KR101618034B1 - 금 나노입자가 고정된 산화아연 나노막대를 포함하는 전기화학센서 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전기화학센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로 산화아연 나노 막대를 지지체로 하고, 상기 산화아연 나노 막대에 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자를 고정함으로써 생체적합성이 향상될 뿐만 아니라, 금 클러스터 나노입자와 산화아연 나노 막대 간의 결합력이 향상되므로 센서의 민감도가 높아지고, 최종 생성물이 빠르게 검출되어 효율적으로 효소활성을 정량적으로 측정할 수 있다.

Description

금 나노입자가 고정된 산화아연 나노막대를 포함하는 전기화학센서 및 이의 제조방법{Redox-active gold nanoparticles immobilized on ZnO-nanorod electrodes for biosensing applications}
본 발명은 금 나노입자가 고정된 산화아연 나노막대를 포함하는 전기화학센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 많은 종류의 나노 물질 합성하게 되면서 센서를 구성할 때, 분석물질을 인식할 수 있는 수용체를 고정시킬 수 있는 지지체(immobilizing matrices)로 산화 아연 나노 구조(nanostructured ZnO)를 사용하는 센서가 개발되어 왔다.
특히, 산화아연(ZnO) 나노막대(nanorod) 또는 나노선(nanowires)는 화학 센서(chemical sensor)로 큰 주목을 받고 있다. 산화아연 나노구조가 3.37 eV 정도의 밴드갭 에너지와 60 meV의 큰 엑시톤(exciton) 바인딩 에너지를 가지고 있을 뿐만 아니라, 높은 압전특성과 화학적 감지특성(sensing properties)를 가지고 있기 때문이다.
이러한 산화아연 나노막대 또는 나노선을 이용한 화학센서로는 대한민국 공개특허 제10-2012-0027725호가 공지되어 있으며, 절연막 상에 형성된 금속 나노막대를 포함하는 박막 트랜스듀서용 멤브레인에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 금속 나노막대는 생물학적 활성물질을 검출하기 위한 탐침물질이 고정되어 있는 티올기로 기능화된 금인 것을 특징으로 한다. 다만, 상기 박막 트랜스듀서용 멤브레인의 전기적 검출방식이 표적물질과의 결합에 따라 금속막과 기판에 구비된 전극 사이의 거리 변화에 따른 정전용량 변화를 측정하는 방식으로 이루어지므로 민감도 및 신뢰성이 약하다는 문제가 존재한다.
다른 일례로, 진단용 센서에 산화아연 나노 구조물을 이용한 기술이 공지되어 있으나, 이는 독성이 있는 톨루이딘 블루(toluidine blue)와 같은 산화 환원 매개체를 포함하므로 바이오 센서와 같은 의료분야에 이용이 제한된다.(비특허 문헌 1)
특허 문헌 1. 대한민국 공개특허 제10-2012-0027725호
비특허 문헌 1. Hu, W.; Liu, Y.; Yang, H.; Zhou, X.; Li, C. M. Biosensors and Bioelectronics, 2011, 26, 3683.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 산화아연 나노 막대 및 리간드로 보호된 금 나노입자를 이용하여 전기화학센서를 제조함으로써, 효소활성을 정량적으로 측정할 수 있는 고감도의 전기화학센서를 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 전기화학센서를 대량생산하기 위한 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자; 및 상기 금 클러스터 나노입자가 고정된 산화아연 나노 막대를 포함하는 전기화학센서를 제공한다.
상기 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자와 산화아연 나노 막대는 정전기적 인력에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 산화아연 나노 막대의 지름은 50~200 ㎚이고, 길이가 1~2 ㎛인 것을 특징으로 한다.
상기 글루타티온 리간드는 L-환원형 글루타티온인 것을 특징으로 한다.
상기 전기화학센서는 pH 8~9 범위 내에서 작동하는 것을 특징으로 한다.
상기 전기화학센서는 p-아미노페놀을 전기화학적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.
상기 전기화학센서는 특정 효소의 활성을 정량적으로 측정하는 것을 특징으로 한다.
상기 효소는 p-아미노페닐 포스페이트(p-aminophynyl phosphate(p-APP))를 p-아미노페놀(p-aminophenol(p-AP))로 변환시키는 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline Phosphatase(ALP))인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 아래 단계를 포함하는 전기화학센서의 제조방법을 제공한다.
Ⅰ) 금 클러스터 나노입자의 표면에 글루타티온 리간드를 결합시키는 단계,
Ⅱ) 기판 상에 산화아연 나노 막대를 성장시키는 단계, 및
Ⅲ) 상기 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자에 상기 산화아연 나노 막대를 결합시켜 고정하는 단계.
상기 Ⅰ) 단계는 Ⅰ-ⅰ) 글루타티온 리간드 용액과 금 수화물 용액을 혼합하는 단계; Ⅰ-ⅱ) 상기 혼합물에 수소화붕소나트륨을 첨가하여 환원반응을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 Ⅱ) 단계는 Ⅱ-ⅰ) 기판 상에 아연 시드층을 형성하는 단계; Ⅱ-ⅱ) 상기 아연 시드층이 형성된 기판을 질산아연이 포함된 용액에 담근 후, 가열하는 단계; 및 Ⅱ-ⅲ) 상기 아연 시드층이 형성된 기판 상에 산화아연 나노 막대가 성장하는 단계;를 포함하고,
상기 Ⅱ-ⅱ) 단계는 50-100 ℃로 0.5-4 시간 동안 가열되는 것을 특징으로 한다.
