 개선할 수 있음을 알 수 있다.
Based on this, it can be seen that
도 7 및 도 9에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1 내지 5의 화합물들은 아드리아마이신에 의해 유발된 SA-β-gal의 활성 저해 활성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
As can be seen in Figs. 7 and 9, it was confirmed that the compounds of Example 1 and Comparative Examples 1 to 5 do not have the activity inhibiting activity of SA-β-gal induced by adriamycin.
따라서, 본 발명의 화합물 1은 혈관내피세포 노화 억제활성을 가지며, 조직결합세포인 섬유아세포에는 노화 억제활성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이로 인해, 본 발명의 화합물 1은 혈관세포의 노화 억제에 현저한 효과를 가져 혈관질환 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
Thus, it was confirmed that the
이와 같이, 본 발명의 화합물 1은 높은 혈관노화 억제 활성이 있어 추후 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 혈관노화 억제용 약학적 조성물 및 건강기능성 식품 등의 여러 분야에서 활용가능성이 큰 물질임이 자명하다.
As described above, the
[[ 제조예Manufacturing example ]]
제조예Manufacturing example 1 : 약학적 조성물의 제조 1: Preparation of pharmaceutical composition
본 발명의 노루궁뎅이버섯 유래 물질인 화합물 1을 포함하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
The preparation examples of the pharmaceutical composition comprising the
제조예Manufacturing example 1-1. 1-1. 산제의Sanje 제조 Produce
화합물 1 2 g
유당 1 gLactose 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
The above components were mixed and packed in airtight bags to prepare powders.
제조예Manufacturing example 1-2. 정제의 제조 1-2. Manufacture of tablets
화합물 1 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎100 mg of milk
스테아린산 마그네 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
After mixing the above components, tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
제조예Manufacturing example 1-3. 캡슐제의 제조 1-3. Preparation of capsules
화합물 1 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎100 mg of milk
스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg of magnesium stearate
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
After mixing the above components, the capsules were filled in gelatin capsules according to the conventional preparation method of capsules.
제조예Manufacturing example 1-4. 환의 제조 1-4. Manufacture of rings
화합물 1 1 g
유당 1.5 gLactose 1.5 g
글리세린 1 gGlycerin 1 g
자일리톨 0.5 g0.5 g of xylitol
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
After mixing the above components, they were prepared so as to be 4 g per one ring according to a conventional method.
제조예Manufacturing example 1-5. 과립의 제조 1-5. Manufacture of granules
화합물 1 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎Soybean extract 50 mg
포도당 200 ㎎200 mg of glucose
전분 600 ㎎600 mg of starch
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
After mixing the above components, 100 mg of 30% ethanol was added and the mixture was dried at 60 캜 to form granules, which were then filled in a capsule.
제조예Manufacturing example 2 : 건강 기능성 식품의 제조. 2: Preparation of health functional foods.
제조예Manufacturing example 2-1. 건강 기능성 식품의 제조 2-1. Manufacture of Health Functional Foods
화합물 1 3000 ㎎
비타민 A 아세테이트 70 ㎍70 [mu] g of vitamin A acetate
비타민 E 1.0 ㎎Vitamin E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 ㎎0.13 mg vitamin B1
비타민 B2 0.15 ㎎0.15 mg of vitamin B2
비타민 C 10 ㎎10 mg vitamin C
비오틴 10 ㎍Biotin 10 μg
엽산 50 ㎍50 ㎍ of folic acid
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎Calcium pantothenate 0.5 mg
황산제1철 1.75 ㎎1.75 mg of ferrous sulfate
산화아연 0.82 ㎎0.82 mg of zinc oxide
탄산마그네슘 25.3 ㎎Magnesium carbonate 25.3 mg
제1인산칼륨 15 ㎎15 mg of potassium phosphate monobasic
구연산칼륨 90 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
Although the composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixture is relatively mixed with a suitable preparation for health food, the compounding ratio may be arbitrarily changed, and the above ingredients may be mixed according to a conventional method for producing healthy food , Granules can be prepared and used in the manufacture of health food compositions according to conventional methods.
제조예Manufacturing example 2-2. 건강 음료의 제조 2-2. Manufacture of health drinks
화합물 1 3 g
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g100 g of oligosaccharide
매실농축액 2 gPlum concentrate 2 g
타우린 1 gTaurine 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖Purified water was added to a total of 900 ml
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.The above components were mixed according to a conventional health drink manufacturing method, and the mixture was heated at 85 DEG C for about 1 hour with stirring, and the solution thus prepared was filtered to obtain a sterilized 2-liter container, which was sealed and sterilized, Of health functional beverage composition.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is relatively mixed with the ingredients suitable for the favorite beverage as a preferable preparation example, the blending ratio may be arbitrarily varied depending on the regional and national preference such as the demand class, the demanding country, and the use purpose.
Claims (10)
[화학식 1]
A pharmaceutical composition for preventing or treating dementia caused by vascular endothelial cell senescence, which comprises a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient and has a function of inhibiting SA-? -Galactosidase activity Or < / RTI >
[Chemical Formula 1]
The pharmaceutical composition for preventing or treating dementia according to claim 4, wherein the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is derived from a spore mushroom.
[화학식 1]
A pharmaceutical composition for preventing or treating dementia caused by vascular endothelial cell senescence, which comprises a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient and has a function of inhibiting SA-? -Galactosidase activity Or health functional food for improvement.
[Chemical Formula 1]
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