KR101629963B1 - cDNA microarray chip for a diagnosis of inflammatory disease - Google Patents

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Abstract

본 발명은 염증성 질환에서 특이적인 발현 양상을 보이는 유전자를 이용한 cDNA 마이크로어레이 칩, 상기 칩을 이용하여 염증 질환을 스크리닝하는 방법, 및 상기 칩을 이용한 염증성 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cDNA microarray chip using a gene showing a specific expression pattern in an inflammatory disease, a method for screening an inflammatory disease using the chip, and a method for screening a therapeutic agent for an inflammatory disease using the chip.

cDNA, 마이크로어레이, 염증질환, 염증성 질환 cDNA, microarrays, inflammatory diseases, inflammatory diseases

Description

염증성 질환 진단용 ｃＤＮＡ 마이크로어레이 칩{cDNA microarray chip for a diagnosis of inflammatory disease}{CDNA microarray chip for a diagnosis of inflammatory disease}

본 발명은 염증성 질환에서 특이적인 발현 양상을 보이는 유전자를 이용한 cDNA 마이크로어레이 칩, 상기 칩을 이용하여 염증 질환을 스크리닝하는 방법, 및 상기 칩을 이용한 염증성 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cDNA microarray chip using a gene showing a specific expression pattern in an inflammatory disease, a method for screening an inflammatory disease using the chip, and a method for screening a therapeutic agent for an inflammatory disease using the chip.

염증(inflammation)이란 생체에 유해한 자극으로 생기는 생체 조직의 반응을 총괄하는 개념으로서, 병의 경과에 따라 급성 염증과 만성 염증으로 나뉘며, 원인에 따라 병원균에 의한 염증, 이물질에 의한 염증, 생체 내의 이상에 의하여 생기는 염증 등으로 나뉜다. 일반적으로 염증은 여러 질환에 동반되는 증상이며, 만성 염증성 질환으로 분류되는 류마티스 관절염, 아토피, 알레르기 등은 그 병인은 다르지만 만성적인 염증을 동반하는 공통적인 특징을 가지고 있다.Inflammation is a concept that collectively refers to the reaction of living tissues caused by harmful stimuli to the living body. It is divided into acute inflammation and chronic inflammation according to the progress of the disease. Inflammation caused by pathogenic bacteria, inflammation caused by foreign substances, And inflammation caused by inflammation. In general, inflammation is a symptom accompanied by various diseases. Rheumatoid arthritis, atopy, and allergy classified as chronic inflammatory diseases have a common characteristic accompanied by chronic inflammation although their etiologies are different.

지금까지 염증은 여러 원인이 관여하는 것으로 연구되어 왔으나, 최근에는 염증 관련 유전자들의 역할이 분자 생물학적 수준에서 밝혀지고 있으며, 약물치료 의 타겟 선정이나 치료제 개발에서 관련 유전자의 규명이 매우 중요하게 평가되고 있다. 따라서 염증에 관여하는 치료제 개발을 위한 약물 스크리닝에서 관련 유전자의 발현 정도의 차이를 밝히는 일은 염증성 질환의 진단, 치료, 예방 등에 있어서 매우 중요한 사항으로 평가받고 있다.So far, inflammation has been studied as involving several causes, but recently the role of inflammation related genes has been revealed at the molecular level, and the identification of related genes has been highly evaluated in the target selection of drug therapy or the development of therapeutic agents . Therefore, identification of differences in the expression level of related genes in drug screening for the development of therapeutic agents involved in inflammation is considered to be very important in the diagnosis, treatment and prevention of inflammatory diseases.

DNA 마이크로어레이 시스템은 어레이상에 집적된 생분자(bio-molecules)에 따라 cDNA 마이크로어레이, 올리고뉴클레오타이드 마이크로 어레이 및 게놈 마이크로어레이로 분류된다. 그 중 cDNA 마이크로어레이는 제작이 간편하며, 콘텐츠의 확보와 이에 따른 질병 특이적 칩을 제작함으로써 효과적으로 질병의 유무를 판단할 수 있게 한다.DNA microarray systems are classified into cDNA microarrays, oligonucleotide microarrays and genomic microarrays, depending on the bio-molecules integrated into the array. Among them, the cDNA microarray is easy to manufacture, and it can effectively determine the presence or absence of diseases by securing contents and producing disease-specific chips accordingly.

따라서 염증을 스크리닝할 수 있도록 고안된 cDNA 칩(chip)은 염증 질환의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 칩의 사용으로 염증에 관여하는 유전자 발현의 변화를 측정하는 한편, 염증반응에 있어서의 신호전달 메카니즘(mechanism)까지 확인할 수 있게 되어, 염증 관련 질환의 연구 및 치료에 있어서 유용한 도구로 사용될 수 있다. 그러나 아직까지 염증 관련 칩의 제작에 있어서는 현재까지 체계적이고 유용한 칩이 개발되지 않은 상태이다,Therefore, a cDNA chip designed to screen inflammation can be used for diagnosis and treatment of inflammatory diseases. The use of such a chip can measure a change in gene expression involved in inflammation, Signal transduction mechanism, which can be used as a useful tool in the study and treatment of inflammation related diseases. However, until now, systematic and useful chips have not yet been developed in the production of inflammation related chips,

이에 본 발명자들은 염증성 질환의 스크리닝 및 상기 질환에 대한 치료제 개발을 위한 효과적인 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 마이크로어레이 분석 방법에 의하여 염증성 질환에서만 특이적으로 발현이 증가 또는 감소하는 유전자들을 동정할 수 있음을 밝혀내고, 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have made efforts to find an effective method for the screening of inflammatory diseases and the development of therapeutic agents for the diseases. As a result, it is possible to identify genes whose expression is specifically increased or decreased only in inflammatory diseases by microarray analysis And completed the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 염증성 질환에서 특이적인 발현 양상을 보이는 유전자를 이용한 cDNA 마이크로어레이 칩을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a cDNA microarray chip using a gene having a specific expression pattern in an inflammatory disease.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 칩을 이용한 염증 질환의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a method for screening an inflammatory disease using the chip.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 마이크로어레이 칩을 이용하여 염증성 질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for screening an agent for treating inflammatory diseases using the microarray chip.

하나의 양태로서, 본 발명은 염증성 질환에서 특이적으로 발현 증가되거나 감소되는 유전자의 cDNA를 배열시킨 염증 질환 진단용 cDNA 마이크로어레이 칩(microarray chip)을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a cDNA microarray chip for diagnosing inflammatory diseases in which cDNAs of genes whose expression is specifically increased or decreased in inflammatory diseases are arranged.

본 발명의 염증성 질환이란 염증을 수반하는 모든 질환을 의미하며, 당업계에서 통용되는 모든 염증성 질환이 본 발명의 영역에 포함될 수 있다. 바람직하게 염증성 질환은 류마티즘 관절염, 알레르기, 아토피 및 천식 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. The inflammatory disease of the present invention means all diseases accompanied by inflammation, and all inflammatory diseases commonly used in the art can be included in the scope of the present invention. Preferably, the inflammatory disease includes, but is not limited to, rheumatoid arthritis, allergy, atopy and asthma.