상기 Ⅲ) 단계는 pH 8-9로 조절한 후에 수행되는 것을 특징으로 한다.
이에 따르면, 본 발명은 전기화학센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로 산화아연 나노 막대를 지지체로 하고, 상기 산화아연 나노 막대에 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자를 고정함으로써 생체적합성이 향상될 뿐만 아니라, 금 클러스터 나노입자와 산화아연 나노 막대 간의 결합력이 향상되므로 센서의 민감도가 높아지고, 최종 생성물이 빠르게 검출되어 효율적으로 효소활성을 정량적으로 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 제조된 전기화학센서의 구조를 나타낸 평면도이다.
도 2는 본 발명의 전기화학센서에 포함되는 글루타티온의 pKa를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 제조예 1에 따른 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자(Au25GS18)의 합성과정을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대의 합성과정을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 전기화학센서를 제조하는 과정을 나타내는 도면이다.
도 6은 제조예 1에 따른 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자(Au25GS18)의 UV-vis 흡수 스펙트럼이다.
도 7은 제조예 1에 따른 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 이미지이다.
도 8a, b는 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대의 옆면과 상면을 촬영한 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 9는 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대의 XRD 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 10a는 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대의 표면을 촬영한 투과전자현미경(TEM) 이미지이다.
도 10b는 실시예 1에 따른 전기화학센서의 산화아연 나노 막대 표면을 촬영한 투과전자현미경(TEM) 이미지이다.
도 10c는 실시예 1에 따른 전기화학센서의 상면을 촬영한 투과전자현미경(TEM) 이미지이다.
도 10d는 실시예 1에 따른 전기화학센서의 XPS 패턴이다.
도 11은 실시예 1에 따른 전기화학센서를 SEM-EDS(Scanning Electron Microscope and Energy Dispersive X-Ray Spectrometer)로 측정한 그래프이다.
도 12a는 산화인듐주석으로 코팅된 유리판(ITO 유리판), 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대, 실시예 1에 따른 전기화학센서 각각의 순환 전압전류법(CV) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12b는 다양한 스캔 속도(5-200 mV/s)에서 실시예 1에 따른 전기화학센서의 순환 전압전류법(CV) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12c는 스캔속도의 제곱근에 대한 산화 및 환원 전류의 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 13a는 실시예 1에 따른 전기화학센서의 제조과정 중에서 드롭-캐스팅하는 횟수에 따라 산화아연 나노 막대 표면에 고정화되는 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자(Au25GS18)의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 13b는 고정화된 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자(Au25GS18) 개수를 변화시켰을 때, 실시예 1에 따른 전기화학센서의 민감도를 나타낸 그래프이다.
도 14는 p-아미노페놀 농도를 0, 0.05, 0.11, 0.17, 0.23 mM으로 변화시켰을 때, 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대(a), 실시예 1에 따른 전기화학센서(b)의 전압전류 그래프이다.
도 14c는 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대(a), 실시예 1에 따른 전기화학센서(b)의 전압전류 그래프로부터 p-아미노페놀의 함량을 결정하기 위한 교정 그래프이다.
도 15a는 실시예 1에 따른 전기화학센서에 알칼리성 인산가수분해효소를 적과하였을 때의 전압전류 그래프이다.
도 15b는 상기 실시예 1에 따른 전기화학센서의 전압전류 그래프로부터 알칼리성 인산가수분해효소의 활성도를 결정하기 위한 교정 그래프이다.
도 16a는 실시예 1에 따른 전기화학센서에 120초 후에 알칼리성 인산가수분해효소를 적과하여 주었을 때 크로노암페로메트리(chronoamperometry)법을 이용하여 측정한 전압전류 그래프이다.
도 16b는 상기 실시예 1에 따른 전기화학센서의 전압전류 그래프로부터 알칼리성 인산가수분해효소의 활성도를 결정하기 위한 교정 그래프이다.
우선, 센서(sensor)는 화학적 물리적 생물학적 변화를 감지하여 읽을 수 있는 신호로 변환해 주는 장치로서, 일반적으로 전기화학적 감지(electrochemical detection)를 이용하는데, 이는 가격이 저렴하고, 사용이 용이하며, 이동성 및 휴대성이 좋고, 검출한계가 낮으면서 신호 처리가 간편하기 때문이다.
상기 센서의 효율을 향상시키기 위해서는 반응시간, 잡음비(signal to nose), 선택성 및 검출한계를 향상시켜야 하며, 특히, 검출한계는 신호를 선택적으로 인식할 수 있는 인식률과 효율적인 변환과정이 요구된다.
일례로 종래 전기화학센서는 산화/환원 활성을 갖는 독성의 물질을 포함하여야만 전기화학센서로 이용이 가능하였으며, 이는 바이오 센서와 같은 분야에 제한적이라는 문제가 있다.
따라서, 본 발명은 트리펩타이드의 일종인 글루타티온을 이용하여 생체에 적합하면서도 금 클러스터 나노입자와 산화아연 나노 막대의 밀접한 결합을 갖는 고감도의 전기화학센서를 구현하였다.
