KR101622787B1

KR101622787B1 - Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of the inflammatory disease by sepsis

Info

Publication number: KR101622787B1
Application number: KR1020140035993A
Authority: KR
Inventors: 김원; 박성광; 강경표; 정유진
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 전북대학교병원
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2016-05-20
Also published as: KR20150113270A

Abstract

본 발명은 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 SIRT2억제제는 LPS-유도된 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현을 억제함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 및 치료할 수 있는 효과적인 방법이 될 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis and treatment of inflammatory diseases. More particularly, the SIRT2 inhibitor of the present invention inhibits the expression of CXCL2 and CCL2, which are LPS-induced inflammatory factors, And thus can be an effective method for preventing and treating renal inflammatory diseases caused by sepsis.

Description

[0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases caused by sepsis,

본 발명은 패혈증에 의한 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SIRT2유전자의 발현 조절을 통해 패혈증에 의한 염증유발인자를 조절함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis and treatment of inflammatory diseases caused by sepsis. More particularly, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory diseases caused by septicemia by controlling the expression of SIRT2 gene, A pharmaceutical composition for preventing and treating renal inflammatory disease caused by sepsis, and a health functional food.

패혈증은 전신염증반응과 더불어 감염이 확인되거나 의심되는 상황으로 정의된다. 중증 패혈증(severe sepsis)은 패혈증에서 장기기능부전(organ dysfunction: 저혈압, 저산소증, 핍뇨증, 대사성산증, 혈소판 감소증, 의식장애)이 동반되는 경우로 정의된다. 패혈증 쇼크(septic shock)는 중증 패혈증에서 수액요법이나 혈압상승제를 투여하여도 혈압이 정상화되지 않는 경우로 정의한다. 패혈증은 중증 패혈증 및 궁극적으로는 패혈성 쇼크의 임상적 단계로 진행될 수 있다. 임상적 패혈증은 넓은 의미에서 미생물성 작용제에 의한 침윤이 감염의 임상적 증상과 관련이 있는 상태로 정의된다. 패혈증의 임상적 증상으로는 (1) 체온 > 38℃ 또는 < 36℃ (2) 심박수 > 1분 당 90회 (3) 호흡수 > 1분 당 20회 또는 PaC0₂ < 32 mmHg; (4) 백혈구 수 > 12000/㎥, < 4,000/cu ㎥ 또는 > 10％ 비성숙 (밴드) 형태 (5) 기관기능부전, 과유합, 또는 고혈압 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.Sepsis is defined as a condition in which an infection is confirmed or suspected, along with a systemic inflammatory response. Severe sepsis is defined as the combination of organ dysfunction (hypotension, hypoxia, oliguria, metabolic acidosis, thrombocytopenia, and unconsciousness) in sepsis. Septic shock is defined as a condition in which normal blood pressure is not normalized even in the case of severe sepsis by administering a fluid therapy or a blood pressure enhancer. Sepsis may progress to the clinical stage of severe sepsis and ultimately septic shock. Clinical sepsis is defined broadly as a condition in which infiltration by microbial agents is associated with the clinical symptoms of the infection. Clinical symptoms of sepsis include (1) body temperature> 38 ° C or <36 ° C (2) heart rate> 90 per minute (3) respiratory rate> 20 per minute or PaCO ₂ <32 mmHg; (4) Leukocyte count> 12,000 / ㎥, <4,000 / cu ㎥ or> 10% unmatured (band) form (5) organ dysfunction, hyperostosis, or hypertension.

감염이 발생하면, 감염 부위의 대식세포가 활성화되어 tumor necrosis factor (TNF)-α 및 interleukin (IL)-1을 분비함으로써, 조직으로의 혈장 단백질 방출량이 증가되고, 조직으로의 식세포와 림프구의 이동 증가 및 혈관벽에 대한 혈소판의 부착 증가를 초래한다. 이러한 방식으로, 국소 혈관이 폐색되고 병원체가 감염 부위에 집중된다. 특히, 패혈증은 전신성 감염이 일어나며 TNF-α에 의해 유도된 심각한 혈관 폐색이 수반된다. 또한 TNF-α의 전신적 방출은 혈관확장 및 혈관의 투과성 증가로 인한 혈장 체적의 손실을 초래하여 쇼크를 야기한다. 패혈성 쇼크에서, TNF-α는 파종성 혈관 내 응고(혈액 응고)를 더욱 촉발하여 작은 혈관에서의 혈병 생성 및 혈액 응고 단백질들의 대량 소모를 초래한다. 환자의 혈액 응고 능력이 상실되기 때문에, 예컨대 신장, 간, 심장 및 폐 등과 같은 중요한 기관들이 정상적인 관류의 부전으로 인해 손상된다. 중증 패혈증과 패혈증 쇼크의 사망률은 각각 25 ~ 30%, 40 ~ 70% 에 달하는 것으로 보고되어 있다.When an infection occurs, macrophages in the infected area are activated to secrete tumor necrosis factor (TNF) -α and interleukin (IL) -1, thereby increasing the amount of plasma protein released into the tissue, and the migration of phagocytes and lymphocytes And increased platelet adhesion to the vessel wall. In this way, local blood vessels are occluded and pathogens are concentrated at the site of infection. In particular, sepsis is a systemic infection that involves severe vascular occlusion induced by TNF-α. In addition, systemic release of TNF-a results in loss of plasma volume due to vasodilation and increased permeability of blood vessels, resulting in shock. In septic shock, TNF-a further triggers disseminated intravascular coagulation (blood clotting), resulting in the production of blood clots in small vessels and the mass consumption of blood coagulation proteins. Since the patient's blood clotting ability is lost, important organs such as the kidney, liver, heart and lung are damaged due to the failure of normal perfusion. The mortality rates of severe sepsis and sepsis shock are reported to be 25-30% and 40-70%, respectively.

여러 경우의 패혈증에서는 대장균(E.coli)이 병원체이지만, 예를 들어 클렙시엘라 (Klebsiella)-엔테로박터(Enterobacter)-세라티아(Serratia)군 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 와 같은 다른 그람-음성 박테리아도 이러한 상태를 개시할 수 있다. 포도알균(Staphlococcus) 등의 그람-양성 미생물, 전신적 바이러스 및 진균 감염도 일부 경우에서 패혈증을 개시한다.In many cases, E. coli is a pathogen in sepsis, but other gram-negative bacteria, such as, for example, Klebsiella-Enterobacter-Serratia group and Pseudomonas, This state can be initiated. Gram-positive microorganisms such as Staphlococcus, systemic viruses and fungal infections also initiate sepsis in some cases.

Lipopolysaccharide는 그람-음성 박테리아의 표층의 펩티드글리칸을 구성하는 중요 구성성분이다. 지질A라는 지질과 이에 공유결합하는 각종의 당으로 구성하여 비환원말단의 당사슬이 외계에 향해서 존재하고 있으며 패혈증을 일으키는 인자중의 하나이다. (생명과학대사전, 2008.2.5, 아카데미서적)Lipopolysaccharide is an important constituent of peptide glycans in the surface layer of Gram-negative bacteria. Lipid A is composed of various lipids covalently bonded to the lipid, and the oligosaccharide at the non-reducing end is present toward the extraterrestrial and is one of the factors causing sepsis. (Life Science Dictionary, February 5, 2008, Academic Book)

비뇨생식관, 위장관 및 기도가 패혈증을 초래하는 가장 통상적인 감염 부위이다. 기타의 패혈증-관련 감염 부위로는 창상, 화상 및 골반 감염 부위 및 정맥 내 카테터 감염 부위 등이 있다.The urogenital tract, gastrointestinal tract, and airways are the most common sites of infection that result in sepsis. Other sepsis-related infection sites include wound, burn and pelvic infection sites, and intravenous catheter infections.

패혈증은 혈류 침입에 민감한 기저 질환 또는 증상을 앓는 입원 환자, 또는 화상, 외상 또는 수술 환자들에게서 가장 흔하게 나타난다. 혈류 침입에 민감해지도록 만드는 인자로는 전체적으로 약화된 면역계, 예를 들어 신생아 및 연장자에 존재하는 면역계, 및 감염에 대한 국소적인 민감성을 증가시키는 증상 또는 질환, 예를들어 약화된 순환성, 당뇨병, 요독증 및 AIDS가 포함된다. 결국, IL-1 유전자의 여러 대립유전자의 존재로 인해 발생할 수 있는 약화된 면역 반응에 대한 성향을 갖는 대상은 또한 패혈증 발병 위험이 더 높다(미국 특허 제6,251,598호).Sepsis is most commonly seen in hospitalized patients with underlying disease or symptoms that are sensitive to bloodstream infiltration, or in patients with burns, trauma, or surgery. Factors that make them susceptible to bloodstream infiltration include the overall weakened immune system, such as the immune system present in neonates and elders, and the symptoms or diseases that increase the local sensitivity to infection, such as decreased circulation, diabetes, Uremia, and AIDS. As a result, subjects with a tendency for weakened immune responses that may arise due to the presence of multiple alleles of the IL-1 gene are also at higher risk of developing sepsis (US Patent No. 6,251,598).