본 발명의 염증성 질환에서 특이적인 발현 양상을 보이는 유전자란, 다른 정상 세포에서와는 달리 염증성 질환을 나타내는 세포에서 특이적으로 발현이 증가하거나 감소하는 유전자를 의미한다. 이러한 유전자는, 케모카인 (Chemokine) 및 이들의 수용체, 인터루킨 시리즈(interleukin series), TGF-β NFκB, TNF 리간드 및 수용체, 전사 인자(transcription factor), 세포 사멸 경로(apoptosis pathway) 관련 유전자 등이 있으며, 바람직하게는 하기 표 2에 개시된 유전자이다.A gene having a specific expression pattern in the inflammatory disease of the present invention means a gene whose expression is increased or decreased specifically in a cell showing an inflammatory disease different from other normal cells. These genes include chemokine and its receptor, interleukin series, TGF-β NFκB, TNF ligand and receptor, transcription factor, and apoptosis pathway-related genes, Preferably, the genes are those shown in Table 2 below.

발현이 2배 이상 증가한 유전자Genes with more than 2-fold increase in expression 발현이 2배 이상 감소한 유전자Genes whose expression is reduced more than 2-fold EHD1 TBC1D20 CD14 PRDX5 CUGBP1 METRNL SEMA3E DGKA ISG15 RIOK3 FTMT FTH1 UHMK1 ARIH2 RRAGD GADD45A PTPN11 FABP5 YPEL3 CRCT1 ZFAND5 ZFAND5 CAND1 FLJ40319 PMP22 FLJ43855 C6orf106 PANX3 SFTPC DDIT4 RPS3A HBM C1QTNF5 VIM GLTSCR1 TMSL3 PLXNA1 TMSL3 TMSB4X FOLR2 OSBPL8 HRASLS5 GGNBP2 EEF1A1 MAGT1 CDK5R2 ERO1L CRHR2 WHSC1 UCN2 RPLP0 PLK2 UBC PLOD3 C17orf48 ZFAND5 ESD BASP1 ODC1 FTH1 SNTA1 PLAGL2 ZFAND5 EEF1A1 FTH1 ALG1 EEF1A1 CAV1 RPLP1 ELF5 SOD2 FTH1 COX6B2 PALM2-AKAP2 COL6A3 CXCL3 HMGA2 RPLP0 UBB HECTD2 CEBPB KRT10 OR5H1 KBTBD2 BCL2L1 RORC WWTR1 SLC29A4 UPP1 UBC PRDX1 UBB APCS TNK2 AQP1 FAM126A MAGEC2 MARCKSEHD1 TBC1D20 CD14 PRDX5 CUGBP1 METRNL SEMA3E DGKA ISG15 RIOK3 FTMT FTH1 UHMK1 ARIH2 RRAGD GADD45A PTPN11 FABP5 YPEL3 CRCT1 ZFAND5 ZFAND5 CAND1 FLJ40319 PMP22 FLJ43855 C6orf106 PANX3 SFTPC DDIT4 RPS3A HBM C1QTNF5 VIM GLTSCR1 TMSL3 PLXNA1 TMSL3 TMSB4X FOLR2 OSBPL8 HRASLS5 GGNBP2 EEF1A1 MAGT1 CDK5R2 ERO1L CRHR2 WHSC1 UCN2 RPLP0 PLK2 UBC PLOD3 C17orf48 ZFAND5 ESD BASP1 ODC1 FTH1 SNTA1 PLAGL2 ZFAND5 EEF1A1 FTH1 ALG1 EEF1A1 CAV1 RPLP1 ELF5 SOD2 FTH1 COX6B2 PALM2-AKAP2 COL6A3 CXCL3 HMGA2 RPLP0 UBB HECTD2 CEBPB KRT10 OR5H1 KBTBD2 BCL2L1 RORC WWTR1 SLC29A4 UPP1 UBC PRDX1 UBB APCS TNK2 AQP1 FAM126A MAGEC2 MARCKS SUZ12 AKR7A3 FOS APBA3 DARS PSMB9 RPP40 NKRF PARP1 SNRPF FKBP3 AHSA1 NUTF2 TOP2B BUB1 IDH2 ENO3 MZF1 ETF1 ALG8 ID3 TBX3 NOLC1 MRPL49 SDHD TFAP4 GALK1 RAD1 VDAC1 TUBE1 ARD1A CCDC85B CSK THOC4 TRIM25 SSB BCS1L SNRPB ASAHL TRAF4 GPS1 POLE EXOSC8 POLE2 BUB1B BRD1 SLC36A1 DHX16 CPSF1 MAGOH STMN1 PPIH PDS5B CDC14B RAD51C APPBP2 FZD7 PATZ1 SLC44A1 EHMT1 HMGB3 OLFM1 RP2 GNB1 CBX5 ITSN1 CUX1 KIF20A EZH2 RTDR1 NF2 NR1D2 TUBB2C ORC5L NF2 GLI4 RBBP6 FH SP100 NAB2 CA12 COPE CEBPA FHOD1 PRMT1 PKMYT1 PMS1 SFRS3 PROKR1 PURA MLF1 TAF2 CRIP1 FUBP1 HNRNPR ORC1L UCP2 RAD51L1 SFRS1 SFRS1 HNRNPU ASPM PRPF19 LMO2 GEMIN6 LSM2 AAAS TADA2L CAND1 WHSC1 HCLS1 LAGE3 RAD54L RNF111 SFRS2 FBL NHP2L1 HMX1 SORL1 SLC3A2 GPHN AATF TRIM28 MCM7 PMS2 WDR6 PNN RAB2A NAGPA KITLG RFC1 NONO LMNA TMED1 IDH3A PRDX2 HNRNPU THOC2 SHMT1 EXOSC5 CUX1 PA2G4 MECP2 NDRG2 PPP2R5D STIP1 POLR2L OAS3 HTRA2 HNRPH1 SRF HIPK3 CLEC2D SLC4A7 AMD1 SF3A1 PMS2 ACAA1 EWSR1 THOC4 SFRS9 SREBF1 UNG MED22 PPP1R12A NOLA2 PA2G4 VEZF1 ARID1A STX16 PITPNA GTF2I KIF2A PRKAR2A SNRPD1 HMGN2 SF3B3 HNRNPA1 RBMX TFDP1 ACO2 HMGN2 PHF6 ETV5 PTGES3 SSB HMGN2 HNRNPA1 RBMX SF3A3SUZ12 AKR7A3 FOS APBA3 DARS PSMB9 RPP40 NKRF PARP1 SNRPF FKBP3 AHSA1 NUTF2 TOP2B BUB1 IDH2 ENO3 MZF1 ETF1 ALG8 ID3 TBX3 NOLC1 MRPL49 SDHD TFAP4 GALK1 RAD1 VDAC1 TUBE1 ARD1A CCDC85B CSK THOC4 TRIM25 SSB BCS1L SNRPB ASAHL TRAF4 GPS1 POLE EXOSC8 POLE2 BUB1B BRD1 SLC36A1 DHX16 CPSF1 MAGOH STMN1 PPIH PDS5B CDC14B RAD51C APPBP2 FZD7 PATZ1 SLC44A1 EHMT1 HMGB3 OLFM1 RP2 GNB1 CBX5 ITSN1 CUX1 KIF20A EZH2 RTDR1 NF2 NR1D2 TUBB2C ORC5L NF2 GLI4 RBBP6 FH SP100 NAB2 CA12 COPE CEBPA FHOD1 PRMT1 PKMYT1 PMS1 SFRS3 PROKR1 PURA MLF1 TAF2 CRIP1 FUBP1 HNRNPR ORC1L UCP2 RAD51L1 SFRS1 SFRS1 HNRNPU ASPM PRPF19 LMO2 GEMIN6 LSM2 AAAS TADA2L CAND1 WHSC1 HCLS1 LAGE3 RAD54L RNF111 SFRS2 FBL NHP2L1 HMX1 SORL1 SLC3A2 GPHN AATF TRIM28 MCM7 PMS2 WDR6 PNN RAB2A NAGPA KITLG RFC1 NONO LMNA TMED1 IDH3A PRDX2 HNRNPU THOC2 SHMT1 EXOSC5 CUX1 PA2G4 MECP2 NDRG2 PPP2R5D STIP1 POLR2L OAS3 HTRA2 HNRPH1 SRF HIPK3 CLEC2D SLC4A7 AMD1 SF3A1 PMS2 ACAA1 EWSR1 THOC4 SFRS9 SREBF1 UNG MED22 PPP1R12A NOLA2 PA2G4 VEZF1 ARID1A STX16 PITPNA GT F2I KIF2A PRKAR2A SNRPD1 HMGN2 SF3B3 HNRNPA1 RBMX TFDP1 ACO2 HMGN2 PHF6 ETV5 PTGES3 SSB HMGN2 HNRNPA1 RBMX SF3A3