이하에서, 본 발명에 따른 상기 전기화학센서에 대해 보다 상세하게 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면은 기판; 상기 기판 상에 형성된 수직 배열 구조의 산화아연 나노 막대; 및 상기 산화아연 나노 막대 표면에 결합된 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자;에 관한 것으로, 본 발명에 따른 금 클러스터 나노입자는 25개로 제한된 원자개수의 동일한 원자수를 갖는 매우 균일한 입자로서, 양자제한효과가 적용되어 양자점의 특성을 갖는다.
이때, 상기 금 클러스터 나노입자의 직경은 0.1 내지 2.0 nm의 양자크기일 수 있다. 이러한, 양자크기의 금 클러스터 나노입자는 전기화학적 촉매 활성을 나타내는 산화/환원의 매개체와 전자 전달의 전도체의 이중적 역할을 하므로 추가의 전자전달 매개체를 필요하지 않으므로 이를 이용한 전기화학센서는 간단한 구성을 가진다.
상기 금 클러스터 나노입자는 작용기 및 리간드의 종류에 따라 달라지는 금 클러스터 나노입자의 음 또는 양전하성의 크기에 의해 표적물질인 단백질, DNA, RNA 및 효소와의 상호관계에 영향을 미치게 된다.
따라서, 본 발명에서는 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP)의 효소활성을 측정하기 위해 글루타티온을 리간드로 사용하는 것이 바람직하며, L-환원형 글루타티온을 사용하는 것이 가장 바람직한데, 리간드로 산화형 글루타티온 및 종래 유기싸이올계 리간드를 사용할 경우, 금 클러스터 나노입자와 산화아연 나노 막대 간의 강한 결합이 형성되지 않아 제조된 전기화학센서의 민감성이 저하되는 문제가 발생한다.
또한, L-환원형 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자는 표면개질 및 리간드 말단의 기능화와 같은 추가과정을 도입하지 않아도 물에 잘 녹는다는 특성이 있고, 이를 이용하면 상기 L-환원형 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자를 물에 녹인 후, 메탄올을 첨가하면 용매화될 때 필요한 힘보다 반데르 발스 힘이 더 큰 무거운 금 클러스터 나노입자는 뭉쳐서 침전되므로 이를 통해 보다 간편한 방법으로 25개로 제한된 원자개수를 갖는 매우 균일한 입자를 분리할 수 있다.
상술한 바와 같이, L-환원형 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자는 산화아연 나노 막대에 고정되는데, 이때, 상기 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자와 산화아연 나노 막대는 강하게 결합된다.
보다 구체적으로, 상기 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자는 도 2에 나타난 바와 같이, 2 개의 카르복실기를 가지고 있으므로 음전하를 띄고 있고, 산화아연 나노 막대는 약 9.5의 높은 등전점(isoelectric point)을 가지므로 상기 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자와 산화아연 나노 막대는 정전기적 인력으로 강하게 결합하게 된다.
이때, 산화 아연 나노막대 위에 물에 녹인 L-환원형 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노 입자를 떨어트리는 드롭-캐스팅 단계의 횟수를 제어함으로써, 산화아연 나노 막대에 고정화되는 L-환원형 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자(Au25GS18)의 개수를 조절 할 수 있다.
상기 기판은 전도성 기판이라면 이에 제한되지 않으나, 보다 바람직하게는 사파이어(sapphire), 유리(glass), 실리콘(Si), 산화인듐주석(ITO) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 산화아연 나노 막대는 기판 상에 수직 배열 구조로 성장될 수 있는데, 이는 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자를 고정하는 지지체 역할뿐만 아니라, 전자 전도체 역할도 동시에 수행한다.
특히, 상기 산화아연 나노 막대가 수평 배열 구조로 성장할 경우, 산화아연 나노 막대의 표면적이 낮아 효소 반응을 통해 생성된 최종 생성물을 빠르게 검출하지 못한다는 문제가 발생할 수 있다.
이때, 상기 산화아연 나노 막대는 지름이 50~200 ㎚이고, 길이가 1~2 ㎛인 것이 바람직한데, 200 ㎚를 초과하게 되면 산화아연 나노 막대 간의 거리가 좁아지므로 서로 엉겨 성장하므로 균일하지 못하다는 문제가 발생한다. 또한, 길이가 1~2 ㎛의 범위를 벗어나면 제조되는 산화아연 나노 막대가 균일하게 성장하지 못하는 문제가 발생한다.
상기 전기화학센서는 p-아미노페놀(p-aminophenol(p-AP))을 전기화학적으로 검출하는 것을 특징으로 하는데, 이는 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP)의 반응결과로 생성되는 최종 생성물이다.
따라서, p-아미노페놀(p-aminophenol(p-AP))의 검출을 통해 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP)의 효소활성을 측정할 수 있다는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 상기 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP)의 반응은 p-아미노페닐 포스페이트(p-aminophynyl phosphate(p-APP))를 p-아미노페놀(p-aminophenol(p-AP))로 변환시키는 과정을 의미한다.
종래 알칼리성 인산가수분해효소를 검출하기 위한 방법으로는 비색 정량 분석법이 공지되어 있다. 보다 구체적으로 4-나이트로페닐 포스페이트(4-nitrophenyl phosphate)에 알칼리성 인산가수분해효소(ALP)를 첨가하고, 탈인산화(dephosphorylation)과정을 거쳐 4-나이트로페놀(nitrophenol)이 생성되며, 상기 과정에서 나타나는 색 변화를 측정하여 알칼리성 인산가수분해효소를 정량하는 방법이다. 이러한 분석법은 긴 반응 시간이 요구된다는 문제가 있다.