패혈증은 감염 원인균과 숙주의 면역, 염증 그리고 응고계통 사이의 복잡한 상호작용의 결과로 발생하는 것으로 이해되고 있다. 숙주의 반응 정도와 감염 원인균의 특성 모두 패혈증의 예후에 중대한 영향을 미친다. 패혈증에서 관찰되는 장기부전은 숙주의 감염 원인균에 반응이 부적절한 경우에 발생하며, 만일 숙주의 감염 원인균에 대한 반응이 지나치게 증폭된다면 숙주 자체의 장기손상을 유발할 수 있다. 이러한 개념을 바탕으로 숙주의 염증 반응에 주도적인 역할을 수행하는 전염증사이토카인 (proinflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-1β, IL-6 등에 대한 길항 물질이 패혈증의 치료제로 시도되었으나 대부분 실패하였으며, 기계환기치료, 활성It is understood that sepsis occurs as a result of complex interactions between infectious agents and host immune, inflammatory and coagulant systems. Both the response of the host and the characteristics of the causative organism have a significant impact on the prognosis of sepsis. Organ failure observed in sepsis occurs when the host is inadequately reacted to an infectious agent, and if the response to the host's infection causes excessive amplification, it can lead to organ damage in the host itself. Based on this concept, antagonists against proinflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, and IL-6, which play a leading role in the inflammatory response of the host, , Mechanical ventilation therapy, active

단백질 C (activated protein C) 투여, 글루코코르티코이드 치료 등이 현재 시도되고 있으나 여러 가지 한계점이 지적되고 있다. 또한, 높은 사망률을 보임에도 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않은 패혈증 및 패혈증에 의한 염증성 질환들에 대한 연구 및 치료방법이 부족하다는 문제점이 있었다.
Administration of protein C (activated protein C), glucocorticoid therapy and the like have been tried, but various limitations have been pointed out. In addition, despite the high mortality rate, there is a problem in that there is a lack of research and treatment methods for inflammatory diseases caused by sepsis and sepsis which have not yet developed a clear therapeutic agent.

SIRT2(Sirtuin 2)는 써투인(sirtuin) 단백질 패밀리 중 하나이며, 어떤 조건 하에서 중요한 세포 생존 기능을 수행한다. 그렇지만, 염증 및 산화 스트레스와 관련한 SIRT2 단백질의 생물학적 기능은 명확하지 않다.SIRT2 (Sirtuin 2) is one of a family of sirtuin proteins that undergo important cell survival functions under certain conditions. However, the biological function of the SIRT2 protein in relation to inflammation and oxidative stress is unclear.

써투인(sirtuin)으로 알려진 SIRT2 (silent information regulator 2)는 수명, 노화, 암발생, 신경퇴화 및 물질대사 질환과 같은 생물학적 과정에서 NAD+-의존적 디아세틸레이즈 조절자이다 [Michan, S.; Sinclair, D. Biochem. J. 404: 1-13; 2007, Finkel, T. et al. Nature 460: 587-591; 2009, Donmez, Z.; Guarente, L. Aging Cell 9: 285-290; 20101-3]. SIRT2 유전자 패밀리는 세균에서 진핵생물까지 잘 보존되어 있다. 인간에서는 일곱 개 타입의 SIRT가 밝혀졌다 [Frye, R. A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 793-798; 2000]. 인간의 일곱 가지 SIRT 중 대부분의 연구는 SIRT1에 촛점을 맞추었다. SIRT1의 과다발현은 DNA 손상 및 산화 스트레스하에서 세포의 생존율을 증가시킨다 [Oberdoerffer, P. et al. Cell 135: 907-918; 2008.]. 또, SIRT1의 신경보호 역할은 알츠하이머 병과 근위축성 측색경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)에서 잘 정립되어 있다[Chen, J. et al. J. Biol. Chem. 280: 40364-40374; 2005, Kim, D. et al. EMBO J. 26: 3169-3179; 2007]. 그렇지만, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘은 잘 알려지지 않았다.
SIRT2 (silent information regulator 2), known as sirtuin, is a NAD + -dependent deacetylase modulator in biological processes such as life span, aging, cancer development, neurodegeneration and metabolic disease [Michan, S .; Sinclair, D. Biochem. J. 404: 1-13; 2007, Finkel, T. et al. Nature 460: 587-591; 2009, Donmez, Z .; Guarente, L. Aging Cell 9: 285-290; 20101-3]. The SIRT2 gene family is well conserved from bacteria to eukaryotes. Seven types of SIRT have been identified in humans (Frye, RA Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 793-798; 2000]. Most of the seven human SIRTs have focused on SIRT1. Overexpression of SIRT1 increases cell survival under DNA damage and oxidative stress [Oberdoerffer, P. et al. Cell 135: 907-918; 2008.]. In addition, the neuroprotective role of SIRT1 is well established in Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis [Chen, J. et al. J. Biol. Chem. 280: 40364-40374; 2005, Kim, D. et al. EMBO J. 26: 3169-3179; 2007]. However, the biological functions and mechanisms of SIRT2 in inflammation and oxidative stress are not well known.

한편, 패혈증으로 인해 환자의 혈액 응고 능력이 상실되기 때문에, 예컨대 신장, 간, 심장 및 폐 등과 같은 중요한 기관들이 정상적인 관류의 부전으로 인해 손상 된다. 신장과 같은 장기에 패혈증이 유발될 경우 높은 사망률을 보임에도 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않아 패혈증 및 패혈증에 의한 염증성 질환들에 대한 연구 및 치료방법이 부족하다는 문제점이 있었다.On the other hand, since the patient's blood clotting ability is lost due to sepsis, important organs such as the kidney, liver, heart and lung are damaged due to the failure of normal perfusion. Although there is a high mortality rate when septicemia is induced in the organs such as the kidney, there is a problem that research and treatment methods for inflammatory diseases due to sepsis and sepsis are lacking because of no developed therapeutic agent yet.

나아가, 상기한 바와 같이, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘에 대한 연구가 부족한 문제점이 있으며, 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전에 대한 연구가 매우 부족하여 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환의 예방 및 치료를 할 수 있는 방법이 매우 부족하다는 문제점이 있었다.Further, as described above, there is a problem in that there is a lack of research on the biological function and mechanism of SIRT2 in inflammation and oxidative stress, and there is a problem in that it is related to the intracellular interaction and signaling and regulation mechanism of SIRT2 with renal inflammatory disease caused by sepsis There is a problem in that a method for preventing and treating a renal inflammatory disease caused by sepsis is very insufficient.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫 번째 해결하려는 과제는 패혈증에 의한 염증유발인자를 조절함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Disclosure of the Invention The present invention has been conceived to solve the above-mentioned problems, and it is a first object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing and treating inflammatory diseases which alleviate kidney inflammation by controlling inflammatory factors caused by sepsis, To provide a composition.

본 발명의 두 번째 해결하려는 과제는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.A second object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases.

본 발명은 상기 첫번째 과제를 달성하기 위하여, SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the first object, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prophylaxis and treatment of inflammatory diseases comprising SIRT2 inhibitor as an active ingredient.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 염증성 질환은 패혈증에 의한 신장 염증성 질환일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the inflammatory disease may be a renal inflammatory disease caused by sepsis.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT2억제제는 상기 SIRT2유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 앱타머 또는 항체로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the SIRT2 inhibitor may include at least one member selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, siRNAs, aptamers or antibodies specific to the SIRT2 gene.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT2억제제는 AGK2 또는 AK-1일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the SIRT2 inhibitor may be AGK2 or AK-1.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 LPS-유도된 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현을 억제함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하는 것일 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition may inhibit renal injury by inhibiting the expression of CXCL2 and CCL2 which are LPS-induced inflammatory inducers, thereby inhibiting renal damage.

본 발명은 상기 두번째 과제를 달성하기 위하여, 상기 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.In order to achieve the second object, the present invention provides a health functional food for preventing and improving an inflammatory disease comprising the SIRT2 inhibitor as an active ingredient.

본 발명은 본 발명은 패혈증에 의한 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 SIRT2억제제는 LPS-유도된 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현을 억제함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품으로서 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases caused by sepsis. More particularly, the SIRT2 inhibitor of the present invention inhibits the expression of CXCL2 and CCL2, which are LPS-induced inflammatory inducers, Can be usefully used as a pharmaceutical composition and a health functional food for preventing and treating kidney inflammatory diseases caused by sepsis by alleviating inflammation and inhibiting renal damage.