cDNA는 게놈 DNA (genomic DNA)와는 달리 인트론(intron)이 존재하지 않는 DNA로서, 게놈 DNA에서 전사과정(transcription)을 거쳐 생성된 mRNA를 이용하여 이에 상보적인 DNA를 제조할 수 있는데 이것을 cDNA라고 한다. 이렇게 제조된 cDNA는 여러 곳에 사용될 수 있으며, 그 중 가장 대표적인 것이 cDNA 마이크로어레이(microarray)이다.Unlike genomic DNA, cDNA is a DNA that does not have an intron. Using mRNA generated through transcription in genomic DNA, it is possible to produce complementary DNA, which is called cDNA . The cDNA thus prepared can be used in various places, and a typical example thereof is a cDNA microarray.

cDNA 마이크로어레이란, cDNA가 직접 슬라이드에 붙어 있는 형태의 마이크로어레이로써, 슬라이드에 부착된 단일 가닥의 cDNA에 샘플에서 추출한 mRNA를 혼성화 (hybridization) 시키는 과정을 통해 해당 cDNA와 동일한 서열의 mRNA 발현이 이루어지고 있는지를 확인할 수 있는 칩(chip)이다. 이러한 cDNA 마이크로어레이를 제작하기 위하여는 역전사효소를 이용하여 cDNA를 제작하는 단계 및 이중 가닥의 cDNA에서 한 가닥을 떼어내는 과정 등이 필요하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Raw 264.7 세포주에 LPS로 염증반응을 유도하고, 상기 염증 반응이 유도된 세포를 선별한 후, 해당 세포로부터 RNA를 수득하고, 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 제작하는 한편, 상기 cDNA를 이용하여 마이크로어레이를 수행하였다.The cDNA microarray is a microarray in which the cDNA is directly attached to the slide. The mRNA extracted from the sample is hybridized with the single-stranded cDNA attached to the slide, It is a chip that can confirm whether or not it is losing. In order to produce such a cDNA microarray, it is necessary to prepare a cDNA using a reverse transcriptase and to remove a strand from the double-stranded cDNA. In a preferred embodiment of the present invention, the Raw 264.7 cell line is induced with an LPS-induced inflammatory response, the cells in which the inflammatory reaction is induced are selected, RNA is obtained from the cell, cDNA is prepared using reverse transcriptase, The microarray was performed using the cDNA.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 염증성 질환 진단용 cDNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 염증 질환을 스크리닝하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for screening an inflammatory disease using a cDNA microarray chip for diagnosing an inflammatory disease.

염증 질환에 대한 스크리닝은, 염증반응 촉진 인자를 세포에 노출시킨 후 발현이 유의성 있게 증가한 유전자를 선별하는 과정을 예로 들 수 있으나, 상기 방법에 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 통상적으로 이용되는 유전자의 발현을 이용한 스크리닝 방법을 모두 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 염증 유도 인자 중 하나인 LPS를 Raw 246.7 세포주에 처리하여 염증반응을 유도하고, 상기 반응에 의하여 유전자의 발현이 2배 이상 증가 또는 2배 이상 감소한 유전자군을 염증 질환 여부를 판단할 수 있는 염증 질환 스크리닝의 인자로 판단하여 실험을 수행하였다.Screening for inflammatory diseases includes, but is not limited to, the process of selecting genes whose expression is significantly increased after exposing the cells to an inflammatory response promoting factor, but the method is not limited to the above method, and a gene commonly used in the art And screening methods using expression. In a preferred embodiment of the present invention, the Raw 246.7 cell line is treated with LPS, which is one of the inflammation inducing factors, to induce an inflammatory reaction. The gene group in which the expression of the gene is increased more than 2 times or more than 2 times by the above- The results of this study were as follows.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 염증성 질환 진단용 cDNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 염증성 질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for screening a therapeutic agent for an inflammatory disease using a cDNA microarray chip for diagnosing an inflammatory disease.

본 발명은, 마이크로어레이 분석법이 정상 세포와 염증 세포를 그 유전자의 발현 양상에 기초하여 구분하는데 유효한 수단으로서 이용될 수 있다. 즉, 마이크로어레이 분석법을 이용하여 염증 세포에 특이적이거나 과발현되는 유전자를 동정하는 한편, 동정된 유전자를 표적 유전자로 하여 염증 질환의 치료제 개발의 기초적인 자료를 제공할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 분석법에 의해서 과발현되는 것으로 확인된 유전자들이 염증반응에 직접적으로 관련되어 있는지의 여부에 관한 연구를 추가적으로 수행할 수 있게 되며, 이들 유전자 발현 양상을 분석함으로써 염증 질환에 대한 관련성, 조기 예측 등을 가능하게 할 수 있다.The present invention can be used as an effective means for distinguishing between normal cells and inflammatory cells based on the expression pattern of the gene, by microarray analysis. Namely, the microarray analysis method can be used to identify genes that are specific or overexpressed in inflammatory cells, while using the identified genes as target genes, basic data for the development of therapeutic agents for inflammatory diseases can be provided. In addition, studies on whether genes over-expressed by microarray analysis are directly related to the inflammatory response can be additionally performed. By analyzing the expression pattern of these genes, it is possible to determine the relevance to inflammatory diseases, early prediction And so on.

따라서 cDNA 마이크로어레이 분석법을 이용함으로써 짧은 시간 동안 염증 세포에서의 모든 유전자 발현 양상을 동시에 모니터할 수 있고, 표적 유전자의 선정을 쉽게 할 수 있게 되어 결과적으로 상대적으로 짧은 시간 동안에 많은 약물의 개발을 가능하게 할 수 있게 된다.Therefore, by using cDNA microarray analysis, it is possible to simultaneously monitor all gene expression patterns in inflammatory cells for a short period of time, and to easily select a target gene, resulting in the development of many drugs in a relatively short time .