상술한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 산화아연 나노 막대와 금 클러스터 나노입자를 밀접하게 결합시키고 안정적으로 고정하여 반응 시간을 단축시킨 고감도의 전기화학센서를 개발하였다.
또한, 본 발명의 전기화학센서는 표적물질 및 활성물질을 포함하지 않고 전기적 활성을 갖는 p-아미노 페놀을 검출할 수 있으므로 종래 전기화학센서에 비해 간단한 구조를 통해 감도 및 반응시간이 우수한 전기화학센서를 제공한다.
이때, 전기화학센서는 p-아미노페놀에 대한 민감도가 100-200 ㎂/mM이고, 검출한계(detection limit)가 0.1~0.5 μM이다.
본 발명의 다른 측면은 Ⅰ) 금 클러스터 나노입자의 표면에 글루타티온 리간드를 결합시키는 단계; Ⅱ) 기판 상에 산화아연 나노 막대를 성장시키는 단계; 및 Ⅲ) 상기 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자에 상기 산화아연 나노 막대를 결합시켜 고정하는 단계;를 포함하는 전기화학센서의 제조방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 Ⅰ) 단계는 Ⅰ-ⅰ) 글루타티온 리간드 용액과 금 수화물 용액을 혼합하는 단계, 및 Ⅰ-ⅱ) 상기 혼합물에 수소화붕소나트륨을 첨가하여 환원반응을 수행하는 단계를 포함하고,
상기 Ⅱ) 단계는 Ⅱ-ⅰ) 기판 상에 아연 시드층을 형성하는 단계; Ⅱ-ⅱ) 상기 아연 시드층이 형성된 기판을 질산아연이 포함된 용액에 담그어 50-100 ℃로 0.5-4 시간동안 가열하는 단계; 및 Ⅱ-ⅲ) 상기 아연 시드층이 형성된 기판 상에 산화아연 나노 막대가 성장하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 기판은 전도성 기판이라면 이에 제한되지 않으나, 보다 바람직하게는 사파이어(sapphire), 유리(glass), 실리콘(Si), 산화인듐주석(ITO) 및 금(Au)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이때, 상기 Ⅰ) 단계에서 제조된 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자는 표면개질 및 리간드 말단의 기능화와 같은 추가과정을 도입하지 않아도 물에 잘 녹는다는 특성이 있고, 이를 이용하면 상기 L-환원형 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자를 물에 녹인 후, 메탄올을 첨가하면 용매화될 때 필요한 힘보다 반데르 발스 힘이 더 큰 무거운 금 클러스터 나노입자는 뭉쳐서 침전되므로 이를 통해 보다 간편한 방법으로 25개로 제한된 원자개수를 갖는 매우 균일한 입자를 분리할 수 있다.
이때, 상기 산화아연 나노 막대는 상기 Ⅱ-ⅱ) 단계에서 온도와 시간을 조절하여 제조되는 산화아연 나노 막대의 길이와 지름을 조절할 수 있는데, 온도가 증가하고 반응시간이 길어질수록 산화아연 나노 막대의 길이와 지름이 커진다. 따라서, 상기 산화아연 나노 막대의 가열 온도 또는 가열 시간이 50 ℃ 또는 0.5 시간 미만이면 산화아연 나노 막대의 지름과 길이가 줄어들어 표면적이 충분하지 못하므로 전기화학센서의 민감도가 저하되고, 100 ℃ 또는 4 시간을 초과하게 되면 산화아연 나노 막대의 지름과 길이가 커지게 되어 산화아연 나노 막대 간의 거리가 좁아지고, 엉겨서 성장하므로 균일하지 못한 산화아연 나노 막대를 얻는다는 문제가 있다.
상기 Ⅲ) 단계는 산화 아연 나노막대 위에 물에 녹인 L-환원형 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노 입자를 떨어트리는 드롭-캐스팅 단계를 포함하고, 이러한 드롭-캐스팅 단계의 횟수를 제어함으로써, 산화아연 나노 막대에 고정화되는 L-환원형 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자(Au25GS18)의 개수를 조절 할 수 있다.
또한, 상기 Ⅲ) 단계는 pH를 8-9로 조절한 후에 수행되는 것이 바람직한데, 상기 pH 범위를 벗어날 경우, 상기 산화아연 나노 막대와 상기 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자 간의 정전기적 인력이 저하되어 밀접한 결합을 형성하기가 어렵다.
일반적으로 효소는 세포와 조직 안에 위치하면서 그들의 고유한 촉매 기능을 수행하지만, 질병에 걸린 인체 내의 효소는 과다해지거나 부족해지게 된다. 따라서, 인체 내의 효소 농도를 측정하여 질병을 진단하는 연구가 주목을 받고 있다.
일례로 효소 중의 하나인 알칼리성 인산가수분해효소는 대부분의 신체 내에 존재하며, 파제트병, 골연화, 간염 및 폐색성 황달과 같은 질병에 걸릴 경우 증가하고, 구루병에 걸릴 경우, 효소활성이 저하된다고 알려져 있다.