도 1은 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의한 CXCL2의 발현 조절에 미치는 효과를 확인한 결과이다. 도 1a는 마우스 신장에서 CXCL2의 발현을 면역화학염색을 통해 확인한 사진이다. 도 1b는 염색을 통해 확인한 CXCL2 양성 세포의 밀도를 이미지 분석 프로그램을 통해 확인한 그래프이다. 도1c는 마우스 혈청에서 CXCL2의 함량을 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 1d는 마우스신장조직에서 CXCL2의 함량을 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다.(SIRT2+/+:SIRT2가 존재하는 실험군, SIRT2-/-:SIRT2가 결여된 실험군, CB: control buffer를 투여한 대조군, LPS: LPS를 투여한 대조군)
도 2는 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의한 CCL2의 발현 조절에 미치는 효과를 확인한 결과이다. 도 2a는 마우스 신장에서 CCL2의 발현을 면역화학염색을 통해 확인한 사진이다. 도 2b는 염색을 통해 확인한 CCL2 양성 세포의 밀도를 이미지 분석 프로그램을 통해 확인한 그래프이다. 도 2c는 마우스 혈청에서 CCL2의 함량을 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 2d는 마우스 신장조직에서 CCL2의 함량을 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다.(SIRT2+/+:SIRT2가 존재하는 실험군, SIRT2-/-:SIRT2가 결여된 실험군, CB: control buffer를 투여한 대조군, LPS: LPS를 투여한 대조군)
도 3은 신장세포에서 SIRT2유전자의 발현 조절에 따른 CXCL2의 발현양상 확인한 결과이다. 도 3a는 마우스 근위세뇨관세포에 SIRT2를 siRNA를 이용하여 SIRT2를 결여시켰을 때 CXCL2의 mRNA 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이다. 도 3b는 세포 배양액에서 CXCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 3c는 세포에서 CXCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다. 도 3d는 마우스 근위세뇨관세포에 SIRT2를 아데노바이러스를 이용하여 SIRT2를 증가시켰을 때 CXCL2의 mRNA 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이다 도 3e는 세포 배양액에서 CXCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 3f는 세포에서 CXCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다.(SIRT2 siRNA: SIRT2 siRNA 처리한 실험군, ContsiRNA: siRNA 대조군, Ad-SIRT2: SIRT2 재조합-아데노바이러스 처리한 실험군, ad-cont: control virus 처리한 대조군, CB: control buffer를 투여한 대조군, LPS: LPS를 투여한 대조군)
도 4는 신장세포에서 SIRT2유전자의 발현 조절에 따른 CCL2의 발현양상 확인한 결과이다. 도 4a는 마우스 근위세뇨관세포에 SIRT2를 siRNA를 이용하여 SIRT2를 결여시켰을 때 CCL2의 mRNA 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이다. 도 4b는 세포 배양액에서 CCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 4c는 세포에서 CCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다. 도 4d는 마우스 근위세뇨관세포에 SIRT2를 아데노바이러스를 이용하여 SIRT2를 증가시켰을 때 CCL2의 mRNA 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이다 도 4e는 세포 배양액에서 CCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이고, 도 4f는 세포에서 CCL2를 효소결합면역흡착분석법을 통해 확인한 그래프이다.(SIRT2 siRNA: SIRT2 siRNA 처리한 실험군, ContsiRNA: siRNA 대조군, Ad-SIRT2: SIRT2 재조합-아데노바이러스 처리한 실험군, ad-cont: control virus 처리한 대조군, CB: control buffer를 투여한 대조군, LPS: LPS를 투여한 대조군)
도 5는 신장세포에서 SIRT2억제제에 의한 CXCL2(5a) 및 CCL2(5b)의 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인한 그래프이다.
도 6은 SIRT2유전자의 발현에 따른 LPS 투여 시 신장 손상도을 neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)(6a) 및 kidney injury molecule (KIM-1)(6b) 함량을 효소결합면역흡착분석법 측정을 통해 확인한 그래프이다.FIG. 1 shows the effect of LPS on the expression of CXCL2 in SIRT2 gene-deficient mice. 1A is a photograph showing the expression of CXCL2 in mouse kidney through immunochemical staining. FIG. 1B is a graph showing the density of CXCL2-positive cells determined through staining by an image analysis program. 1C is a graph showing the content of CXCL2 in mouse serum by enzyme-linked immunosorbent assay, and FIG. 1D is a graph showing the content of CXCL2 in mouse kidney tissues by enzyme-linked immunosorbent assay (SIRT2 + / +: SIRT2 SIRT2 - / -: SIRT2 - deficient group, CB: control buffer - treated group, LPS: LPS - treated group)
Figure 2 shows the effect of LPS on the expression of CCL2 in SIRT2 gene-deficient mice. FIG. 2A is a photograph showing the expression of CCL2 in mouse kidney through immunochemical staining. FIG. 2B is a graph showing the density of CCL2-positive cells determined by staining through an image analysis program. FIG. 2C is a graph showing the content of CCL2 in mouse serum through enzyme-linked immunosorbent assay, and FIG. 2D is a graph showing the content of CCL2 in mouse kidney tissue by enzyme-linked immunosorbent assay (SIRT2 + / +: SIRT2 SIRT2 - / -: SIRT2 - deficient group, CB: control buffer - treated group, LPS: LPS - treated group)
FIG. 3 shows the expression pattern of CXCL2 in the kidney cells according to the expression of the SIRT2 gene. FIG. 3A is a graph showing the mRNA expression pattern of CXCL2 when qRT-PCR was performed when SIRT2 was deleted using SIRT2 siRNA in mouse proximal tubular cells. FIG. 3B is a graph showing CXCL2 in enzyme-linked immunosorbent assay in a cell culture solution, and FIG. 3C is a graph showing CXCL2 in cells by enzyme-linked immunosorbent assay. FIG. 3D is a graph showing the expression pattern of CXCL2 mRNA expression by qRT-PCR when SIRT2 was increased by SIRT2 using adenovirus in mouse proximal tubular cells. FIG. 3E is a graph showing the expression of CXCL2 by enzyme-linked immunosorbent assay (SIRT2 siRNA: SIRT2 siRNA treated group, Cont siRNA: siRNA control group, Ad-SIRT2: SIRT2 recombinant-adenovirus treated group, ad -cont: control virus-treated control, CB: control buffer-treated group, LPS: LPS-treated control group)
FIG. 4 shows the expression patterns of CCL2 according to the expression of SIRT2 gene in kidney cells. 4A is a graph showing the mRNA expression pattern of CCL2 when qRT-PCR was performed when SIRT2 was deleted using SIRT2 siRNA in mouse proximal tubular cells. FIG. 4b is a graph of CCL2 assayed by enzyme-linked immunosorbent assay in a cell culture medium, and FIG. 4c is a graph of CCL2 assayed by enzyme-linked immunosorbent assay in cells. FIG. 4d is a graph showing the expression pattern of CCL2 mRNA expression by qRT-PCR when SIRT2 was increased by SIRT2 using adenovirus in mouse proximal tubular cells. FIG. 4e is a graph showing CCL2 expression in cell culture medium by enzyme-linked immunosorbent assay (SIRT2 siRNA: SIRT2 siRNA treated group, Cont siRNA: siRNA control group, Ad-SIRT2: SIRT2 recombinant-adenovirus treated group, ad -cont: control virus-treated control, CB: control buffer-treated group, LPS: LPS-treated control group)
FIG. 5 is a graph showing the expression patterns of CXCL2 (5a) and CCL2 (5b) by SIRT2 inhibitor in kidney cells through qRT-PCR.
FIG. 6 is a graph showing the levels of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) (6a) and kidney injury molecule (KIM-1) (6b) measured by enzyme-linked immunosorbent assay when LPS was administered according to the expression of SIRT2 gene to be.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

상술한 바와 같이 패혈증으로 인해 환자의 혈액 응고 능력이 상실되기 때문에, 예컨대 신장, 간, 심장 및 폐 등과 같은 중요한 기관들이 정상적인 관류의 부전으로 인해 손상 된다. 신장과 같은 장기에 패혈증이 유발될 경우 높은 사망률을 보임에도 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않아 패혈증 및 패혈증에 의한 염증성 질환들에 대한 연구 및 치료방법이 부족하다는 문제점이 있었다.As described above, since the blood clotting ability of the patient is lost due to sepsis, important organs such as the kidney, liver, heart and lung are damaged due to the failure of normal perfusion. Although there is a high mortality rate when septicemia is induced in the organs such as the kidney, there is a problem that research and treatment methods for inflammatory diseases due to sepsis and sepsis are lacking because of no developed therapeutic agent yet.

나아가, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메커니즘에 대한 연구가 부족한 문제점이 있으며, 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절 기작에 연관된 분자적 기전에 대한 연구가 매우 부족하여 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환의 예방 및 치료를 할 수 있는 방법이 매우 부족하다는 문제점이 있었다.
Furthermore, there is a lack of research on the biological function and mechanism of SIRT2 in inflammation and oxidative stress, and there is a problem in the intracellular interaction of SIRT2 with the renal inflammatory disease caused by sepsis and the molecular mechanism involved in signal transduction and regulatory mechanism There is a problem that a method for preventing and treating a renal inflammatory disease caused by sepsis is very insufficient.

이에 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.Thus, according to a preferred embodiment of the present invention, a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases comprising SIRT2 inhibitor as an active ingredient is provided, and the above-mentioned problems are solved.

이를 통해 SIRT2유전자의 발현 조절을 통한 패혈증에 의한 염증유발인자를 조절함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
Accordingly, the present invention can be effectively used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of renal inflammatory diseases caused by sepsis by inhibiting renal inflammation by controlling the inflammation inducing factor by septicemia through regulation of SIRT2 gene expression.

본 발명은 SIRT2억제제를 유효성분으로 포함한다.The present invention includes a SIRT2 inhibitor as an active ingredient.

본 발명의 "SIRT2(Sirtuin 2)"는 써투인(sirtuin) 단백질 패밀리 중 하나이며, 어떤 조건 하에서 중요한 세포 생존 기능을 수행한다. The "SIRT2 (Sirtuin 2)" of the present invention is one of the sirtuin protein family and performs important cell survival functions under certain conditions.