바람직한 양태로서, 상기 염증성 질환 치료제의 스크리닝은 유전자 수준에서 염증성 질환을 완화시키는 양상을 확인할 수 있는 모든 치료제에 대한 스크리닝을 의미한다. 바람직한 양태로서 상기 스크리닝 방법은 cDNA 마이크로어레이 칩을 이용한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide), 펩티드 (peptide), 작은 분자의 화합물(small molecule compound), 항체(antibody) 및 상기 표적 유전자의 프로모터에 결합하여 유전자 발현량을 조절하는 물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 통상적으로 인식되는 유전자 수준의 발현 조절 수단에 관련된 모든 치료 물질을 포함할 수 있다.In a preferred embodiment, the screening of the therapeutic agent for an inflammatory disease refers to screening for any therapeutic agent capable of confirming the manner of alleviating the inflammatory disease at the genetic level. In a preferred embodiment, the screening method includes an antisense oligonucleotide, a peptide, a small molecule compound, an antibody, and a promoter of the target gene using a cDNA microarray chip, Including, but not limited to, a substance that modulates expression level, and may include any therapeutic substance related to a gene-level expression control means ordinarily recognized in the art.

예들 들어 염증 세포에서 과발현되는 유전자의 전사 또는 번역을 억제하기 위하여, 과발현되는 유전자의 염기서열에 기초하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있으며, 이를 염증 치료제로 이용할 수 있다. 설계된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 세포 내로 침투시키기 위하여는 당업계에서 통상적으로 공지된 기술을 제한 없이 이용할 수 있으며, 하나의 예로서 리포펙틴 또는 리포펙타민으로 포장(packaging)시키고, 포장된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 세포 내로 주입시켜 표적 유전자의 발현량을 감소시킴으로써 염증 반응을 완화시킬 수 있다.For example, antisense oligonucleotides can be designed based on the nucleotide sequence of an overexpressed gene in order to inhibit transcription or translation of a gene overexpressed in inflammatory cells, which can be used as an inflammation therapeutic agent. In order to infiltrate the designed antisense oligonucleotides into cells, techniques commonly known in the art can be used without limitation, as one example, packaging with lipofectin or lipofectamine, and packaging antisense oligonucleotides into cells To reduce the expression level of the target gene, thereby alleviating the inflammatory response.

본 발명의 cDNA 마이크로어레이 칩을 이용하는 경우, 대상에 있어서 염증 관련 질환에 대한 관련성 및 조기 진단 정보를 얻을 수 있으며, 나아가 염증성 질환에 대한 체계적인 진단 및 예측을 가능하게 하여 유전자 발현과 관련된 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.When the cDNA microarray chip of the present invention is used, it is possible to obtain relevance and early diagnosis information on an inflammation-related disease in a subject, and to systematically diagnose and predict an inflammatory disease, thereby being useful for developing a therapeutic agent related to gene expression Lt; / RTI >

실시예1Example 1 : 염증 관련 칩 : Inflammation related chip DNADNA 제작을 위한 유전자 선별 Genetic screening for production

협력 기관인 경희대 의대로부터 Genecards 및 기타 데이터베이스를 이용하여 검색된 염증 관련 유전자 리스트 중, 총 500개의 유전자를 칩 제작용 컨텐츠로 적용하였다. 칩 제작용 컨텐츠는 하기의 표 2에 나타내었다.A total of 500 genes from the list of inflammation related genes searched by the cooperating agency Kyunghee University Medical College using genecards and other databases were applied as content for chip production. The contents for chip fabrication are shown in Table 2 below.