따라서, 상술한 바와 같이 제조된 고감도의 전기화학센서를 이용하여 상기 알칼리성 인산가수분해효소를 분석함으로써 인체의 중요한 질병을 진단할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 가지고 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하기로 한다.
제조예 1.
도 3에 따라 고도로 단분산된, L- 환원형 글루타티온 리간드로 보호된 Au25나노입자(Au25)를 합성하고, [Au25(GS)18]-임을 확인하였다.
우선, 알칼리성 인산가수 분해 효소(Alkaline phosphatase, ALP) enzyme, EC 3.1.3.1, from Bovine intestinal mucosa 7500 U/mg), 4염화금산 3수화물(hydrogen tetrachloroaurate trihydrate, HAuCl4·H2O,reagentgrade), 수소화 붕소 나트륨(sodium borohydride , NaBH4,99%), L-환원형 글루타티온 (L-glutathione reduced,>99%), 아연 아세테이트 2수화물(Zinc acetate dihydrate , Zn(OAc)2·2H2O,99.5%), 질산아연 6수화물 (Zinc nitrate hexahydrate, ZnNO3·6H2O,99%) 헥사메틸렌 테트라민 (hexamethylenetetramine, C6H12N4,99%)은 모두 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하여 사용 하였고, 인듐주석산화물(ITO)로 코팅된 유리판은 삼성정밀화학에서 구입하여 사용하였다. 물은 Millipore Milli-Q 시스템(18.2 MΩm)으로 정제하여 사용하였다. 모든 화학물질은 더 이상의 정제 없이 구입한 그대로 사용하였다.
구체적인 합성 과정은 다음과 같다. L-환원형 글루타티온으로 보호된 금 클러스터 나노입자(이하, Au25GS18라고도 한다.)는 브루스트-시프릿(Brust-Schiffrin)법을 개선한 합성법을 사용하였다. 싸이올/금의 몰비를 4:1로 하였다. 자세히 설명하자면, 40 mL의 물에 용해된 1.23 g (4.0 mmol) 의 글루타티온(L-glutathione, GS)을 교반하며, 80 mL의 메탄올에 용해된 0.394 g (1.0 mmol)의 HAuCl4·H2O을 천천히 가하였다. 45 분간의 추가 교반이 진행됨에 따라 불투명한 노란색에서 흰색 현탁액의 Au(Ⅰ)-GS polymer을 형성한다. 냉각시킨 10 mL의 물에 용해된 0.374 g (10.0 mmol)의 환원제 NaBH4용액을 격렬히 교반하고 있는 용액에 신속하게 가하였다. 용액은 즉시 흑갈색으로 변하였는데, 이는 L-환원형 글루타티온으로 보호된 금 나노입자가 형성되었음을 뜻한다. 90분 동안 추가로 교반한다. 반응이 완결되면 회전 증발하여 용매를 완전히 제거한 후 10 mL의 물에 용해시키고 2 mL의 비용매인 메탄올을 넣어 생기는 고체를 원심분리기를 이용하여 침전시키고, 다시 가라앉지 않은 용액에 추가로 2 mL의 메탄올을 넣어주어 원심분리를 하여 침전시키는 과정을 반복한다. 이 과정을 통해 입자크기가 작은 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자를 분리하고, 이 고체를 과량의 메탄올을 넣어 불순물을 제거하여 L-환원형 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자(Au25GS18) 60 mg를 수득하였다.
제조예 2.
먼저 2.5 x 1.0 cm2의 산화인듐주석으로 코팅된 유리판(ITO 유리판)을 세척하기 위하여 수산화칼륨이 포화된 아이소프로판올에 2 시간동안 담근 후에 물과 에탄올을 이용하여 표면의 이물질을 제거하고 아르곤 가스를 이용하여 표면을 건조시킨다. 0.005 M의 징크아세테이트 2수화물(Zinc acetate dihydrate) 에탄올 용액을 산화인듐주석으로 코팅된 유리판(ITO 유리판) 표면에 용액을 떨어 트려 30 초간 적셔 준 후 에탄올을 이용하여 씻어주고 아르곤 가스를 이용하여 말리는 과정을 5 회 반복하여 산화인듐주석으로 코팅된 유리판(ITO 유리판) 표면을 코팅시켜 준다. 상기 산화인듐주석으로 코팅된 유리판(ITO 유리판)에 코팅된 징크아세테이트가 미소결정을 이루어 산화인듐주석으로 코팅된 유리판(ITO 유리판) 위에 산화아연의 시드(seed)가 되도록 350 ℃, 20 분간 가열하여 준다. 산화아연 시드층은 나노막대가 더 일정한 방향성을 가지고 자랄 수 있도록 도와준다. 5 mL의 0.025 M의 질산아연(Zinc nitrate)과 0.025 M 헥사메틸렌테트라민(Hexamethylenetetramine)을 10 mL 바이알에 넣고 산화아연 시드층을 만든 산화인듐주석으로 코팅된 유리판(ITO 유리판)을 비스듬하게 넣고 오븐 안에서 80 ℃, 3 시간 가열해준다. 가열과정을 거치면 높은 방향성과 지름이 150 nm 길이가 1.5 μm의 균일한 크기를 가진 산화아연 나노막대가 형성된다. 이때, 가열 시간과 온도, 농도를 조절하면 산화아연 나노막대의 굵기와 길이를 조절할 수 있다.