써투인(sirtuin)으로 알려진 SIRT2 (silent information regulator 2)는 수명, 노화, 암발생, 신경퇴화 및 물질대사 질환과 같은 생물학적 과정에서 NAD+-의존적 디아세틸레이즈 조절자이다 [Michan, S.; Sinclair, D. Biochem. J. 404: 1-13; 2007, Finkel, T. et al. Nature 460: 587-591; 2009, Donmez, Z.; Guarente, L. Aging Cell 9: 285-290; 20101-3]. SIRT2 유전자 패밀리는 세균에서 진핵생물까지 잘 보존되어 있다. 인간에서는 일곱 개 타입의 SIRT가 밝혀졌다 [Frye, R. A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 793-798; 2000]. 인간의 일곱 가지 SIRT 중 대부분의 연구는 SIRT1에 촛점을 맞추었다. SIRT1의 과다발현은 DNA 손상 및 산화 스트레스하에서 세포의 생존율을 증가시킨다 [Oberdoerffer, P. et al. Cell 135: 907-918; 2008.]. 또, SIRT1의 신경보호 역할은 알츠하이머 병과 근위축성 측색경화증 (amyotrophic lateral sclerosis)에서 잘 정립되어 있다[Chen, J. et al. J. Biol. Chem. 280: 40364-40374; 2005, Kim, D. et al. EMBO J. 26: 3169-3179; 2007]. 그렇지만, 염증 및 산화 스트레스에서 SIRT2의 생물학적 기능과 메카니즘은 잘 알려지지 않았다.SIRT2 (silent information regulator 2), known as sirtuin, is a NAD + -dependent deacetylase modulator in biological processes such as life span, aging, cancer development, neurodegeneration and metabolic disease [Michan, S .; Sinclair, D. Biochem. J. 404: 1-13; 2007, Finkel, T. et al. Nature 460: 587-591; 2009, Donmez, Z .; Guarente, L. Aging Cell 9: 285-290; 20101-3]. The SIRT2 gene family is well conserved from bacteria to eukaryotes. Seven types of SIRT have been identified in humans (Frye, R. A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 272: 793-798; 2000]. Most of the seven human SIRTs have focused on SIRT1. Overexpression of SIRT1 increases cell survival under DNA damage and oxidative stress [Oberdoerffer, P. et al. Cell 135: 907-918; 2008.]. In addition, the neuroprotective role of SIRT1 is well established in Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis [Chen, J. et al. J. Biol. Chem. 280: 40364-40374; 2005, Kim, D. et al. EMBO J. 26: 3169-3179; 2007]. However, the biological functions and mechanisms of SIRT2 in inflammation and oxidative stress are not well known.

따라서 본 발명은 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환과 SIRT2의 세포 내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전을 규명함으로써 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of renal inflammatory diseases caused by sepsis by identifying the molecular mechanisms involved in the intracellular interaction, signal transduction and regulatory mechanism of SIRT2 caused by sepsis-induced renal inflammatory disease to provide.

구체적으로, 실시예 3 및 실시예 4를 통해 알 수 있듯이, SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현 조절 효과를 확인하기 위하여 마우스 신장조직에 대해 면역화학염색 및 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CXCL2 및 CCL2의 발현을 확인 하였고, 혈액에서도 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CXCL2 및 CCL2 발현을 확인하였다. 그 결과, LPS를 투여하였을 때 증가한 CXCL2 및 CCL2의 발현이 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 감소됨을 알 수 있었다(도 1 및 도 2참조).
Specifically, as can be seen from Examples 3 and 4, in order to confirm the effect of regulating the expression of CXCL2 and CCL2 by LPS in SIRT2 gene-deficient mice, mouse kidney tissues were subjected to immunochemical staining and enzyme binding Immunosorbent assay was performed to confirm the expression of CXCL2 and CCL2. In blood, CXCL2 and CCL2 expression was also confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay. As a result, it was found that the expression of CXCL2 and CCL2, which were increased when LPS was administered, decreased in SIRT2 gene-deficient mice (see FIGS. 1 and 2).

LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현이 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현이 감소됨을 알 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).
The expression of CXCL2 and CCL2 increased by LPS was decreased by LPS in SIRT2 gene-deficient mice (see FIGS. 1 and 2).

본 발명에서 상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본 발명에서 사용된 상기 치료라는 용어는 치료하는 이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 본 발명에 따른 SIRT2억제제는 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 유도된 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현을 억제함으로써 신장염증을 완화시켜 신장손상을 억제하여 패혈증에 의한 신장 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.In the present invention, the treatment means, unless otherwise stated, reversing, alleviating, inhibiting or preventing the disease or disorder to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or disorder And the term " treatment " used in the present invention refers to the treatment when the treatment is defined as described above. Therefore, the SIRT2 inhibitor according to the present invention inhibits the expression of CXCL2 and CCL2, which are inflammation inducers induced by LPS, in the SIRT2 gene-deficient mouse, thereby suppressing renal inflammation and thereby inhibiting renal damage, thereby preventing renal inflammatory diseases caused by sepsis And a pharmaceutical composition for therapeutic use.

구체적으로, 실시예 5 및 실시예 6에 나타난 바와 같이, 마우스의 근위세뇨관 세포에서 SIRT2유전자를 siRNA를 통해 결여시켰을 때 LPS에 의해 증가하는 CXCL2 및 CCL2의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, SIRT2유전자-결여된 세포에 LPS를 처리 하였을 때, LPS에 의해 증가한 CXCL2 및 CCL2의 mRNA의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 이와 반대로, SIRT2-재조합 아데노바이러스를 제작하여 SIRT2유전자를 과발현 시켰을 때, LPS에 의해 CXCL2 및 CCL2의 발현이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4 참조).Specifically, as shown in Example 5 and Example 6, when the SIRT2 gene was deleted in the proximal tubular cells of mice by siRNA, the effects of LPS on CXCL2 and CCL2 expression were examined. As a result, the SIRT2 gene- When LPS was treated with deficient cells, the expression of CXCL2 and CCL2 mRNA increased by LPS was decreased. In contrast, when SIRT2-recombinant adenovirus was produced and overexpressed the SIRT2 gene, it was confirmed that the expression of CXCL2 and CCL2 was significantly increased by LPS (see FIGS. 3 and 4).

이를 통해 SIRT2유전자의 발현이 LPS 처리에 의해 증가한 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
It was confirmed that the expression of SIRT2 gene affects the expression of CXCL2 and CCL2, which are inflammation inducers that were increased by LPS treatment.

본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양의 SIRT억제제를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 염증성 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.The pharmaceutical compositions for the prophylaxis and treatment of inflammatory diseases according to the present invention may comprise a pharmaceutically effective amount of a SIRT inhibitor alone or may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents. A pharmaceutically effective amount as used herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate, and treat the symptoms of an inflammatory disease.

본 발명에 따른 SIRT2억제제의 약학적으로 유효한 양은 0.5 내지 100 ㎎/(day·체중·㎏), 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎎/(day·체중·㎏)이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 신장 독성 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.The pharmaceutically effective amount of the SIRT2 inhibitor according to the present invention is 0.5 to 100 mg / (day · body weight · kg), preferably 0.5 to 5 mg / (day · body weight · kg). However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the severity of the renal toxic disease symptom, age, body weight, health condition, sex, administration route and treatment period of the patient.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.The term "pharmaceutically acceptable" as used herein refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or the like when administered to humans. Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. Further, it may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.In addition, the compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the mammal. The formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatine capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.

또한, 본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 염증성 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
In addition, the composition for preventing or treating an inflammatory disease according to the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or muscular, and the dose of the active ingredient may vary depending on the administration route, The composition for preventing or treating an inflammatory disease according to the present invention can be appropriately selected according to various factors such as body weight and the severity of a patient and the composition for preventing or treating an inflammatory disease according to the present invention can be used in combination with a known compound having an effect of preventing, Lt; / RTI >

또한, 본 발명에서 상기 SIRT2억제제는 상기 SIRT2에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA, shRNA, 앱타머, 항체, 단일사슬 가변영역 단편, 저분자량의 화합물 또는 천연추출물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 AGK2 또는 AK-1일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 AK-1일 수 있다.In addition, in the present invention, the SIRT2 inhibitor includes antisense oligonucleotides, RNAi, siRNA, shRNA, aptamer, antibody, single chain variable region fragment, low molecular weight compound or natural extract specific to the SIRT2, , Preferably AGK2 or AK-I, more preferably AK-I.

상기 AK-1은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.The AK-1 may include a compound represented by the following general formula (1).

상기 AGK2는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.The AGK2 may include a compound represented by the following formula (2).

또한, 상기 AK-1 및/또는 AGK2는 benzylsulfonamide의 세포 투과를 통해 SIRT2 nicotinamide binding site를 타겟하여 SIRT2 activity를 억제할 수 있다.
In addition, AK-1 and / or AGK2 can inhibit SIRT2 activity by targeting the SIRT2 nicotinamide binding site through cell permeation of benzylsulfonamide.

본 발명의 SIRT2억제제는 LPS에 의해 유도된 패혈증에 의한 신장염증 반응 및 신장기능 손상의 억제 효과를 제공한다.
The SIRT2 inhibitor of the present invention provides an inhibitory effect on renal inflammatory response and renal function damage by LPS-induced sepsis.

구체적으로, 실시예 7에서 알 수 있듯이, 신장세포에서 SIRT2억제제에 의한 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현 양상 확인하기 위하여, 마우스 근위세뇨관 세포에 LPS 처리 30분 전에 미리 SIRT2억제제인 AK-1(10μM)을 처리한 후, LPS(10μg/mL)를 1시간 동안 처리하고 세포를 수확하여 CXCL2 및 CCL2의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR을 수행한 결과, SIRT2억제제인 AK-1을 처리 하였을 때, LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다(도 5 참조).Specifically, as shown in Example 7, in order to examine the expression pattern of CXCL2 and CCL2, which are inflammation inducers by SIRT2 inhibitor, in kidney cells, mouse proximal tubular cells were pretreated with SIRT2 inhibitor AK-1 After treatment with LPS (10 μg / mL) for 1 hour, the cells were harvested and the mRNA expression levels of CXCL2 and CCL2 were analyzed by qRT-PCR. As a result, when treated with SIRT2 inhibitor AK-1, It was confirmed that the expression of CXCL2 and CCL2 increased by LPS (see FIG. 5).