칩 제작 후보로서의 염증 관련 유전자 목록List of inflammation related genes as candidates for chip production ABCA1 / ABCB7/ ABP1 / AGER / AGK / AGPAT1 / AGRP / AGT / AGTR1 / AGTR2 / ASS1 / BDKRB1 / BDKRB2 / BDNF / BMP2 / BMP4 / BMP6 / BMP7 / BMPR1A / BMPR1B / BMPR2 / BPI / BTG2 / BTK / BTNL2 / C2 / CBL / CD14 / CD160 / CD163 / CD1D / CD2 / CD209 / CD274 / CD28 / CD34 / CD36 / CD38 /CD40 / CD40LG / CD44 / CD46 / CD47 / CD55 / CD58 / CD59 / CD63 / CD68 / CD69 / CD79A / CD80 / CD86 / CD8A / CD93 / CD96 / CD97 / CDC25B / CDH5 / CDK2 / CDKN3 / CEACAM4 / CEACAM8 / CEBPA / CEBPB / CEBPD / CERK / CETP / CR1 / CR2 / CRABP1 / CRAT / CREB1 / CRH / CRHBP / CRHR1 / CRHR2 / CRIP1 / CRIP2 / CRISP3 / CRK / CRP / CRYAB / CYBB / CYP19A1 / CYP1A1 / CYP1A2 / CYP27B1 / CYP2A6 / CYP2B6 / CYP2E1 / CYP3A4 / CYP4F2 / CYP4F3 / CYP7A1 / CYR61 / CYSLTR1 / CYSLTR2 / DCN / DDC / DDT / DPEP1 / DPP4 / DSP / DUSP1 / DUSP19 / DYSF / E2F1 / E2F5 / EEF1A1/ EGFR / EGR1 / ENG / ENTPD1 / ENTPD2 / ERAF / ERBB3 / EREG / ERVWE1 / F10 / F11R / F7 / F8 / FAAH / FABP1 / FABP3 / FABP4 / FANCC / FAS / FASLG / FASN / FBN1 / FBXO32 / FGB / FGF1 / FGF10 / FGF2 / FGF7 / FGFR1 / FGFR2 / FIGF / FMOD / FSCN1 / FST / FTL / G6PC / GABPA / GAD1 / GAD2 / GADD45G / GAL / GALR1 / GAP43 / GAPDH / GAS6 / GATA2 / GATA3 / GC / GCG / GCH1 / GCNT1 / GIF / GJA1 / GLS / GLUD1 / GLUL / GPI / GPR151 / GPR44 / GPR84 / GPT / GPX3 / GPX4 / GSK3B / GSN / GSS / GSTA1 / GSTM2 / GSTP1 / GSTT1 / GZMB / H6PD / HBB / HBEGF / HBG2 / HDAC1 / HDAC2 / HDAC7A / HDAC9 / HDC / HK2 / HMGB1 / HMGCR / HMOX1 / HMOX2 / HNF4A / HNRPL / ICAM1 / ICAM2 / ICAM3 / ICOS / ICOSLG / ID1 / IDUA / IL12B / IL12RB1 / IL12RB2 / IL13RA1 / IL15 / IL16 / IL17A / IL17B / IL17RA / IL18 / IL1A / IL1R1 / IL1RAP / IL1RAPL2 / IL2 / IL22RA2 / IL24 / IL25 / IL2RA / IL31 / IL7 / IL8 / ITGA1 / ITGA2 / ITGA3 / ITGA4 / ITGA5 / TGA6 / ITGAL / ITGAM / ITGAV / ITGAX / ITGB1 / ITGB2 / ITGB3 / ITGB4 / ITGB6 / ITGB7 / ITK / JAK2 / JAK3 / JAM3 / JMJD6 / JPH4 / KNG1 / LALBA / LAMA2 / LARGE / LCAT / LCN1 / LCN2 / LDHA / LDHB / LDLR / LEP / LEPR / LSL / LST1 / LTA / LTA4H / LTB / LTB4DH / LTB4R / LTB4R2 / LTBR / LTC4S / LTF / MB / MBL2 / MBP / MC1R / MC3R / MC4R / MCAM / MCL1 / MDK / MEF2A / MEF2C / MEFV / MERTK / MGP / MNDA / MRC1 / MS4A1 / MS4A2 / MSBP1 / MSBP2 / MSN / MSR1 / MST1 / MST1R / MUC2 / MUC3A / MUC5AC / MUC6 / MX1 / NAGLU / NAIP / NCAM1 / NCOA1 / NCOA6 / NCOR2 / NCR3 / NDUFS4 / NDUFV1 / NF1 / NFATC1 / NFE2L2 / NFKB1 / NFKBIA / NFKBIB / NLF1 / NLF2 / NLRC3 / NLRC4 / NLRP1 / NLRP10 / NLRP11 / NLRP12 / NLRP13 / NLRP14 / NLRP2 / NLRP2P / NLRP3 / NLRP3P / NLRP4 / NLRP5 / NLRP6 / LRP7 / NLRP8 / NLRP9 / NLRP9P / NLRX1 / NOD1 / NOD2 / NOG / NOS1 / NOS2A / NOS3 / NOTCH1 / NOX1 / NQO1 / NT5E / NTAN1 / NTF3 / NTRK2 / NTRK3 / NTS / NTSR1 / OLIG2 / OLR1 / P2RX3 / P2RX7 / P2RY2 / PADI4 / PAEP / PAFAH1B1 / PAM / PAPPA / PARP1 / PBEF1 / PHB / PI3 / PIAS1 / PIGF / PIGR / PIK3C2A / PIK3CA / PIK3CB / PIK3CD / PIK3CG / PMCH / PML / PMP2 / PNOC / PPARA / PPARD / PPARG / PPARGC1A / PPBP / PPIG / PPM2C / PPP2R4 / PTAFR / PTGDR / PTGDS / PTGER1 / PTGER2 / PTGER3 / PTGER4 / PTGES / PTGES2 / PTGES3 / PTGFR / PTGIR / PTGIS / PTGS1 / PTGS2 / PTHLH / PTK2 / PTK2B / PTMA / PTN / PTPN11 / PTPN6 / PTPRC / PTS / PTX3 / PXN / PYCARD / PYY / RCAN1 / RECK / REG1A / REG3A / REL / RELA / RELB / REN / RETN / RETNLB / RHO / RHOA / RHOD / S100A11 / S100A12 / S100A13 / S100A6 / S100A7 / S100A7A / S100A8 / S100A9 / SAA1 / SAA2 / SAA3P / SAA4 / SAA@ / SAG / SAT1 / SCD / SCG2 / SCG5 / SCGB1A1 / SCGB3A2 / SCYE1 / SHC1 / SSB / SST / SSTR2 / SULT1A3 / SUMF1 / SYK / T / TCN2 / TDO2 / TGFB1 / TGFB2 / TGFB3 / TGFBR2 / TGIF1 / TGM1 / TGM2 / TH / THBD / THBS1 / THBS2 / THPO / THY1 / TKT / TLR2 / TLR3 / TLR4 / TLR5 / TLR7 / TLR8 / TLR9 / TOLLIP / TWIST1 / TXN / TXNDC3 / TXNIP / UCN / UCN2 / UCN3 / UCP1 / UCP2 / UCP3 / UMOD / VCAM1 / VCAN / VDAC1 / VDR / VEGFA / VEGFB / VEGFC / VWF / WARSBMPR1A / BMPR1B / BMPR2 / BPI / BTG2 / BTK / BTNL2 / BMPR1 / AGTR1 / AGTR2 / ASS1 / BDKRB1 / BDKRB2 / BDNF / BMP2 / BMP4 / BMP6 / BMP7 / BMPR1A / ABC1 / CD69 / CD69 / CD79 / CD79 / CD40 / CD40 / CD40 / CD44 / CD46 / CD47 / CD55 / CD58 / CD59 / CD63 / CD68 / CD69 / CRHR1 / CRHR1 / CRHR1 / CRHR1 / CRHR1 / CRHR1 / CRBP1 / CRB / CRB / CYP3A4 / CYP4F2 / CYP4F3 / CYP7A1 / CYR61 / CYSLTR1 / CYSLTR2 / DCN / DDC / CYP1A2 / CYP27A1 / CYP2A6 / CYP2A6 / CYP2A6 / CYP2A6 / CYP2A6 / CYP2A6 / CRYPR2 / CRIP1 / CRIP2 / CRISP3 / CRK / CRP / CRYAB / CYBB / CYP19A1 / FABP1 / FABP1 / FABP3 / ESP1 / DPP4 / DSP / DUSP1 / DUSP19 / DYSF / E2F1 / E2F5 / EEF1A1 / EGFR / EGR1 / ENG / ENTPD1 / ENTPD2 / ERAF / ERBB3 / EREG / ERVWE1 / F10 / F11R / F7 / FABP4 / FANCC / FAS / FASLG / FASN / FBN1 / FBXO32 / FGB / FGF1 / FGFR1 / FGFR2 / FIGF / FMOD / FSCN1 / FST / FTL / G6PC / GABPA / GAD1 / GAD2 / GADD45G / GAL / GALR1 / GAP43 / GAPDH / GAS6 / GATA2 / GATA3 / GC / GCG / FGF1 / GCH1 / GCNT1 / GIF / GJA1 / GLS / GLUD1 / GLUL / GPI / GPR151 / GPR44 / GPR84 / GPT / GPX3 / GPX4 / GSK3B / GSN / GSS / GSTA1 / GSTM2 / GSTP1 / GSTT1 / GZMB / H6PD / IL15RB1 / IL13RA1 / IL15 / IL15R / IL12RB1 / IL15R / IL12RB1 / HD15 / HD15 / ILGA / IL17B / IL17RA / IL18 / IL1A / IL1R1 / IL1RAP / IL1RAPL2 / IL2 / IL22RA2 / IL24 / IL25 / IL2RA / IL31 / IL7 / IL8 / ITGA1 / ITGA2 / ITGA3 / ITGA4 / ITGA5 / TGA6 / ITGAL / LDH / LDLR / LEP / LCA1 / LCN2 / LDA / LCG1 / LCA2 / LDA / LCA2 / LDA / LCG1 / LAG / LCGA / LEPR / LSL / LST1 / LTA / LTA4H / LTB / LTB4DH / LTB4R / LTB4 MSN / LTBR / LTC4S / LTF / MB / MBL2 / MBP / MC1R / MC3R / MC4R / MCAM / MCL1 / MDK / MEF2A / MEF2C / MEFV / MERTK / MGP / MNDA / MRC1 / MS4A1 / MS4A2 / MSBP1 / NFLB1 / NLF1 / NLF2 / NFKB1 / NFLB2 / NFKB1 / NFLB1 / NFLB2 / NFLB1 / NFLB1 / NFLB1 / NLRP4 / NLRP4 / NLRP9 / NLRP1 / NOD1 / NOD2 / NOG / NOS1 / NOS2A / NLRP2 / NLRP2 / NLRP3 / NLRP4 / PBF1 / PHB / PI3 / NTS3 / P2RX7 / P2RY2 / PADI4 / PAEP / PAFAH1B1 / PAM / PAPPA / PARP1 / NBO1 / NT3 / PTGER2 / PTGER2 / PTGER2 / PIG3 / PIK3CB / PIK3CD / PIK3CG / PMCH / PML / PMP2 / PNOC / PPARA / PPARD / PPARG / PPARGC1A / PPBP / PPIG / PPIK2C / PTGER3 / PTGER4 / PTGES / PTGES2 / PT REL / RELA / REG1A / REG3A / REG1A / REG3A / PTG / PTGS1 / PTGS2 / PTHLH / PTK2 / PTK2B / PTMA / PTN / PTPN11 / PTPN6 / PTPRC / PTS / PTX3 / PXN / PYCARD / PYY / SAG / SAT1 / SCD / SCG2 / SCG5 / RELB / REN / RETN / RETNLB / RHO / RHOA / RHOD / S100A11 / S100A12 / S100A13 / S100A6 / S100A7 / S100A8 / S100A9 / SAA1 / SAA2 / SAA3 / / SCGB1A1 / SCGB3A2 / SCYE1 / SHC1 / SSB / SST / SSTR2 / SULT1A3 / SUMF1 / SYK / T / TCN2 / TDO2 / TGFB1 / TGFB2 / TGFB3 / TGFBR2 / TGIF1 / TGM1 / TGM2 / TH / THBD / THBS1 / / THR1 / TKT / TLR2 / TLR3 / TLR4 / TLR5 / TLR7 / TLR8 / TLR9 / TOLLIP / TWIST1 / TXN / TXNDC3 / TXNIP / UCN / UCN2 / UCN3 / UCP1 / UCP2 / UCP3 / UMOD / VCAM1 / VCAN / VDAC1 / VDR / VEGFA / VEGFB / VEGFC / VWF / WARS