실시예 1.
Au25GS18를 산화아연 나노 막대에 고정시키는 방법은 가장 먼저, 50 ℃온도 하에서, 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대에 제조예 1에 따른 Au25GS18 용액(0.1-1 mg/mL)을 50 μL씩 떨어뜨린 후, 10 분간 지속한 다음 물을 이용하여 반응하지 않고 남은 Au25GS18를 제거하고, 공기 중에서 건조한다.
도 6은 제조예 1에 따른 Au25GS18의 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로, 이때, UV-Vis 스펙트럼은 Shimadzu UV-Vis NIR 분광계(UV 3600)로 측정하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 제조예 1에 따른 Au25GS18는 종래 문헌에서 나타난 흡수 그래프와 동일하게 측정되었으며, 이는 Au25GS18가 균일하게 잘 합성되었음을 의미한다.
도 7은 제조예 1에 따른 Au25GS18의 투과전자현미경(TEM) 이미지로, 이때, JEOL 투과전자현미경(JEOL 2100F)을 사용하여 상기 Au25GS18의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 기록하였다. 투과전자현미경(TEM)의 샘플은 1 mg/mL의 Au25GS18를 400 메쉬 폼바/탄소 코팅된 구리격자 위에 드롭-캐스팅한 후 실온에서 1 시간 동안 건조하여 제조하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 제조예 1에 따른 Au25GS18의 평균 핵 지름은 1.1 nm로 측정되었으며, 상기 Au25GS18가 균일하게 형성되었다는 것을 나타낸다.
도 8a, b는 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대의 옆면과 상면을 촬영한 주사전자현미경(SEM) 이미지로, 상기 산화아연 나노 막대는 시드층을 통해 제조되어 균일하고 밀도가 높으며, 일정한 방향성을 가진다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 8a, b를 통해 상기 산화아연 나노 막대의 지름이 150 ㎚이고, 길이가 1.5 ㎛라는 것을 확인하였다.
도 9는 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대의 XRD 패턴을 나타낸 그래프로, 이를 통해 상기 산화아연 나노 막대가 수직(002) 면으로 일정하게 성장하였음을 확인할 수 있다.
도 10a는 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대의 표면을 촬영한 투과전자현미경(TEM) 이미지이고, 도 10b는 실시예 1에 따른 전기화학센서의 산화아연 나노 막대 표면을 촬영한 투과전자현미경(TEM) 이미지이며, 도 10c는 실시예 1에 따른 전기화학센서의 상면을 촬영한 투과전자현미경(TEM) 이미지이며, 도 10d는 실시예 1에 따른 전기화학센서의 XPS 패턴이다.
도 10a와 도 10b를 비교하면 실시예 1에 따른 전기화학센서의 산화아연 나노 막대의 표면에 Au25GS18가 균일하게 고정화되어 있다는 것을 확인할 수 있고, 도 10c를 통해서는 Au25GS18가 고정화된 산화아연 나노 막대의 형태가 어떠한 변형도 나타내지 않음을 확인할 수 있다. 이는 Au25GS18과 산화아연 나노 막대의 결합이 서로 간에 단순 정전기적 인력에 의한 결합으로 이루어져 물리적인 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
도 10d는 ESCALAB 220i-XL(VG Scientific Unstrument), X-ray source는 AI Kα(1486.6eV)를 사용하여 측정하였으며, 실시예 1에 따른 전기화학센서의 XPS 패턴은 산화아연 나노막대와 Au25GS18의 XPS 패턴이 겹쳐져서 측정됨을 확인할 수 있으며, 이를 통해 실시예 1에 따른 전기화학센서는 Au25GS18이 고정된 산화아연 나노막대를 포함하고 있다는 것을 알 수 있다.
도 11은 실시예 1에 따른 전기화학센서를 SEM-EDS(Scanning Electron Microscope and Energy Dispersive X-Ray Spectrometer)로 측정한 그래프로, 이에 따르면, 금(Au)와 아연(Zn)에 대한 신호가 관측되므로 실시예 1에 따른 전기화학센서의 산화아연 나노 막대에 Au25GS18가 고정되어있음을 확인할 수 있다.
도 12a는 산화인듐주석으로 코팅된 유리판(ITO 유리판), 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대, 실시예 1에 따른 전기화학센서 각각의 순환 전압전류법(CV) 결과를 나타내는 그래프이고, 도 12b는 다양한 스캔 속도(5-200 mV/s)에서 실시예 1에 따른 전기화학센서의 순환 전압전류법(CV) 결과를 나타내는 그래프이며, 도 12c는 스캔속도의 제곱근에 대한 산화 및 환원 전류의 변화량을 나타낸 그래프이다.
이때, 전기화학 측정을 위해 전기화학분석용 워크스테이션(Model 660 B, CH Instruments)을 사용하였으며, 0.1 M KCl 수용액 내에서 순환 전압전류법(CV)으로 실시예 1에 따른 전기화학센서(작업전극)의 전기화학 특성과 전기촉매 활성을 조사하였다. 상기 작업전극은 실시예 1에 따른 전기화학센서이고, 상대전극은 Pt선, 기준전극은 Ag/AgCl(3 M NaCl)전극을 사용하는 3전극 시스템을 사용했다. 또한, 전기화학적 특성을 비교하기 위해 전극 면적을 고정하는데 비 전도성 물질인 에폭시(epoxy)를 이용하여 1.0x1.0 cm2로 마스킹하였다.