또한, 실시예 8에서 알 수 있듯이, 신장기능 손상도를 확인하기 위하여, 마우스에 LPS를 처리하고 3 시간 후 방광을 통해 소변을 수확하였다. 수확한 소변은 효소결합면역흡착분석법을 통해 NGAL 및 KIM-1의 함량을 측정하였다. Further, as shown in Example 8, in order to confirm the degree of impaired renal function, mice were treated with LPS and urine was collected through the bladder 3 hours later. The content of NGAL and KIM-1 was measured by enzyme-linked immunosorbent assay in the collected urine.

그 결과, LPS를 투여한 대조군에서 증가한 NGAL 및 KIM-1의 함량이 SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 유의성 있게 감소함을 확인할 수 있었다(도 6 참조).As a result, it was confirmed that the content of NGAL and KIM-1 increased in the LPS-treated control group significantly decreased in the SIRT2 gene-deficient mouse (see FIG. 6).

이를 통해 SIRT2유전자가 LPS에 의해 유도된 신장손상에도 영향을 미침을 확인할 수 있었고, SIRT2유전자의 조절을 통해 LPS에 의한 신장손상을 억제할 수 있는 효과가 있음을 확인하였다.
These results suggest that the SIRT2 gene affects the LPS - induced renal damage, and that the SIRT2 gene has the effect of inhibiting LPS - induced kidney damage.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합 할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.In the present invention, the term "antisense oligonucleotide" means a DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA. The term " antisense oligonucleotide " . &Lt; / RTI > The antisense sequence of the present invention refers to a DNA or RNA sequence complementary to the mRNA of the gene and capable of binding to the mRNA, and the translation, mRNA translocation, maturation, or all other overall biological It is possible to inhibit the essential activity for the function.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제 5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.Also, the antisense nucleic acid can be modified at one or more bases, sugar or backbone positions to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995 ). The nucleic acid backbone can be modified with phosphorothioate, phosphotriester, methylphosphonate, short chain alkyl, cycloalkyl, short chain heteroatomic, heterocyclic biantennary bond, and the like. In addition, the antisense nucleic acid may comprise one or more substituted sugar moieties. The antisense nucleic acid may comprise a modified base. Modified bases include hypoxanthane, 6-methyladenine, 5-methylpyrimidine (especially 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, genentioyl HMC, -Thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine . In addition, the antisense nucleic acid of the present invention may be chemically combined with one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cytotoxicity of the antisense nucleic acid. A cholesterol moiety, a cholesteryl moiety, a cholic acid, a thioether, a thiocholesterol, an aliphatic chain, a phospholipid, a polyamine, a polyethylene glycol chain, adamantane acetic acid, a palmityl moiety, octadecylamine, hexylamino- And liposoluble moieties such as Cole sterol moieties. Oligonucleotides, including liposoluble moieties, and methods of preparation are well known in the art (U.S. Pat. Nos. 5,138,045, 5,218,105 and 5,459,255). The modified nucleic acid may increase the stability to nuclease and increase the binding affinity of the antisense nucleic acid with the target mRNA.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
The antisense oligonucleotides may be synthesized in vitro in a conventional manner and administered in vivo or may allow the synthesis of antisense oligonucleotides in vivo. An example of synthesizing an antisense oligonucleotide in a test tube is to use RNA polymerase I. One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector whose recognition site (MCS) origin is in the opposite direction. Such antisense RNAs are preferably made such that translation stop codons are present in the sequence so that they are not translated into the peptide sequence.

본 발명에서 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.
In the present invention, "RNAi" refers to RNA interference, and in Korean, it means RNA interference. RNA interference is a specific gene suppression phenomenon that is well conserved among most organisms. It is thought to be a type of gene monitoring mechanism used by cells to suppress defenses against transfection, to inhibit transposon, or to remove abnormal mRNA. In particular, gene suppression by small RNA is referred to as RNA interference in a broad sense, and RNA interference in the narrow sense implies mRNA degradation by siRNA. RNA interference also implies a technique for gene silencing using siRNA.

본 발명에서 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.In the present invention, the term "siRNA " refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (International Patent Publication Nos. 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 and 00 / 44914). SiRNA is provided as an efficient gene knock-down method or as a gene therapy method because it can inhibit the expression of a target gene.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
The siRNA molecule of the present invention may have a structure in which a sense strand (a sequence corresponding to the mRNA sequence of the marker gene) and an antisense strand (a sequence complementary to the mRNA sequence) are positioned on opposite sides to form a double strand, , The siRNA molecules of the invention may have a single stranded structure with self-complementary sense and antisense strands. Furthermore, siRNAs are not limited to the complete pairing of double-stranded RNA moieties in RNA pairs, but may be mated by mismatch (corresponding bases are not complementary), bulge (no bases corresponding to one strand) And a portion that is not achieved may be included. In addition, the siRNA terminal structure can be blunt or cohesive at both ends, if the expression of the marker gene can be inhibited by the RNAi effect, and the adhesive terminal structure has a 3'-terminal protruding structure and a 5'- Both end protruding structures are possible.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.In addition, the siRNA molecule of the present invention may have a form in which a short nucleotide sequence is inserted between self-complementary sense and antisense strands, in which case the siRNA molecule formed by the expression of the nucleotide sequence is Thereby forming a hairpin structure, which in turn forms a stem-and-loop structure. This stem-and-loop structure is processed in vitro or in vivo to produce an active siRNA molecule capable of mediating RNAi.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
Methods for preparing siRNA include a method of directly synthesizing siRNA in a test tube, introducing the siRNA into a cell through transformation, and a method of expressing siRNA expression vector or PCR-derived siRNA expression cassette into a cell There is a way to convert or infect.

본 발명에서의 "앱타머(aptamer)"라는 용어는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 분자를 말한다. 앱타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.The term "aptamer" in the present invention refers to an oligonucleotide molecule having a binding activity to a given target molecule. An aptamer can inhibit the activity of a given target molecule by binding to a predetermined target molecule.

본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 본 발명의 앱타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 15 내지 200 뉴클레오타이드일 수 있지만, 예컨대 15 ~ 100 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 15 ~ 80 뉴클레오타이드이며, 보다 바람직하게는 18 ~ 60 뉴클레오타이드이고, 가장 바람직하게는 20 ~ 45 뉴클레오타이드 이하일 수 있다. 총 뉴클레오타이드 개수가 적으면 화학합성, 화학수식 및 대량 생산이 보다 용이하고, 경제적이며, 생체내 안정성은 높으면서 독성은 낮아 유리하다.
The aptamers of the present invention may be RNA, DNA, modified oligonucleotides or mixtures thereof. The aptamers of the present invention may also be in the form of straight chain or cyclic. The length of the aptamer of the present invention is not particularly limited and may be usually 15 to 200 nucleotides, but is, for example, 15 to 100 nucleotides, preferably 15 to 80 nucleotides, more preferably 18 to 60 nucleotides, May be 20 to 45 nucleotides or less. When the total number of nucleotides is small, the chemical synthesis, chemical modification and mass production are easier, economical, and in vivo, the toxicity is low because of high stability.

또한 본 발명의 SIRT억제제로는 SIRT2 단백질 활성 억제제를 포함하며, 이러한 단백질 활성 억제제로서 바람직하게는 SIRT2에 특이적으로 결합하는 항체, 단일사슬 가변영역 단편, 펩타이드, 저분자량의 화합물 또는 천연추출물을 예시할 수 있다.The SIRT inhibitor of the present invention includes a SIRT2 protein activity inhibitor. Examples of the protein activity inhibitor include an antibody, a single chain variable region fragment, a peptide, a low molecular weight compound or a natural extract that specifically binds to SIRT2 can do.

본 발명에서 이용될 수 있는 SIRT2 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이다. SIRT2 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler et al., European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al.,J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 문헌[Harlow, E. et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991]에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 SIRT2 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.The antibody that specifically binds to and inhibits the activity of the SIRT2 protein that can be used in the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody. Antibodies against the SIRT2 protein can be generated using methods conventionally practiced in the art such as the fusion method (Kohler et al., European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), the recombinant DNA method 4,816,56) or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 . &Lt; / RTI > A general procedure for antibody preparation is described in Harlow, E. et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley / Greene, NY, 1991, the disclosures of which are incorporated herein by reference. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing an immortalized cell line with an antibody-producing lymphocyte, and the techniques necessary for this process are well known and readily practicable by those skilled in the art . Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a SIRT2 protein antigen into a suitable animal, collecting the antiserum from the animal, and then separating the antibody from the antiserum using a known affinity technique.

본 발명에서 항체는 단일사슬 가변영역 단편(scFv)을 포함할 수 있다. 상기 단일사슬 가변영역 단편은 "경사슬의 가변성 부위(VL)-링커-중사슬의 가변성 부위(VH)"로 구성될 수 있다. 상기 링커는 중사슬 및 경사슬의 가변성 부위를 인위적으로 연결하는 작용을 하는 일정 길이의 아미노산 서열을 의미한다.
In the present invention, the antibody may comprise a single chain variable region segment (scFv). The single-stranded variable region fragment may be composed of "variable-region (VL) of light chain-variable-region (VH) of linker-double-stranded ". The linker refers to a constant-length amino acid sequence that artificially connects the variable region of the heavy chain and the light chain.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, SIRT2억제제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.According to another preferred embodiment of the present invention, there is provided a health functional food for preventing and improving an inflammatory disease comprising SIRT2 inhibitor as an active ingredient, thereby solving the above-mentioned problems.