실시예2Example 2 : : RawRaw 264.7 세포주를 이용한 염증반응의 유도 Induction of inflammatory response using 264.7 cell lines

본 실험을 수행하기 위하여 일반적으로 류마티스 관절염이나 기타 염증 질환의 연구에 널리 사용되는 마우스 유래 세포주인 Raw 264.7 대식세포주를 사용하였다. 상기 Raw 264.7 대식세포주를 10%FBS(fetal bovine serum) 와 페니실린-스트렙토마이신 100 units/mL (penicillin-streptomycin 100 units/mL)을 첨가한 DMEM배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA )를 이용하여 37℃, 95% 공기(air), 5% CO2의 환경에서 배양한 후 LPS를 5㎍/㎖의 농도로 16시간 처리하여 염증반응 세포 모델로 사용하였다. 염증 반응은 LPS (lipopolysaccharide)를 처리하여 유발시켰으며, 이때 LPS에 의하여 생성된 산화 질소(nitric oxide)의 농도가 기저치에 비하여 20배 이상인 경우에 염증이 유발된 것으로 인정하고 세포 자체가 실험에 적합한 것으로 간주하였다.In order to carry out this experiment, a mouse-derived cell line Raw 264.7 macrophage line commonly used for the study of rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases was used. The Raw 264.7 macrophage cell line was cultured in DMEM medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum) and penicillin-streptomycin 100 units / After incubation at 37 ° C, 95% air and 5% CO 2 , LPS was treated at a concentration of 5 μg / ml for 16 hours and used as an inflammatory response cell model. The inflammatory reaction was induced by treatment with LPS (lipopolysaccharide). At this time, when the concentration of nitric oxide produced by LPS was more than 20 times that of the basal level, it was recognized that inflammation was induced. Respectively.

형태학적 관찰Morphological observation

Raw 264.7 대식세포주를 10mm 배양 접시에 2.5x105 개로 분주하고 배양액을 첨가하여 24시간 배양한 후, 정상 배지에서 배양한 대조군과 LPS(5㎍/㎖) 16시간 처치한 군에서 세포의 형태를 현미경을 통하여 관찰하였다(도 1).The Raw 264.7 macrophage cell line was divided into 2.5 × 10 5 cells in a 10 mm culture dish, cultured for 24 hours, and the morphology of cells in a group treated with LPS (5 μg / ml) (Fig. 1).

산화 질소(Nitric oxide) 농도측정Nitric oxide concentration measurement

NO의 생성은 아질산염(nitrite, NO2)의 농도를 측정하여 산정하였다. 아질산염의 농도는 그리스 시약(Griess reagent) (1% 설파닐아마이드(sulfanilamide) 0.1% 나프틸-에틸디아민 디하이드로클로라이드 (natpthyl-ethtlenediamine dihydrochloride)/2.5% H3PO4를 이용하여 비색 분석(colorimetric assay)법으로 측정하였다. 100㎖의 배양액을 96 웰 플레이트(well plate)에 넣고, 그리스 시약 (Griess reagent) 100와 1분간 반응시킨 후, 540nm의 흡광도에서 ELISA 리더 (reader)를 이용하여 측정하였다. 표준 곡선 (Standard curve)은 이미 알려진 아질산나트륨 (sodium nitrite)의 농도를 이용하였고, 배양액만 넣은 웰(well)은 blank control로 사용하였다. 각 데이터는 세 번 반복하여(triplicate)하여 평균을 구하였다(도 2).The production of NO was estimated by measuring the concentration of nitrite (NO 2 ). The concentration of nitrite was determined by colorimetric assay using a Griess reagent (1% sulfanilamide 0.1% natpthyl-ethtlenediamine dihydrochloride / 2.5% H 3 PO 4 ) ) 100 ml of the culture was placed in a 96-well plate, reacted with a Griess reagent 100 for 1 minute, and then measured using an ELISA reader at an absorbance of 540 nm. For the standard curve, the known concentrations of sodium nitrite were used, and the wells containing only the culture medium were used as blank controls. Each data was averaged by triplicate three times (Fig. 2).

실시예3Example 3 : : RNARNA 의 추출 Extraction of

RAW 264.7 대식세포주에 LPS 5㎍/㎖로 처치한 실험군에 TRIZOL (Invitrogen, CA, USA) 1를 첨가하여 균질화 시킨 후 BCP(bromochlorpropane) 100㎕를 첨가하여 잘 혼합하였다. 그 후 4℃에서 12,000×g 로 15분간 원심분리하여 상층액을 수집하였다. 수집된 상층액에 500㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 혼합한 후 상온에서 10분간 방치하고, 다시 4℃에서 12,000×g로 15분간 원심분리하여 침천물을 남겨두고 상층액을 제거하였다. 수집된 침전물에 75% 에탄올(ethanol)을 1㎖ 첨가하여 혼합한 후 다시 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 건조시켜 20㎕의 0.1% DEPC 용액을 첨가하여 55~60℃에서 용해, 세척하여 추출된 총 RNA를 Nano-drop spectrophotometer를 이용하여 정량하였다. 정량된 RNA는 표 3과 같다.TRIZOL (Invitrogen, CA, USA) 1 was added to the RAW 264.7 macrophage cell line treated with 5 μg / ml of LPS, and homogenized with 100 μl of BCP (bromochloropropane). The supernatant was then collected by centrifugation at 12,000 x g for 15 minutes at 4 ° C. 500 μl of isopropanol was added to the collected supernatant, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes and then centrifuged at 12,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant. 1 ml of 75% ethanol was added to the collected precipitate, and the mixture was centrifuged again for 5 minutes to remove the supernatant. The precipitate was dried, and 20 μl of 0.1% DEPC solution was added thereto and dissolved at 55 to 60 ° C., Total RNA extracted by washing was quantified by Nano-drop spectrophotometer. The quantified RNA is shown in Table 3.