상기 도 12a에 따르면, 실시예 1에 따른 전기화학센서에서만 뚜렷한 산화 환원 피크가 0.23과 0.17 V에서 관찰되었으며, 이는 Au25GS18에 의해 발생한 것으로 여겨진다. 또한, 연속적인 측정 실험에서도 실시예 1에 따른 전기화학센서의 산화 환원 피크의 크기가 안정적이고 재현성있게 나타났음을 확인하였다.
또한, 상기 도 12b 및 도 12c에 따르면, 실시예 1에 따른 전기화학센서는 전자전달이 확산에 의해 결정된다는 것을 알 수 있다. 즉, 실시예 1에 따른 전기화학센서의 산화아연 나노 막대의 표면과 Au25GS18 간의 전자 전달이 전자-호핑(electron hopping)과 같은 확산에 기인한다는 것을 의미한다.
또한, 상기 도 12c는 아래 [수학식 1]을 통해 계산된 전류와 스캔속도의 제곱근을 나타낸 그래프로, 이들의 관계가 선형으로 나타났다. 다시 말해 이들 외의 다른 항들은 상수이기 때문에 D1 /2 APP가 일정한 값을 가지게 되는 것으로 설명이 가능하다.
[수학식 1] Randles-Sevcik equation
Figure 112014012954774-pat00001
상기 식에서 하기 ip는 최대 전류값이고, n은 산화-환원이 일어날 때 이동하는 전자의 수, A는 전극의 면적(cm2), C는 농도(mol/cm3), v는 스캔속도(V/s)이고, D는 확산계수(cm2/s)을 나타낸다.
도 13a는 실시예 1에 따른 전기화학센서의 제조과정 중에서 드롭-캐스팅하는 횟수에 따라 산화아연 나노 막대 표면에 고정화되는 Au25GS18의 개수를 나타낸 그래프이고, 도 13b는 고정화된 Au25GS18 개수를 변화시켰을 때, 실시예 1에 따른 전기화학센서의 민감도를 나타낸 그래프이다.
도 13a 및 도 13b에 따르면, 산화아연 나노 막대 표면에 고정화되는 Au25GS18의 개수는 실시예 1에 따른 전기화학센서를 제조하는 과정 중 드롭-캐스팅하는 횟수에 따라 조절될 수 있음을 확인하였다. 즉, 드롭-캐스팅 횟수가 증가할수록 실시예 1에 따른 전기화학센서에 포함되는 Au25GS18의 개수가 증가한다는 것을 확인할 수 있다.
이때, 산화아연 나노 막대 표면에 고정화되는 Au25GS18의 개수는 산화 환원 피크를 이용하여 추측할 수 있고, 이러한 추측은 패러데이법칙(N=Q/nF)를 이용한 피크의 면적을 통해 Q를 계산하여 얻을 수 있다.
즉, 드롭-캐스팅의 횟수를 계속적으로 증가시키더라도 330 ㎍/㎝2 이상의 Au25GS18를 고정화할 수 없다는 것을 확인할 수 있다. 이때, 고정화된 Au25GS18의 양에 따라 p-아미노페놀의 감도가 증가된다는 것을 확인할 수 있다.
도 14는 p-아미노페놀 농도를 0, 0.05, 0.11, 0.17, 0.23 mM으로 변화시켰을 때, 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대(a), 실시예 1에 따른 전기화학센서(b)의 전압전류 그래프이고, 도 14c는 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대(a), 실시예 1에 따른 전기화학센서(b)의 전압전류 그래프로부터 p-아미노페놀의 함량을 결정하기 위한 교정 그래프이다.
이에 따르면, 실시예 1에 따른 전기화학센서에서의 p-아미노페놀 농도 변화에 따라 산화 전위가 감소하고 증가하는 정도가 가장 확연하게 나타남을 확인할 수 있다. 이는 실시예 1에 따른 전기화학센서가 p-아미노페놀에 대하여 전기화학적으로 촉매활성을 가진다는 것을 의미한다.
또한, 도 14c의 교정 그래프에 따르면 산화 전류의 증가는 p-아미노페놀 함량에 따라 선형적이였고, 상기 교정 그래프의 기울기를 통해 민감도(sensitivity)를 추측할 수 있다. 실시예 1에 따른 전기화학센서의 민감도가 제조예 2에 따른 산화아연 나노 막대의 민감도에 비해 6 배 이상 우수한 것을 확인하였으며, 이는 효소반응의 최종 생성물인 p-아미노페놀의 감지능이 우수하다는 것을 의미하므로, 본 발명의 전기화학센서를 이용하여 알칼리성 인산가수분해효소의 활성도를 측정할 수 있다는 것을 나타낸다.
이때, 실시예 1에 따른 전기화학센서의 민감도는 164 ㎂/mM이고, 검출한계(detection limit)는 0.21 μM로 확인되었다.
도 15a는 실시예 1에 따른 전기화학센서에 알칼리성 인산가수분해효소를 적과하였을 때의 전압전류 그래프이고, 도 15b는 상기 실시예 1에 따른 전기화학센서의 전압전류 그래프로부터 알칼리성 인산가수분해효소의 활성도를 결정하기 위한 교정 그래프이다.