본 발명은 SIRT2억제제 및 식품학적으로 허용 가능한 식품첨가제를 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 SIRT2억제제를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.The present invention provides health functional foods for the prevention and improvement of inflammatory diseases, including SIRT2 inhibitors and food additive food additives. Foods to which the SIRT2 inhibitor of the present invention can be added include, for example, various foods, beverages, gums, tea, vitamin complexes, and health functional foods.

본 발명에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.&Quot; Health functional food "as defined in the present invention means food prepared and processed by using a raw material or ingredient having functionality useful to the human body according to Law No. 6727 on Health Functional Food, and" Of the structure and function of the nutrient to control the physiological effects, such as to obtain a beneficial effect for health is intended to eat.

또한, 염증성 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.It can also be added to foods or beverages for the purpose of preventing inflammatory diseases. At this time, the amount of the extract in the food or beverage may be 0.01 to 15% by weight of the total food, and the health beverage composition may be added in a proportion of 0.02 to 5 g, preferably 0.3 to 1 g, have.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.The health functional food of the present invention includes forms such as tablets, capsules, pills, and liquids.

예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 적당한 방법으로 과립상으로 한 다음 활택제 등을 넣어 압축 성형하여 조제하거나 정제 형태의 건강기능식품을 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 직접 압축 성형하여 만들거나 또는 미리 만든 과립에 건강기능식품을 그대로 혹은 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 다음 압축 성형하여 조제하거나 건강기능식품에 부형제, 결합제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 분말을 용매로 습윤시키고, 습윤된 분말을 저압으로 틀에 넣어서 성형한 후, 적당한 방법으로 건조하여 조제한다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품에 필요에 따라 교미제 등을 넣을 수 있으며, 적당한 제피제로 제피가능하다.For example, the health functional food of the tablet form may be prepared as it is, or it may be prepared by putting an excipient, a binder, a disintegrant, or other additives into the granules by an appropriate method, Functional food may be prepared by directly compressing the mixture of the food or by mixing directly with an excipient, binder, disintegrant or other suitable additive, or by mixing the preformed granules with the proper food additives or the appropriate additives, Add an excipient, binder or other suitable additive to the functional food, wet the powder evenly with a solvent, mold the wet powder into a low-pressure mold, and dry it by a suitable method. In addition, a mating agent or the like may be added to the health functional food in the form of tablets, if necessary.

상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 보통 캅셀에 건강기능식품 또는 건강기능식품에 적당한 부형제 등을 고르게 섞은 것 또는 적당한 방법으로 입상으로 한 것 또는 입상으로 한 것에 적당한 제피제로 제피한 것을 그대로 또는 가볍게 성형하여 충전하여 조제하며, 연질 켑셀제는 보통 캅셀에 건강기능식품 또는 건강기능식품에 적당한 부형제 등을 넣은 것을 젤라틴 등 적당한 캅셀기제에 글리세린 또는 소르비톨 등을 넣어 소성을 높인 캅셀기제로 피포하여 일정한 형상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 상기 캅셀기제에 착색료 보존료 등을 첨가할 수 있다.The hard capsule of the capsule type health functional food is usually prepared by mixing the capsule with an appropriate excipient such as a health functional food or a health functional food or by granulating it in a suitable manner or by granulating it into a granular form suitable for granulation, Soft gelatin capsules are prepared by filling capsules with an appropriate excipient such as a health functional food or a health functional food into a suitable capsule base such as gelatin or the like with glycerin or sorbitol, And if necessary, a coloring agent preservative or the like may be added to the capsule base.

환형태의 건강기능식품은 보통 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 구상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.The ring type health functional food is usually prepared by mixing an excipient, a binder and a disintegrant in an ordinary healthy functional food, shaping it into a spherical form by an appropriate method, and then adding a gelatin to starch or other suitable skin care agent, It may also be an objectionable substance.

과립형태의 건강기능식품은 보통 건강기능식품을 그대로 또는 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 넣어 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 입상으로 만들고 될 수 있는 대로 입자를 고르게 한 것이며, 필요에 따라 착향료, 교미제 등을 넣을 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호 (1680 ㎛), 14호 (1410 ㎛) 및 45호 (350㎛) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것은 전체량의 5.0 %이하 이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0 %이하이어야 한다.The granular health functional foods are usually prepared by mixing the healthy functional food as it is or by adding the excipient, binder, disintegrant, etc. to the health functional food and then making it into granular form by proper method and evenly grinding the granular material as needed. , A mating agent, and the like. In the next granularity test using granules 12 (1680 ㎛), 14 (1410 ㎛) and 45 (350 ㎛) sieve, the whole of the 12th trough passed through the granule, And not more than 5.0% of the total amount and not more than 15.0% of the total amount.

본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국 약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
The definitions of the excipients, binders, disintegrants, lubricants, mating agents, flavoring agents and the like of the present invention are described in documents known in the art, and their functions and the like are the same or similar (Korean Pharmacopoeia, , Council of Korean Pharmacy College, 5th ed., P. 33-48, 1989).

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 SIRT2억제제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
The health functional beverage composition of the present invention has no particular limitation on the other ingredients other than the above-mentioned SIRT2 inhibitor as an essential ingredient in the indicated ratios and may contain various flavors or natural carbohydrates as an additional ingredient such as ordinary beverages . Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as disaccharides such as glucose and fructose such as maltose, sucrose and the like and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, And sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. Natural flavors (tau martin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used as flavors other than those described above The ratio of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 ml of the composition of the present invention.

상기 외에 본 발명의 SIRT2억제제는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
In addition to the above, the SIRT2 inhibitor of the present invention can be used as a flavoring agent such as a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, coloring agents and aging agents (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, Salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. In addition, the compounds of the present invention may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks. These components may be used independently or in combination. The ratio of such additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the compound of the present invention.

결국, 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전을 규명함으로써 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환의 예방 및 치료할 수 있는 방법이 될 수 있다.
In conclusion, it could be a method to prevent and treat renal inflammatory diseases caused by sepsis by identifying the molecular mechanisms involved in the intracellular interaction and signal transduction and regulatory mechanism of SIRT2 with renal inflammatory diseases caused by sepsis .

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and thus the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

[[ 실시예Example ]]

실시예Example 1: 실험동물의 준비 1: Preparation of experimental animals

본 발명에 사용된 실험동물로 8 내지 10 주령의 수컷 SIRT2유전자-결여된 마우스인 SIRT2-/- mice (Jackson laboratory, 미국)와 SIRT2유전자가 존재하는 마우스인 SIRT2 +/+ mice (C57BL/6, 오리엔트, 한국)를 사용하였다. 상기 실험동물에게 표준 실험실 사료와 물을 임의대로 제공하였고, 전북대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 유지하였다.
SIRT2 + / + mice (C57BL / 6 mice), which are SIRT2 - / - mice (Jackson laboratory, USA) and SIRT2 gene mice, which are male SIRT2 gene deficient mice at 8-10 weeks of age, Orient, Korea) were used. The laboratory animals were provided with standard laboratory feeds and water, and were maintained according to protocols approved by the Chonbuk National University Animal Experimental Ethics Committee.

1-1. 실험동물 준비1-1. Preparation of experimental animals

상기 실험동물은 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 4개 군으로 나누어 실험을 수행하였다.The experimental animals were divided into four groups as shown in Table 1 below.

그룹group SIRT2 유전자SIRT2 gene LPS(10㎍/㎏)LPS (10 [mu] g / kg) control buffer (CB)control buffer (CB) 1One +/++ / + -- ++ 22 +/++ / + ++ -- 33 -/-- / - -- ++ 44 -/-- / - ++ --

상기 표 1과 같이, 1)정상 실험동물 (SIRT2 +/+)에 control buffer(CB)를 투여한 대조군, 2)정상 실험동물(SIRT2 +/+)에 Lipopolysaccharide(LPS, 10 ㎍/㎏)를 투여한 대조군, 3)SIRT2유전자-결여된 마우스(SIRT2-/-)에 CB를 투여한 대조군 및 4) SIRT2유전자-결여된 마우스(SIRT2-/-)에 LPS (10 ㎍/㎏)를 투여한 대조군으로 구분하였다. 상기 control buffer와 LPS는 멸균한 생리식염수 (0.9% NaCl 100 ㎕)에 희석하여 복강 내 주사하였다.
(LPS, 10 μg / kg) was added to control animals (SIRT2 + / +) and control animals (SIRT2 + / + (3) SIRT2 gene-deficient mice (SIRT2 - / -), and (4) SIRT2 gene deficient mice (SIRT2 - Control group. The control buffer and LPS were diluted in sterile physiological saline (100 μl of 0.9% NaCl) and injected intraperitoneally.

1-2. 샘플의 준비1-2. Preparation of samples

상기 CB나 LPS를 투여한 실험동물은 투여 3시간 및 6시간 후, 케타민(ketamine, 100 ㎎/㎏)과 자이라진(xylazine, 10 ㎎/㎏)으로 마취 후 혈액과 소변, 신장 조직을 수집하였다.The animals were treated with ketamine (100 mg / kg) and xylazine (10 mg / kg) for 3 hours and 6 hours after the administration of CB or LPS. Blood, urine and kidney tissues were collected after anesthesia with ketamine .