샘플Sample ㎍/㎖Mu g / ml 260/280260/280 260/230260/230 LPS 5 ㎍/㎖*LPS 5 [mu] g / ml * 2671.72671.7 2.132.13 0.950.95 LPS 5 ㎍/㎖ ** LPS 5 [mu] g / ml ** 1443.391443.39 2.142.14 22

추출된 RNA는 spectrophotometer 및 아가로스 겔 (agarose gel) 전기영동을 통해서 정량 및 정성 분석을 실시하여 마이크로어레이 분석에 적합함을 확인하였다(도 3).The extracted RNA was quantitatively and qualitatively analyzed by spectrophotometer and agarose gel electrophoresis, and was confirmed to be suitable for microarray analysis (FIG. 3).

대조군 및 실험군 RNA의 정량 분석 Quantitative analysis of control and experimental group RNA 샘플Sample A260/280A260 / 280 양 (Amount)(㎍)Amount (㎍) rRNA 비율
(23S/16S Ribosomal)rRNA ratio
(23S / 16S ribosomal) 1One 대조군Control group 2.052.05 37.037.0 1.71.7 22 LPS 처리 실험군LPS treatment group 2.102.10 35.035.0 1.81.8

도 3과 표 4에서와 같이, 본 연구에서 적용된 RNA 샘플은 정량 및 정성적으로 일반적인 마이크로어레이 실험시 사용되는 품질 이상의 것이 적용되었다.As shown in FIG. 3 and Table 4, the RNA samples applied in this study were quantitatively and qualitatively more than the quality used in a general microarray experiment.

실시예4Example 4 : : 역전사Reverse transcription 효소( enzyme( reversereverse transcriptasetranscriptase )를 이용한 ) 역전사Reverse transcription 수행( Perform( ReverseReverse transcription ( transcription ( RTRT )) 및 )) And cDNAcDNA 수득 purchase

상기에서 분리된 대조군 및 실험군 RNA 각 50㎍에 Cy3, Cy5 및 올리고 dT (1.5)를 넣고 DEPC 처리된 물로 최종 부피를 20.5㎕가 되도록 조정하였다. 70℃에서 5분간 방치한 후, 즉시 얼음에 넣은 다음 5X buffer 8㎕, low dNTP 4㎕, Cy3와 Cy5를 각각 4㎕, RNase 억제제(inhibitor) 1㎕를 위에 준비된 것과 합쳐서 총 부피를 40㎕가 되도록 DEPC 처리한 물로 조정하였다. 이 혼합물을 42℃에서 1시간 방치시키고 역전사 효소(reverse transcriptase) (20 units/㎕) 2.5㎕를 첨가하여 42℃에서 1시간 방치시켰다. 0.5M EDTA 5㎕와 1 N NaOH 10㎕를 넣고 37℃에서 10분간 방치시킨 후 1 M TrisHCl (pH 7.5)를 넣고 centriSep spin column을 사용하여 3,500 rpm에서 5분간 원심분리시켜 표지된 RNA만을 정제하였다. 2.5배 부피의 100% 에탄올과 1/10 배의 아세트산 나트륨(sodium acetate)을 첨가하고 잘 섞은 다음 -80℃에서 15분간 방치시켰다. 이후 14,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 ice-cold 70% 에탄올 1㎖로 RNA 펠렛(pellet)을 세척하였다. 이후 실온에서 RNA 건조시킨 후 혼성화 버퍼(hybridization buffer)에 녹였다.Cy3, Cy5, and oligo dT (1.5) were added to 50 占 퐂 of each of the control and experimental RNAs separated from the above, and the final volume was adjusted to 20.5 占 by DEPC-treated water. After incubation at 70 ° C for 5 minutes, immediately place in ice, 4 μl of 5X buffer, 4 μl of low dNTP, 4 μl of Cy3 and Cy5, and 1 μl of RNase inhibitor (inhibitor) The water was adjusted to be DEPC-treated. The mixture was allowed to stand at 42 ° C for 1 hour, and 2.5 μl of reverse transcriptase (20 units / μl) was added and left at 42 ° C for 1 hour. After 5 μl of 0.5 M EDTA and 10 μl of 1 N NaOH were added, the plate was incubated at 37 ° C for 10 minutes, 1 M TrisHCl (pH 7.5) was added, and centrifuged at 3,500 rpm for 5 minutes using a centriSep spin column to purify only the labeled RNA . 2.5 times volume of 100% ethanol and 1/10 times of sodium acetate were added, mixed well and allowed to stand at -80 ° C for 15 minutes. After centrifugation at 14,000 rpm at 4 ° C for 10 minutes, the RNA pellet was washed with 1 ml of ice-cold 70% ethanol. After that, RNA was dried at room temperature and dissolved in a hybridization buffer.

실시예5Example 5 : 염증 관련 유전자 선별을 위한 : For screening inflammation-associated genes cDNAcDNA 마이크로어레이Microarray ( ( cDNAcDNA microarraymicroarray ) 수행) Perform

염증 관련 유전자 선별을 위하여 Agilnt사의 인간 게놈 (human genome) 44 K DNA 마이크로어레이 칩 (microarray chip)을 이용하였다. 마이크로어레이 위에 사전 혼성화 버퍼 (prehybridization buffer) 10㎕를 넣고 커버 글래스(corver glass)를 덮고 실온에서 2시간 방치한 후 2X SSC에서 2분간 세척하였다. 이후 0.2X SSC에서 2분간 세척한 다음 1,000 rpm에서 3분간 슬라이드 원심분리기를 이용하여 건조시켰다. 앞에서 준비한 형광 표지된 RNA 샘플을 95℃에서 2분간 방치한 다음 즉시 얼음에 넣고 14,000 rpm에서 8분간 원심분리 한 다음 10㎕의 샘플을 넣고 커버 글래스(corver glass)를 덮었다. 62℃에서 12~16시간 혼성화 반응을 한 다음 2X SSC와 0.2% SDS로 58에서 30분 동안 2회 반복 세척하고 0.05X SSC로 5분간 추가로 세척한 후 1,000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 혼성화 반응이 끝난 슬라이드를 GNSL 스캐너를 사용하여 초기 형광이미지를 습득하였고 이후 Imagene 3.0 등의 분석 소프트웨어를 통해서 대조군과 비교하여 LPS에 의해 발현이 2배 이상 증가한 유전자 및 감소한 유전자를 선별하였다(표 1). A human genome 44 K DNA microarray chip from Agilnt was used for screening inflammation-related genes. 10 μl of prehybridization buffer was placed on the microarray, covered with corver glass, allowed to stand at room temperature for 2 hours, and then washed in 2X SSC for 2 minutes. Thereafter, the cells were washed with 0.2X SSC for 2 minutes and then dried at 1,000 rpm for 3 minutes using a slide centrifuge. The fluorescently labeled RNA samples prepared above were left at 95 ° C for 2 minutes, immediately added to ice, centrifuged at 14,000 rpm for 8 minutes, 10 μl of sample was added and covered with corver glass. Hybridization was carried out at 62 ° C for 12 to 16 hours, followed by washing twice with 2 × SSC and 0.2% SDS for 30 minutes at 58 ° C., further washing with 0.05 × SSC for 5 minutes, and then centrifugation at 1,000 rpm for 3 minutes. The hybridization slide was used to acquire an initial fluorescence image using a GNSL scanner, and then analyzed by Imagene 3.0 and other analysis software to select genes with a two-fold increase in expression or decreased genes by LPS compared to the control group (Table 1) .