이때, 알칼리성 인산가수분해효소는 Mg2 +가 존재하는 37 ℃의 염기성 조건에서 가장 활성이 우수하다고 알려져 있으나, 실시예 1에 따른 전기화학센서는 pH 8-9에서 안정적으로 결합을 유지할 수 있으므로 pH 8에서 효소반응을 수행하였다.
보다 구체적으로, 0.5 mM p-아미노페닐 포스페이트, 1 mM MgCl2, 0.1 M KCl과 pH 8 완충용액을 포함하는 37 ℃ 수용액에 알칼리성 인산가수분해효소를 첨가한 후, 상기 효소반응을 순환 전압전류법(CV)을 이용하여 기록하였다.
상기 도 15b에 따르면, 알칼리성 인산가수분해효소 농도 변화에 따라서 전류전압 그래프가 선형적으로 증가함을 확인할 수 있는데, 이때 민감도는 90.7 nAU-1L이고, 검출되는 전위는 0.25 V에서 낮은 산화 전위를 갖는 것을 확인하였다. 이는 알칼리성 인산가수분해효소의 감지를 위해 사용되는 스크린 프린팅기술(screen printed)을 이용하여 제조된 그래파이트(graphite)전극과 마이크로 패턴기술로 제조된 ITO 전극보다 낮은 전위이다.
도 16a는 실시예 1에 따른 전기화학센서에 120초 후에 알칼리성 인산가수분해효소를 적과하여주었을 때 크로노암페로메트리(chronoamperometry)법을 이용하여 측정한 전압전류 그래프이고, 도 16b는 상기 실시예 1에 따른 전기화학센서의 크로노암페로메트리 그래프로부터 알칼리성 인산가수분해효소의 활성도를 결정하기 위한 교정 그래프이다.
이때, 0.5 mM p-아미노페닐 포스페이트, 1 mM MgCl2, 0.1 M KCl과 pH 8 완충용액을 포함하는 37 ℃ 수용액에 알칼리성 인산가수분해효소를 첨가한 후, 상기 효소반응을 크로노암페로메트리(chronoamperometry)법을 이용하여 기록하였다. 상기 크로노암페로메트리 전류응답(chronoamperometry current response)은 0.25 V의 전압을 가해주고, 측정되는 전류값을 기록하였다.
도 16b에 따르면 시간에 따라서 전류의 반응을 보는 방법인 크로노암페로메트리 방법을 사용하여 0-300 U/L 알칼리성 인산가수분해효소를 가해주고 그 전류 값을 측정한 결과, p-아미노페놀 포스페이트의 소모로 인해서 직선이 아닌 곡선의 모양으로 나타났다.
또한 상기 도 16a에서 측정된 전압전류 그래프의 초기 변화 기울기를 이용하여 민감도를 추측하였다. 이때 민감도는 0.4925 nAs-1U-1L이고 검출한계는 1.77 U/L로 측정되었다.
상술한 결과에 의하면 Au25GS18는 우수한 산화/원원 매개체로 이용이 가능할 뿐만 아니라, 전기적 도체로의 특성도 뛰어나므로 이를 이용하여 산화아연 나노 막대를 지지체로 사용한 전기화학센서의 센싱 특성이 종래 전기화학센서에 비해 향상되었음을 알 수 있다.

Claims (12)

  1. 기판; 상기 기판 상에 형성된 수직 배열 구조의 산화아연 나노 막대; 및 상기 산화아연 나노 막대 표면에 결합된 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자;를 포함하는 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자와 산화아연 나노 막대는 정전기적 인력에 의해 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 산화아연 나노 막대의 지름은 50~200 ㎚이고, 길이가 1~2 ㎛인 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 글루타티온 리간드는 L-환원형 글루타티온인 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 전기화학센서는 pH 8~9 범위 내에서 작동하는 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 전기화학센서는 특정 효소의 활성을 정량적으로 측정하는 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 효소는 p-아미노페닐 포스페이트(p-aminophynyl phosphate, p-APP)를 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)로 변환시키는 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline Phosphatase, ALP)인 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서.
  9. Ⅰ) 금 클러스터 나노입자의 표면에 글루타티온 리간드를 결합시키는 단계;
    Ⅱ) 기판 상에 산화아연 나노 막대를 성장시키는 단계; 및
    Ⅲ) 상기 글루타티온 리간드로 보호된 금 클러스터 나노입자에 상기 산화아연 나노 막대를 결합시켜 고정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 Ⅰ) 단계는 Ⅰ-ⅰ) 글루타티온 리간드 용액과 금 수화물 용액을 혼합하는 단계; Ⅰ-ⅱ) 상기 혼합물에 수소화붕소나트륨을 첨가하여 환원반응을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 Ⅱ) 단계는 Ⅱ-ⅰ) 기판 상에 아연 시드층을 형성하는 단계; Ⅱ-ⅱ) 상기 아연 시드층이 형성된 기판을 질산아연이 포함된 용액에 담근 후, 50-100 ℃로 0.5-4 시간동안 가열하는 단계; 및 Ⅱ-ⅲ) 상기 아연 시드층이 형성된 기판 상에 산화아연 나노 막대가 성장하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 Ⅲ) 단계는 pH 8-9로 조절한 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 p-아미노페놀(p-aminophenol, p-AP)의 전기화학적 검출용 전기화학센서의 제조방법.
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