보다 구체적으로, 상기 혈액채취는 실험동물을 케타민(ketamine) 100 ㎎/㎏과 자이라진(xylazine) 10 ㎎/㎏으로 마취시킨 후, 심장천자(cardiacpuncture)에 의해 혈액을 채취하였다. 상기 신장 조직은 채취 후 4등분 하여 2등분은 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후 CXCL2 및 CCL2 특이적으로 염색되는 항체를 이용하여 염색하여 CXCL2 및 CCL2의 발현을 확인하였다. 나머지 2등분은 RNA와 단백을 추출하여 실험에 사용하였다.
More specifically, the blood collection was performed by anesthetizing the experimental animals with 100 mg / kg of ketamine and 10 mg / kg of xylazine, and then collecting blood by cardiac puncture. The renal tissues were divided into four equal parts after collection, the second part was fixed with 4% paraformaldehyde, and the expression of CXCL2 and CCL2 was confirmed by staining with CXCL2 and CCL2-specific antibodies. The remaining two fractions were extracted from RNA and protein.

실시예Example 2: 실험재료 및 세포배양 2: Experimental material and cell culture

2-1. 세포배양2-1. Cell culture

마우스의 근위세뇨관 세포를 Dr Lloyd G. Cantley (Yale University School of Medicine, New Haven, CT, 미국)에게 제공받아, 가습된 5% CO₂ 및 95% 공기의 대기 조건, 그리고 37℃의 온도 조건에서 10%(vol/vol) 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 α-MEM 배지에서 배양하여 준비하였다.Proximal tubular cells of the mice were supplied to Dr Lloyd G. Cantley (Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA), and humidified atmospheric conditions of 5% CO ₂ and 95% air, And cultured in α-MEM medium supplemented with 10% (vol / vol) fetal bovine serum.

지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)는 시그마알드리치(St Louis, MO, 미국)에서 SIRT2억제제(inhibitor)인 AK-1(하기 화학식 1과 같은 구조를 포함함)은 calbiochem(San Diego, CA, 미국)에서 구입하여 사용하였다. Lipopolysaccharide (LPS) is a SIRT2 inhibitor AK-1 (including a structure as shown below in Formula 1) in calbiochem (San Diego, CA, USA) in Sigma Aldrich Were purchased and used.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

2-2. 2-2. SIRT2SIRT2 유전자-결여된 세포의 준비Preparation of gene-deficient cells

세포에서 SIRT2유전자를 제거하기 위하여 siRNA(100 pmol, Dharmacon ON-TARGETplus SMART pool, Dharmacon Inc., CO, 미국)와 10 ㎕ Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)을 Opti-MEM 배지에 희석하여 처리한 후, 7시간 후에 배양배지로 바꾸어 배양한다. 배양 2일 후, 세포를 수확하여 SIRT2 단백이 감소함을 확인하였다.(100 pmol, Dharmacon ON-TARGET Plus SMART pool, Dharmacon Inc., CO, USA) and 10 μl Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) were diluted in Opti-MEM medium to remove the SIRT2 gene After 7 hours, the culture medium is changed to a culture medium. After 2 days of culture, cells were harvested and SIRT2 protein was decreased.

SIRT2 siRNA처리 후 LPS와 control buffer(CB)를 처리 1, 3 및 6시간 후에 세포배양액과 RNA, 단백질을 얻어 Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)과 효소결합면역흡착분석법을 수행하였다.
Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and enzyme-linked immunosorbant assay were performed after 1, 3, and 6 hours of treatment with LPS and control buffer (CB) after SIRT2 siRNA treatment.

2-3. 2-3. SIRT2SIRT2 유전자 과발현Gene overexpression

세포 내 SIRT2유전자의 발현을 증가시키기 위해서 유전자 재조합 아데노바이러스(Ad-CMVeGFP-SIRT2; ad-SIRT2 or AD-CMVeGFP; ad-cont)를 ViraQuest, INC.( IA, 미국)에서 구입하여 사용하였다. 혈청 2%가 포함된 α-MEM배지에 바이러스를 희석하여 세포에 24시간 동안 처리 후, 배양배지로 바꾸어 48시간 배양한다. 세포 내 바이러스 감염효율은 GFP의 발현을 통해 확인하였다. (Ad-CMVeGFP-SIRT2; ad-SIRT2 or AD-CMVeGFP; ad-cont) was purchased from ViraQuest, INC. (IA, USA) to increase the expression of the SIRT2 gene in the cells. The virus is diluted in α-MEM medium containing 2% serum, and the cells are treated for 24 hours, and then cultured for 48 hours. The efficiency of intracellular viral infection was confirmed by the expression of GFP.

SIRT2유전자 재조합 아데노바이러스를 처리 후, LPS와 control buffer를 처리 1, 3 및 6시간 후에 세포배양액과 RNA, 단백을 얻어 qRT-PCR과 효소결합면역흡착분석법을 수행하였다.
After treatment with SIRT2 recombinant adenovirus, cell culture medium, RNA, and protein were obtained 1, 3, and 6 hours after LPS and control buffer treatment, and qRT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay were performed.

실시예Example 3: 3: SIRT2SIRT2 유전자-결여된 마우스에서 In gene-deficient mice LPSLPS 에 의한 On by CXCL2CXCL2 의 발현 확인Confirmation of expression of

상기 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 증가된 CXCL2의 발현 조절에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 실험동물의 신장조직에 대해 면역화학염색 및 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CXCL2의 발현을 확인하였고, 혈액에서도 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CXCL2의 발현을 확인하였다. In order to confirm whether the SIRT2 gene-deficient mouse was effective in regulating the expression of CXCL2 by LPS, the kidney tissues obtained in Example 1 were subjected to immunochemical staining and enzyme-linked immunosorbent assay The expression of CXCL2 was confirmed, and the expression of CXCL2 was also confirmed in blood by enzyme-linked immunosorbent assay.

상기 면역화학염색은 CXCL2로 염색된 근위세뇨관을 Zeiss Z1 현미경을 이용하여 가시화하는 방법으로 수행하였다. 각 부위에서 슬라이드당 10개의 무작위적, 중복되지 않는 필드를 선택하여 CXCL2 발현 양상(도 1a)을 확인하였다. The immunochemical staining was performed by visualizing the proximal tubule stained with CXCL2 using a Zeiss Z1 microscope. Ten randomized, non-overlapping fields per slide were selected at each site to confirm the expression pattern of CXCL2 (Fig. 1A).

도 1a를 통해 확인한 신장 조직 내 CXCL2 양성 세포의 밀도 및 면적을 이미지 분석 프로그램을 이용하여 계산하였다(AnalySIS, Soft Imaging System, Munster, 독일). 그 결과를 도 1b에 나타내었다.The density and area of CXCL2-positive cells in kidney tissue as determined through Figure 1A were calculated using an image analysis program (AnalySIS, Soft Imaging System, Munster, Germany). The results are shown in FIG.

또한, 혈액(도 1c) 및 신장조직(도 1d)에서 CXCL2의 발현을 효소결합면역흡착분석법 (Abcam, Cambridge, MA, 미국)을 이용하여 측정하였다.
In addition, expression of CXCL2 was measured in blood (Fig. 1C) and kidney tissue (Fig. 1D) using enzyme-linked immunosorbant assay (Abcam, Cambridge, Mass., USA).

도 1a 내지 1d에 나타난 바와 같이, LPS를 투여하였을 때 증가한 CXCL2의 발현이 SIRT2가 결여된 마우스에서 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
As shown in Figs. 1A to 1D, it was confirmed that the expression of CXCL2 increased when LPS was administered, and decreased in mice lacking SIRT2.

실시예Example 4: 4: SIRT2SIRT2 유전자-결여된 마우스에서 In gene-deficient mice LPSLPS 에 의한 On by CCL2CCL2 의 발현 확인Confirmation of expression of

상기 SIRT2유전자-결여된 마우스에서 LPS에 의해 증가된 CCL2의 발현 조절에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 실험동물의 신장조직에 대해 면역화학염색 및 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CCL2의 발현을 확인하였고, 혈액에서도 효소결합면역흡착분석법을 수행하여 CCL2의 발현을 확인하였다. In order to confirm whether the SIRT2 gene-deficient mouse was effective in regulating the expression of CCL2 by LPS, the kidney tissues obtained in Example 1 were subjected to immunochemical staining and enzyme-linked immunosorbent assay And the expression of CCL2 was confirmed in blood by enzyme - linked immunosorbent assay.

상기 면역화학염색은 CCL2로 염색된 근위세뇨관을 Zeiss Z1 현미경을 이용하여 가시화하는 방법으로 수행하였다. 각 부위에서 슬라이드당 10개의 무작위적, 중복되지 않는 필드를 선택하여 CCL2 발현 양상(도 2a)을 확인하였다. The immunochemical staining was performed by visualizing the proximal tubule stained with CCL2 using a Zeiss Z1 microscope. Ten randomized, non-overlapping fields per slide were selected at each site to confirm the expression pattern of CCL2 (Fig. 2a).