실시예6Example 6 : 선별된 : Selected cDNAcDNA 를 이용한 Using 마이크로어레이Microarray 칩( chip( microarraymicroarray chipchip )의 제작) Production

DNA가 부착될 수 있는 기판으로는 아민기가 코팅되어 있는 가로 25mm x 세로 75mm 의 실험용 유리 슬라이드를 사용하였다. 이 기판 위에 집적시킨 유전자는 염증 질환을 유도하는 것으로 추정되는 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자이며, PCR을 사용하여 증폭된 cDNA를 1배의 아이소프로판올(isopropanol) 및 0.1 배의 염(3M NaOAc)을 이용하여 침전시킨 후, 원심분리 (3,000rpm, 4℃, 60분)으로 정제한 하였다. 상기 정제된 cDNA 들은 마이크로 어레이 부착 완충용액 (Micro spotting solution)을 이용하여 20 ng/㎕의 농도가 되도록 녹이고, 상기 제조된 cDNA들은 유전수에 따라 적정한 블록을 가지는 DNA 칩으로 제작되었다.As a substrate on which DNA can be adhered, a laboratory glass slide having a width of 25 mm and a length of 75 mm coated with an amine group was used. The gene integrated on this substrate is one or more genes selected from genes presumed to induce inflammatory diseases. The cDNA amplified by PCR is amplified using 1-fold isopropanol and 0.1-fold salt (3M NaOAc) And then purified by centrifugation (3,000 rpm, 4 캜, 60 minutes). The purified cDNAs were dissolved to a concentration of 20 ng / μl using a micro spotting solution, and the prepared cDNAs were prepared as DNA chips having appropriate blocks according to the number of the genomes.

도 1은 Raw 264.7 대식세포주를 배양접시에 분주하고 배양액을 첨가하여 배양한 대조군과 LPS 처리군에 있어서의 세포 형태를 현미경을 통하여 관찰한 것이다.Fig. 1 is a microscopic observation of cell morphology in Raw 264.7 macrophage cell line treated with LPS-treated group and control group in which culture medium was added.

도 2는 대조군 및 LPS 처리군에서 산화질소(nitrite)의 농도를 측정 결과를 나타낸 그래프이다.2 is a graph showing the results of measurement of the concentration of nitrite in the control and LPS-treated groups.

도 3은 대조군 및 실험군으로부터 분리 정제한 전체 RNA의 전기영동 사진을 나타낸 것이다. Lane L; 리보좀 RNA 마커 (ribosomal RNA marker), Lane 1; 대조군으로부터 추출된 RNA, Lane 2; 실험군으로부터 추출된 RNA.FIG. 3 is an electrophoresis photograph of total RNA isolated and purified from the control and experimental groups. Lane L; Ribosomal RNA marker, Lane 1; RNA extracted from control, Lane 2; RNA extracted from the experimental group.

Claims (5)

외부 독소에 의한 염증성 질환에서 특이적으로 발현이 감소하는 SNRPD1, SNRPB, SNRPF 및 SFRS2 유전자의 뉴클레오타이드를 포함하는 외부 독소에 의한 염증성 질환 진단용 cDNA 마이크로어레이 칩(microarray chip).A cDNA microarray chip for the diagnosis of inflammatory diseases caused by an external toxin comprising nucleotides of SNRPD1, SNRPB, SNRPF and SFRS2 genes whose expression is specifically reduced in inflammatory diseases caused by external toxins. 제1항에 있어서, 외부 독소에 의한 염증성 질환에서 특이적으로 발현이 감소하는 ACO2, ARID1A, BUB1, BUB1B, CDC14B, CSK, DHX16, EXOSC8, EXOSC5, ENO3, EZH2, FH, FOS, GTF2I, GNB1, HNRNPA1, HNRNPU, IDH2, IDH3A, LMNA, LSM2, MAGOH, MCM7, NHP2L1, ORC5L, ORC1L, PARP1, PKMYT1, PMS2, POLR2L, POLE, POLE2, PPIH, PRPF19, PRMT1, RAD51C, RAD51L1, RAD54L, RBMX, RFC1, SDHD, SFRS1, SFRS3, SFRS9, SF3A1, SF3A3, SF3B3, SRF, SSB, SUZ12, TAF2, TFDP1, THOC2, THOC4, TOP2B 및 UNG 유전자, 및 특이적으로 발현이 증가하는 BCL2L1, CD14, CEBPB, FABP5, FTMT, FTH1, PLOD3, PTPN11, RPS3A, RPLP0, RPLP1, TMSB4X, TMSL3, UBC 및 WHSC1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 외부 독소에 의한 염증성 질환 진단용 cDNA 마이크로어레이 칩.The method according to claim 1, wherein the expression of ACO2, ARID1A, BUB1, BUB1B, CDC14B, CSK, DHX16, EXOSC8, EXOSC5, ENO3, EZH2, FH, FOS, GTF2I, GNB1, HNRNPA1, HNRNPU, IDH2, IDH3A, LMNA, LSM2, MAGOH, MCM7, NHP2L1, ORC5L, ORC1L, PARP1, PKMYT1, PMS2, POLR2L, POLE, POLE2, PPIH, PRPF19, PRMT1, RAD51C, RAD51L1, RAD54L, RBMX, RFC1, BCL2L1, CD14, CEBPB, FABP5, FTMT, which specifically increase expression, and SDHD, SFRS1, SFRS3, SFRS9, SF3A1, SF3A3, SF3B3, SRF, SSB, SUZ12, TAF2, TFDP1, THOC2, THOC4, TOP2B and UNG genes A cDNA microarray chip for the diagnosis of an inflammatory disease by an external toxin further comprising a nucleotide of any one or more genes selected from the group consisting of FTH1, PLOD3, PTPN11, RPS3A, RPLP0, RPLP1, TMSB4X, TMSL3, UBC and WHSC1 genes. 제1항 또는 제2항의 외부 독소에 의한 염증성 질환 진단용 cDNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 외부 독소에 의한 염증성 질환을 스크리닝하는 방법. A method for screening an inflammatory disease caused by an external toxin using the cDNA microarray chip for the diagnosis of an inflammatory disease by the external toxin of claim 1 or 2. 제1항 또는 제2항의 외부 독소에 의한 염증성 질환 진단용 cDNA 마이크로어레이 칩을 이용하여 외부 독소에 의한 염증성 질환 치료제를 스크리닝하는 방법. A method for screening a therapeutic agent for an inflammatory disease by an external toxin using the cDNA microarray chip for the diagnosis of an inflammatory disease by the external toxin of claim 1 or 2. 제4항에 있어서, 상기 외부 독소에 의한 염증성 질환 치료제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 및 항체로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것임을 특징으로 하는 외부 독소에 의한 염증성 질환 치료제를 스크리닝하는 방법.[Claim 5] The method according to claim 4, wherein the therapeutic agent for inflammatory diseases caused by the external toxin is at least one selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, peptides, and antibodies.
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