도 2a를 통해 확인한 신장 조직 내 CCL2 양성 세포의 밀도 및 면적을 이미지 분석 프로그램을 이용하여 계산하였다(AnalySIS, Soft Imaging System, Munster, 독일). 그 결과를 도 2b에 나타내었다. 또한, 혈액(도 2c) 및 신장조직(도 2d)에서 CCL2의 발현을 효소결합면역흡착분석법 (Abcam, Cambridge, MA, 미국)을 이용하여 측정하였다.
The density and area of CCL2-positive cells in the kidney tissue as determined through FIG. 2a were calculated using an image analysis program (AnalySIS, Soft Imaging System, Munster, Germany). The results are shown in FIG. 2B. Expression of CCL2 was also measured in blood (Fig. 2c) and kidney tissue (Fig. 2d) using enzyme-linked immunosorbant assay (Abcam, Cambridge, Mass., USA).

도 2a 내지 2d에 나타난 바와 같이, LPS를 투여하였을 때 증가한 CCL2의 발현이 SIRT2가 결여된 마우스에서 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
As shown in FIGS. 2A to 2D, it was confirmed that the expression of CCL2 increased when LPS was administered, and decreased in mice lacking SIRT2.

실시예Example 5: 신장세포에서 5: In kidney cells SIRT2SIRT2 유전자의 발현 조절에 따른 Regulation of gene expression CXCL2CXCL2 의 발현 확인Confirmation of expression of

실시예 2의 방법으로, 마우스의 근위세뇨관 세포에서 SIRT2유전자를 siRNA를 통해 결여시켰을 때 LPS에 의해 증가하는 CXCL2 mRNA 발현에 효과를 미치는지 확인하고자 qRT-PCR을 수행하였다. QRT-PCR was performed to confirm the effect of LPS-induced CXCL2 mRNA expression in the proximal tubular cells of the mouse, when the SIRT2 gene was deleted through siRNA, by the method of Example 2.

마우스 근위세뇨관 세포에서 RNA를 수확하기 위하여 TRI Reagent (MRC, Cincinnati, OH, 미국)를 이용하였고, SYBR® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, 미국)을 cDNA와 혼합한 후 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, 미국)이용하여 PCR을 수행함으로써 CXCL2의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다.
SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, Calif., USA) was mixed with cDNA for TRI Reagent (MRC, Cincinnati, OH, USA) for harvesting RNA from mouse proximal tubular cells, -Time PCR System (Applied Biosystems, USA) to confirm the expression of CXCL2. The results are shown in Fig.

도 3a에 나타난 바와 같이, SIRT2유전자-결여된 세포에 LPS를 처리하였을 때, LPS에 의해 증가한 CXCL2의 mRNA의 발현이 감소함을 확인하였다.
As shown in FIG. 3A, when LPS was treated with SIRT2 gene-deficient cells, it was confirmed that the expression of CXCL2 mRNA increased by LPS was decreased.

또한, 마우스 근위세뇨관 세포에서 LPS를 처리하였을 때, CXCL2유전자의 발현을 확인하기 위하여 세포배양액과 세포에서 분리한 단백질에 대하여 효소결합면역흡착분석법을 수행하였다. 그 결과를 도 3b 및 3c에 나타내었다.
When LPS was treated with mouse proximal tubular cells, enzyme - linked immunosorbant assay was performed on the proteins isolated from cell culture medium and cells to confirm the expression of CXCL2 gene. The results are shown in Figs. 3B and 3C.

도 3b 및 3c에서 나타난 바와 같이, 세포 배양액에서도 SIRT2유전자-결여된 실험군에서 CXCL2의 발현이 감소함을 확인할 수 있었고, 세포에서 추출한 단백질 역시 SIRT2유전자가 결여되었을 때 CXCL2의 발현이 유의성 있게 감소함을 확인할 수 있었다.
As shown in FIGS. 3B and 3C, the expression of CXCL2 was decreased in the SIRT2 gene-deficient experimental group, and the expression of CXCL2 was significantly decreased when the SIRT2 gene was deleted from the cells. I could confirm.

나아가, 아데노바이러스를 이용하여 SIRT2유전자의 발현을 증가시켰을 때 CXCL2의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 3d-f에 나타내었다.
Furthermore, expression of CXCL2 was confirmed when adenovirus was used to increase the expression of SIRT2 gene. The results are shown in Fig. 3d-f.

도 3d-f에 나타난 바와 같이, SIRT2유전자의 발현이 증가되었을 때 LPS에 의해 CXCL2의 발현이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
As shown in Fig. 3d-f, when the expression of SIRT2 gene was increased, the expression of CXCL2 was significantly increased by LPS.

실시예Example 6: 신장세포에서 6: in kidney cells SIRT2SIRT2 유전자의 발현 조절에 따른 Regulation of gene expression CCL2CCL2 의 발현 확인Confirmation of expression of

상기 실시예 4와 동일한 방법으로 CCL2의 발현양상을 확인하였다.The expression pattern of CCL2 was confirmed in the same manner as in Example 4 above.

상기 도 4에 나타난 바와 같이, 세포에 LPS를 처리 하였을 때 증가한 CCL2의 발현이 SIRT2유전자-결여된 세포에서는 현저히 감소함을 확인할 수 있었고, 아데노바이러스에 의해 SIRT2 유전자가 과발현한 세포에서는 CCL2의 발현이 더욱 더 증가함을 확인할 수 있었다.
As shown in FIG. 4, it was confirmed that CCL2 expression was significantly decreased in cells lacking SIRT2 gene when cells were treated with LPS, and CCL2 expression was observed in cells overexpressing SIRT2 gene by adenovirus And it was confirmed that it increased further.

따라서, 도 3 내지 4에 나타난 바와 같이, SIRT2유전자의 발현이 LPS 처리에 의해 증가한 염증유발인자인 CXCL2 및 CCL2의 발현에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
Therefore, as shown in FIGS. 3 to 4, it was confirmed that the expression of SIRT2 gene affects the expression of CXCL2 and CCL2, which are inflammatory inducers that were increased by LPS treatment.

실시예Example 7: 신장세포에서 7: in kidney cells SIRT2SIRT2 억제제에 의한 By inhibitor CXCL2CXCL2 및 And CCL2CCL2 의 발현 확인Confirmation of expression of

마우스 근위세뇨관 세포에 LPS 처리 30분 전에 미리 SIRT2억제제인 AK-1(10μM)을 처리한 후, LPS(10㎍/㎖)를 1시간 동안 처리하고 세포를 수확하여 CXCL2 및 CCL2의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
The proximal tubule cells were treated with SIRT2 inhibitor AK-1 (10 μM) 30 minutes before LPS treatment, treated with LPS (10 μg / ml) for 1 hour, harvested and the level of mRNA expression of CXCL2 and CCL2 qRT-PCR. The results are shown in Fig.

도 5에서 나타난 바와 같이, SIRT2억제제인 AK-1을 처리하였을 때, LPS에 의해 증가된 CXCL2 및 CCL2의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.
As shown in FIG. 5, when AK-1, which is a SIRT2 inhibitor, was treated, the expression of CXCL2 and CCL2 increased by LPS was decreased.

실시예Example 8: 8: NGALNGAL 및 And KIMKIM -1 함량 측정을 통한 신장기능 손상도 확인-1 content of kidney

마우스에 LPS를 처리하였을 때 신장기능 손상을 확인하기 위하여 LPS 처리 3 시간 후 실시예 1의 방법으로 마취 한 후, 방광을 통해 소변을 수확하였다. 수확한 소변은 효소결합면역흡착분석법을 통해 NGAL 및 KIM-1(R&D system, Minneapolis, MN, 미국)의 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
When mice were treated with LPS, the animals were anesthetized by the method of Example 1 after 3 hours of LPS treatment and then the urine was harvested through the bladder in order to check for renal damage. The contents of NGAL and KIM-1 (R & D system, Minneapolis, MN, USA) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The results are shown in Fig.

도6에 나타난 바와 같이, LPS를 투여한 대조군에서 증가한 NGAL 및 KIM-1의 함량이 SIRT2유전자-결여된 마우스에서는 유의성 있게 감소함을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 6, it was confirmed that the content of NGAL and KIM-1 increased in the control group to which LPS was administered significantly decreased in the SIRT2 gene-deficient mouse.

통계학적 분석Statistical analysis

데이터를 평균±표준편차로 나타내었다. 아노바(ANOVA)를 이용한 유의차로 다중 비교하고 터키사후검정을 이용한 개별 비교를 하였으며, 통계적 유의성은 p<0.05로 수행하였다.
Data are presented as mean ± standard deviation. Anova (ANOVA) was used for statistical significance (p <0.05).

따라서, 본 발명의 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환과 SIRT2의 세포내 상호작용 및 신호전달과 조절기작에 연관된 분자적 기전을 규명함으로써 패혈증에 의해 유발되는 신장 염증성 질환의 예방 및 치료할 수 있는 방법이 될 수 있다.Accordingly, the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases of the present invention can be used for the treatment and prophylaxis of sepsis-induced renal inflammatory diseases and the intracellular interaction of SIRT2, and molecular mechanisms involved in signal transduction and regulatory mechanisms, And can be a preventive and remedy for a kidney inflammatory disease.

Claims

A pharmaceutical composition for the prophylaxis and treatment of an inflammatory disease comprising AK-1 represented by the formula (1) as an SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
[Chemical Formula 1]

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the inflammatory disease is a renal inflammatory disease caused by sepsis.

delete

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for the prophylaxis and treatment of inflammatory diseases, characterized by inhibiting renal inflammation and inhibiting renal damage by inhibiting the expression of CXCL2 and CCL2, which are LPS- Composition.

A health functional food for preventing and ameliorating an inflammatory disease comprising AK-1 represented by the formula (1) as an SIRT2 inhibitor as an active ingredient.
[Chemical Formula 1]